CN115843695B - 一种镜面草组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种镜面草组织培养方法，过程包括：外植体获取、消毒、接种培养；激素浓度逐渐降低的启动诱导培养；走茎枝培养途径的增殖扩繁培养；壮苗成苗培养；生根培养。本发明优点包括：以新发嫩茎为外植体，采用茎枝培养途径，获得较高增殖率；能使镜面草大量成苗，成苗周期短，生根率高，适合大规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种镜面草的培养方法。
背景技术
镜面草(Pileapeperomioides)，荨麻科冷水花属，多年生肉质草本植物，无毛，丛生，具根状茎。茎直立，粗状，不分枝，高2-13厘米，粗5-10毫米，节很密集，带绿色，干时变棕褐色。因其肥厚近圆形的肉质叶形似古代仙人照面的镜子，由此得名----镜面草。镜面草常用的繁殖方式是分株和扦插繁殖，每年3-5月份是分株和扦插的最好时机。生长健壮的植株，在根部极易形成不定芽，长出一些大小不等的小植株。春天气温回升时可用利刃从母株上截取下来另行栽植成活。镜面草能用作观赏，也能作药用，其市场价值很大，采取分株和扦插繁殖方式生产力有限，因此研发一种适用于大规模生产的组织培养方法是有前景的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种镜面草组织培养方法，以解决现有技术中镜面草生产力有限，不能大规模生产的问题。
为了达到上述目的本发明采用如下技术方案：
一种镜面草组织培养方法，过程包括：
(1)外植体获取、消毒、接种培养，接种培养基成分：MS、0.3mg/LBA、30g/L蔗糖、5.8g/L卡拉胶，pH＝6～6.2；
(2)启动诱导培养，先后经过启动诱导培养基1和启动诱导培养基2培养诱导出芽，启动诱导培养基1成分：MS、1.0mg/L BA、30g/L蔗糖、5.8g/L卡拉胶，pH＝6～6.2，启动诱导培养基2成分：1/4MS、0.1mg/L BA、30g/L蔗糖、5.8g/L卡拉胶，pH＝6～6.2；
(3)增殖扩繁培养，增殖培养基成分：MS、0.5～1.5mg/L BA、30g/L蔗糖、5.8g/L卡拉胶，pH＝6～6.2；
(4)壮苗成苗培养，壮苗成苗培养基成分：MS、0～0.1mg/L BA、0.2～0.5g/LAC、30g/L蔗糖、5.8g/L卡拉胶，pH＝6～6.2。
进一步地，若所述步骤(4)培养结束后未达到出货标准，需要进行步骤(5)生根培养，生根培养基成分：MS、0～0.2g/LAC、30g/L蔗糖、5.8g/L卡拉胶，pH＝6～6.2。
进一步地，所述步骤(1)外植体获取过程包括：选取生长健壮、无病虫害、遗传性状纯正的母株作为母本，使其茎叶部分干爽，保持生机活力；选取母本基质中新发嫩茎作为外植体，清洗；然后外植体消毒，消毒方法：质量分数0.1％升汞消毒15min，消毒完后用无菌水冲洗5-6遍。
进一步地，所述步骤(1)接种过程：
消毒完的外植体(嫩茎)切成1cm长的小段，每段上带有1～3个节，区分形态学上下端后插入接种培养基中，按如下要求进行培养：
接种培养基成分：MS、0.3mg/L BA、30g/L蔗糖、5.8g/L卡拉胶，pH＝6～6.2；
培养条件：22-25℃，散光培养，12h光/12h暗；
转接周期：30-45d。
进一步地，所述步骤(2)启动诱导培养过程：
取出茎段，切分茎段，每个茎段带1-2个小节转入启动诱导培养基1，按如下要求进行培养，诱导出芽：
培养条件：22-25℃，3000LX光培养，光周期：12h光/12h暗；
转接周期：45d；
诱导出小芽后，转接在启动诱导培养基2中，
培养条件同启动诱导培养基1培养；
培养周期：30d。
进一步地，所述步骤(3)增殖扩繁培养过程：
当芽团数达到一定量时可切割启动诱导期得到的芽进行增殖扩繁，切割要求：先将长出的芽去顶，去黑头、枯黄叶、愈伤组织。可切成1-2个芽/团或者0.6cm*0.6cm左右大小的团块，切割完成后转入增殖培养基，按如下要求进行培养：
培养条件：22-25℃，3000LX光培养，光周期：12h光/12h暗；
转接周期：30d～35d；
上一个增殖培养基培养后得到的增殖苗在转接入下一个增殖培养基前，需把不定根、枯死叶片切除，如果上一个增殖培养基培养后得到的增殖苗高度大于2cm，在转接入下一个增殖培养基继续增殖培养时，将其横切成小段，每段有1～3个节位。
进一步地，所述步骤(4)壮苗成苗培养过程：
切割：将增殖培养得到的团块苗切成带有2-3个芽的小团块，按方向性切割，去掉基部多余的愈伤，不要去顶；接入壮苗成苗培养基中，按如下要求进行培养：
培养条件：22-25℃，3000LX光培养，光周期：12h光/12h暗；
转接周期：25d。
进一步地，所述步骤(5)生根诱导培养过程：
将步骤(4)壮苗成苗培养得到的单株生根，株高3cm以上，叶片5叶以上的团苗，放入生根培养基中按如下要求进行生根培养：
培养条件：22-25℃，3000LX光培养，光周期：12h光/12h暗；
培养周期：14d。
进一步地，所述出货标准是：株高4-5cm，冠幅4-5cm，叶长1cm，叶宽1cm，叶7-8片。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
研发以新发嫩茎为外植体；启动诱导培养时采取逐渐降低激素浓度的方式培养芽，使芽较接种时长大，节间较短，叶片较密，茎变粗，为增殖扩繁提供有充足活力的芽；增殖扩繁培养采用茎枝培养途径，获得较高增殖率；能使镜面草大量成苗，成苗周期短，生根率高，适合大规模生产。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：
图1是镜面草母株；
图2是镜面草新发嫩茎；
图3是外植体消毒成功实验照片；
图4是外植体经过启动诱导成功诱导出芽的实验照片；
图5是实施例1增殖苗横切的实验照片；
图6是实施例1增殖苗切割后转接时接种的实验照片；
图7是实施例1增殖苗切割后培养34d的实验照片；
图8是实施例1壮苗成苗培养接种时的实验照片；
图9是实施例1壮苗成苗培养20d时的实验照片；
图10是实施例1壮苗成苗培养25d时的实验照片；
图11是实施例1生根培养接种时的实验照片；
图12是实施例1生根培养到14d时的实验照片；
图13是最低出货标准示意图；
图14是实施例3增殖苗切割后转接时接种的实验照片；
图15是实施例3增殖苗切割后培养34d的实验照片；
图16是实施例4增殖苗切割后转接时接种的实验照片；
图17是实施例4增殖苗切割后培养34d的实验照片；
图18是实施例5壮苗成苗培养接种时的实验照片；
图19是实施例5壮苗成苗培养20d时的实验照片；
图20是实施例5壮苗成苗培养25d时的实验照片；
图21是实施例6接种到生根培养基时的实验照片；
图22是实施例6生根培养到14d时的实验照片；
图23是实施例7接种到生根培养基时的实验照片；
图24是实施例7生根培养到14d时的实验照片；
图25是实施例8外植体接种到接种培养基的实验照片；
图26是实施例8接种培养结束后实验照片。
具体实施方式
下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明，在此以本发明的示意性实施例及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
实施例1
STG0母本预处理
母本要求：生长健壮、无病虫害、遗传性状纯正的母株，如图1所示。
处理方法：将母本移至室外的晾放架晾放，不浇水，防淋雨，使茎叶部分干爽即可。不能使茎段、侧芽萎蔫干瘪，一定要使茎段保持生机活力。
STG1外植体消毒与接种：
①外植体预处理：
时间：晴天。
处理工具：手术刀或剪刀。
处理方法：选取母本基质中新发嫩茎作为外植体，如图2所示，徒手掰下，清理干净基质。
②外植体细处理：
处理工具：已消毒的空广口瓶。
处理方法：将外植体在流水下冲洗干净，再拿到超净工作台上，自然晾干水分，暂不切分直接放入已消毒的空广口瓶中。
③外植体消毒
a)消毒前准备工作：打开照明灯和消毒炉消毒接种工具，使用75％的酒精消毒手术刀、擦拭超净台与消毒双手。
b)处理工具：质量分数0.1％升汞、5-6瓶无菌水、已消毒的空广口瓶、装废升汞的瓶子。
c)消毒方法：质量分数0.1％升汞消毒15min，消毒完后用无菌水冲洗5-6遍。
④外植体接种
a)处理工具：接种培养基，已消毒的接种工具。
b)处理方法：消毒完的外植体(嫩茎)切成1cm长的小段，每段上带有1～3个节，区分形态学上下端后插入接种培养基中，按如下要求进行培养：
接种培养基成分：MS、0.3mg/L BA、30g/L蔗糖、5.8g/L卡拉胶，pH＝6～6.2；
培养条件：22-25℃，散光培养，12h光/12h暗；
培养周期：30-45d。
注意事项：接种后每天巡查，及时清理细菌真菌污染。观察外植体生长情况。如发现外植体除芽点外其余部分发黑或发白，说明消毒时间过长，应当缩短消毒时间。外植体消毒成功的效果如图3所示。
STG2启动诱导期
取出茎段，切分茎段，每个茎段带1-2个小节转入启动诱导培养基1，按如下要求进行培养，诱导出芽：
启动诱导培养基1：MS、1.0mg/L BA、30g/L蔗糖、5.8g/L卡拉胶，pH＝6～6.2；
培养条件：22-25℃，3000LX光培养，光周期：12h光/12h暗；
转接周期：45d；
诱导出小芽后，转接在启动诱导培养基2中，启动诱导培养基2：1/4MS、0.1mg/LBA、30g/L蔗糖、5.8g/L卡拉胶，pH＝6～6.2；
培养条件同启动诱导培养基1培养；
培养周期：30d。
如图4所示，较接种时长大，节间较短，叶片较密，茎变粗。将芽切下进行增殖。
STG3增殖扩繁期
当芽团数达到一定量时可切割启动诱导期得到的芽进行增殖扩繁。
切割要求：先将长出的芽去顶，去黑头、枯黄叶、愈伤组织。可切成1-2个芽/团或者0.6cm*0.6cm左右大小的团块，切割完成后转入增殖培养基，按如下要求进行培养：
增殖培养基：MS、1.0mg/L BA、30g/L蔗糖、5.8g/L卡拉胶，pH＝6～6.2；
培养条件：22-25℃，3000LX光培养，光周期：12h光/12h暗；
转接周期：30d～35d。
上一个增殖培养基培养后得到的增殖苗在转接入下一个增殖培养基前，需把不定根、枯死叶片切除，如图6所示是增殖苗切割后接种时情形，图7为培养34d时的情形；如果上一个增殖培养基培养后得到的增殖苗偏高，例如高度大于2cm，在转接入下一个增殖培养基继续增殖培养时，可横切成小段，每段有1～3个节位，如图5所示；然后参照上述培养要求进行培养。
增殖率达3-3.5时，则进入壮苗成苗期培养。
STG4壮苗成苗期
镜面草初代增殖苗茎干脆弱，转接过程中容易折断，生产上不利于生根，需转接过渡1-2代后茎干微发硬转接不易折断才可做生根。
切割：将增殖培养得到的团块苗切成带有2-3个芽的小团块，按方向性切割，去掉基部多余的愈伤，不要去顶；接入壮苗成苗培养基中，按如下要求进行培养：
壮苗成苗培养基：MS、0.1mg/L BA、0.5g/LAC、30g/L蔗糖、5.8g/L卡拉胶，pH＝6～6.2；
培养条件：22-25℃，3000LX光培养，光周期：12h光/12h暗；
转接周期：25d。
如图8所示为接种时的情形。如图9所示为壮苗成苗培养20d时的情形，成苗率是0.53。如图10所示为壮苗成苗培养25d时的情形。成苗率是1.13。
STG5生根诱导期
将壮苗成苗培养得到的单株生根，株高3cm以上，叶片5叶以上的团苗，放入生根培养基中按如下要求进行生根培养：
生根培养基：MS、30g/L蔗糖、5.8g/L卡拉胶，pH＝6～6.2；
培养条件：22-25℃，3000LX光培养，光周期：12h光/12h暗；
培养周期：14d。
如图11所示是接种到生根培养基时的情形，如图12所示是生根培养到14d时的情形，生根率100％。
最低出货标准：株高4-5cm，冠幅4-5cm，叶长1cm，叶宽1cm，叶7-8片，如图13所示是满足最低出货标准的示意图。若是壮苗成苗期得到团苗已经达到出货标准，则可以装袋出货，无需再生根培养。
实施例2
本实施例中外植体嫩茎消毒处理方法为：75％酒精消毒30s，0.1％升汞消毒12min。结果因消毒不够充分，外植体依然存在较多的污染源，接种培养后最终全部污染失败。
实施例3
本实施例中与实施例1不同的是增殖培养基：MS、0.5mg/LBA、30g/L蔗糖、5.8g/L卡拉胶，pH＝6～6.2，如图14所示是增殖苗切割后转接时接种情形，图15为培养34d时的情形；培养效果与实施例1相当。
实施例4
本实施例中与实施例1不同的是增殖培养基：MS、1.5mg/LBA、30g/L蔗糖、5.8g/L卡拉胶，pH＝6～6.2，如图16所示是增殖苗切割后转接时接种情形，图17为培养34d时的情形；培养效果与实施例1相当。
实施例5
本实施例中与实施例1不同的是壮苗成苗培养基：MS、0.2g/LAC、30g/L蔗糖、5.8g/L卡拉胶，pH＝6～6.2。如图18所示为接种时的情形。如图19所示为壮苗成苗培养20d时的情形，成苗率是0.65。如图20所示为壮苗成苗培养25d时的情形。成苗率是1.06。培养效果与实施例1相当。
实施例6
本实施例中与实施例1不同的是生根培养基：MS、0.2g/LAC、30g/L蔗糖、5.8g/L卡拉胶，pH＝6～6.2。
如图21所示是接种到生根培养基时的情形，如图22所示是生根培养到14d时的情形，生根率100％。培养效果与实施例1相当。
实施例7
本实施例中与实施例1不同的是生根培养基：MS、0.5mg/L IBA、30g/L蔗糖、5.8g/L卡拉胶，pH＝6～6.2.
如图23所示是接种到生根培养基时的情形，如图24所示是生根培养到14d时的情形，培养结束后并没有生根。
实施例8
本实施例中分别选取叶片和叶柄为外植体做消毒实验。
操作步骤：
1)准备接种培养基和无菌水，接种培养基配方：MS、0.5mg/L 2、4-D、1.0mg/LBA、30g/L蔗糖、6g/L卡拉胶，pH＝6～6.2。
2)母本处理：提前一天拿出棚，以确保外植体采取时，植株干爽，基质不能干，以免植株变软。采取外植体之前，母本拍照记录。
3)外植体预处理：选取植株新鲜平展、无病斑、无损伤的叶，用剪刀从叶柄基部将整个叶剪下，放到干燥的碟子中，拍照记录。
4)外植体细处理：将外植体拿到超净工作台上，擦拭去外植体表面的灰尘，然后从叶片和叶柄连接处将叶柄和叶片切分开，分别放入消毒空瓶中，拍照记录。
5)消毒：将每一瓶材料做好标记，按处理序号顺序依次消毒，消完毒后，用无菌水冲洗4-5遍。拍照记录。
6)接种：一张叶片以“十字”切分成4份，平放到接种培养基中；叶柄切成1cm长的小段，平放到接种培养基中。拍照记录，如图25所示。
7)培养：22-23℃，3000-4000LX光培养，光周期12h光/12h暗，培养观察30天，每周观察记录两次，记录污染数、死亡数。拍照记录。
不同外植体消毒方法及效果如表1所示：
表1
培养结束后，如图26所示，左图可见叶柄外植体已经成功分化出愈伤组织，右图可见叶片还没有愈伤生长。
取出带愈伤的叶柄外植体，视其愈伤团块大小，把未长愈伤的叶柄部位从中间剖开，接种时伤口面接触培养基，叶柄可用接种刀刺几个小口利于愈伤生长，注意每个团块必须带有愈伤，不能只有叶柄，分别接种到诱导培养基1、诱导培养基2、诱导培养基3；
叶片外植体尚没有愈伤长出，取出叶片外植体后，把发黑衰亡的部分切掉，把叶片从中间切开后，分别接种到诱导培养基1中。培养35天，每周观察其生长状况。
诱导培养基1：MS、2mg/L 2-ip、0.5mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖、6g/L卡拉胶，pH＝6～6.2；
诱导培养基2：MS、2mg/L TDZ、0.5mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖、6g/L卡拉胶，pH＝6～6.2；
诱导培养基3：MS、2mg/L BA+0.5mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖、6g/L卡拉胶，pH＝6～6.2；
培养条件：21-23℃，光照3000-4000lx，光周期：12h光/12h；
培养效果如表2所示：
表2
结束培养后，上述试验愈伤生长明显，但还没分化出芽。
接着进入下一阶段：
取出愈伤组织，视愈伤团块大小，把愈伤团块分割成2～3团，尽量保证每个团块大小基本一致，把每团上黑色的组织刮掉后，接种到诱导培养基4、诱导培养基5、诱导培养基6中，观察结果，并拍照记录。
诱导培养基4：MS、0.5mg/L BA、30g/L蔗糖、6g/L卡拉胶，pH＝6～6.2；
诱导培养基5：MS、1mg/L TDZ、0.05mg/L NAA、30g/L蔗糖、6g/L卡拉胶，pH＝6～6.2；
诱导培养基6：MS、1mg/L BA、30g/L蔗糖、6g/L卡拉胶，pH＝6～6.2；
培养条件：21-23℃，光照强度3000-4000lx，光周期12h光/12h暗；
转接周期35d，
培养第45d，培养效果如表3所示：
表3
从上可知，本阶段愈伤未能诱导出芽，而且玻璃化现象还没能解决，所有处理均有衰竭发褐的团块。
接着进入下一阶段：
取出愈伤组织，视愈伤团块大小，把愈伤团块分割成2～3团，尽量保证每个团块大小基本一致，把每团上黑色的组织和不定根刮掉后，接种到诱导培养基7、诱导培养基8、诱导培养基9中，培养35d，观察结果，并拍照记录。
诱导培养基7：MS、0.5mg/L BA、、30g/L蔗糖、6g/L卡拉胶，pH＝6～6.2；
诱导培养基8：MS、1mg/L TDZ、0.05mg/LNAA、30g/L蔗糖、6g/L卡拉胶，pH＝6～6.2；
诱导培养基9：MS、1mg/L BA、30g/L蔗糖、6g/L卡拉胶，pH＝6～6.2；
培养条件：21-23℃，光照强度：3000-4000lx，光周期：12h光/12h暗
培养效果：组织细胞坏死，全部愈伤团块衰竭死亡，愈伤组织再分化失败。愈伤组织诱导较难。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (8)
1.一种镜面草组织培养方法，其特征在于：
过程包括：
(1)选取母本基质中新发嫩茎作为外植体，清洗；然后外植体消毒，消毒方法：质量分数0.1％升汞消毒15min，消毒完后冲洗，接种培养，接种培养基成分：MS、0.3mg/LBA、30g/L蔗糖、5.8g/L卡拉胶，pH＝6～6.2；
(2)启动诱导培养，先后经过启动诱导培养基1和启动诱导培养基2培养诱导出芽，启动诱导培养基1成分：MS、1.0mg/LBA、30g/L蔗糖、5.8g/L卡拉胶，pH＝6～6.2，启动诱导培养基2成分：1/4MS、0.1mg/LBA、30g/L蔗糖、5.8g/L卡拉胶，pH＝6～6.2；
(3)增殖扩繁培养，增殖培养基成分：MS、0.5～1.5mg/LBA、30g/L蔗糖、5.8g/L卡拉胶，pH＝6～6.2；
(4)壮苗成苗培养，壮苗成苗培养基成分：MS、0～0.1mg/LBA、0.2～0.5g/LAC、30g/L蔗糖、5.8g/L卡拉胶，pH＝6～6.2。
2.根据权利要求1所述的一种镜面草组织培养方法，其特征在于：
若所述步骤(4)培养结束后未达到出货标准，需要进行步骤(5)生根培养，生根培养基成分：MS、0～0.2g/LAC、30g/L蔗糖、5.8g/L卡拉胶，pH＝6～6.2；
所述出货标准是：株高4-5cm，冠幅4-5cm，叶长1cm，叶宽1cm，叶7-8片。
3.根据权利要求1或2所述的一种镜面草组织培养方法，其特征在于：
所述步骤(1)外植体获取过程包括：选取生长健壮、无病虫害、遗传性状纯正的母株作为母本，使其茎叶部分干爽，保持生机活力；选取母本基质中新发嫩茎作为外植体，清洗；然后外植体消毒，消毒方法：质量分数0.1％升汞消毒15min，消毒完后用无菌水冲洗5-6遍。
4.根据权利要求1或2所述的一种镜面草组织培养方法，其特征在于：
所述步骤(1)接种过程：
消毒完的外植体切成1cm长的小段，每段上带有1～3个节，区分形态学上下端后插入接种培养基中，按如下要求进行培养：
接种培养基成分：MS、0.3mg/LBA、30g/L蔗糖、5.8g/L卡拉胶，pH＝6～6.2；
培养条件：22-25℃，散光培养，12h光/12h暗；
转接周期：30～45d。
5.根据权利要求1或2所述的一种镜面草组织培养方法，其特征在于：
所述步骤(2)启动诱导培养过程：
取出茎段，切分茎段，每个茎段带1-2个小节转入启动诱导培养基1，按如下要求进行培养，诱导出芽：
培养条件：22-25℃，3000LX光培养，光周期：12h光/12h暗；
转接周期：45d；
诱导出小芽后，转接在启动诱导培养基2中，
培养条件同启动诱导培养基1培养；
培养周期：30d。
6.根据权利要求1或2所述的一种镜面草组织培养方法，其特征在于：
所述步骤(3)增殖扩繁培养过程：
当芽团数达到一定量时可切割启动诱导期得到的芽进行增殖扩繁，切割要求：先将长出的芽去顶，去黑头、枯黄叶、愈伤组织，可切成1-2个芽/团或者0.6cm*0.6cm左右大小的团块，切割完成后转入增殖培养基，按如下要求进行培养：
培养条件：22-25℃，3000LX光培养，光周期：12h光/12h暗；
转接周期：30d～35d；
上一个增殖培养基培养后得到的增殖苗在转接入下一个增殖培养基前，需把不定根、枯死叶片切除，如果上一个增殖培养基培养后得到的增殖苗高度大于2cm，在转接入下一个增殖培养基继续增殖培养时，将其横切成小段，每段有1～3个节位。
7.根据权利要求1或2所述的一种镜面草组织培养方法，其特征在于：
所述步骤(4)壮苗成苗培养过程：
切割：将增殖培养得到的团块苗切成带有2-3个芽的小团块，按方向性切割，去掉基部多余的愈伤，不要去顶；接入壮苗成苗培养基中，按如下要求进行培养：
培养条件：22-25℃，3000LX光培养，光周期：12h光/12h暗；
转接周期：25d。
8.根据权利要求2所述的一种镜面草组织培养方法，其特征在于：
所述步骤(5)生根诱导培养过程：
将步骤(4)壮苗成苗培养得到的单株生根，株高3cm以上，叶片5叶以上的团苗，放入生根培养基中按如下要求进行生根培养：
培养条件：22-25℃，3000LX光培养，光周期：12h光/12h暗；
培养周期：14d。
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| 镜面草叶片和叶柄愈伤组织诱导;冯晓晓等;《中国园艺文摘》(第6期);1-5 * |
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