CN113207686A - 一种基于种皮愈伤组织分化的香椿再生技术 - Google Patents

一种基于种皮愈伤组织分化的香椿再生技术 Download PDF

Info

Publication number
CN113207686A
CN113207686A CN202110435132.7A CN202110435132A CN113207686A CN 113207686 A CN113207686 A CN 113207686A CN 202110435132 A CN202110435132 A CN 202110435132A CN 113207686 A CN113207686 A CN 113207686A
Authority
CN
China
Prior art keywords
callus
culture medium
seed coat
culture
under
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110435132.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113207686B (zh
Inventor
王友如
艾薇
李玲
黄蓉
邱正明
刘军
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hubei Normal University
Original Assignee
Hubei Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hubei Normal University filed Critical Hubei Normal University
Priority to CN202110435132.7A priority Critical patent/CN113207686B/zh
Publication of CN113207686A publication Critical patent/CN113207686A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113207686B publication Critical patent/CN113207686B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/001—Culture apparatus for tissue culture

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于种皮愈伤组织分化的香椿再生技术，其特征在于包括无菌种子获得、种皮愈伤组织的诱导、种皮愈伤组织的生长、种皮愈伤组织的分化、幼苗生根诱导培养、炼苗、移栽等步骤，本发明通过采用创造性的工艺步骤、技术参数等因素，能够获得97.5％以上的生根苗成活率。本发明至少具有下列有益效果：①繁殖系数高、速度快；②能实现良种规模化生产，满足大棚或温室栽培需要；③能保持原优质品系全部的遗传特性、实现该品种种质的一致性、便于推广栽培优良品种；④香椿功能基因研究和转基因分子育种提供了技术支撑。本发明具有良好的应用价值。

Description

一种基于种皮愈伤组织分化的香椿再生技术
【技术领域】
本发明涉及植物的再生技术，特别是一种基于种皮愈伤组织分化的香椿再生技术。
【背景技术】
香椿(Toona sinensis(A.Juss)Roem)，楝科(Meliaceae)香椿属(Toona Roem)，多年生落叶大乔木，中国特有树种，是我国传统菜用木本蔬菜，其嫩芽清香宜人，营养丰富，医膳兼用，居名特优蔬菜之首，为千家万户所珍爱。嫩芽生长过程中分泌驱虫物质，无农药污染，为名符其实的绿色食品，香椿嫩芽化学成分和营养物质丰富，其食用、营养和药用价值极高，是典型的“药食同源”木本蔬菜，国外称为“中国绿色保健蔬菜”。
由于香椿具有重要的食用、营养、药用、经济价值，我国很多地方已开始大面积栽培。香椿种子是一个高度杂合体，优质香椿种子数量有限。现有技术中，种子繁殖后代单株之间出现严重的性状分离，后代通过扦插育苗、埋根、分蘖等方法繁殖系数低、速度慢，这些繁殖方法不利于快速繁殖、推广栽培优良品种。建立无性快速繁殖技术体系，保持原优质品系全部的遗传特性，实现该品种种质的一致性，是香椿种苗研究中急需解决的技术问题。
以优质红香椿种子的种皮为研究对象，研究多种不同因素对香椿种皮愈伤组织诱导、分化的影响，建立基于香椿种皮愈伤组织的诱导、再生、生根培养和炼苗移栽等植株高效快速再生技术体系，为香椿的生物技术改良和优良品系的快速繁殖奠定基础。本技术为快繁名贵优良香椿品种，实现良种规模化生产，满足大棚或温室栽培需要，加快优质香椿品种的应用提供了强有力技术支撑。
【发明内容】
本发明的目的是克服现有技术中的上述缺陷，提供一种繁殖系数高、速度快、能保持原优质品系全部的遗传特性、实现该品种种质的一致性、便于推广栽培优良品种的基于种皮愈伤组织分化的香椿再生技术。
为实现上述目的，本发明提供的一种基于种皮愈伤组织分化的香椿再生技术，其特征在于包括如下步骤：
1)无菌种子获得：香椿种子去翅后，用清水冲洗1-2h后，浸泡于无菌水中12h，再用70％医用酒精浸泡3-5min，后用无菌水冲洗3-5次，沥干表面水分；
2)种皮愈伤组织的诱导：将步骤1)处理后的种子在诱导培养基中，在黑暗、温度24℃、空气湿度70％条件下，培养1w后，移至空气湿度70％、光照13h/黑暗11h、光照温度26℃/黑暗温度24℃、光照强度10-20μmol photons/m2/s的培养条件下，每2w继代一次，得到种皮愈伤组织，即愈伤组织Ⅰ；
3)种皮愈伤组织的生长：将步骤2)中的愈伤组织I继代至愈伤生长培养基中，在空气湿度70％、在光照13h/黑暗11h，光照温度25℃/黑暗温度23℃，光照强度30-50μmolphotons/m2/s条件下，生长形成松散愈伤组织，即愈伤组织Ⅱ；
4)种皮愈伤组织的分化：将步骤3)中的愈伤组织Ⅱ移至装有愈伤组织分化培养基的容器中，用膜封口，在光照13h/黑暗11h，光照温度27℃/黑暗温度25℃，光照强度40-60μmol photons/m2/s条件下，每隔2w继代一次，先形成不定芽，然后形成再生植株；
5)幼苗生根诱导培养：将步骤4)中的3-5cm的再生植株，清除茎基部愈伤组织，将茎基部垂直插入生根培养基中，在空气湿度70％，光照13h/黑暗11h，光照温度27℃/黑暗温度25℃，光照强度40-60μmol photons/m2/s条件下，用膜将培养容器封口培养1w后，清理再生植株茎部叶片，只留下2-3片，茎基部用刀片垂直横切后，在200mg/L IBA溶液中浸泡10-15min，沥干后，茎基部垂直插入生根培养基，同条件下培养，形成香椿幼苗；
6)炼苗：选择株高3-4cm，展开叶5-7片的香椿幼苗，培养容器在室外自然条件下放置2d后，揭开培养瓶封口膜，练苗4-5d后，移栽；
7)移栽：冲洗干净香椿幼苗根部，移栽到蛭石、泥炭、珍珠岩质量比为3：1：1混合的基质中，用遮阳网遮阴并保持空气湿度在70-80％，7-10d后去掉遮阳网，遮阳期间用40％多菌灵悬浮剂用无菌水按体积稀释800-1000倍后定期喷洒杀菌1次/周，共计2-3次；
所述MS培养基、MMS培养基均含有成分为大量元素KNO3、NH4NO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4、CaCl2·2H2O；微量元素MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、H3BO3、KI、Na2MoO4·7H2O、CuSO4.5H2O、CoCl2.6H2O；铁盐Na2-EDTA、FeSO4.4H2O；有机物甘氨酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫铵素、烟酸、肌醇；碳源蔗糖；
所述MS培养基中上述成分浓度(mg/L)依次为1900、1650、370、170、440、22.3、8.6、6.2、0.83、0.25、0.025、0.025、74.6、55.6、2.0、0.5、0.1、0.5、100、30000；
所述MMS培养基中上述成分浓度(mg/L)依次为2100、1430、270、150、320、12、5.7、4.2、0.5、0.2、0.025、0.025、37.3、27.8、1.5、0.5、0.15、0.6、80、30000；
所述1/2MS培养基中，所述成分大量元素浓度均为MS培养基的1/2，其余成分浓度与MS培养基相同；
所述3/4MS培养基中，所述成分大量元素浓度均为MS培养基的3/4，其余成分浓度与MS培养基相同；
所述诱导培养基为MMS+0.01mg/LTDZ+0.3mg/L IAA+0.01mg/L 2，4-D+质量百分比3％蔗糖+质量百分比0.8％琼脂；所述愈伤生长培养基为MMS+0.5mg/L6-BA+0.1mg/L 2，4-D+质量百分比3％蔗糖+质量百分比0.8％琼脂；所述愈伤组织分化培养基为3/4MS+1.5mg/L6-BA+0.001mg/L TDZ+0.1mg/L IAA+质量百分比3％蔗糖+质量百分比0.8％琼脂；所述生根培养基为1/2MS+质量百分比3％蔗糖+质量百分比0.8％琼脂。
本发明至少具备以下有益效果：①繁殖系数高、速度快；②能实现良种规模化生产，满足大棚或温室栽培需要；③能保持原优质品系全部的遗传特性、实现该品种种质的一致性、便于推广栽培优良品种；④香椿功能基因研究和转基因分子育种提供了技术支撑。
【附图说明】
图1为种皮愈伤组织(箭头所指)图；
图2为在愈伤组织生长培养基中培养2周的种皮愈伤组织图；
图3为愈伤组织在分化培养基中培养2周后形成的不定芽图；
图4为愈伤组织分化培养基培养3-4周后形成的叶片图；
图5为再生植株图。
【具体实施方式】
为了更好地理解本发明，下面结合附图，详细描述实施例。应理解，本实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的范围。
除特别说明外，本实施例所采用的技术手段为本领域的常规技术手段。
实施例1本发明方法实施例之一
1)无菌种子获得
香椿种子去翅后，用清水冲洗1h后，浸泡于无菌水中12h，再用70％医用酒精浸泡3min，后用无菌水冲洗5次，在无菌滤纸上沥干种子表面水分，备用；
2)种皮愈伤组织的诱导
上述步骤中的种子在诱导培养基(基本培养基MMS+0.01mg/LTDZ+0.3mg/L IAA+0.01mg/L 2，4-D+质量百分比的3％蔗糖+质量百分比0.8％琼脂)中，在黑暗、温度24℃、空气湿度70％条件下，培养1w后，移至空气湿度70％、光照13h/黑暗11h、光照温度26℃/黑暗温度24℃、光照强度10-20μmol photons/m2/s的培养条件下，每2w继代一次。2w后，种皮愈伤组织开始形成，愈伤组织呈现白色为主捎带少许绿色、松散状(图1，图中箭头所示)，愈伤组织诱导率100％。在本条件下诱导后培养了4w的愈伤组织备用；
3)种皮愈伤组织的生长
将上述步骤中的愈伤组织继代至愈伤生长培养基(基本培养基MMS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L 2，4-D+质量百分比3％的蔗糖+质量百分比0.8％的琼脂)中，在空气湿度70％、在光照13h/黑暗11h，光照温度25℃/黑暗温度23℃，光照强度30-40μmol photons/m2/s条件下，生长1-2w形成松散愈伤组织(大约20-30％的松散愈伤组织呈现绿色、70-80％的松散愈伤组织呈现淡黄色)(图2)，备用；
4)种皮愈伤组织的分化
将上述步骤中的松散愈伤组织移至含有愈伤组织分化培养基(3/4MS+1.5mg/L 6-BA+0.001mg/L TDZ+0.1mg/L IAA+质量百分比3％的蔗糖+质量百分比0.8％的琼脂)的培养瓶中，用膜封口，在光照13h/黑暗11h，光照温度27℃/黑暗温度25℃，光照强度40-50μmolphotons/m2/s条件下，每隔2w继代一次；愈伤组织在分化培养基中培养2-3w后，不定芽开始分化形成(图3)，一个愈伤组织一般可形成4-6个丛芽(图4)，第6-7周，茎逐步伸长生长，再生茎生长出复叶(图5)；愈伤组织分化率95％以上。生长到3-5cm的再生植株备用于生根诱导(图5)；
5)幼苗生根诱导培养
将上所述条件下3-5cm的再生植株，清除茎基部愈伤组织，将茎基部垂直插入生根培养基(1/2MS+质量百分比3％的蔗糖+质量百分比0.8％的琼脂)中，在空气湿度70％，光照13h/黑暗11h，光照温度27℃/黑暗温度25℃，光照强度40-50μmol photons/m2/s条件下，用膜将培养容器封口培养1w后，清理再生植株茎部叶片，只留下2-3片，茎基部用刀片垂直横切后，在200mg/L IBA溶液中浸泡10min，沥干后，茎基部垂直插入生根培养基，,在空气湿度70％，光照13h/黑暗11h，光照温度27℃/黑暗温度25℃，光照强度40-50μmol photons/m2/s条件下，培养1-2w后，茎基部开始形成不定根，2-3w后，茎基部形成不定根3-7条；再生植株生根率100％；
6)炼苗
待香椿幼苗在生根培养基中生长3w后，选择株高3-4cm，展开叶5-7片的植株，培养瓶在室外自然条件下放置2d后，揭开培养瓶封口膜，练苗4d后，移栽；
7)移栽
清除香椿幼苗根部周围琼脂后，用自来水冲洗干净再生植株根部的培养基，移栽到蛭石、泥炭、珍珠岩质量比为3：1：1混合的基质中，用遮阳网遮阴并保持空气湿度在80％，7d后去掉遮阳网，遮阳期间用40％多菌灵悬浮剂用无菌水按体积稀释800倍后定期喷洒杀菌1次/周，共计3次，生根苗成活率达97.7％。
实施例2本发明方法实施例之二
本实施例与实施例1操作步骤一样，区别仅在于各参数有所不同，具体如下：
1)无菌种子获得
香椿种子去翅后，用清水冲洗2h后，浸泡于无菌水中12h，再用70％医用酒精浸泡5min，后用无菌水冲洗3次，在无菌滤纸上沥干种子表面水分，备用；
2)种皮愈伤组织的诱导
上述步骤中的种子在诱导培养基(同实施例1)中，在黑暗、温度24℃、空气湿度70％条件下，培养1w后，移至空气湿度70％、光照13h/黑暗11h、光照温度26℃/黑暗温度24℃、光照强度10-20μmol photons/m2/s的培养条件下，每2w继代一次。2w后，种皮愈伤组织开始形成，愈伤组织呈现白色为主捎带少许绿色、松散状，愈伤组织诱导率100％；在本条件下诱导后培养了4w的愈伤组织备用；
3)种皮愈伤组织的生长
将上述步骤中的愈伤组织继代至愈伤生长培养基(同实施例1)中，在空气湿度70％、在光照13h/黑暗11h，光照温度25℃/黑暗温度23℃，光照强度40-50μmol photons/m2/s条件下，生长1-2w形成松散愈伤组织(大约20-30％的松散愈伤组织呈现绿色、70-80％的松散愈伤组织呈现淡黄色)，备用；
4)种皮愈伤组织的分化
将上述步骤中的松散愈伤组织移至含有愈伤组织分化培养基(同实施例1)的培养瓶中，用膜封口，在光照13h/黑暗11h，光照温度27℃/黑暗温度25℃，光照强度50-60μmolphotons/m2/s条件下，每隔2w继代一次。愈伤组织在分化培养基中培养2-3w后，不定芽开始分化形成，一个愈伤组织一般可形成4-6个丛芽，第6-7周，茎逐步伸长生长，再生茎生长出复叶；愈伤组织分化率95％以上。生长到3-5cm的再生植株备用于生根诱导；
5)幼苗生根诱导培养
将上所述条件下3-5cm的再生植株，清除茎基部愈伤组织，将茎基部垂直插入生根培养基(同实施例1)中，在空气湿度70％，光照13h/黑暗11h，光照温度27℃/黑暗温度25℃，光照强度40-50μmol photons/m2/s条件下，用膜将培养容器封口培养1w后，清理再生植株茎部叶片，只留下2-3片，茎基部用刀片垂直横切后，在200mg/L IBA溶液中浸泡15min，沥干后，茎基部垂直插入生根培养基，,在空气湿度70％，光照13h/黑暗11h，光照温度27℃/黑暗温度25℃，光照强度40-50μmol photons/m2/s条件下，培养1-2w后，茎基部开始形成不定根，2-3w后，茎基部形成不定根3-7条；再生植株生根率100％；
6)炼苗
待香椿幼苗在生根培养基中生长4w后，选择株高3-4cm，展开叶5-7片的植株，培养瓶在室外自然条件下放置2d后，揭开培养瓶封口膜，练苗4d后，移栽；
7)移栽
清除香椿幼苗根部周围琼脂后，用自来水冲洗干净再生植株根部的培养基，移栽到蛭石、泥炭、珍珠岩质量比为3：1：1混合的基质中，用遮阳网遮阴并保持空气湿度在80％，7-10d后去掉遮阳网，遮阳期间用40％多菌灵悬浮剂用无菌水按体积稀释1000倍后定期喷洒杀菌1次/周，共计2次，生根苗成活率达97.5％。
实施例3本发明方法实施例之三
本实施例与实施例1或2操作步骤一样，区别仅在于各参数有所不同，具体如下：
1)无菌种子获得
香椿种子去翅后，用清水冲洗1.5h后，浸泡于无菌水中12h，再用70％医用酒精浸泡4min，后用无菌水冲洗3次，在无菌滤纸上沥干种子表面水分，备用；
2)种皮愈伤组织的诱导
上述步骤中的种子在诱导培养基(同实施例1)中，在黑暗、温度24℃、空气湿度70％条件下，培养1w后，移至空气湿度70％、光照13h/黑暗11h、光照温度26℃/黑暗温度24℃、光照强度10-20μmol photons/m2/s的培养条件下，每2w继代一次。2w后，种皮愈伤组织开始形成，愈伤组织呈现白色为主捎带少许绿色、松散状，愈伤组织诱导率100％；在本条件下诱导后培养了4w的愈伤组织备用；
3)种皮愈伤组织的生长
将上述步骤中的愈伤组织继代至愈伤生长培养基(同实施例1)中，在空气湿度70％、在光照13h/黑暗11h，光照温度25℃/黑暗温度23℃，光照强度40-50μmol photons/m2/s条件下，生长1-2w形成松散愈伤组织(大约20-30％的松散愈伤组织呈现绿色、70-80％的松散愈伤组织呈现淡黄色)，备用；
4)种皮愈伤组织的分化
将上述步骤中的松散愈伤组织移至含有愈伤组织分化培养基(同实施例1)的培养瓶中，用膜封口，在光照13h/黑暗11h，光照温度27℃/黑暗温度25℃，光照强度50-60μmolphotons/m2/s条件下，每隔2w继代一次。愈伤组织在分化培养基中培养2-3w后，不定芽开始分化形成，一个愈伤组织一般可形成4-6个丛芽，第6-7周，茎逐步伸长生长，再生茎生长出复叶；愈伤组织分化率95％以上。生长到3-5cm的再生植株备用于生根诱导；
5)幼苗生根诱导培养
将上所述条件下3-5cm的再生植株，清除茎基部愈伤组织，将茎基部垂直插入生根培养基(同实施例1)中，在空气湿度70％，光照13h/黑暗11h，光照温度27℃/黑暗温度25℃，光照强度50-60μmol photons/m2/s条件下，用膜将培养容器封口培养1w后，清理再生植株茎部叶片，只留下2-3片，茎基部用刀片垂直横切后，在200mg/L IBA溶液中浸泡12min，沥干后，茎基部垂直插入生根培养基，,在空气湿度70％，光照13h/黑暗11h，光照温度27℃/黑暗温度25℃，光照强度50-60μmol photons/m2/s条件下，培养1-2w后，茎基部开始形成不定根，2-3w后，茎基部形成不定根3-7条；再生植株生根率100％；
6)炼苗
待香椿幼苗在生根培养基中生长3w后，选择株高3-4cm，展开叶5-7片的植株，培养瓶在室外自然条件下放置2d后，揭开培养瓶封口膜，练苗4d后，移栽；
7)移栽
清除香椿幼苗根部周围琼脂后，用自来水冲洗干净再生植株根部的培养基，移栽到蛭石、泥炭、珍珠岩质量比为3：1：1混合的基质中，用遮阳网遮阴并保持空气湿度在75％，8d后去掉遮阳网，遮阳期间用40％多菌灵悬浮剂用无菌水按体积稀释900倍后定期喷洒杀菌1次/周，共计3次，生根苗成活率达97.6％。
实施例4对比实施例之一
1)无菌苗的获得
先用实施例1中步骤1)的方法获得无菌种子，后将种子置于含质量百分比0.8％琼脂的MS培养基中，在空气湿度70％，光照13h/黑暗11h，光照温度26℃/黑暗温度24℃，光照强度40-60μmol photons/m2/s的培养条件下，连续培养3w，香椿种子萌发生长出无菌幼苗；
2)外植体的获得
将上述步骤中获得的香椿无菌幼苗的根茎叶分别作为外植体。将叶片切成1.5毫米见方的小块、将茎和根切成1.5毫米长，分别作为外植体，置于诱导培养基中；
3)愈伤组织的诱导
上述步骤中的外植体按照实施例1步骤2)的条件。第4w外植体愈伤组织开始形成，呈现绿色、质地坚硬，2w后，将愈伤组织移至愈伤组织生长培养基中继代培养；
4)愈伤组织的生长
将上述步骤中的愈伤组织按照实施例1步骤3)的条件生长1-2w。生长2w后，愈伤组织褐化现象严重；
5)愈伤组织分化培养
将上述步中生长了1-2w的愈伤组织按照实施例1步骤4)的条件继代。3w后，愈伤组织与培养基接触部分开始褐化，7-8w后基部愈伤组织80-90％褐化，连续6代以上，不能分化出不定芽。
本实施例说明，以香椿种子繁殖的无菌根茎叶为为外植体，利用本发明的愈伤组织诱导条件、愈伤组织生长条件、愈伤组织分化条件，不能诱导愈伤组织分化，即不能诱导植株的再生。
实施例5对比实施例之二
1)无菌外植体的获得
挑选自然状态下生长的健壮香椿幼叶，用清水冲洗30min后，1％次氯酸钠处理1.5min，后用70％酒精处理3min，再用无菌水清洗4～5次后，切成1.5毫米见方的小块，作为外植体，置于诱导培养基中；
2)愈伤组织的诱导
上述步骤中的外植体按照实施例1步骤2)的条件处理。2-3w外植体愈伤组织开始形成，呈现绿色、质地坚硬，4w后，将愈伤组织移至愈伤组织生长培养上继代培养；
3)愈伤组织的生长
将上述步骤中的愈伤组织按照实施例1步骤3)的条件，生长2w后，愈伤组织褐化现象严重；
4)愈伤组织分化培养
将上述条件下生长了2-4w的愈伤组织按照实施例1步骤4)的条件继代，1w后，愈伤组织与培养基接触部分开始褐化，3w后基部愈伤组织全部褐化，连续继代6代以上，愈伤组织不能分化出不定芽。
本实施例说明，以自然生长状态的香椿茎叶消毒后作为外植体，利用本发明的愈伤组织诱导条件、愈伤组织生长条件、愈伤组织分化条件，不能诱导愈伤组织分化，即不能诱导植株的再生。
实施例6对比实施例之三
1)无菌种子的获得
将香椿种子用清水冲洗1-2h后，浸泡于无菌水中12h，再用70％医用酒精浸泡3-5min，后用无菌水冲洗3-5次，在无菌滤纸上沥干种子表面水分；
2)种皮愈伤组织的诱导
每皿接种10粒种子，每次处理4皿，重复3次，按照现有技术1(许丽琼，涂炳坤.香椿叶片组织培养和快繁技术的研究[J].湖北农业科学，2007，46(1):24-26)中记载的方法，将种子在MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L KT+0.5mg/L NAA+质量百分比的3％蔗糖+质量百分比0.8％中，在黑暗23℃、空气湿度70％条件下，培养1w后，移至空气湿度70％，光照13h/黑暗11h，光照温度26℃/黑暗温度24℃，光照强度10-20μmol photons/m2/s的培养条件下，每隔两周继代一次。连续继代3-4代，种皮部分无法形成愈伤组织。
本实施例说明，按照上述现有技术1中记载的愈伤组织诱导条件，不能诱导种皮愈伤组织的形成。
实施例7对比实施例之四
1)无菌种子的获得
将香椿种子用清水冲洗1-2h后，浸泡于无菌水中12h，再用70％医用酒精浸泡3-5min，后用无菌水冲洗3-5次，在无菌滤纸上沥干种子表面水分；
2)种皮愈伤组织的诱导
每皿接种10粒种子，每次处理4皿，重复3次，30d后统计愈伤组织诱导率。按照现有技术2(王春林，杨群英，薛爱红，王远程.香椿组织培养与快速繁殖的研究[J].园艺学报,1994,21(4):406-407)中记载的方法，将种子在B5+2.5mg/L 6-BA+2.5mg/L NAA+质量百分比的3％蔗糖+质量百分比0.8％中，在黑暗23℃、空气湿度70％条件下，培养1w后，移至空气湿度70％，光照13h/黑暗11h，光照温度26℃/黑暗温度24℃，光照强度10-20μmol photons/m2/s的培养条件下，每隔两周继代一次。每隔两周继代一次。连续继代3-4代，种皮部分无法形成愈伤组织。
本实施例说明，按照上述现有技术2中记载的愈伤组织诱导条件，不能诱导种皮愈伤组织的形成。
实施例8对比实施例之五
1)无菌种子的获得
将香椿种子用清水冲洗1-2h后，浸泡于无菌水中12h，再用70％医用酒精浸泡3-5min，后用无菌水冲洗3-5次，在无菌滤纸上沥干种子表面水分；
2)种皮愈伤组织的诱导
每皿接种10粒种子，每次处理4皿，重复3次，30d后统计愈伤组织诱导率。按照现有技术3(周玉玲，余慧琳，刘广卿，李艳萍，张福娟，姜曙光，孙凤岭.红香椿组织培养和快速繁殖研究[J].中国农学通报，2009，25(10):116-119)中记载的方法，将种子在MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L ZT+0.1mg/LNAA+0.1mg/LIBA+质量百分比的3％蔗糖+质量百分比0.8％的琼脂中，在黑暗23℃、空气湿度70％条件下，培养1w后，移至空气湿度70％，光照13h/黑暗11h，光照温度26℃/黑暗温度24℃，光照强度10-20μmol photons/m2/s的培养条件下，每隔两周继代一次。每隔2w继代一次。连续继代3-4代，种皮部分无法形成愈伤组织。
本实施例说明，按照上述现有技术3中记载的愈伤组织诱导条件，不能诱导种皮愈伤组织的形成。
实施例9对比实施例之六
1)无菌种子获得
将香椿种子清水冲洗1-2h后，浸泡于无菌水中12h，再用70％医用酒精浸泡3-5min，后用无菌水冲洗3-5次，在无菌滤纸上沥干种子表面水分；
2)种皮愈伤组织的诱导
每皿接种10粒种子，每次处理4皿，重复3次，按照本申请人专利(ZL201610947913.3)中记载的方法，将种子在基本培养基MMS+1.0mg/L6-BA+0.5mg/L 2,4-D+0.1mg/L TDZ+质量百分比的3％蔗糖+质量百分比0.8％的琼脂中，在黑暗23℃、空气湿度70％条件下，培养1w后，移至空气湿度70％，光照13h/黑暗11h，光照温度26℃/黑暗温度24℃，光照强度10-20μmol photons/m2/s的培养条件下，每隔两周继代一次。每隔两周继代一次。连续继代3-4代，种子种皮部分无法形成愈伤组织。
本实施例说明，以本申请人上述专利(ZL201610947913.3)中的愈伤组织诱导条件，不能诱导种皮愈伤组织的形成。
在以上实施例中，所述的培养基成分如下：
Figure BDA0003032882930000131

Claims (1)

1.一种基于种皮愈伤组织分化的香椿再生技术，其特征在于包括如下步骤：
1)无菌种子获得：香椿种子去翅后，用清水冲洗1-2h后，浸泡于无菌水中12h，再用70％医用酒精浸泡3-5min，后用无菌水冲洗3-5次，沥干表面水分；
2)种皮愈伤组织的诱导：将步骤1)处理后的种子在诱导培养基中，在黑暗、温度24℃、空气湿度70％条件下，培养1w后，移至空气湿度70％、光照13h/黑暗11h、光照温度26℃/黑暗温度24℃、光照强度10-20μmol photons/m2/s的培养条件下，每2w继代一次，得到种皮愈伤组织，即愈伤组织Ⅰ；
3)种皮愈伤组织的生长：将步骤2)中的愈伤组织I继代至愈伤生长培养基中，在空气湿度70％、在光照13h/黑暗11h，光照温度25℃/黑暗温度23℃，光照强度30-50μmol photons/m2/s条件下，生长形成松散愈伤组织，即愈伤组织Ⅱ；
4)种皮愈伤组织的分化：将步骤3)中的愈伤组织Ⅱ移至装有愈伤组织分化培养基的容器中，用膜封口，在光照13h/黑暗11h，光照温度27℃/黑暗温度25℃，光照强度40-60μmolphotons/m2/s条件下，每隔2w继代一次，先形成不定芽，然后形成再生植株；
5)幼苗生根诱导培养：将步骤4)中的3-5cm的再生植株，清除茎基部愈伤组织，将茎基部垂直插入生根培养基中，在空气湿度70％，光照13h/黑暗11h，光照温度27℃/黑暗温度25℃，光照强度40-60μmol photons/m2/s条件下，用膜将培养容器封口培养1w后，清理再生植株茎部叶片，只留下2-3片，茎基部用刀片垂直横切后，在200mg/L IBA溶液中浸泡10-15min，沥干后，茎基部垂直插入生根培养基，同条件下培养，形成香椿幼苗；
6)炼苗：选择株高3-4cm，展开叶5-7片的香椿幼苗，培养容器在室外自然条件下放置2d后，揭开培养瓶封口膜，练苗4-5d后，移栽；
7)移栽：冲洗干净香椿幼苗根部，移栽到蛭石、泥炭、珍珠岩质量比为3：1：1混合的基质中，用遮阳网遮阴并保持空气湿度在70-80％，7-10d后去掉遮阳网，遮阳期间用40％多菌灵悬浮剂用无菌水按体积稀释800-1000倍后定期喷洒杀菌1次/周，共计2-3次；
所述MS培养基、MMS培养基均含有成分为大量元素KNO3、NH4NO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4、CaCl2·2H2O；微量元素MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、H3BO3、KI、Na2MoO4·7H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O；铁盐Na2-EDTA、FeSO4·4H2O；有机物甘氨酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫铵素、烟酸、肌醇；碳源蔗糖；
所述MS培养基中上述成分浓度(mg/L)依次为1900、1650、370、170、440、22.3、8.6、6.2、0.83、0.25、0.025、0.025、74.6、55.6、2.0、0.5、0.1、0.5、100、30000；
所述MMS培养基中上述成分浓度(mg/L)依次为2100、1430、270、150、320、12、5.7、4.2、0.5、0.2、0.025、0.025、37.3、27.8、1.5、0.5、0.15、0.6、80、30000；
所述1/2MS培养基中，所述成分大量元素浓度均为MS培养基的1/2，其余成分浓度与MS培养基相同；
所述3/4MS培养基中，所述成分大量元素浓度均为MS培养基的3/4，其余成分浓度与MS培养基相同；
所述诱导培养基为MMS+0.01mg/LTDZ+0.3mg/L IAA+0.01mg/L 2，4-D+质量百分比3％蔗糖+质量百分比0.8％琼脂；所述愈伤生长培养基为MMS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L 2，4-D+质量百分比3％蔗糖+质量百分比0.8％琼脂；所述愈伤组织分化培养基为3/4MS+1.5mg/L6-BA+0.001mg/L TDZ+0.1mg/L IAA+质量百分比3％蔗糖+质量百分比0.8％琼脂；所述生根培养基为1/2MS+质量百分比3％蔗糖+质量百分比0.8％琼脂。
CN202110435132.7A 2021-04-22 2021-04-22 一种基于种皮愈伤组织分化的香椿再生技术 Active CN113207686B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110435132.7A CN113207686B (zh) 2021-04-22 2021-04-22 一种基于种皮愈伤组织分化的香椿再生技术

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110435132.7A CN113207686B (zh) 2021-04-22 2021-04-22 一种基于种皮愈伤组织分化的香椿再生技术

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113207686A true CN113207686A (zh) 2021-08-06
CN113207686B CN113207686B (zh) 2022-02-08

Family

ID=77088422

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110435132.7A Active CN113207686B (zh) 2021-04-22 2021-04-22 一种基于种皮愈伤组织分化的香椿再生技术

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113207686B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114051930A (zh) * 2021-11-23 2022-02-18 河北农业大学 一种树莓种子的组培快繁的接种和育苗方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA14365U (en) * 2005-11-11 2006-05-15 Maharach Nat Grape And Wine In Method of obtaining grape plants from parent forms with low fertility
WO2014068557A1 (en) * 2012-10-30 2014-05-08 Fruitura Bioscience Ltd. Process for the large scale production of fruit cells
CN106258998A (zh) * 2016-11-03 2017-01-04 湖北师范大学 一种基于愈伤组织分化的香椿再生体系
CN106818485A (zh) * 2017-02-14 2017-06-13 中国热带农业科学院香料饮料研究所 一种以外种皮为外植体获得胡椒体细胞胚胎的方法
CN110432149A (zh) * 2019-09-06 2019-11-12 甘肃省农业科学院生物技术研究所 一种兼用于胡麻花药和子房愈伤组织诱导的培养基和培养方法
CN111657147A (zh) * 2020-06-30 2020-09-15 富阿丽 一种大葱花培育种用分化培养基及分化培养方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA14365U (en) * 2005-11-11 2006-05-15 Maharach Nat Grape And Wine In Method of obtaining grape plants from parent forms with low fertility
WO2014068557A1 (en) * 2012-10-30 2014-05-08 Fruitura Bioscience Ltd. Process for the large scale production of fruit cells
CN106258998A (zh) * 2016-11-03 2017-01-04 湖北师范大学 一种基于愈伤组织分化的香椿再生体系
CN106818485A (zh) * 2017-02-14 2017-06-13 中国热带农业科学院香料饮料研究所 一种以外种皮为外植体获得胡椒体细胞胚胎的方法
CN110432149A (zh) * 2019-09-06 2019-11-12 甘肃省农业科学院生物技术研究所 一种兼用于胡麻花药和子房愈伤组织诱导的培养基和培养方法
CN111657147A (zh) * 2020-06-30 2020-09-15 富阿丽 一种大葱花培育种用分化培养基及分化培养方法

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ASRI INSIANA PUTRI等: "INISIASI TUNAS AKSILER SERTA KALUS Toona sinensis DAN Toona sureni DENGAN SUMBER BAHAN STEK CABANG [Axillary Buds and Callus Initiation from Stem Cutting of Toona sinensis and Toona sureni]", 《JURNAL PEMULIAAN TANAMAN HUTAN》 *
P.CHAKRABORTI等: "Variation in Callus Induction and Root-Shoot Bud Formation Depend on Seed Coat of Sesame Genotypes", 《RESEARCH JOURNAL OF BOTANY》 *
周玉玲等: "红香椿组织培养和快速繁殖研究", 《中国农学通报》 *
张小红等: "TDZ对香椿愈伤组织诱导及芽增殖生长等的影响", 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 *
张长河等: "三尖杉的组织培养—紫杉醇来源的新途径", 《生物技术》 *
王春林等: "香椿组织培养与快速繁殖的研究", 《园艺学报》 *
许丽琼等: "香椿叶片组织培养和快繁技术的研究", 《湖北农业科学》 *
陈实等: "香椿种子组织培养研究", 《农技服务》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114051930A (zh) * 2021-11-23 2022-02-18 河北农业大学 一种树莓种子的组培快繁的接种和育苗方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN113207686B (zh) 2022-02-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101647393B (zh) 毛花猕猴桃组培快速繁殖方法
CN102870680B (zh) 一种适宜脱毒兔眼蓝莓的高效快繁方法
CN103190347B (zh) 一种茶壶枣组织培养方法
CN110604059B (zh) 一种油茶茎段离体培养再生植株的方法
CN102845313A (zh) 狗枣猕猴桃的离体快速繁殖方法
CN101536674A (zh) 粗肋草的组织培养繁殖方法
CN103461143B (zh) 一种油茶组织培养快速繁殖方法
CN115281081A (zh) 一种微型试管脱毒种姜的繁育方法
CN113142059A (zh) 一种花叶良姜组培芽增殖生根同步培养的方法
CN102144543A (zh) 一项铁线莲阿拉贝拉组织培养快繁技术
CN106538382B (zh) 一种以幼穗为外植体建立假俭草高效再生体系的方法
CN1541519A (zh) 兜兰的无菌播种和组织培养技术
CN108770690B (zh) 一种利用马来甜龙竹芽尖进行高效稳定再生体系的建立方法
CN113207686B (zh) 一种基于种皮愈伤组织分化的香椿再生技术
CN112655553A (zh) 一种猫须草无菌短枝快速繁殖的方法
CN112425506A (zh) 一种黄金艾草的组织培养快速繁殖方法
CN1586166A (zh) 大花蕙兰优质种苗快速繁殖方法
CN106613973B (zh) 利用组培苗叶片再生不定芽快速繁育羊踯躅的方法
CN115136893A (zh) 一种大籽猕猴挑的愈伤组织再生体系建立方法
CN111642394B (zh) 一种多肉丸叶海豹组培用组合培养基、多肉丸叶海豹组培方法和多肉丸叶海豹栽培方法
CN111758573B (zh) 一种美味猕猴桃砧木组培快繁方法
CN112106664B (zh) 一种壮丽含笑种子无菌萌发及快速繁殖方法
CN108112479A (zh) 一种番木瓜组培苗分化芽的茎段悬空植叶促根方法
CN111657144A (zh) 一种南高丛蓝莓品种‘奥尼尔’的组培快繁方法
CN111557242A (zh) 一种莲组培苗培养与快速扩繁的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant