CN104585034B - 一种朱顶红花瓣组织诱导再生植株的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物诱导再生技术领域，具体公开了一种朱顶红花瓣组织诱导再生植株的方法。本发明将朱顶红花瓣垂直于花蕾纵轴进行横切，切成宽度≤1.0mm的环状花瓣细丝，作为外植体；将外植体置于诱导培养基上，在24~26℃，黑暗条件下培养，花瓣的外表面产生突状物；再将产生突状物的外植体转移至再生培养基上，在24~26℃，每日12~14h光照环境下培养，突状物形成不定芽继而形成完整植株。本发明采用朱顶红环状花瓣细丝作为外植体，建立了高效的器官发生途径的植株再生体系，其突状物诱导率最高达100%，不定芽诱导率最高达100%，植株再生率最高达98%，平均每个外植体最多可产生12.8棵小植株，植株的再生效率明显提高。
Description
技术领域
本发明属于植物诱导再生技术领域，具体涉及一种朱顶红花瓣组织诱导再生植株的方法。
背景技术
朱顶红（HippeastrumhybridumHort.）又名朱顶兰、孤挺花、华胄兰等，为石蒜科朱顶红属重要多年生的草本植物，原产热带美洲，是世界著名的球根花卉。
朱顶红的组织培养研究始于20世纪70年代，目前，多采用鳞茎或鳞茎盘、子房或花梗（包括幼嫩蒴果、幼嫩花茎和幼胚）和下胚轴为起始材料，经诱导培养获得愈伤组织、不定芽或体细胞胚，然后培养获得完整植株。当使用鳞茎或鳞茎盘作为外植体时，需要挖取种球，会对种球造成破坏，特别是在育种早期阶段，对原始母球造成破坏；当使用花梗或子房作为外植体时，由于花梗或子房的数量有限，难以用于植株的大量繁殖。上述途径存在愈伤组织诱导周期较长、无菌苗易发生退化与变异，朱顶红的繁殖再生率低等缺点。
在朱顶红花序中，花瓣的生物量占有很大比例，尤其是重瓣花品种，花瓣多达20枚以上，占花蕾总鲜重的70%以上，因此，利用花瓣作为外植体进行组培快繁，具有很大应用价值。现有技术中，洪志忠（2005）将朱顶红花瓣切成1cm2的块状进行培养，仅在花瓣基部获得了微量的芽，朱顶红的繁殖效率低。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种朱顶红花瓣组织诱导再生植株的方法。本发明采用环状花瓣细丝作为外植体，建立了高效的器官发生途径的植株再生体系，可有效提高朱顶红组培繁殖效率，植株再生率最高可达98.0%，平均每个外植体最多可产生12.8棵小植株。
本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。
一种朱顶红花瓣组织诱导再生植株的方法，包括如下步骤：
S1.外植体处理：取朱顶红幼嫩花序，经表面消毒后，切除外苞片，取出花蕾，将花瓣垂直于花蕾纵轴进行横切，切成宽度≤1.0mm的环状花瓣细丝，将花瓣细丝作为外植体；
S2.突状物诱导：将处理好的外植体水平放置于诱导培养基上，在24~26℃，黑暗条件下培养，花瓣的外表面产生突状物；
S3.植株再生：将产生突状物的外植体转移至再生培养基上，在24~26℃，每日12~14h光照环境下培养，突状物形成不定芽继而形成完整植株。
本发明采用环状花瓣细丝作为外植体，建立了高效的器官发生途径的植株再生体系，其突状物诱导率最高达100%，不定芽诱导率最高达100%，植株再生率最高达98%，平均每个外植体最多可产生12.8棵小植株。与现有技术中将朱顶红花瓣切成1cm2的块状进行培养诱导的报道相比，本发明将幼嫩花瓣切成宽度≤1.0mm的环状花瓣细丝，使花瓣外表面高频率形成不定芽并继而形成再生植株，植株的再生效率明显提高。
花瓣细丝的宽度直接影响花瓣外表面形成不定芽并继而形成再生植株的再生效率，优选地，S1所述花瓣被切成宽度为0.8~1.0mm的环状细丝。
优选地，S3所述光照的强度为1000~1400lux。
优选地，S2所述诱导培养基以MS培养基为基本培养基，并添加0.1~1.0mg/L噻苯隆（TDZ）、0.1~3.0mg/L2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）、20~40g/L蔗糖，pH5.8~6.0。
更优选地，所述噻苯隆（TDZ）在诱导培养基中的添加量为0.5mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）在诱导培养基中的添加量为0.1~1.0mg/L。
优选地，S3所述再生培养基以MS培养基为基本培养基，并添加0~1.0mg/L6-苄基氨基腺嘌呤（6-BA）、20~40g/L蔗糖，pH5.8~6.0。
更优选地，所述6-苄基氨基腺嘌呤（6-BA）在再生培养基中的添加量为0~0.5mg/L。
优选地，S1所述消毒的方法为用70%乙醇浸泡15min后，用无菌水清洗3次。
优选地，S2所述培养的时间为8~12周，S3所述培养的时间为4~8周。
最优选地，一种朱顶红花瓣组织诱导再生植株的方法，包括如下步骤：
S1.外植体处理：取朱顶红幼嫩花序，70%乙醇浸泡15min后，用无菌水清洗3次，切除外苞片，取出花蕾，将花瓣垂直于花蕾纵轴进行横切，切成宽度为0.8~1.0mm的环状花瓣细丝，将花瓣细丝作为外植体；
S2.突状物诱导：将处理好的外植体水平放置于诱导培养基上，在24~26℃，黑暗条件下培养8~12周，花瓣的外表面产生突状物；
S3.植株再生：将产生突状物的外植体转移至再生培养基上，在24~26℃，每日12~14h光照、光照强度为1000~1400lux的环境下培养4~8周，突状物形成不定芽继而形成完整植株；
S2所述诱导培养基为以MS培养基为基本培养基，添加0.5mg/L噻苯隆（TDZ）、0.1~1.0mg/L2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）、20~40g/L蔗糖，pH5.8~6.0；
S3所述再生培养基为以MS培养基为基本培养基，添加0.5mg/L6-苄基氨基腺嘌呤（6-BA），20~40g/L蔗糖，pH5.8~6.0。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
（1）本发明采用环状花瓣细丝作为外植体，建立了高效的器官发生途径的植株再生体系，其突状物诱导率最高达100%，不定芽诱导率最高达100%，植株再生率最高达98%，平均每个外植体最多可产生12.8棵小植株。与现有技术中将朱顶红花瓣切成1cm2的块状进行培养诱导的报道相比，本发明将幼嫩花瓣切成宽度≤1.0mm的环状花瓣细丝，使花瓣外表面高频率形成不定芽并继而形成再生植株，植株的再生效率明显提高。
（2）在朱顶红花序中，花瓣的生物量占有很大比例，尤其是高度重瓣的品种，其花瓣数可达20枚以上，本发明采用花瓣组织作为外植体，一个小花蕾平均可切出200个以上的外植体，一个花序最多可诱导并再生10000棵以上的植株，显著提高了植株的再生效率，利于朱顶红植株的高效快速繁殖，同时也为朱顶红基因工程提供技术支持。
附图说明
图1为朱顶红花瓣外植体诱导形成突状物。
图2为朱顶红花瓣外植体获得再生植株。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1TDZ和2,4-D对朱顶红花瓣突状物诱导的影响
研究不同浓度的TDZ和2,4-D对朱顶红花瓣突状物诱导率的影响：取朱顶红幼嫩花序，70%乙醇浸泡15min后，用无菌水清洗3次，切除外苞片，取出花蕾，将花瓣垂直于花蕾纵轴进行横切，切成宽度≤1.0mm的环状花瓣细丝，将花瓣细丝作为外植体；将处理好的外植体水平放置于诱导培养基上，在24~26℃，黑暗条件下培养8~12周，花瓣的外表面产生突状物；所述诱导培养基为以MS培养基为基本培养基，并按表1添加一定浓度的噻苯隆（TDZ）、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D），以及20~40g/L蔗糖，pH5.8~6.0，实验结果如表1所示。结果表明，TDZ和2,4-D的浓度均会影响朱顶红花瓣突状物的诱导率。当诱导培养基中添加的TDZ为0.5mg/L，2,4-D为0.1~3.0mg/L时，突状物的诱导率≥92%；当TDZ为1.0mg/L，2,4-D为0.1mg/L时，突状物的诱导率达96%。其中，当TDZ为0.5mg/L，2,4-D为0.1~1.0mg/L时，突状物的诱导率达100%。
表1TDZ和2,4-D对朱顶红花瓣突状物诱导的影响
注：突状物诱导率（%）=（诱导出突状物外植体数÷接种的全部外植体数）×100%。
实施例26-BA对不定芽和植株再生的影响
研究不同浓度的6-BA对不定芽诱导和植株再生的影响：取产生突状物的外植体转移至再生培养基上，在24~26℃，每日12~14h光照、光照强度为1000~1400lux的环境下培养，突状物形成不定芽继而形成完整植株；所述再生培养基为以MS培养基为基本培养基，并按表2添加一定浓度的6-苄基氨基腺嘌呤，以及20~40g/L蔗糖，pH5.8~6.0，实验结果如表2所示。结果表明，6-BA的浓度影响朱顶红花瓣的不定芽诱导率及植株的再生率。当6-BA浓度为0~0.5mg/L时，不定芽诱导率达100%，植株再生率≥92%；当6-BA浓度为0.5mg/L时，不定芽诱导率达100%，植株再生率达98%，平均每个外植体上再生植株达12.8棵。
表26-BA对不定芽诱导和植株再生的影响
注：不定芽诱导率（%）=（形成不定芽的外植体数÷接种的全部外植体数）×100%；植株再生率（%）=（再生出植株的外植体数÷接种的全部外植体数）×100%。
实施例3
一种朱顶红花瓣组织诱导再生植株的方法，包括如下步骤：
S1.外植体处理：取朱顶红刚刚抽出的幼嫩花序，用自来水清洗后，在超净工作台中，用70%乙醇浸泡15min后，用无菌水清洗3次，用手术刀切除外苞片，然后用镊子取出花蕾，将花瓣垂直于花蕾纵轴进行横切，切成宽度为0.5~1.0mm的环状花瓣细丝，将花瓣细丝作为外植体；
S2.突状物诱导：将切好的呈环状的花瓣细丝外植体迅速转移，水平放置于诱导培养基上，在24~26℃，黑暗条件下培养，大约1周后，花瓣细丝开始膨大，8~12周，花瓣的外表面和伤口部位产生大量突状物；
所述诱导培养基以MS培养基为基本培养基，并添加0.5mg/L噻苯隆、0.1~1.0mg/L2,4-二氯苯氧乙酸、20~40g/L蔗糖，pH5.8~6.0，灭菌待用；
S3.植株再生：将产生突状物的外植体转移至再生培养基上，在24~26℃，每日12~14h光照、光照强度为1000~1400lux的环境下培养4~8周，突状物形成不定芽继而形成完整植株；所述再生培养基以MS培养基为基本培养基，并添加0.5mg/L6-苄基氨基腺嘌呤，20~40g/L蔗糖，pH5.8~6.0。
按上述条件进行培养，突状物的诱导率为100%，不定芽诱导率为100%，植株再生率为98%，平均每个外植体上再生植株达12.8棵。
对比例1
本对比例对朱顶红花瓣外植体的处理方式采用：取出花蕾，将花瓣平行于花蕾纵轴进行纵切，将纵切的花瓣作为外植体。花瓣外植体诱导再生植株的其他步骤与实施例3相同。比较本对比例与实施例3的突状物诱导率、不定芽诱导率及植株再生率，结果见表3。
对比例2
本对比例对朱顶红花瓣外植体的处理方式采用：取出花蕾，将花瓣切成1cm2的块状作为外植体。花瓣外植体诱导再生植株的其他步骤与实施例3相同。比较本对比例与实施例3的突状物诱导率、不定芽诱导率及植株再生率，结果见表3。
对比例3
本对比例将花瓣外植体诱导再生植株的各步骤与实施例3相同，但所述诱导培养基的组成不同。本对比例诱导培养基以MS培养基为基本培养基，并添加0.5mg/LNAA、0.1~1.0mg/L2,4-D、20~40g/L蔗糖，pH5.8~6.0，灭菌待用。比较本对比例与实施例3的突状物诱导率、不定芽诱导率及植株再生率，结果见表3。
表3不同处理方式对朱顶红花瓣组织诱导再生植株的影响
Claims (9)
1.一种朱顶红花瓣组织诱导再生植株的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.外植体处理：取朱顶红幼嫩花序，经表面消毒后，切除外苞片，取出花蕾，将花瓣垂直于花蕾纵轴进行横切，切成宽度≤1.0mm的环状花瓣细丝，将花瓣细丝作为外植体；
S2.突状物诱导：将处理好的外植体水平放置于诱导培养基上，在24~26℃，黑暗条件下培养，花瓣的外表面产生突状物；
S3.植株再生：将产生突状物的外植体转移至再生培养基上，在24~26℃，每日12~14h光照环境下培养，突状物形成不定芽继而形成完整植株；
其中，S2所述诱导培养基以MS培养基为基本培养基，并添加0.1~1.0mg/L噻苯隆、0.1~3.0mg/L2,4-二氯苯氧乙酸、20~40g/L蔗糖，pH5.8~6.0。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S1所述花瓣被切成宽度为0.8~1.0mm的环状细丝。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S3所述光照的强度为1000~1400lux。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述噻苯隆的添加量为0.5mg/L，所述2,4-二氯苯氧乙酸的添加量为0.1~1.0mg/L。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S3所述再生培养基以MS培养基为基本培养基，并添加0~1.0mg/L6-苄基氨基腺嘌呤、20~40g/L蔗糖，pH5.8~6.0。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述6-苄基氨基腺嘌呤的添加量为0~0.5mg/L。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S1所述消毒的方法为用70%乙醇浸泡15min后，用无菌水清洗3次。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S2所述培养的时间为8~12周，S3所述培养的时间为4~8周。
9.根据权利要求1~8任一项所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.外植体处理：取朱顶红幼嫩花序，70%乙醇浸泡15min后，用无菌水清洗3次，切除外苞片，取出花蕾，将花瓣垂直于花蕾纵轴进行横切，切成宽度为0.8~1.0mm的环状花瓣细丝，将花瓣细丝作为外植体；
S2.突状物诱导：将处理好的外植体水平放置于诱导培养基上，在24~26℃，黑暗条件下培养8~12周，花瓣的外表面产生突状物；
S3.植株再生：将产生突状物的外植体转移至再生培养基上，在24~26℃，每日12~14h光照、光照强度为1000~1400lux的环境下培养4~8周，突状物形成不定芽继而形成完整植株；
S2所述诱导培养基为以MS培养基为基本培养基，添加0.5mg/L噻苯隆、0.1~1.0mg/L2,4-二氯苯氧乙酸、20~40g/L蔗糖，pH5.8~6.0；
S3所述再生培养基为以MS培养基为基本培养基，添加0.5mg/L6-苄基氨基腺嘌呤，20~40g/L蔗糖，pH5.8~6.0。
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