CN106258961A - 一种液体培养木薯试管薯的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种液体培养木薯试管薯的方法。本方法包括木薯组培苗增殖继代培养和木薯试管苗诱导培养，先将无菌木薯组培苗分切成单芽茎段，转接到半固体培养基A中进行增殖继代培养，再转接到液体诱导培养基B中进行培养，培养周期为25～30 d；其中所述的液体诱导培养基B为1/2 MS+萘乙酸0.01～0.02 mg/L+硫酸铜0.3～0.5 mg/L+蔗糖40～50 g/L+0.05～0.10mg/L PP333，pH值为5.8；诱导培养的培养方式为滤纸桥培养。本发明提供了一种简单方便、可行性强、诱导率高、不受外界条件限制的木薯试管薯诱导方法，解决了木薯试管薯诱导周期长的问题。

Description

一种液体培养木薯试管薯的方法
技术领域
发明属于农业繁殖技术领域，具体涉及一种液体培养木薯试管薯的方法。
背景技术
木薯（ Manihot esculenta Crantz）是大戟科（ Euphorbiaceae）木薯属（Manihot） 植物，耐旱抗贫瘠，广泛种植于非洲、 美洲和亚洲等100多个国家和地区，被誉为“淀粉之王” ，是世界近六亿人赖以生存的粮食。木薯用途广泛，除作粮食外，还是重要的工业原料，如木薯块根淀粉、干片可制变性淀粉、酒精和山梨醇等，而这些产品又是食品、医药、纺织、造纸等产业的重要原料。
木薯是一种块根作物，淀粉和蛋白是它的主要储藏物质。木薯的主要价值主要体现在淀粉的运用上，其块根淀粉含量极高，达27%之上,被誉为“淀粉之王”。因此，块根发生发育及淀粉积累规律的研究具有重要意义。国内外对试管薯的离体诱导培养均以半固体培养基，如Fan等（2011）研究结果表明，MS基本培养基添加0.5 mg/l NAA、0.5 mg/l BA及60g/l蔗糖的半固体培养基可有效诱导木薯试管薯；姚远（2010）研究表明，MS基本培养基添加0.1mg/l NAA、0.1mg/l BA及30 g/l蔗糖的半固体培养基可有效诱导木薯试管薯。但有关液体培养基诱导木薯试管薯的研究未见报道。
发明内容
本发明的目的在于：针对上述存在的不足，本发明提供了一种简单方便、可行性强、诱导率高、不受外界条件限制的木薯试管薯的诱导方法，同时解决了木薯试管薯诱导周期长的问题。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种液体培养木薯试管薯的方法，其步骤包括木薯组培苗增殖继代培养和木薯试管苗诱导培养，首先将无菌木薯组培苗分切成单芽茎段，转接到半固体培养基A中进行增殖继代培养，再转接到液体诱导培养基B中进行诱导培养。
进一步地，所述的液体培养木薯试管薯的方法，所述的液体诱导培养基B为1/2 MS+萘乙酸0.01～0.02 mg/L + 硫酸铜0.3～0.5 mg/L +蔗糖 40～50 g/L+ 0.05 ～0.10mg/L PP333，pH值为5.8。
进一步地，所述的液体培养木薯试管薯的方法，所述诱导培养的培养方式为滤纸桥培养。
进一步地，所述的液体培养木薯试管薯的方法，所述的半固体培养基A为MS + 6-苄基氨基嘌呤0.02～0.05 mg/L +萘乙酸0.01～0.02 mg/L+ 硫酸铜0.3～0.5 mg/L + 蔗糖 20 g/L + 琼脂粉6.4 g/L。
进一步地，所述的液体培养木薯试管薯的方法，所述诱导培养的温度为26±1 ℃，光照强度为1500～2000 lx，光照时间为16 h/d，培养周期为25～30 d。
进一步地，所述的液体培养木薯试管薯的方法，所述增殖继代培养的温度为26±1℃，光照强度为1500～2000 lx，光照时间为16 h/d，培养周期为35～40 d。
综上所述，本发明由于采用了上述方案，本发明具有以下积极效果：
（1）本发明的液体培养木薯试管薯的方法，提供一种简单方便、可行性强、不受外界条件限制的木薯试管薯的诱导方法。
（2）本发明的液体培养木薯试管薯的方法，填补了木薯试管薯液体培养的空白，提高了木薯试管薯的诱导效率，缩短了木薯试管薯的诱导周期。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
将无菌木薯组培苗切成单芽茎段，转接到培养基A中进行增殖继代培养，在培养温度为26±1 ℃，光照强度为1500 lx，光照时间为16 h/d，培养周期为35 d，其中培养基A为MS +6-苄基氨基嘌呤0.02 mg/L +萘乙酸0.01mg/L+ 硫酸铜0.3 mg/L + 蔗糖 20 g/L + 琼脂粉6.4 g/L的半固体培养基；再将增殖继代培养后的木薯组培苗单芽茎段转接到液体诱导培养基B中进行液体静置培养，培养温度为26±1℃，光照强度为2000 lx，光照时间为16 h/d，培养周期为25 d，其中所述液体诱导培养基B为1/2 MS +萘乙酸0.01 mg/L + 硫酸铜0.3mg/L +蔗糖 40g/L，pH值为5.8。
实施例2
将无菌木薯组培苗切成单芽茎段，转接到培养基A中进行增殖继代培养，在培养温度为26±1 ℃，光照强度为1500 lx，光照时间为16 h/d，培养周期为35 d，其中培养基A为MS +6-苄基氨基嘌呤0.02 mg/L +萘乙酸0.01mg/L+ 硫酸铜0.3 mg/L + 蔗糖 20 g/L + 琼脂粉6.4 g/L的半固体培养基；再将增殖继代培养后的木薯组培苗单芽茎段转接到液体诱导培养基B中进行液体静置培养，培养温度为26±1℃，光照强度为2000 lx，光照时间为16 h/d，培养周期为25 d，其中所述液体诱导培养基B为1/2 MS +萘乙酸0.01 mg/L + 硫酸铜0.3mg/L +蔗糖 50g/L，pH值为5.8。
实施例3
与实施例1或2不同之处在于：诱导培养阶段的培养方式为液体振荡培养，其他条件不变。
实施例4
与实施例1至3不同之处在于：诱导培养阶段的培养方式为滤纸桥培养，其他条件不变。
实施例5
与实施例4不同之处在于：在液体诱导培养基B中添加了0.05 mg/L 的PP333，其他条件不变。
实施例6
与实施例4或5不同之处在于：在诱导培养基B中添加的PP333浓度变为0.10 mg/L，其他条件不变。其他实施例液体诱导培养基B中PP333的浓度还可以为0.07 mg/L或0.08mg/L等数值。
实施例7
与实施例1至6不同之处在于：液体诱导培养基B中萘乙酸的浓度为0.02mg/L，其他条件不变。
实施例8
与实施例1至7不同之处在于：液体诱导培养基B中硫酸铜的浓度为0.4 mg/L，其他条件不变。其他实施例液体诱导培养基B中硫酸铜的浓度还可以为0.35mg/L或0.45mg/L等数值。
实施例9
与实施例1至8不同之处在于：半固体培养基A中6-苄基氨基嘌呤的浓度为0.05 mg/L，其他条件不变。其他实施例半固体培养基A中6-苄基氨基嘌呤的浓度还可以为0.03 mg/L或0.04 mg/L等数值。
实施例10
与实施例1至9不同之处在于：半固体培养基A中萘乙酸的浓度为0.02 mg/L，其他条件不变。
实施例11
与实施例1至10不同之处在于：半固体培养基A中硫酸铜的浓度为0.5 mg/L，其他条件不变。其他实施例半固体培养基A中硫酸铜的浓度还可以为0.4 mg/L等数值。
实施例12
与实施例1至11不同之处在于：增殖继代培养时光照强度为2000 lx，其他条件不变。其他实施例增殖继代培养时光照强度为还可以为1800 lx等数值。
实施例13
与实施例1至12不同之处在于：增殖继代培养时培养周期为40 d。其他条件不变。其他实施例增殖继代培养时培养周期还可以为37 d等数值。
实施例14
与实施例1至13不同之处在于：诱导培养时培养周期为25 d。其他条件不变。其他实施例：诱导培养时培养周期还可以为30 d等数值。
实施例15
与实施例1至14不同之处在于：诱导培养时光照强度为1500 lx。其他条件不变。其他实施例增殖继代培养时光照强度为还可以为1700 lx等数值。
为了更好的说明本发明的液体培养木薯试管薯的方法具有简单方便、可行性强、诱导率高、诱导周期短的优点，作以下实验。
1、不同蔗糖浓度对液体培养木薯试管薯的诱导影响
实验组处理：取180个处理好的无菌木薯组培苗的单芽茎段，随机分成两组，以实施例1、实施例2的方法分别诱导随机分成的两组，液体诱导培养基B中蔗糖浓度依次为40 g/L 、50 g/L，每个实验组设置3个重复试验，每个重复实验设有30个单芽茎段。
对照组处理：取180个处理好的无菌木薯组培苗的单芽茎段，随机分成两组，每个对照组设置3个重复试验，每个重复实验设有30个单芽茎段。对照组1：与实施例1不同之处在于，液体诱导培养基B的蔗糖浓度为30 g/L。对照组2：与实施例1不同之处在于，液体诱导培养基B的蔗糖浓度为60 g/L。
试验结果记录每组实验的生根数、最粗根粗的平均值，并计算每组实验的诱导率。测试结果参见表1。
表1
通过实验对比，得出：蔗糖浓度为40～50g/L时，最有利于进行液体培养木薯试管薯。
2、不同培养方式对液体培养木薯试管薯的诱导影响
实验处理：取270个处理好的无菌木薯组培苗的单芽茎段，随机分成三组，以实施例1、实施例3、实施例4的方法分别诱导随机分成的三组，培养方式依次为液体静置培养、液体振荡培养、滤纸桥培养，每个实验组设置3个重复试验，每个重复实验设有30个单芽茎段。试验结果记录每组实验的生根数、最粗根粗的平均值，并计算每组实验的诱导率。测试结果参见表2。
表2
培养方式 诱导率（%） 生根数（个） 最粗根粗（cm）
液体静置培养 79.33 2.47 0.74
液体振荡培养 84.80 2.40 0.76
滤纸桥培养 92.55 2.75 0.85
通过实验对比，得出：滤纸桥培养方式是液体培养木薯试管薯的最佳培养方式。
3、不同PP333浓度对液体培养木薯试管薯的诱导影响
实验组处理：取180个处理好的无菌木薯组培苗的单芽茎段，随机分成两组，以实施例5、实施例6的方法分别诱导随机分成的两组，PP333的浓度依次为0.05 mg/L、0.10 mg/L，每个实验组设置3个重复试验，每个重复实验设有30个单芽茎段。
对照组处理：取180个处理好的无菌木薯组培苗的单芽茎段，随机分成两组，每个实验组设置3个重复试验，每个重复实验设有30个单芽茎段。对照组1：与实施例5不同之处在于，液体诱导培养基B的PP333浓度为0.02 mg/L。对照组2：与实施例5不同之处在于，液体诱导培养基B的PP333浓度为0.15mg/L。
试验结果记录每组实验的生根数、最粗根粗的平均值，并计算每组实验的诱导率。测试结果参见表3。
表3
PP333浓度（mg/L） 诱导率（%） 生根数（个） 最粗根粗（cm）
0.02 91.43 2.63 1.69
0.05 98.78 2.35 1.86
0.10 98.33 1.85 2.03
0.15 76.26 1.23 2.01
通过实验对比，得出：添加PP333有利于进行液体培养木薯试管薯的培养，但是当PP333的浓度为0.05～0.10 mg/L时，最有利于进行液体培养木薯试管薯的培养。
综上，通过实验证明，采用本发明的一种液体培养木薯试管薯的方法，可提供一种简单方便、可行性强、不受外界条件限制的木薯试管薯的诱导方法，同时解决了木薯试管薯诱导率低、诱导周期长的问题，大大缩短了试管薯诱导时间，在30d的培养时间内，试管薯诱导率可高达98.78%。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同腰间的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施例加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (6)

1.一种液体培养木薯试管薯的方法，其特征在于：其步骤包括木薯组培苗增殖继代培养和木薯试管苗诱导培养，首先将无菌木薯组培苗分切成单芽茎段，转接到半固体培养基A中进行增殖继代培养，再转接到液体诱导培养基B中进行诱导培养。
2.根据权利要求1所述的液体培养木薯试管薯的方法，其特征在于：所述的液体诱导培养基B为1/2 MS +萘乙酸0.01～0.02 mg/L + 硫酸铜0.3～0.5 mg/L +蔗糖 40～50 g/L+0.05 ～0.10mg/L PP333，pH值为5.8。
3.根据权利要求1所述的液体培养木薯试管薯的方法，其特征在于：所述诱导培养的培养方式为滤纸桥培养。
4.根据权利要求1所述的液体培养木薯试管薯的方法，其特征在于：所述的半固体培养基A为MS + 6-苄基氨基嘌呤0.02～0.05 mg/L +萘乙酸0.01～0.02 mg/L+ 硫酸铜0.3～0.5 mg/L + 蔗糖 20 g/L + 琼脂粉6.4 g/L。
5.根据权利要求1所述的液体培养木薯试管薯的方法，其特征在于：所述诱导培养的温度为26±1 ℃，光照强度为1500～2000 lx，光照时间为16 h/d，培养周期为25～30 d。
6.根据权利要求1所述的液体培养木薯试管薯的方法，其特征在于：所述增殖继代培养的温度为26±1 ℃，光照强度为1500～2000 lx，光照时间为16 h/d，培养周期为35～40 d。
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