CN105519440B

CN105519440B - 南洋楹无性系组织培养的方法

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Publication number: CN105519440B
Application number: CN201610012823.5A
Authority: CN
Inventors: 晏姝; 韦如萍; 胡德活; 王润辉; 郑会全
Original assignee: Guangdong Academy of Forestry
Current assignee: Guangdong Academy of Forestry
Priority date: 2016-01-05
Filing date: 2016-01-05
Publication date: 2017-12-05
Anticipated expiration: 2036-01-05
Also published as: CN105519440A

Abstract

本发明涉及一种南洋楹无性系组织培养的方法，该方法以南洋楹优良母树种子通过无菌育苗技术获得的无菌苗作为外植体或者采用南洋楹优良母树的萌芽条作为外植体，将外植体经过诱导培养、增殖培养、生根培养、炼苗以后，再移栽至育苗基质中培育。该方法对诱导增殖流程、培养基以及培养条件、炼苗等技术环节进行了优化。通过在诱导培养基中加入胞分裂素6‑BA，在增殖培养时先将组培苗通过28～35天自然散射光培养，将生根与炼苗结合进行，植株移栽时在晴天下午4点半以后或阴天移植，且对各培养基的组分进行优化等有效减少了幼苗玻璃化、黄化现象以及无效愈伤组织的产生，提高了增殖倍率以及成苗率，缩短培养周期，使苗木成活率达到90％以上。

Description

南洋楹无性系组织培养的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种南洋楹无性系组织培养的方法。

背景技术

南洋楹(Paraserianthes falcataria)是含羞草科(Mimosaceae)，属常绿乔木树种，种植后3～4年可成林，4～5年可利用,且根系具有结瘤固氮能力，可改良土壤、提高地力，是一个生态友好型的优良速生工业用材树种。我国南洋楹栽培面积已达3万余公顷，但现有栽培林分全部为实生苗造林，存在如下缺陷：(1)南洋楹种子主要依靠进口和在国内早期引种尚存的少量散生母树上采集，种子来源不清、品质良莠不齐、产量年份波动较大；(2)由于林木基因杂合程度高，南洋楹林分普遍存在生长速度不一、分枝数量与大小不一等分化问题。通过组织培养的方法可望快速满足市场对南洋楹良种种苗的需求，实现南洋楹造林的无性系化和良种化，显著提高南洋楹林分的生长量和木材质量，促进南洋楹相关产业可持续发展。

目前，南洋楹组织培养技术尚处于试验研究阶段，主要由于外植体采集困难、灭菌难度高、玻璃化及黄化现象严重、增殖倍数较低等瓶颈问题阻碍了其规模化繁殖。

发明内容

基于此，本发明提供了一种南洋楹无性系组织培养的方法，该方法能够减少幼苗玻璃化现象和无效愈伤组织的产生，有效提高增殖倍率以及成苗率，缩短培育周期，实现南洋楹无性系规模化繁殖。

具体技术方案如下：

一种南洋楹无性系组织培养的方法，包括以下步骤：

(1)获取外植体：采集南洋楹优良母树种子，通过无菌育苗技术获得无菌苗，以单株无菌苗作为外植体；或者采用南洋楹优良母树的根颈部位萌芽条作为外植体；

(2)诱导培养：将外植体分段切割，每段含1个顶芽或1～2个腋芽，接入诱导培养基诱导愈伤组织及芽分化产生不定芽，培养1个周期后切除基部老化愈伤组织继续转接，再培养一个周期，每个周期28～35天；

(3)增殖培养：将芽分化增殖与芽伸长增加腋芽数量增殖相结合，将步骤(2)的愈伤组织和不定芽直接转入增殖培养基，自然散射光培养28～35天后，转接，转为人工光源培养；

(4)生根培养：不定芽增长到3～5cm时，切下转入生根培养基，培养6～12天；

(5)炼苗：将培养瓶移到室外遮阴棚中闭瓶炼苗10～14天，边炼苗边生根，再揭去瓶盖注入清水，注入清水的量为覆盖培养基平面以上0.5～1.0cm，开盖炼苗2～5天；

(6)植株移栽：将炼苗后的小苗根部的培养基清洗干净后，于晴天下午的4点半以后或阴天移栽至育苗基质中，覆盖透明塑料薄膜，保湿，培育28～32天后除去塑料薄膜，让其继续生长；所述育苗基质为体积比为3～4：1的黄心土和泥碳土。

在其中一个实施例中，步骤(2)所述的诱导培养基由以下组分组成：MS培养基、0.4～1.0mg/L细胞分裂素6-BA、25～35g/L蔗糖、6～8g/L卡拉胶；所述诱导培养基的p H为5.6～6；培养条件为：温度20～30℃，每天光照14～18小时，光照的强度为1000～2000lx。

在其中一个实施例中，步骤(2)所述的诱导培养基由以下组分组成：MS培养基、0.5mg/L细胞分裂素6-BA、30g/L蔗糖、7g/L卡拉胶；所述诱导培养基的p H为5.8；培养条件为：温度28℃，每天光照16小时，光照的强度为1500lx。

在其中一个实施例中，步骤(3)将不定芽团转入增殖培养基时将长度大于1.0cm的芽体单独切下，并分段切割，每段含1个顶芽或1～2个腋芽。

在其中一个实施例中，步骤(3)所述增殖培养基由以下组分组成：MS培养基、0.1～0.3mg/L细胞分裂素6-BA、0.01～0.05mg/L萘乙酸、25～35g/L蔗糖、6～8g/L卡拉胶；所述育苗培养基的p H为5.6～6；培养温度为20～30℃，人工光源培养的光照强度为1000～2000lx，每天光照12～16小时。

在其中一个实施例中，步骤(3)所述增殖培养基由以下组分组成：MS培养基、0.2mg/L细胞分裂素6-BA、0.05mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖、7g/L卡拉胶；所述育苗培养基的p H为5.8，培养温度为28℃，人工光源培养的光照强度为1500lx，每天光照14小时。

在其中一个实施例中，步骤(4)所述生根培养基由以下组分组成：1/2MS培养基、0.1～0.5mg/L萘乙酸、0.1～0.5mg/L吲哚丁酸、20～30g/L蔗糖、6～8g/L卡拉胶；所述生根培养基的p H为5.6～6；培养温度为20～30℃。

在其中一个实施例中，步骤(4)所述生根培养基由以下组分组成：1/2MS培养基、0.2mg/L萘乙酸、0.2mg/L吲哚丁酸、25g/L蔗糖、7g/L卡拉胶；所述生根培养基的p H为5.8；培养温度为28～30℃。

在其中一个实施例中，步骤(5)所述闭瓶炼苗的时间为12天，注入清水的量为覆盖培养基平面以上1cm，开盖炼苗的时间为3天。

在其中一个实施例中，步骤(6)将炼苗后的小苗根部用浓度为5％的多菌灵清洗干净；所述保湿为保持湿度80～90％；除去塑料薄膜前，晴天需覆盖遮阴网；所述育苗基质为体积比为3：1的黄心土和泥碳土。

本发明的发明人经过长期的经验积累与实验研究，获得了本发明所述的南洋楹无性系组织培养的方法，该方法经过发明人长期的实验研究，对诱导增殖流程、培养基以及培养条件、炼苗等技术环节进行了优化。在诱导培养步骤中，在其培养基中加入高剂量细胞分裂素6-BA可以快速诱导愈伤组织及芽分化，同时使芽体内积累一定浓度的激素，可降低后续增殖培养过程中激素的使用量，减少幼苗玻璃化现象和无效愈伤组织的产生；增殖培养过程中将芽分化增殖与芽伸长增加腋芽数量增殖相结合，有效提高了增殖倍率，使增殖倍率提高到3.0以上；且在增殖培养时先将组培苗通过28～35天的自然散射光照，有效减少了玻璃化和黄化现象，苗色增绿；将生根与炼苗结合进行，可缩短培育周期，强化炼苗过程，经过本技术炼苗后的植株强壮、根长适宜、抗性增强，且苗木移栽的成活率显著提高；在植株移栽步骤中选择在晴天下午4点半以后移植或者阴天移植，可以有效提高移植苗的成活率，晴天下午4点半以后移植，其成活率达到早上的3倍。因此，本发明提供的南洋楹无性系组织培养的方法可以有效减少幼苗玻璃化、黄化现象以及无效愈伤组织的产生，提高增殖倍率以及成苗率，缩短培育周期，实现南洋楹无性系规模化繁殖。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步的阐述。

实施例1 南洋楹无性系组织培养的方法

本实施例的南洋楹无性系组织培养的方法，包括以下步骤：

1、获取外植体：在广东省博罗县林业科学研究所营建的引进南洋楹种源及家系试验林中，采集17年的优良母树的BLS16种子，通过无菌育苗技术获得无菌外植体。

2、诱导培养：选择1株生长健壮的无菌苗，苗高约3.0cm，切除根部后，切分为2段，其中一段含1个顶芽，另一段含2个腋芽，接入诱导培养基，培养35天后，切除基部老化愈伤组织继续转接，再培养30天。诱导培养基的成分为：MS培养基+细胞分裂素6-BA(0.5mg/L)+蔗糖(30g/L)+卡拉胶(7g/L)，p H值为5.8；培养条件为：温度28℃，每天光照16小时，光照的强度为1500lx。获得增殖芽12个，最长芽长度为5.0cm，幼嫩愈伤组织2团。

3、增殖培养：将芽分化增殖与芽伸长增加腋芽数量增殖相结合，将愈伤组织和不定芽直接转入增殖培养基，长度大于1.0cm的芽体单独切下，并分段切割，每段含1个顶芽或1～2个腋芽，接入增殖培养基。放置于培养室内可接收自然散射光的位置，控制温度约为28℃。培养30天后，转接，培养光源转为光照强度为1500lx的人工光源，每天光照14小时。增殖培养基的成分为：MS培养基+6-BA(0.2mg/L)+萘乙酸(NAA，0.05mg/L)+蔗糖(30g/L)+卡拉胶(7g/L)，pH值5.8。人工光源培养一个周期为20天，连续培养4个周期。每个周期得到的苗木苗径粗壮，叶片多，叶色绿，平均苗高为3.2cm，平均增殖率为4.1。

4、生根培养：不定芽增长到3～5cm时，切下转入生根培养基培养10天。生根培养基成分为：1/2MS培养基+NAA(0.2mg/L)+吲哚丁酸(IBA，0.2mg/L)+蔗糖(25g/L)+卡拉胶(7g/L)，p H值5.8。培养温度约28℃。

5、炼苗：将培养瓶移到室外遮阴蓬中闭瓶炼苗12天，边炼苗边生根，再揭去瓶盖注入清水(注水量为培养基平面以上1cm)，炼苗3天。所得植株强壮，抗风抗萎蔫性强，根系长度2～4cm，适宜移栽。

6、植株移栽：用浓度为5％的多菌灵清洗干净根部的培养基后，于晴天下午4点半后移栽至育苗基质中，育苗基质为体积比为3：1的黄心土和泥碳土，覆盖透明塑料薄膜，每天早晚用喷雾器喷水，保持湿度85％，晴天时需覆盖遮阴网。30天后除去塑料薄膜，室温培养，成苗率为90％。

实施例2 增殖培养基的成分浓度对增殖培养的影响

本实施例的南洋楹无性系组织培养的方法，除了步骤2中增殖培养基部分成分的浓度外，其它均与实施例1相同，本实施例与实施例1的增殖培养基的区别如表1所示：

表1 增殖培养基中6-BA，NAA，蔗糖的浓度

试验号	6-BA(mg/L)	NAA(mg/L)	蔗糖(g/L)
				实施例2a	0.1	0.01	25
实施例2b	0.15	0.03	30
				实施例1	0.2	0.05	30
实施例2c	0.3	0	25
				实施例2d	0.4	0.02	25
实施例2e	0.5	0.04	30

自然散射光培养30天后，再人工光源培养20天，不同6-BA以及NAA的浓度、碳源配比对南洋楹无性系芽的增殖倍数和长势的影响情况见表2。

表2 增殖培养基对无性系芽增殖结果的影响

从表2可见，随着6-BA浓度的增加，增殖倍数呈先增大后降低的趋势，而苗径组织成熟度减低、苗色变黄，可见，高6-BA浓度是导致苗木玻璃化的主要因素，增殖培养过程中6-BA浓度应控制在0.1-0.3mg/L。最佳增殖培养基配方为：MS培养基+6-BA(0.2mg/L)+NAA(0.05mg/L)+蔗糖(30g/L)+卡拉胶(7g/L)，p H值5.8，该条件下，自然散射光培养30天，再人工光源培养20天后，增殖倍数即可达4.1，平均苗高3.2cm，苗木健壮。

实施列3 自然光照对增殖培养的影响

本实施例的南洋楹无性系组织培养的方法，除了步骤2中增殖培养的光照条件不同，其它均与实施例1相同。本实施例的增殖培养步骤中，未经自然散射光培养，直接采用人工光源进行培养，光照强度为1500lx，每天光照14小时，培养20天后苗木玻璃化现象明显，且丛生芽的伸长受到抑制，叶片黄化、落叶枯萎。而实施例1先经过自然散射光培养，再用人工光源的培养方法极少出现玻璃化现象，苗径较粗壮，叶片较多，叶色较绿。

实施例4 炼苗对苗木成活率的影响

本实施例的南洋楹无性系组织培养的方法，包括以下步骤：

1、获取外植体：同实施例1的步骤1；

2、诱导培养：同实施例1的步骤2；

3、增殖培养：同实施例1的步骤3；

4、生根培养：不定芽增长到3～5cm时，切下转入生根培养基，培养35天。所得植株细弱，见风极易萎蔫，且根系长短不一。生根培养基成分为：1/2MS培养基+NAA(0.2mg/L)+吲哚丁酸(IBA，0.2mg/L)+蔗糖(25g/L)+卡拉胶(7g/L)，p H值5.8。培养温度约28℃。

5、植株移栽：同实施例1的步骤6。成苗率为60％。

由此可见，实施例1中的炼苗步骤将生根与炼苗结合进行，可缩短培育周期，苗木移栽成活率显著提高，且植株强壮、根长适宜，抗性增强。

实施例5 移栽时间对苗木成活率的影响

本实施例的南洋楹无性系组织培养的方法，除步骤5植株移栽的时间与实施例1不同，其它均与实施例1相同。本实施例植株移栽的时间为晴天上午9点左右，结果发现，苗木成活率不足30％，远远低于实施例1中的90％。这是由于南洋楹生根苗枝叶旺盛，移栽时若经过阳光直射，极易出现过度失水枯萎，从而降低移栽苗木的成活率，而下午4点半以后无阳光直射，并经过12小时以上的缓苗期，苗木水分得到保持，成活率显著提高。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种南洋楹无性系组织培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)获取外植体：采集南洋楹优良母树种子，通过无菌育苗技术获得无菌苗，以单株无菌苗作为外植体；或者采用南洋楹优良母树的根颈部位的萌芽条作为外植体；

(2)诱导培养：将外植体分段切割，每段含1个顶芽或1～2个腋芽，接入诱导培养基诱导愈伤组织和不定芽，培养1个周期后切除基部老化愈伤组织继续转接，再培养一个周期，每个周期28～35天；所述诱导培养基由以下组分组成：MS培养基、0.4～1.0mg/L细胞分裂素6-BA、25～35g/L蔗糖、6～8g/L卡拉胶；所述诱导培养基的p H为5.6～6；

(3)增殖培养：将芽分化增殖与芽伸长增加腋芽数量增殖相结合，将步骤(2)的愈伤组织和不定芽直接转入增殖培养基，自然散射光培养28～35天后，转接，转为人工光源培养；所述增殖培养基由以下组分组成：MS培养基、0.1～0.3mg/L细胞分裂素6-BA、0.01～0.05mg/L萘乙酸、25～35g/L蔗糖、6～8g/L卡拉胶；所述增殖培养基的p H为5.6～6；

2.根据权利要求1所述的南洋楹无性系组织培养的方法，其特征在于，步骤(2)所述培养的条件为：温度20～30℃，每天光照14～18小时，光照的强度为1000～2000lx。

3.根据权利要求2所述的南洋楹无性系组织培养的方法，其特征在于，步骤(2)所述的诱导培养基由以下组分组成：MS培养基、0.5mg/L细胞分裂素6-BA、30g/L蔗糖、7g/L卡拉胶；所述诱导培养基的p H为5.8；培养条件为：温度28℃，每天光照16小时，光照的强度为1500lx。

4.根据权利要求1-3任一项所述的南洋楹无性系组织培养的方法，其特征在于，步骤(3)将不定芽团转入增殖培养基时将长度大于1.0cm的芽体单独切下，并分段切割，每段含1个顶芽或1～2个腋芽。

5.根据权利要求1-3任一项所述的南洋楹无性系组织培养的方法，其特征在于，步骤(3)所述培养的温度为20～30℃，人工光源培养的光照强度为1000～2000lx，每天光照12～16小时。

6.根据权利要求5所述的南洋楹无性系组织培养的方法，其特征在于，步骤(3)所述增殖培养基由以下组分组成：MS培养基、0.2mg/L细胞分裂素6-BA、0.05mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖、7g/L卡拉胶；所述育苗培养基的p H为5.8，培养温度为28℃，人工光源培养的光照强度为1500lx，每天光照14小时。

7.根据权利要求1-3任一项所述的南洋楹无性系组织培养的方法，其特征在于，步骤(4)所述生根培养基由以下组分组成：1/2MS培养基、0.1～0.5mg/L萘乙酸、0.1～0.5mg/L吲哚丁酸、20～30g/L蔗糖、6～8g/L卡拉胶；所述生根培养基的p H为5.6～6；培养温度为20～30℃。

8.根据权利要求7所述的南洋楹无性系组织培养的方法，其特征在于，步骤(4)所述生根培养基由以下组分组成：1/2MS培养基、0.2mg/L萘乙酸、0.2mg/L吲哚丁酸、25g/L蔗糖、7g/L卡拉胶；所述生根培养基的p H为5.8；培养温度为温度28～30℃。

9.根据权利要求1-3任一项所述的南洋楹无性系组织培养的方法，其特征在于，步骤(5)所述闭瓶炼苗的时间为12天，注入清水的量为覆盖培养基平面以上1cm，开盖炼苗的时间为3天。

10.根据权利要求1-3任一项所述的南洋楹无性系组织培养的方法，其特征在于，步骤(6)将炼苗后的小苗根部用浓度为5％的多菌灵清洗干净；所述保湿为保持湿度80～90％；除去塑料薄膜前，晴天需覆盖遮阴网；所述育苗基质为体积比为3：1的黄心土和泥碳土。