CN103609455B - 基于微扦插的非洲堇组织培养健壮苗优化生产方法 - Google Patents
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Abstract
一种植物再生技术领域的基于微扦插的非洲堇组织培养健壮苗优化生产方法，通过在非洲堇不定芽增殖阶段，在培养基中添加赤霉素，然后将所得组培苗通过瓶外扦插生根方法进行生根，本发明能够提高组培苗的高度及健壮程度以及组培苗的成活率，降低了生产成本，便于非洲堇组培苗的大量生产。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种植物再生技术领域的组织培养方法，具体是一种基于微扦插的非洲堇组织培养健壮苗优化生产方法。
背景技术
非洲堇（Saintpauliaionantha）又名非洲紫罗兰，是苦苣苔科（Gesneriaceae）非洲苦苣苔属（Saintpaulia）多年生草本植物。其花色艳丽，品种繁多，且开花期长，适宜在室内养殖，因此有“室内花卉皇后”的美称。非洲堇在荷兰、丹麦、德国、法国都有批量生产，在欧美已成为窗台植物，在超市中随时可买到。中国栽培非洲堇的历史不长，自20世纪80年代开始才从美国和荷兰引种试管苗。目前仅有少数中外合资园艺公司在小批量地生产，栽培尚不普遍，但发展前景很好。
非洲堇的工厂化生产主要依赖组织培养法进行。植物的组织培养是指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生完整植株的一种植物繁殖技术。非洲堇的组织培养一般分为3个阶段：不定芽诱导阶段、不定芽增殖壮苗阶段以及组培苗生根阶段。
由于非洲堇叶片自身的脱分化能力很强，在不定芽增殖壮苗阶段，经常可以发现一些叶片不及长大就发生了再分化的现象，如图1所示，严重影响了组培苗增殖阶段的成苗率。同时，由于非洲堇组培苗自身的增殖系数比较大，往往容易造成增殖小苗过多，对生长物质和生长空间的竞争比较严重，不仅造成培养基质的浪费，同时影响了组培苗的生长及壮苗，降低了有效苗的数量和品质，进而影响了后续扦插生根的成活率。
经过对现有技术的检索发现，何家涛报道利用MS培养基附加6-苄氨基嘌呤0.1～1.0mg/L、萘乙酸0.01～0.5mg/L、赤霉素0.1～1.0mg/L，对芽的生长及增殖效果好（西北农业学报，2006,15(1):173～175,179）。激素的种类、浓度和配比对植物组织培养扩大繁殖具有重要的作用。过高的激素浓度会增加再生植株的突变率。而非洲堇的染色体更容易发生突变。此报道中的激素范围较大，不够准确，无法用于非洲堇组培苗的实际大规模生产。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种基于微扦插的非洲堇组织培养健壮苗优化生产方法，在组培苗生根阶段采取了瓶外生根技术，是指无根试管苗不经瓶内生根过程，直接栽培于培养基中进行生根。相比传统的瓶内生根法，这种技术缩短了育苗周期，降低了生产成本的70%左右。本发明能够提高组培苗的高度及健壮程度以及组培苗的成活率，降低了生产成本。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明通过在非洲堇不定芽增殖阶段，在培养基中添加赤霉素，然后将所得组培苗通过瓶外扦插生根方法进行生根，本发明具体步骤如下：
1）增殖壮苗：将非洲堇无菌不定芽移入培养基中进行壮苗培养，得到组培苗；
所述的培养基每升中所含有的组分及含量为：MS培养基干粉4.4g/L、6-苄氨基嘌呤（6-BA）0.1-0.6mg/L、萘乙酸（NAA）0.1-0.3mg/L、赤霉素（GA3）1-2mg/L、蔗糖20-40mg/L以及吉兰糖胶（Gelrite）2.6g/L，余量为纯水。
2）前处理：无需炼苗，将组培苗直接从步骤1中的培养基中取出洗净后，整理并分成单株。
所述的组培苗是指：高度为1.5-2.5cm且最少带有四片展开叶子的培养后的壮苗。
所述的整理是指：剪除组培苗上坏死的叶片及其周边愈伤组织。
3）微扦插：将非洲堇单株直接扦插在湿润的蛭石上，保持温度为25±2℃，85%的空气湿度直至单株生根。
所述的步骤3）操作前优选先使用1‰高锰酸钾溶液对蛭石进行消毒，薄膜覆盖3小时，扦插前24小时用清水冲洗干净。
所述的步骤3）操作后优选进行喷雾压实，以使扦插苗和基质充分接触。
4）植后管理：在生根过程的前10天，用透明塑料薄膜进行覆盖保湿，实现健壮苗优化生产。
所述的保湿是指：当土表层干燥时采用喷雾方式浇水，生根之后慢慢揭去薄膜，早晚各喷水一次。
所述的步骤4）中优选每15天对生根苗使用25%多菌灵500倍液喷雾以防止病虫害。
技术效果
与现有技术相比，本发明技术效果包括：
抑制不定芽过高的增殖再生率的同时，提高了组培苗的高度及健壮程度，从而提高了移栽成活率。
抑制了叶片的脱分化过程，增加了有效苗的数量。
利用微扦插方法对组培苗进行生根诱导，降低了生产成本，缩短育苗周期，有利于扩大生产。
附图说明
图1为过度分化的非洲堇组培苗。
图2为在未添加GA的培养基非洲堇组培苗生长细弱。
图3为在添加GA的培养基上非洲堇组培苗生长强壮。
图4为实施例中组培苗的微扦插。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例包括以下步骤：
1）将生长至高约0.5cm以上的非洲堇不定芽丛从外植体上切下，移入培养基中培养。
所述的培养基的组分及含量为（每升）：MS培养基干粉（4.4g/L）、6-苄氨基嘌呤（0.1mg/L）、萘乙酸（0.1mg/L）、蔗糖（20mg/L）、吉兰糖胶（2.6g/L），在培养基中分别添加0mg/L、1mg/L以及2mg/L的赤霉素。
1.1）调整培养基的pH值至5.8，120℃高温灭菌20分钟。
1.2）在温度25±2℃，光照时间12h/d，光照度1500-2000lx的条件下进行培养，每隔20天换一次培养基。
1.3）培养50天后，统计组培苗高度和增殖系数。
结果显示，随着添加赤霉素浓度的升高，组培苗高度逐渐增加，但增殖系数有所下降。因此添加1mg/L的赤霉素最为适宜。
2）将高度在2cm左右，最少有四片展开叶的组培苗直接从培养瓶中取出，用清水洗净粘附的培养基，剪去老弱叶片和周围的愈伤组织，分成单株。
3）扦插之前，使用1‰高锰酸钾溶液对蛭石进行消毒，薄膜覆盖3小时，扦插前24小时用清水冲洗干净。采用直插法将非洲堇小苗扦插在湿润的蛭石上。
4）保持温度为25±2℃，85%的空气湿度。插完后进行喷雾压实，以使扦插苗和基质充分接触。在生根过程的前10天，用透明塑料薄膜进行覆盖保湿，待土表层稍干进行喷雾浇水，生根之后慢慢揭去薄膜，早晚各喷水一次。
为了防止病虫害，每15天对生根苗使用25%多菌灵500倍液喷雾。
如图4所示，组培苗7天左右就开始生根。且生根率在100%左右。
实施例2
本实施例包括以下步骤：
将高约1cm的非洲堇不定芽切下，在不定芽增殖培养基上继代培养。不定芽增殖所用的基本培养基为MS培养基，添加吉兰糖胶2.6g/L。选择6-苄氨基嘌呤/萘乙酸比例,赤霉素浓度以及蔗糖浓度三个因子，进行正交设计，因素水平见表1。
表1L9(34)因素水平表
根据因子水平表及L9(34)正交表，可以得到9种试验设计组合，具体设计见表2。
表2非洲堇叶片不定芽诱导L9(34)正交试验设计
每个培养皿放置9个外植体，试验设置3个重复。每隔20天换一次培养基，培养50天后统计不定芽的平均高度和有效不定芽丛（高度在1cm以上，最少有两片叶子展开）的数量，计算增殖系数，结果见表3。
表3不定芽再生L9(34)正交试验结果
统计高度在1cm以上，最少有两片叶子展开的不定芽数量，计算不定芽的增殖系数。直观分析的结果见表4。由三因素极差(R)可以看出，各试验因素对非洲堇增殖的影响结果如下：对于增殖系数来说，6-苄氨基嘌呤/萘乙酸的R值最大，为4.13；蔗糖浓度次之，为2.04；赤霉素浓度的R值最小，仅为1.61。因此，对于增殖系数来说，三因素影响顺序为：6-苄氨基嘌呤/萘乙酸＞蔗糖浓度＞赤霉素浓度。
表4增殖系数直观分析
计算不定芽的平均高度，直观分析的结果见表5。对于不定芽高度来说，赤霉素浓度和蔗糖浓度的R值都比较大，为0.53；6-苄氨基嘌呤/萘乙酸的R值相对较小，为0.32。因此，对于不定芽高度来说，三因素的影响顺序为：赤霉素浓度=蔗糖浓度＞6-苄氨基嘌呤/萘乙酸。
表5不定芽高度直观分析
将蛭石与草炭土按体积比1:1混合作为扦插基质。利用1‰高锰酸钾溶液对基质进行消毒，薄膜覆盖3小时，扦插前24小时用清水冲洗干净。
取高约2cm的不定芽进行扦插，插完后进行喷雾压实，以使扦插苗和基质充分接触。保持温度为25±2℃，85%的空气湿度。在生根过程的前10天，用透明塑料薄膜进行覆盖保湿，待土表层稍干进行喷雾浇水，生根之后慢慢揭去薄膜，早晚各喷水一次。每15天对生根苗使用25%多菌灵500倍液喷雾以防止病虫害的发生。
扦插后20～30天后，非洲堇扦插苗的生根率可高达100%。
Claims (1)
1.一种基于微扦插的非洲堇组织培养健壮苗生产方法，其特征在于，通过在非洲堇不定芽增殖阶段，在培养基中添加赤霉素，然后将所得组培苗通过瓶外扦插生根方法进行生根；
所述方法具体包括以下步骤：
1)增殖壮苗：将非洲堇无菌不定芽移入培养基中进行壮苗培养，得到组培苗；
2)前处理：无需炼苗，将组培苗直接从步骤1)中的培养基中取出洗净后，整理并分成单株；
3)微扦插：将非洲堇单株直接扦插在蛭石与草炭土按体积比1:1的混合基质上，保持温度为25±2℃，85％的空气湿度直至单株生根；
4)植后管理：在生根过程的前10天，用透明塑料薄膜进行覆盖保湿，实现健壮苗优化生产；
所述的培养基每升中所含有的组分及含量为：MS培养基干粉4.4g/L、6-苄氨基嘌呤0.1-0.6mg/L、萘乙酸0.1-0.3mg/L、赤霉素1-2mg/L、蔗糖20-40mg/L以及吉兰糖胶2.6g/L，余量为纯水；
所述的组培苗是指：高度为1.5-2.5cm且最少带有四片展开叶子的培养后的壮苗；
所述的步骤3)操作前先使用1‰高锰酸钾溶液对蛭石进行消毒，薄膜覆盖3小时，扦插前24小时用清水冲洗干净；
所述的步骤3)操作后进行喷雾压实，以使扦插苗和基质充分接触；
所述的保湿是指：当土表层干燥时采用喷雾方式浇水，生根之后慢慢揭去薄膜，早晚各喷水一次；
所述的步骤4)中每15天对生根苗使用25％多菌灵500倍液喷雾以防止病虫害。
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