CN111972293A

CN111972293A - 一种芝麻未授粉子房离体培养愈伤组织诱导方法

Info

Publication number: CN111972293A
Application number: CN202011118659.9A
Authority: CN
Inventors: 任西华; 张小林
Original assignee: Jiangsu Chunzhiyu Biotechnology Development Co ltd
Current assignee: Jiangsu Chunzhiyu Biotechnology Development Co ltd
Priority date: 2020-10-19
Filing date: 2020-10-19
Publication date: 2020-11-24

Abstract

本发明提供了一种芝麻未授粉子房离体培养愈伤组织诱导方法，包括以下步骤：（1）材料选取与消毒：选择生长健壮、无病虫害的芝麻植株，采集开花前1~2d花药未开裂的未授粉花蕾，并进行消毒处理；（2）外植体预处理：剥取子房作为外植体，放入一定浓度的维生素C溶液中浸泡处理2h；（3）外植体接种与诱导培养：将外植体平放接种于诱导培养基上，先进行24~48h的热激处理，然后在23~28℃的培养温度下进行诱导培养，培养期间前30d为暗培养，后改为光照培养。通过本发明的方法成功诱导出芝麻未授粉子房愈伤组织，诱导率最高可达36.74%。本发明为进一步建立完整的芝麻未授粉子房离体培养体系奠定了物质基础。

Description

一种芝麻未授粉子房离体培养愈伤组织诱导方法

技术领域

本发明涉及一种芝麻未授粉子房离体培养愈伤组织诱导方法，属于现代作物育种技术领域。

背景技术

芝麻（Sesamum indicum L.）属胡麻科（Pedaliaceae）胡麻属（Sesamum），是世界上最古老的油料作物之一，有2000多年的栽培历史，主要分布在亚洲、非洲等国家，在印度、苏丹、缅甸和我国种植面积较大，单位面积产量和总产量我国最多。芝麻在我国种植区域广泛，主要分布于黄河及长江中下游各省，以及河南、湖北、安徽、江西、河北等省分布较多，其中河南产量最多，约占全国的30%左右。根据种皮颜色的不同，芝麻可分为白芝麻、黑芝麻、黄芝麻等类型，其中白芝麻和黑芝麻最为常见，也是种植面积最大的两种芝麻。芝麻的营养价值很高，不仅富含脂肪、蛋白质、矿物质、维生素及膳食纤维等，还含有很多重要的活性成分，如芝麻素、芝麻酚、芝麻素酚、芝麻林素、芝麻林素酚等。现代研究表明，芝麻中所存在的活性成分对人体健康具有积极作用，例如抗氧化、清除自由基、抗衰老、预防糖尿病、预防肥胖症、治疗高血压、抗肿瘤、抑制肝损伤等，已经在世界范围内引起广泛的关注。

目前世界上主要芝麻生产国都十分重视芝麻品种改良及其开发利用方面的研究工作。品种改良在促进芝麻生产发展中起关键作用，高产、优质、高抗品种一直是育种专家追求的目标。系统选育和杂交选育等常规育种方法是目前芝麻新品种选育的主要途径，主要依靠育种者的经验，存在工作繁琐、育种周期长、效率低等问题，已经不能满足芝麻育种的需要。利用单倍体进行作物育种，可以加快育种进程、节约时间和成本、提高育种效率，是现代作物育种中快速、有效的方法之一。通过单倍体诱导，经染色体加倍后能获得基因位点完全纯合的双单倍体系（DH系），有效地缩短育种周期。此外，在杂合二倍体中许多不表达的隐性基因能够在 DH 系中表达，有利于发现作物的优良表型，改良作物的优良性状，提高作物的育种效率。此外单倍体培养和加倍过程中会出现基因突变，能够创新种质资源，增加群体遗传多样性。诱变单倍体能够快速发现隐性基因突变，有利于突变体筛选和基因功能的研究。

自然界虽然能够自发形成单倍体，但频率极低，仅在0.001%~0.01%，不能满足育种的需求，因而通过人工方法获取单倍体成为主要的手段。目前，获得单倍体的途径主要有以下几种：（1）雄配子体（花药、花粉）离体培养；（2）未受精雌核（未受精的子房和胚珠）离体培养；（3）染色体消除方法；（4）半配受精。在这些途径中，花药及花粉离体培养获得单倍体的研究较为成功，已与常规杂交育种、远缘杂交育种、诱变育种以及转基因技术相结合，发展形成了一套育种技术体系。作为植物单倍体育种的另一条重要途径，未受精子房及胚珠的离体培养与花药及花粉的离体培养具有同样重要的价值和地位，并且还具有以下独特的优点：有些植物花药培养至今难以成功或诱导率太低，而未受精子房或胚珠离体培养可提供一条单倍体育种新途径；对于雄性不育的植物无法用花药来培养获得单倍体，可采用未受精子房或胚珠培养来诱导；未受精子房或胚珠培养的后代能产生较多的绿苗；在某些材料中花粉植株表现明显的倍性变异和性状变异，子房培养后代也许较为稳定。

研究表明，在建立可重复的未受精子房及胚珠离体培养高频再生体系的过程中，众多因素对诱导频率存在不同程度的影响，其中包括供体的基因型、接种时胚囊的发育时期、培养基组成、供体的栽培季节、外植体培养前的预处理、培养方式、培养条件等。目前关于芝麻未受精雌核离体培养诱导单倍体的研究尚未见报道。因此发明人通过对影响芝麻未授粉子房培养的诸因素进行分析，旨在建立一种芝麻未授粉子房诱导培养获得愈伤组织的方法，为开展芝麻离体雌核发育培养和单倍体育种提供参考。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种芝麻未授粉子房离体培养愈伤组织诱导方法，为芝麻未授粉子房培养技术的应用提供技术支撑和理论依据。

本发明提供的技术方案是：

一种芝麻未授粉子房离体培养愈伤组织诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）材料选取与消毒：选择生长健壮、无病虫害的芝麻植株，采集开花前1~2d花药未开裂的未授粉花蕾；将花蕾进行消毒处理：先用75%酒精消毒30s，无菌水冲洗1次，再用3%次氯酸钠消毒8min，无菌水冲洗4~5次，用无菌滤纸吸干表面水分；

（2）外植体预处理：在无菌条件下从花蕾中剥取子房作为外植体，放入一定浓度的维生素C溶液中浸泡处理2h；

（3）外植体接种与诱导培养：将外植体平放接种于诱导培养基上，先进行24~48h的热激处理，然后在23~28℃的培养温度下进行诱导培养，培养期间前30d为暗培养，后改为光照培养直至外植体上诱导出愈伤组织。

所述步骤（2）中，维生素C溶液的浓度为70~80mg/L。

所述步骤（3）中，诱导培养基成分为：KNO₃ 1750-2050mg/L，NH₄NO₃1100-1400mg/L，KH₂PO₄ 145-175mg/L，CaCl₂·2H₂O 480-510mg/L，MgSO₄·7H₂O 320-350mg/L，MnSO₄·4H₂O10.3-13.5mg/L，ZnSO₄·7H₂O 7.2-9.0mg/L，H₃BO₃ 5.6-7.4mg/L，KI 0.8-0.9mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.2-0.3mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.05-0.15mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.02-0.03mg/L，乳酸亚铁28.3-31.1mg/L，肌醇80-100mg/L，丙酮酸钠20-30mg/L，甘氨酸2.0-4.0mg/L，脯氨酸20-30mg/L，天门冬酰胺45-55mg/L，维生素B1 3.6-4.4mg/L，维生素B6 0.6-1.0mg/L，牛磺酸1.4-1.8mg/L，D-生物素0.08-0.1mg/L，KT 0.8-1.2mg/L，2，4-D 1.8-2.2mg/L，马来酰肼1.5-2.5mg/L，核苷酸5.8-7.0mg/L，百合浸提液20-40ml/L，丁酸钠80~120μmol/L，蔗糖46-54g/L，琼脂6-8g/L，pH值为5.6-6.0。

所述步骤（3）中，热激处理的温度为32~35℃。

所述步骤（3）中，光照培养的条件为：光照时间10~14h/d，光照强度1000~2000lx。

所述诱导培养基中百合浸提液的制备方法为：称取一定量的百合鳞片用研钵研碎，按照1∶1.5（g/ml）的料液比加入生理盐水浸泡4h，用双层纱布过滤，将滤液以3000r/min离心10min，取上清液备用。

本发明具有如下有益效果：

1、本发明对影响芝麻未授粉子房离体培养的因素进行了深入研究，初步建立了芝麻未授粉子房诱导培养获得愈伤组织的方法。其中将未授粉子房放入维生素C溶液中浸泡处理2h，在诱导培养前进行热激处理，以及诱导培养过程中采用先暗培养再光照培养的方式，能够促进未授粉子房上愈伤组织的形成，提高愈伤组织诱导效率。

2、本发明研究了诱导培养基中大量元素、微量元素、有机成分、碳源、外源激素以及附加成分等因素对诱导效果的影响，获得了愈伤组织诱导最佳培养基，尤其是在培养基中添加马来酰肼、核苷酸、百合浸提液、丁酸钠等能够有效提高愈伤组织诱导率。

具体实施方式

为使本发明的目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

实施例1

1 材料与方法

1.1试验材料

本研究采用的试验材料是芝麻栽培品种‘豫芝4号’和‘郑黑芝1号’。

1.2试验方法

（1）材料选取与消毒：选择生长健壮、无病虫害的芝麻植株，选取开花前1~2d花药未开裂的未授粉花蕾；将花蕾进行消毒处理：先用75%酒精消毒30s，无菌水冲洗1次，再用3%次氯酸钠消毒8min，无菌水冲洗4~5次，用无菌滤纸吸干表面水分。

（2）外植体预处理：在无菌条件下从花蕾中剥取子房作为外植体，放入一定浓度的维生素C溶液中浸泡处理2h。

（3）外植体接种与诱导培养：将外植体平放接种于诱导培养基上，先在33℃进行热激处理，然后在25℃的培养温度下进行诱导培养，培养期间前30d为暗培养，后改为光照培养10d（光照时间12h/d，光照强度1500lx），统计愈伤组织形成数，计算愈伤组织诱导率。

诱导培养基成分为：KNO₃ 1900mg/L，NH₄NO₃1250mg/L，KH₂PO₄ 160mg/L，CaCl₂·2H₂O 495mg/L，MgSO₄·7H₂O 335mg/L，MnSO₄·4H₂O 11.9mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.1mg/L，H₃BO₃6.5mg/L，KI 0.85mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.10mg/L，CoCl₂·6H₂O0.025mg/L，乳酸亚铁28.3-31.1mg/L，肌醇90mg/L，丙酮酸钠25mg/L，甘氨酸3.0mg/L，脯氨酸25mg/L，天门冬酰胺50mg/L，维生素B1 4.0mg/L，维生素B6 0.8mg/L，牛磺酸1.6mg/L，D-生物素0.09mg/L，KT 1.0mg/L，2，4-D 2.0mg/L，马来酰肼2.0mg/L，核苷酸6.4mg/L，百合浸提液30ml/L，丁酸钠100μmol/L，蔗糖50g/L，琼脂7g/L，pH值为5.8。

诱导培养基中百合浸提液的制备方法为：称取一定量的百合鳞片用研钵研碎，按照1∶1.5（g/ml）的料液比加入生理盐水浸泡4h，用双层纱布过滤，将滤液以3000r/min离心10min，取上清液备用。

2 试验设计

2.1维生素C浸泡处理对未授粉子房愈伤组织诱导的影响

将‘豫芝4号’和‘郑黑芝1号’的外植体分别放入0（CK）、25mg/L、50mg/L、75mg/L、100mg/L的维生素C溶液中浸泡处理2h，然后将外植体接种后进行诱导培养，40d后统计各处理的愈伤组织形成数、生长情况并计算愈伤组织诱导率。

表1的结果表明，用一定浓度的维生素C溶液浸泡处理外植体可以提高愈伤组织的诱导率，其中以75mg/L维生素C溶液处理最有利于未授粉子房愈伤组织的形成，‘豫芝4号’愈伤组织诱导率达35.92%，‘郑黑芝1号’达27.08%，均显著高于对照。

2.2热激处理对未授粉子房愈伤组织诱导的影响

将‘豫芝4号’和‘郑黑芝1号’的外植体放入75mg/L浓度的维生素C溶液中浸泡处理2h，然后将外植体平放接种于诱导培养基上，在33℃分别进行0（CK）、24h、36h、48h、60h、72h的热激处理，然后在25℃的培养温度下进行诱导培养，40d后统计各处理的愈伤组织形成数、生长情况并计算愈伤组织诱导率。

表2的结果表明，外植体接种后进行适当的热激处理有利于提高愈伤组织的诱导率，在0~48h内随着热激处理时间的增加，愈伤组织诱导率逐步提高，并且以48h处理效果最好，‘豫芝4号’愈伤组织诱导率达36.42%，‘郑黑芝1号’达25.80%；但当热激处理时间超过60h后，愈伤组织诱导率反而低于对照。

2.3马来酰肼对未授粉子房愈伤组织诱导的影响

将‘豫芝4号’和‘郑黑芝1号’的外植体接种于添加不同浓度马来酰肼的诱导培养基上，马来酰肼设0mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、4.0mg/L5个处理，每处理重复3次。先在33℃进行热激处理48h，然后在25℃的培养温度下进行诱导培养， 40d后统计各处理的愈伤组织形成数、生长情况并计算愈伤组织诱导率。

表3的结果表明，当马来酰肼浓度小于2.0mg/L时，愈伤组织诱导率随马来酰肼浓度的提高而增加，当马来酰肼浓度在2.0mg/L时诱导效果最好，此时‘豫芝4号’和‘郑黑芝1号’的愈伤组织诱导率达35.07%和25.91%，均为最高值；当马来酰肼浓度为4.0mg/L时，愈伤组织诱导率则明显下降。

2.4丁酸钠对未授粉子房愈伤组织诱导的影响

将‘豫芝4号’和‘郑黑芝1号’的外植体接种于添加不同浓度丁酸钠的诱导培养基上，丁酸钠设0、50、100、150、200μmol/L 5个处理，每处理重复3次。先在33℃进行热激处理48h，然后在25℃的培养温度下进行诱导培养，40d后统计各处理的愈伤组织形成数、生长情况并计算愈伤组织诱导率。

表4的结果表明，当丁酸钠浓度小于100μmol/L时，愈伤组织诱导率随丁酸钠浓度的提高而增加，当丁酸钠浓度在100μmol/L时诱导效果最好，此时‘豫芝4号’和‘郑黑芝1号’的愈伤组织诱导率达36.74%和26.55%，均为最高值；当丁酸钠浓度大于100μmol/L时，愈伤组织诱导率则明显下降，并且当丁酸钠浓度为200μmol/L时，愈伤组织诱导率反而低于对照（0μmol/L），可见添加较低浓度的丁酸钠更有利于芝麻未授粉子房愈伤组织的形成。

以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。

Claims

1.一种芝麻未授粉子房离体培养愈伤组织诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种芝麻未授粉子房离体培养愈伤组织诱导方法，其特征在于，所述步骤（2）中，维生素C溶液的浓度为70~80mg/L。

3.根据权利要求1所述的一种芝麻未授粉子房离体培养愈伤组织诱导方法，其特征在于，所述步骤（3）中，诱导培养基成分为：KNO₃ 1750-2050mg/L，NH₄NO₃1100-1400mg/L，KH₂PO₄ 145-175mg/L，CaCl₂·2H₂O 480-510mg/L，MgSO₄·7H₂O 320-350mg/L，MnSO₄·4H₂O10.3-13.5mg/L，ZnSO₄·7H₂O 7.2-9.0mg/L，H₃BO₃ 5.6-7.4mg/L，KI 0.8-0.9mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.2-0.3mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.05-0.15mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.02-0.03mg/L，乳酸亚铁28.3-31.1mg/L，肌醇80-100mg/L，丙酮酸钠20-30mg/L，甘氨酸2.0-4.0mg/L，脯氨酸20-30mg/L，天门冬酰胺45-55mg/L，维生素B1 3.6-4.4mg/L，维生素B6 0.6-1.0mg/L，牛磺酸1.4-1.8mg/L，D-生物素0.08-0.1mg/L，KT 0.8-1.2mg/L，2，4-D 1.8-2.2mg/L，马来酰肼1.5-2.5mg/L，核苷酸5.8-7.0mg/L，百合浸提液20-40ml/L，丁酸钠80~120μmol/L，蔗糖46-54g/L，琼脂6-8g/L，pH值为5.6-6.0。

4.根据权利要求1所述的一种芝麻未授粉子房离体培养愈伤组织诱导方法，其特征在于，所述步骤（3）中，热激处理的温度为32~35℃。

5.根据权利要求1所述的一种芝麻未授粉子房离体培养愈伤组织诱导方法，其特征在于，所述步骤（3）中，光照培养的条件为：光照时间10~14h/d，光照强度1000~2000lx。

6.根据权利要求3所述的一种芝麻未授粉子房离体培养愈伤组织诱导方法，其特征在于，所述诱导培养基中百合浸提液的制备方法为：称取一定量的百合鳞片用研钵研碎，按照1∶1.5（g/ml）的料液比加入生理盐水浸泡4h，用双层纱布过滤，将滤液以3000r/min离心10min，取上清液备用。