CN103141390A - 红苞半蒴苣苔的繁殖方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种红苞半蒴苣苔的繁殖方法。本发明提供的红苞半蒴苣苔的繁殖方法，包括如下步骤：（1）将红苞半蒴苣苔的叶片灭菌后切块，即为外植体；（2）将步骤（1）得到的外植体接种于诱导培养基上，20-28℃、光强为20μmol·m-2·s-1以下的条件下培养，获得不定芽；（3）将步骤（2）得到的不定芽转接至繁殖培养基，20-28℃光照培养，获得丛生芽；（4）将步骤（3）得到的丛生芽切分后转接至生根培养基，20-28℃光照培养至生根。本发明开辟了一条人工快速繁殖红苞半蒴苣苔的途径，使红苞半蒴苣苔的规模化工业生产成为可能，从而为今后进一步保护和利用该物种奠定了良好的基础，具有广泛的应用前景。

Description

红苞半蒴苣苔的繁殖方法
技术领域
本发明涉及一种红苞半蒴苣苔的繁殖方法。
背景技术
全世界苦苣苔科(Gesneriaceae)植物约有150属3700余种，分布于亚洲东部和南部、非洲、欧洲南部、大洋洲、南美洲至墨西哥的热带至温带地区。我国现已知的有58属463种(27属特产于中国)，均属苦苣苔亚科，绝大部分种类具有较高的观赏价值，其中药用植物约100多种，且有相当一部分为濒危植物。
半蒴苣苔属为中国特有属，共24种，5个变种，其中贵州半蒴苣苔(Hemiboeacavaleriei)、峨眉半蒴苣苔(Hemiboea omeiensis)、半蒴苣苔(Hemiboeasubcapitata)、短茎半蒴苣苔(Hemiboea subacaulis)、华南半蒴苣苔(Hemiboeafollicularis)等均为民间传统草药，但由于分布范围狭窄、对环境条件要求较高、生境恶劣，致使种群数量过少，而在自然状态下该属植物常籍匍匐枝行营养繁殖，增殖速度较慢。
红苞半蒴苣苔(Hemiboea rubribracteata)是2004年发表的苦苣苔科半蒴苣苔属的新种，为多年生草本或半灌木，花和红色总苞美丽，供观赏。目前仅在广西靖西发现一个分布点，生于石灰岩山地峡谷疏林中潮湿岩石上，数量稀少，个体总数不及60株，急需保护。因此，如何妥善保存稀有的种植资源成为一个需要迫切解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种红苞半蒴苣苔的繁殖方法。
本发明提供的红苞半蒴苣苔的繁殖方法，包括如下步骤：
（1）将红苞半蒴苣苔的叶片灭菌后切块，即为外植体；
（2）将步骤（1）得到的外植体接种于诱导培养基上，20-28℃（如23±1℃-25±1℃、25±1℃-27±1℃、23±1℃、25±1℃或27±1℃）、光强为20μmol·m-2·s-1以下（如10-20μmol·m-2·s-1、10μmol·m-2·s-1、20μmol·m-2·s-1或黑暗）的条件下培养，获得不定芽；
所述诱导培养基的pH值为5.8-6.0；
所述诱导培养基是在MS固体培养基中加入蔗糖、KT和IBA得到的，蔗糖的浓度为20-30g·L-1（如20g·L-1或30g·L-1）、KT的浓度为0.1-1.0mg·L-1（如0.1-0.2mg·L-1、0.2-0.5mg·L-1、0.5-1.0mg·L-1、0.1mg·L-1、0.2mg·L-1、0.5mg·L-1或1.0mg·L-1）、IBA的浓度为0.1-0.5mg·L-1（如0.1-0.2mg·L-1、0.2-0.3mg·L-1、0.3-0.5mg·L-1、0.1mg·L-1、0.2mg·L-1、0.3mg·L-1或0.5mg·L-1）；
（3）将步骤（2）得到的不定芽转接至繁殖培养基，20-28℃（如23±1℃-25±1℃、25±1℃-27±1℃、23±1℃、25±1℃或27±1℃）光照培养，获得丛生芽；
所述繁殖培养基的pH值为5.8-6.0；
所述繁殖培养基是在MS固体培养基中加入蔗糖、KT和NAA得到的，蔗糖的浓度为20-30g·L-1（如20g·L-1或30g·L-1）、KT的浓度为0.1-1.0mg·L-1（如0.1-0.2mg·L-1、0.2-0.5mg·L-1、0.5-1.0mg·L-1、0.1mg·L-1、0.2mg·L-1、0.5mg·L-1或1.0mg·L-1）、NAA的浓度为0.1-0.5mg·L-1（如0.1-0.2mg·L-1、0.2-0.3mg·L-1、0.3-0.5mg·L-1、0.1mg·L-1、0.2mg·L-1、0.3mg·L-1或0.5mg·L-1）；
（4）将步骤（3）得到的丛生芽切分后转接至生根培养基，20-28℃（如23±1℃-25±1℃、25±1℃-27±1℃、23±1℃、25±1℃或27±1℃）光照培养至生根；
所述生根培养基的pH值为5.8-6.0；
所述生根培养基为培养基甲或培养基乙；
所述培养基甲的制备方法：在1/2MS固体培养基中加入蔗糖和IBA，蔗糖的浓度为20-30g·L-1（如20g·L-1或30g·L-1）、IBA的浓度为0.1-0.5mg·L-1（如0.1-0.2mg·L-1、0.2-0.5mg·L-1、0.1mg·L-1、0.2mg·L-1或0.5mg·L-1）；
所述培养基乙的制备方法：在1/2MS固体培养基中加入蔗糖、IBA和活性炭，蔗糖的浓度为20-30g·L-1（如20g·L-1或30g·L-1）、IBA的浓度为0.1-0.5mg·L-1（如0.1-0.2mg·L-1、0.2-0.5mg·L-1、0.1mg·L-1、0.2mg·L-1或0.5mg·L-1）、活性炭的浓度为0.1-0.5g/100mL（如0.1-0.2g/100mL、0.2-0.5g/100mL、0.1g/100mL、0.2g/100mL或0.5g/100mL）。
所述步骤（1）中：将红苞半蒴苣苔的叶片灭菌后切成0.5-0.8cm2大小，即为外植体；
所述步骤（1）中所述灭菌的方法为：用质量百分含量为0.1%的HgCl2水溶液侵泡1.5-2.5分钟（如1.5-2分钟、2-2.5分钟、1.5分钟、2分钟或2.5分钟）。
所述步骤（2）中，所述培养的时间为30-50天（如30-40天、40-45天、45-50天、40天、45天、50天或30天）。
所述步骤（2）中，所述培养为光照培养，每天的光照时间为12-14小时。
所述步骤（3）中，所述光照培养的光强为50-80μmol·m-2·s-1（如50-60μmol·m-2·s-1、60-80μmol·m-2·s-1、50μmol·m-2·s-1、60μmol·m-2·s-1或80μmol·m-2·s-1），每天的光照时间为14小时。
所述步骤（3）中，每30-45天继代一次，每个继代周期增殖3.6-4.3倍（如3.6-3.9倍、3.9-4.3倍、3.6倍、3.9倍或4.3倍）。
所述步骤（3）中，所述光照培养的时间为30-45天。
所述步骤（4）中，所述光照培养的光强为50-80μmol·m-2·s-1（如50-60μmol·m-2·s-1、60-80μmol·m-2·s-1、50μmol·m-2·s-1、60μmol·m-2·s-1或80μmol·m-2·s-1），每天的光照时间为14小时。
所述步骤（4）中，所述光照培养的时间为30天。
所述方法还包括将步骤（4）得到的生根的幼苗移栽至培养基质并培养，获得栽培苗的步骤；所述培养基质由1-2质量份石灰石、2-5质量份蛭石和1-2质量份河沙混合得到。所述培养的时间可为20-30天。所述培养的条件为：湿润、遮阴的环境。
外植体处理是影响外植体存活的重要因素，由于红苞半蒴苣苔叶片略为革质，单薄，两面无毛或仅脉上疏生短柔毛，在灭菌处理过程中要格外注意时间控制，避免过分杀菌而导致外植体死亡。
本发明的方法中所用培养基均以MS培养基或1/2MS培养基为基本培养基，根据不同的培养目的，附加不同剂量的活性炭和激素类物质(KT、NAA和IBA)。MS为国际通用的培养基。1/2MS培养基于MS培养基的差别仅在于大量元素和微量元素减半。
本发明通过摸索一系列合理的培养基配方和培养条件，实现了使红苞半蒴苣苔有效繁殖的目的，可有目的地诱导外植体细胞不定芽的形成、丛生芽繁殖体系的建立以及生根。利用组织培养方法进行快速繁殖，试管苗的繁殖速度是以几何级数增殖的，本发明从外植体的诱导到获得栽培苗只需要130天，试管苗移栽成活率可达90％以上。本发明开辟了一条人工快速繁殖红苞半蒴苣苔的途径，使红苞半蒴苣苔的规模化工业生产成为可能，从而为今后进一步保护和利用该物种奠定了良好的基础，具有广泛的应用前景。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，
均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。KT即激动素。IBA即3-吲哚丁酸。NAA即α-萘乙酸。
红苞半蒴苣苔(Hemiboea rubribracteata)：李振宇,刘演.广西半蒴苣苔属（苦苣苔科）一新种----红苞半蒴苣苔.植物分类学报,2004,42(6):537-540.。
MS培养基的组成见表1。
表1MS培养基的组成
Figure BDA00002908180200041
实施例1、红苞半蒴苣苔的繁殖
1、制备外植体（在超净台操作）
取红苞半蒴苣苔的叶片，用自来水清洗干净，然后用0.1%（质量比）HgCl2水溶液侵泡2分钟，用无菌水洗涤4次，然后将叶片切成0.8cm2大小，即为外植体。
2、不定芽的诱导
将步骤1得到的外植体接种于诱导培养基上，25±1℃黑暗培养50天（其中从第20天开始陆续形成不定芽）。
诱导培养基（pH值6.0）是在MS固体培养基中加入蔗糖、KT和IBA得到的，蔗糖的浓度为30g·L-1、KT的浓度为1.0mg·L-1、IBA的浓度为0.5mg·L-1。
3、增殖继代培养
将步骤2得到的不定芽转接至繁殖培养基，25±1℃、每天光照14h（光强为50μmol·m-2·s-1）培养30天（从第20天开始陆续形成丛生芽）；如需进一步扩繁，可以每30天继代一次，每个继代周期增殖3.6倍。
繁殖培养基（pH值6.0）是在MS固体培养基中加入蔗糖、KT和NAA得到的，蔗糖的浓度为30g·L-1、KT的浓度为0.5mg·L-1、NAA的浓度为0.3mg·L-1。
4、生根培养
将步骤3得到的丛生芽切分后转接至生根培养基，25±1℃、每天光照14h（光强为50μmol·m-2·s-1）培养30天，得到生根的试管苗。
生根培养基（pH值6.0）是在1/2MS固体培养基中加入蔗糖、IBA和活性炭得到的，蔗糖的浓度为20g·L-1、IBA的浓度为0.1mg·L-1、活性炭的浓度为0.2g/100mL。
5、试管苗的移栽
将200株步骤4得到的试管苗单株移栽至培养基质（将2体积份石灰石、5体积份河沙和2体积份蛭石混合得到），放置于湿润、遮阴的环境培养30天。试管苗的成活率（即成活植株占移栽至培养基质的单株总株数的百分比）为90%（三次重复实验的平均值），苗高均为4～6cm。
实施例2、红苞半蒴苣苔的繁殖
1、制备外植体（在超净台操作）
取红苞半蒴苣苔的叶片，用自来水清洗干净，然后用0.1%（质量比）HgCl2水溶液侵泡2分钟，用无菌水洗涤4次，然后将叶片切成0.8cm2大小，即为外植体。
2、不定芽的诱导
将步骤1得到的外植体接种于诱导培养基上，23±1℃、每天光照14h（光强为10μmol·m-2·s-1）培养45天（其中从第20天开始陆续形成不定芽）。
诱导培养基（pH值5.8）是在MS固体培养基中加入蔗糖、KT和IBA得到的，蔗糖的浓度为30g·L-1、KT的浓度为0.2mg·L-1、IBA的浓度为0.2mg·L-1。
3、增殖继代培养
将步骤2得到的不定芽转接至繁殖培养基，23±1℃、每天光照14h（光强为80μmol·m-2·s-1）培养30天（从第20天开始陆续形成丛生芽）；如需进一步扩繁，可以每30天继代一次，每个继代周期增殖3.9倍。
繁殖培养基（pH值5.8）是在MS固体培养基中加入蔗糖、KT和NAA得到的，蔗糖的浓度为30g·L-1、KT的浓度为0.1mg·L-1、NAA的浓度为0.1mg·L-1。
4、生根培养
将步骤3得到的丛生芽切分后转接至生根培养基，23±1℃、每天光照14h（光强为80μmol·m-2·s-1）培养30天，得到生根的试管苗。
生根培养基（pH值5.8）是在1/2MS固体培养基中加入蔗糖和IBA得到的，蔗糖的浓度为20g·L-1、IBA的浓度为0.5mg·L-1。
5、试管苗的移栽
将200株步骤4得到的试管苗单株移栽至培养基质（将1体积份石灰石、2体积份河沙和1体积份蛭石混合得到），放置于湿润、遮阴的环境培养30天。试管苗的成活率为93%（三次重复实验的平均值），苗高均为4～6cm。
实施例3、红苞半蒴苣苔的繁殖
1、制备外植体（在超净台操作）
取红苞半蒴苣苔的叶片，用自来水清洗干净，然后用0.1%（质量比）HgCl2水溶液侵泡2.5分钟，用无菌水洗涤4次，然后将叶片切成0.8cm2大小，即为外植体。
2、不定芽的诱导
将步骤1得到的外植体接种于诱导培养基上，27±1℃、每天光照14h（光强为20μmol·m-2·s-1）培养40天（其中从第20天开始陆续形成不定芽）。
诱导培养基（pH值5.8）是在MS固体培养基中加入蔗糖、KT和IBA得到的，蔗糖的浓度为30g·L-1、KT的浓度为0.5mg·L-1、IBA的浓度为0.3mg·L-1。
3、增殖继代培养
将步骤2得到的不定芽转接至繁殖培养基，27±1℃、每天光照14h（光强为60μmol·m-2·s-1）培养30天（从第20天开始陆续形成丛生芽）；如需进一步扩繁，可以每30天继代一次，每个继代周期增殖4.3倍。
繁殖培养基（pH值5.8）是在MS固体培养基中加入蔗糖、KT和NAA得到的，蔗糖的浓度为30g·L-1、KT的浓度为0.2mg·L-1、NAA的浓度为0.2mg·L-1。
4、生根培养
将步骤3得到的丛生芽切分后转接至生根培养基，27±1℃、每天光照14h（光强为60μmol·m-2·s-1）培养30天，得到生根的试管苗。
生根培养基（pH值5.8）是在1/2MS固体培养基中加入蔗糖、IBA和活性炭得到的，蔗糖的浓度为20g·L-1、IBA的浓度为0.2mg·L-1、活性炭的浓度为0.5g/100mL。
5、试管苗的移栽
将200株步骤4得到的试管苗单株移栽至培养基质（将1体积份石灰石、3体积份河沙和1体积份蛭石混合得到），放置于湿润、遮阴的环境培养30天。试管苗的成活率为95%（三次重复实验的平均值），苗高均为4～6cm。
实施例4、红苞半蒴苣苔的繁殖
1、制备外植体（在超净台操作）
取红苞半蒴苣苔的叶片，用自来水清洗干净，然后用0.1%（质量比）HgCl2水溶液侵泡1.5分钟，用无菌水洗涤4次，然后将叶片切成0.5cm2大小，即为外植体。
2、不定芽的诱导
将步骤1得到的外植体接种于诱导培养基上，25±1℃、每天光照12h（光强为10μmol·m-2·s-1）培养30天（其中从第20天开始陆续形成不定芽）。
诱导培养基（pH值6.0）是在MS固体培养基中加入蔗糖、KT和IBA得到的，蔗糖的浓度为20g·L-1、KT的浓度为0.1mg·L-1、IBA的浓度为0.1mg·L-1。
3、增殖继代培养
将步骤2得到的不定芽转接至繁殖培养基，25±1℃、每天光照14h（光强为60μmol·m-2·s-1）培养45天（从第20天开始陆续形成丛生芽）；如需进一步扩繁，可以每45天继代一次，每个继代周期增殖4.3倍。
繁殖培养基（pH值6.0）是在MS固体培养基中加入蔗糖、KT和NAA得到的，蔗糖的浓度为20g·L-1、KT的浓度为1.0mg·L-1、NAA的浓度为0.5mg·L-1。
4、生根培养
将步骤3得到的丛生芽切分后转接至生根培养基，25±1℃、每天光照14h（光强为60μmol·m-2·s-1）培养30天，得到生根的试管苗。
生根培养基（pH值6.0）是在1/2MS固体培养基中加入蔗糖、IBA和活性炭得到的，蔗糖的浓度为30g·L-1、IBA的浓度为0.5mg·L-1、活性炭的浓度为0.1g/100mL。
5、试管苗的移栽
将200株步骤4得到的试管苗单株移栽至培养基质（将1体积份石灰石、3体积份河沙和1体积份蛭石混合得到），放置于湿润、遮阴的环境培养30天。试管苗的成活率为95%（三次重复实验的平均值），苗高均为4～6cm。
实施例5、红苞半蒴苣苔的繁殖
生根培养基（pH值6.0）是在1/2MS固体培养基中加入蔗糖和IBA得到的，蔗糖的浓度为30g·L-1、IBA的浓度为0.1mg·L-1。
其它均同实施例4。
试管苗的成活率为93%（三次重复实验的平均值），苗高均为4～6cm。
实施例6、红苞半蒴苣苔的繁殖
生根培养基（pH值5.8）是在1/2MS固体培养基中加入蔗糖和IBA得到的，蔗糖的浓度为30g·L-1、IBA的浓度为0.2mg·L-1。
其它均同实施例4。
试管苗的成活率为94%（三次重复实验的平均值），苗高均为4～6cm。

Claims (10)

1.红苞半蒴苣苔的繁殖方法，包括如下步骤：
（1）将红苞半蒴苣苔的叶片灭菌后切块，即为外植体；
（2）将步骤（1）得到的外植体接种于诱导培养基上，20-28℃、光强为20μmol·m-2·s-1以下的条件下培养，获得不定芽；
所述诱导培养基的pH值为5.8-6.0；所述诱导培养基是在MS固体培养基中加入蔗糖、KT和IBA得到的，蔗糖的浓度为20-30g·L-1、KT的浓度为0.1-1.0mg·L-1、IBA的浓度为0.1-0.5mg·L-1；
（3）将步骤（2）得到的不定芽转接至繁殖培养基，20-28℃光照培养，获得丛生芽；
所述繁殖培养基的pH值为5.8-6.0；所述繁殖培养基是在MS固体培养基中加入蔗糖、KT和NAA得到的，蔗糖的浓度为20-30g·L-1、KT的浓度为0.1-1.0mg·L-1、NAA的浓度为0.1-0.5mg·L-1；
（4）将步骤（3）得到的丛生芽切分后转接至生根培养基，20-28℃光照培养至生根；
所述生根培养基的pH值为5.8-6.0；所述生根培养基为培养基甲或培养基乙；
所述培养基甲的制备方法：在1/2MS固体培养基中加入蔗糖和IBA，蔗糖的浓度为20-30g·L-1、IBA的浓度为0.1-0.5mg·L-1；
所述培养基乙的制备方法：在1/2MS固体培养基中加入蔗糖、IBA和活性炭，蔗糖的浓度为20-30g·L-1、IBA的浓度为0.1-0.5mg·L-1、活性炭的浓度为0.1-0.5g/100mL。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）中所述灭菌的方法为：用质量百分含量为0.1%的HgCl2水溶液侵泡1.5-2.5分钟。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中，所述培养的时间为30-50天。
4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中，所述培养为光照培养，每天的光照时间为12-14小时。
5.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤（3）中，所述光照培养的光强为50-80μmol·m-2·s-1，每天的光照时间为14小时。
6.如权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤（3）中，每30-45天继代一次，每个继代周期增殖3.6-4.3倍。
7.如权利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤（3）中，所述光照培养的时间为30-45天。
8.如权利要求1至7中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤（4）中，所述光照培养的光强为50-80μmol·m-2·s-1，每天的光照时间为14小时。
9.如权利要求1至8中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤（4）中，所述光照培养的时间为30天。
10.如权利要求1至9中任一所述的方法，其特征在于：所述方法还包括将步骤（4）得到的生根的幼苗移栽至培养基质并培养，获得栽培苗的步骤；所述培养基质由1-2质量份石灰石、2-5质量份蛭石和1-2质量份河沙混合得到。
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