CN112167064A - 一种丹参组培快繁的方法 - Google Patents

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宋振巧
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Abstract

本发明公开了一种丹参组培快繁的方法，属于丹参种苗技术领域，包括以下步骤：选取供品系试验的温室大棚和试验地、外植体，配制培养基，外植体进行切割和接种，进行培养，生根培养，选取培育苗，训苗等步骤。本发明中，采用合理的培育方法，能够保障丹参快速的进行繁殖，在外植体的培育过程中，不同阶段采用不同的培养基，能够有利于外植体的培育，保障丹参组培快繁的质量，对育苗进行驯化，组培苗完全适应外部环境，提高了成活率，小苗出圃品质好。

Description

一种丹参组培快繁的方法
技术领域
本发明涉及丹参种苗技术领域，具体为一种丹参组培快繁的方法。
背景技术
丹参，中药名。为唇形科植物丹参的干燥根和根茎。春、秋二季采挖，除去泥沙，干燥。全国大部分地区都有分布。具有活血祛瘀，通经止痛，清心除烦，凉血消痈之功效。用于胸痹心痛，脘腹胁痛，症瘕积聚，热痹疼痛，心烦不眠，月经不调，痛经经闭，疮疡肿痛。因此丹参种苗需求量逐年增大，但是现有的种植丹参中繁殖速度慢，在培育过程中培育质量不佳及成活率低的问题。为此，急需一种丹参组培快繁的方法来解决这些问题。
发明内容
本发明提供的发明目的在于提供一种丹参组培快繁的方法，能够快速的进行繁殖，保障培育质量，提高成活率。
为了实现上述效果，本发明提供如下技术方案：一种丹参组培快繁的方法，包括以下步骤：
S1、选取供品系试验的温室大棚和试验地。
S2、对接种外植体进行选取。
S3、配制激素类母液备用。
S4、配制培养基备用。
S5、对培养基、接种室和超净工作台进行灭菌处理。
S6、对外植体进行灭菌处理。
S7、对已灭菌的外植体进行切割和接种。
S8、对接种后的外植体进行培养。
S9、将不定芽从愈伤中分离开，转接到相同培养基继续继代培养，并进行生根培养。
S10、选取品种纯正、健康、叶色浓绿、组织结实无玻璃化现象、无徒长现象、根系白且粗壮、有多条、无变异的培育苗。
S11、对选取的培育苗进行训苗。
进一步的，根据S2中的操作步骤，取材前对植株的叶片大小形状、叶色、株型进行鉴定，确保该植株保持原有品种特性，选择丹参生长旺盛的温暖季节，晴朗天气，进行取材，选择生长健壮的植株，靠近茎尖部位的幼嫩叶片，取回后尽量3天内接种完。
进一步的，根据S3中的操作步骤，包括以下步骤：
S301、用电子分析天平准确称取激素类药品NAA和6－BA各0.1g，NAA先用少量0.1mol∕LNaOH或95%酒精溶解；
S302、6－BA用0.1mol∕L的HCL溶解；
S303、将已溶解的激素类药品NAA和6－BA溶液分别加蒸馏水定容至100ml，即成浓缩至1mg∕ml的激素类母液。
进一步的，根据S4中的操作步骤，所述培养基的配制包括以下步骤：
S401、按4.74 g/L比例，称取适量MS培养基粉末溶解于适量蒸馏水，按0.7%琼脂和3%蔗糖加入后加热至琼脂完全溶解，蒸馏水定容至所需体积，按培养基激素配比加入相应激素量，后用1mol/L NaOH溶液和1mol/L HCl溶液调节pH值，趁热分装至培养瓶中，养基体积占培养瓶的1/5-1/4，制得MS培养基。
S402、按2.47g/L比例 称取适量1/2 MS培养基粉末溶解于适量蒸馏水，按0.7%琼脂和3%蔗糖加入后加热至琼脂完全溶解，蒸馏水定容至所需体积，按培养基激素配比加入相应激素和容量，后用1mol/L NaOH溶液和1mol/L HCl溶液调节pH值，趁热分装至培养瓶中，培养基体积占培养瓶的1/5-1/4，制得1/2MS培养基。
进一步的，根据S5中的操作步骤，包括以下步骤：
S501、培养基灭菌：将分装好的培养基，准备充足的蒸馏水和滤纸，一起放入高压灭菌锅内，进行高温高湿高压灭菌，121℃高压灭菌20分钟，备用。
S502、接种室灭菌：在接种前4h用甲醛与高锰酸钾混合薰蒸接种室，并打开紫外灯照射30min。
S503、超净工作台灭菌：正式接种前半小时左右，打开超净工作台上的紫外灯和风机，20-30min后接种。
进一步的，根据S6中的操作步骤，从温室取回的叶片材料，经自来水冲洗干净，用肥皂、洗衣粉或吐温洗涤，用无菌水洗2-3次，放入工作台，倒入70%-75%的酒精中浸泡约30s，再在0．1％的升汞中浸泡5-10min，或在10％的漂白粉上溶液中浸泡10-15min，浸泡时可进行搅动，使植物材料与灭菌剂有良好的接触，然后用无菌水冲洗3-5次。
进一步的，根据S7中的操作步骤，在超净工作台中，将已灭菌的外植体在无菌滤纸上吸干水分，用事先灭菌的手术刀和镊子切割成大小约0.5cm*0.5cm的材料，把培养材料叶片表面向下迅速放入培养瓶，每瓶接种8-10个小叶片，扎上瓶口，培养瓶上贴标签注明接种日期，放在培养室内培养，接种过程中，用火焰烧瓶口，转动瓶口使瓶口各部分都烧到，打开瓶盖，操作期间应经常用75％酒精擦拭工作台和双手，接种器械应反复在95％的酒精中浸泡和在火焰上灭菌，接种结束后，清理和关闭超净工作台。
进一步的，根据S8中的操作步骤，不定芽诱导培养基，培养基组成为MS+6-BA2.0mg/L+NAA 0.5mg/L，PH值为5.8，培养条件为光照时间10h/d，光照强度2000lx，培养温度24-26℃，在20-30天，在叶片边缘出现愈伤和大量不定芽。
进一步的，根据S9中的操作步骤，采用继代培养基对灭菌后的外植体进行培养，继代培养基组成为MS+6-BA2.0mg/L+NAA 0.5mg/L，PH值为5.8，再采用生根培养基对外值体进行培养，生根培养基组成为1/2MS+ NAA 0.1mg/L，20-30d后，待长出完整的根系。
进一步的，根据S11中的操作步骤，包括以下步骤：
S1101、打开瓶口虚盖炼苗3天，组培苗适应后，完全开瓶口3天，组培苗完全适应外部环境。
S1102、将配制好的培养基质混合后装入育苗袋并压实，装到八成满后将育苗袋较紧密排列。
S1103、将组培苗轻轻从培养瓶中拉出，洗净根部的培养基，用竹签在育苗袋中插个小洞，将组培苗根小心放入，将根理顺后轻力压实培养。
S1104、将变异株剔除。
S1105、小苗出圃。
本发明提供了一种丹参组培快繁的方法，具备以下有益效果：
（1）本发明中，采用合理的培育方法，能够保障丹参快速的进行繁殖。
（2）本发明中，在外植体的培育过程中，不同阶段采用不同的培养基，能够有利于外植体的培育，保障丹参组培快繁的质量。
（3）本发明中，对育苗进行驯化，组培苗完全适应外部环境，提高了成活率，小苗出圃品质好。
附图说明
图1为一种丹参组培快繁的方法的流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述；显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案：请参阅图1，一种丹参组培快繁的方法，包括以下步骤：
（1）、选取供品系试验的温室大棚和试验地。
（2）、对接种外植体进行选取，取材前对植株的叶片大小形状、叶色、株型进行鉴定，确保该植株保持原有品种特性，选择丹参生长旺盛的温暖季节，晴朗天气，进行取材，避免在冬季低温阴雨天气取材，选择生长健壮的植株，靠近茎尖部位的幼嫩叶片，取回后尽量3天内接种完。
（3）、配制激素类母液备用，包括以下步骤：（301）、用电子分析天平准确称取激素类药品NAA和6－BA各0.1g，NAA先用少量0.1mol∕LNaOH或95%酒精溶解，（302）、6－BA用0.1mol∕L的HCL溶解，（303）、将已溶解的激素类药品NAA和6－BA溶液分别加蒸馏水定容至100ml，即成浓缩至1mg∕ml的激素类母液。
（4）、配制培养基备用，培养基的配制包括以下步骤：（401）、按4.74 g/L比例，称取适量MS培养基粉末（不含琼脂和蔗糖）溶解于适量蒸馏水，按0.7%琼脂（7g/L）和3%蔗糖(30g/L)加入后加热至琼脂完全溶解，蒸馏水定容至所需体积，按培养基激素配比加入相应激素量，后用1mol/L NaOH溶液和1mol/L HCl溶液调节pH值，趁热分装至培养瓶中，养基体积占培养瓶的1/5-1/4，制得MS培养基，（402）、按2.47g/L比例称取适量1/2 MS培养基粉末（不含琼脂和蔗糖）溶解于适量蒸馏水，按0.7%琼脂（7g/L）和3%蔗糖(30g/L)加入后加热至琼脂完全溶解，蒸馏水定容至所需体积，按培养基激素配比加入相应激素和容量，后用1mol/L NaOH溶液和1mol/L HCl溶液调节pH值，趁热分装至培养瓶中，培养基体积占培养瓶的1/5-1/4，制得1/2MS培养基。
（5）、对培养基、接种室和超净工作台进行灭菌处理，包括以下步骤：（501）、培养基灭菌：将分装好的培养基，准备充足的蒸馏水和滤纸，一起放入高压灭菌锅内，进行高温高湿高压灭菌，121℃高压灭菌20分钟，备用，接种工具也可这样灭菌，也可以在超净工作台上用高温的石英砂灭菌器进行灭菌，（502）、接种室灭菌：在接种前4h用甲醛与高锰酸钾混合薰蒸接种室，并打开紫外灯照射30min，（503）、超净工作台灭菌：正式接种前半小时左右，打开超净工作台上的紫外灯和风机，20-30min后接种，接种前工作人员用肥皂水洗净双手，在缓冲间内 穿好灭过菌的实验服、帽子与拖鞋，进入接种室，用70%-75%的酒精擦拭工作台面和双手。
（6）、对外植体进行灭菌处理，从温室取回的叶片材料，经自来水冲洗干净，用肥皂、洗衣粉或吐温洗涤，用无菌水洗2-3次，放入工作台，倒入70%-75%的酒精中浸泡约30s，再在0．1％的升汞中浸泡5-10min，或在10％的漂白粉上溶液中浸泡10-15min，浸泡时可进行搅动，使植物材料与灭菌剂有良好的接触，然后用无菌水冲洗3-5次。
（7）、对已灭菌的外植体进行切割和接种，在超净工作台中，将已灭菌的外植体在无菌滤纸上吸干水分，用事先灭菌的手术刀和镊子切割成大小约0.5cm*0.5cm的材料，把培养材料叶片表面向下迅速放入培养瓶，每瓶接种8-10个小叶片，扎上瓶口，培养瓶上贴标签注明接种日期，放在培养室内培养，接种过程中，用火焰烧瓶口，转动瓶口使瓶口各部分都烧到，打开瓶盖，操作期间应经常用75％酒精擦拭工作台和双手，接种器械应反复在95％的酒精中浸泡和在火焰上灭菌，接种结束后，清理和关闭超净工作台。
（8）、对接种后的外植体进行培养，不定芽诱导培养基，培养基组成为MS+6-BA2.0mg/L+NAA 0.5mg/L，PH值为5.8，培养条件为光照时间10h/d，光照强度2000lx，培养温度24-26℃，在20-30天，在叶片边缘出现愈伤和大量不定芽。
（9）、将不定芽从愈伤中分离开，转接到相同培养基继续继代培养，并进行生根培养，采用继代培养基对灭菌后的外植体进行培养，继代培养基组成为MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L，PH值为5.8，随着继代次数的增加，6-BA 用量可适当降低，另外继代次数不要超过10次，培养条件为光照时间14 h/d，光照强度2000lx，培养温度 24 - 26℃，再采用生根培养基对外值体进行培养，生根培养基组成为1/2MS+ NAA 0.1mg/L，培养条件为光照时间12h/d，光照强度2000lx，培养温度24-26℃，20-30d后，待长出完整的根系。
（10）、对组培苗进行分级
项目 茎高（cm） 根条数 根直径（mm） 根长度（cm） 叶片数
1级 ≥3 3 ≥2 ≥3 4-6
2级 ≥2 2 ≥1 ≥2 2-4
选取标准：选取品种纯正、健康、叶色浓绿、组织结实无玻璃化现象、无徒长现象、根系白且粗壮、有多条、无变异的培育苗。
（11）、对选取的培育苗进行训苗，包括以下步骤：（1101）、打开瓶口虚盖炼苗3天，组培苗适应后，完全开瓶口3天，组培苗完全适应外部环境，（1102）、选用10cm×12cm、底部打孔的营养袋或底部直径为6cm、底部打孔的营养杯，将腐殖质、蛭石1:1混合成基质，要求有一定的肥力，疏松透气，将配制好的培养基质混合后装入育苗袋并压实，装到八成满后将育苗袋较紧密排列，（1103）、将组培苗轻轻从培养瓶中拉出，洗净根部的培养基，用竹签在育苗袋中插个小洞，将组培苗根小心放入，将根理顺后 轻力压实。种植后浇足 定根水，以后7-10d内每2天淋一次水，保证空气湿度保持在90%左右，待植株有生长迹象后，浇水次数进一步减少，空气湿度逐渐降低，逐渐适应基质表面较干或上干下湿的状态，出育苗盘前适当控水控温。控制适应的生长温度25℃左右，培养过程中密切关注病虫害防治，（1104）、将变异株剔除，种植后部分苗会出现叶片形状不规则、叶片扭曲、植株变矮等不同情况的变异，要及时剔除，（1105）、小苗出圃，春植苗3-4月份出圃，秋植苗在9-10月份上旬出圃，出圃分级
项目 茎高（cm） 根条数 根直径（mm） 根长度（cm） 叶片数
1级 ≥8 ≥5 ≥4 ≥15 10-15
2级 ≥5 ≥4 ≥2 ≥12 6-8
选取标准：品种纯正，生长健壮，叶片浓绿、完整；无病虫害；根系发达，分布均匀，无腐烂现象，无变异。
将小苗连育苗盘一起并排放入包装箱中，不倒置，不挤压，运输时，运输工具清洁卫生，忌强光直射，注意通风保湿，严防压断茎叶。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种丹参组培快繁的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、选取供品系试验的温室大棚和试验地；
S2、对接种外植体进行选取；
S3、配制激素类母液备用；
S4、配制培养基备用；
S5、对培养基、接种室和超净工作台进行灭菌处理；
S6、对外植体进行灭菌处理；
S7、对已灭菌的外植体进行切割和接种；
S8、对接种后的外植体进行培养；
S9、将不定芽从愈伤中分离开，转接到相同培养基继续继代培养，并进行生根培养；
S10、选取品种纯正、健康、叶色浓绿、组织结实无玻璃化现象、无徒长现象、根系白且粗壮、有多条、无变异的培育苗；
S11、对选取的培育苗进行训苗。
2.根据权利要求1所述的一种丹参组培快繁的方法，其特征在于，根据S2中的操作步骤，取材前对植株的叶片大小形状、叶色、株型进行鉴定，确保该植株保持原有品种特性，选择丹参生长旺盛的温暖季节，晴朗天气，进行取材，选择生长健壮的植株，靠近茎尖部位的幼嫩叶片，取回后尽量3天内接种完。
3.根据权利要求1所述的一种丹参组培快繁的方法，其特征在于，根据S3中的操作步骤，包括以下步骤：
S301、用电子分析天平准确称取激素类药品NAA和6－BA各0.1g，NAA先用少量0.1mol∕LNaOH或95%酒精溶解；
S302、6－BA用0.1mol∕L的HCL溶解；
S303、将已溶解的激素类药品NAA和6－BA溶液分别加蒸馏水定容至100ml，即成浓缩至1mg∕ml的激素类母液。
4.根据权利要求1所述的一种丹参组培快繁的方法，其特征在于，根据S4中的操作步骤，所述培养基的配制包括以下步骤：
S401、按4.74 g/L比例，称取适量MS培养基粉末溶解于适量蒸馏水，按0.7%琼脂和3%蔗糖加入后加热至琼脂完全溶解，蒸馏水定容至所需体积，按培养基激素配比加入相应激素量，后用1mol/L NaOH溶液和1mol/L HCl溶液调节pH值，趁热分装至培养瓶中，养基体积占培养瓶的1/5-1/4，制得MS培养基；
S402、按2.47g/L比例 称取适量1/2 MS培养基粉末溶解于适量蒸馏水，按0.7%琼脂和3%蔗糖加入后加热至琼脂完全溶解，蒸馏水定容至所需体积，按培养基激素配比加入相应激素和容量，后用1mol/L NaOH溶液和1mol/L HCl溶液调节pH值，趁热分装至培养瓶中，培养基体积占培养瓶的1/5-1/4，制得1/2MS培养基。
5.根据权利要求1所述的一种丹参组培快繁的方法，其特征在于，根据S5中的操作步骤，包括以下步骤：
S501、培养基灭菌：将分装好的培养基，准备充足的蒸馏水和滤纸，一起放入高压灭菌锅内，进行高温高湿高压灭菌，121℃高压灭菌20分钟，备用；
S502、接种室灭菌：在接种前4h用甲醛与高锰酸钾混合薰蒸接种室，并打开紫外灯照射30min；
S503、超净工作台灭菌：正式接种前半小时左右，打开超净工作台上的紫外灯和风机，20-30min后接种。
6.根据权利要求1所述的一种丹参组培快繁的方法，其特征在于，根据S6中的操作步骤，从温室取回的叶片材料，经自来水冲洗干净，用肥皂、洗衣粉或吐温洗涤，用无菌水洗2-3次，放入工作台，倒入70%-75%的酒精中浸泡约30s，再在0．1％的升汞中浸泡5-10min，或在10％的漂白粉上溶液中浸泡10-15min，浸泡时可进行搅动，使植物材料与灭菌剂有良好的接触，然后用无菌水冲洗3-5次。
7.根据权利要求1所述的一种丹参组培快繁的方法，其特征在于，根据S7中的操作步骤，在超净工作台中，将已灭菌的外植体在无菌滤纸上吸干水分，用事先灭菌的手术刀和镊子切割成大小约0.5cm*0.5cm的材料，把培养材料叶片表面向下迅速放入培养瓶，每瓶接种8-10个小叶片，扎上瓶口，培养瓶上贴标签注明接种日期，放在培养室内培养，接种过程中，用火焰烧瓶口，转动瓶口使瓶口各部分都烧到，打开瓶盖，操作期间应经常用75％酒精擦拭工作台和双手，接种器械应反复在95％的酒精中浸泡和在火焰上灭菌，接种结束后，清理和关闭超净工作台。
8.根据权利要求1所述的一种丹参组培快繁的方法，其特征在于，根据S8中的操作步骤，不定芽诱导培养基，培养基组成为MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L，PH值为5.8，培养条件为光照时间10h/d，光照强度2000lx，培养温度 24-26℃，在20-30天，在叶片边缘出现愈伤和大量不定芽。
9.根据权利要求1所述的一种丹参组培快繁的方法，其特征在于，根据S9中的操作步骤，采用继代培养基对灭菌后的外植体进行培养，继代培养基组成为MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L，PH值为5.8，再采用生根培养基对外值体进行培养，生根培养基组成为1/2MS+ NAA0.1mg/L，20-30d后，待长出完整的根系。
10.根据权利要求1所述的一种丹参组培快繁的方法，其特征在于，根据S11中的操作步骤，包括以下步骤：
S1101、打开瓶口虚盖炼苗3天，组培苗适应后，完全开瓶口3天，组培苗完全适应外部环境；
S1102、将配制好的培养基质混合后装入育苗袋并压实，装到八成满后将育苗袋较紧密排列；
S1103、将组培苗轻轻从培养瓶中拉出，洗净根部的培养基，用竹签在育苗袋中插个小洞，将组培苗根小心放入，将根理顺后轻力压实培养；
S1104、将变异株剔除；
S1105、小苗出圃。
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