CN103461129B - 一种光萼唇柱苣苔组织培养及快速繁殖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种光萼唇柱苣苔组织培养及快速繁殖的方法。本发明以光萼唇柱苣苔叶片为外植体，通过筛选和优化初代诱导、继代增殖、生根和移栽培养基配方和培养条件，经过不定芽的初代诱导、继代增殖和生根培养以及试管苗的移栽阶段，实现光萼唇柱苣苔种苗的快速繁殖，一般只需80天就可以获得光萼唇柱苣苔的幼苗，并且光萼唇柱苣苔幼苗的成活率可达95%以上，从而为该物种的遗传改良、种质资源保护和开发利用奠定基础。
Description
技术领域：
本发明属于植物繁殖领域，具体涉及一种光萼唇柱苣苔组织培养及快速繁殖的方法。
背景技术：
光萼唇柱苣苔（Chirita anachoreta Hance），是苦苣苔科唇柱苣苔属多年生草本，分布于云南、广西、湖南、广东和台湾，喜欢生长在荫蔽的溪边，在野外不常见，居群数量较少，光萼唇柱苣苔叶片两面有柔毛，开白、淡紫色花，花色艳丽、株型秀丽，有较高观赏价值，适合做地被观赏植物。
光萼唇柱苣苔组织培养和快速繁殖的技术，国内外均未见报道。
发明内容：
本发明的目的是提供一种成活率高，能快速繁殖并能大量得到光萼唇柱苣苔幼苗的光萼唇柱苣苔组织培养及快速繁殖的方法。
本发明的光萼唇柱苣苔组织培养及快速繁殖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、外植体消毒处理：以光萼唇柱苣苔（Chirita anachoreta Hance）植株叶片为外植体，清洗消毒干净后得到消毒后的外植体；
b、不定芽的初代诱导：将消毒后的外植体接种到诱导培养基上，在温度25±1℃、光照强度50μmol·m-2·s-1、光照时间12h·d-1的条件下培养，外植体诱导形成不定芽，所用的诱导培养基为：每升含有BAP（苄氨基嘌呤）0.1～0.5μmol、TDZ（N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲）0.1μmol、IBA（3-吲哚丁酸）0.1μmol、蔗糖30g、琼脂5.5g，其余为MS培养基，pH为5.8；
c、芽的继代增殖：将不定芽丛切成块，转入继代的培养基上，在温度25±1℃、光照强度50μmol·m-2·s-1、光照时间12h·d-1的条件下培养，从生芽生长健壮成芽苗，所用的继代的培养基为：每升含有BAP（苄氨基嘌呤）0.1μmol、NAA（萘乙酸）0～0.1μmol、蔗糖30g、琼脂5.5g、其余为MS培养基，pH为5.8；
d、生根培养：将高2～3cm的芽苗分切转入生根培养基上，在温度25±1℃、光照强度50μmol·m-2·s-1、光照时间12h·d-1的条件下培养，形成生根的试管苗，所述的生根培养基为：每升含有NAA（萘乙酸）0.5～1.0μmol、蔗糖30g、琼脂5.5g、其余为1/2MS培养基，pH为5.8；
e、试管苗移栽：将长好根的试管苗移栽到移栽基质中，放置于遮荫温室中培养，浇水保湿，其他按常规条件进行培养，由此得到光萼唇柱苣苔幼苗，所用的移栽基质为：腐质土和蛭石按质量比2∶1混合均匀。
所述的光萼唇柱苣苔优选为野生的光萼唇柱苣苔。
所述的清洗消毒干净优选是先用清水将外植体冲洗干净，再使用质量分数0.1%升汞溶液消毒5-6分钟，无菌水冲洗干净。
所述的MS培养基为国际通用的培养基，其成份和配置方法可参考书籍(谭文澄、戴策刚主编.观赏植物组织培养技术.北京：中国林业出版社，1991.)。
所述的1/2MS培养基是把MS培养基的微量元素减少到原来的1/2，其余成份不变。
本发明以光萼唇柱苣苔叶片为外植体，通过筛选和优化初代诱导、继代增殖、生根和移栽培养基配方和培养条件，经过不定芽的初代诱导、继代增殖和生根培养以及试管苗的移栽阶段，实现光萼唇柱苣苔种苗的快速繁殖，一般只需80天就可以获得光萼唇柱苣苔的幼苗，并且光萼唇柱苣苔幼苗的成活率可达95%以上，从而为该物种的遗传改良、种质资源保护和开发利用奠定基础。
附图说明：
图1是不同植物生长调节剂对光萼唇柱苣苔叶片离体培养的影响。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
a、外植体消毒处理：以广东省南昆山石河奇观景区的野生光萼唇柱苣苔（Chiritaanachoreta Hance）植株叶片为外植体，先用清水将外植体冲洗干净，再使用质量分数0.1%升汞溶液消毒5分钟，无菌水冲洗干净，得到消毒后的外植体；
b、不定芽的初代诱导：将消毒后的外植体接种到诱导培养基上，在温度25±1℃、光照强度50μmol·m-2·s-1、光照时间12h·d-1的条件下，培养20天，叶片外植体诱导形成不定芽，所用的诱导培养基为：每升含有BAP（苄氨基嘌呤）0.1μmol、TDZ（N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲）0.1μmol、IBA（3-吲哚丁酸）0.1μmol、蔗糖30g、琼脂5.5g，其余为MS培养基，pH为5.8，将上述各成份混合均匀后灭菌备用，诱导系数为47.5；
本发明人以每升含有TDZ（N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲）1.0μmol L-1、蔗糖30g、琼脂5.5g，其余为MS培养基，pH为5.8作为诱导培养基，其他条件同上，结果发现，如图1-A所示，玻璃花严重。以每升含有BAP（苄氨基嘌呤）1μmol、蔗糖30g、琼脂5.5g，其余为MS培养基，pH为5.8作为诱导培养基，其他条件同上，结果发现，如图1-B所示，玻璃花严重。只有以每升含有BAP（苄氨基嘌呤）0.1μmol、TDZ（N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲）0.1μmol、IBA（3-吲哚丁酸）0.1μmol、蔗糖30g、琼脂5.5g，其余为MS培养基，pH为5.8作为诱导培养基，才能诱导产生不定芽，生长正常（图1-C）。
c、芽的继代增殖：将不定芽丛切成块，转入继代的培养基上，在温度25±1℃、光照强度50μmol·m-2·s-1、光照时间12h·d-1的条件下，培养30天，从生芽生长健壮成芽苗，所用的继代的培养基为：每升含有BAP（苄氨基嘌呤）0.1μmol、蔗糖30g、琼脂5.5g、其余为MS培养基，pH为5.8，将上述各成份混合均匀后灭菌备用；
d、生根培养：将高2–3cm的芽苗分切转入生根培养基上，在温度25±1℃、光照强度50μmol·m-2·s-1、光照时间12h·d-1的条件下，培养25天后，形成生根的试管苗，所述的生根培养基为：每升含有NAA（萘乙酸）0.5μmol、蔗糖30g、琼脂5.5g、其余为1/2MS培养基，pH为5.8，将上述各成份混合均匀后灭菌备用；
e、试管苗移栽：将长好根的试管苗移栽到移栽基质中，放置于遮荫温室中培养，浇水保湿，其他按常规条件进行培养，由此得到光萼唇柱苣苔幼苗，所用的移栽基质为：腐质土和蛭石按质量比2∶1混合均匀。
本实施例从取外植体到幼苗的获得，总计需要90天左右，并且光萼唇柱苣苔幼苗的成活率可达95%以上，大大的加快了光萼唇柱苣苔幼苗的获取，并由于是组织培养的方法，因此可以快速大量的获得光萼唇柱苣苔幼苗。
实施例2：
a、外植体消毒处理：以广东省南昆山石河奇观景区的野生光萼唇柱苣苔（Didymostigmaobtusum（Clarke）W.T.Wang）植株叶片为外植体，先用清水将外植体冲洗干净，再使用质量分数0.1%升汞溶液消毒6分钟，无菌水冲洗干净，得到消毒后的外植体；
b、不定芽的初代诱导：将消毒后的外植体接种到诱导培养基上，在温度25±1℃、光照强度50μmol·m-2·s-1、光照时间12h·d-1的条件下，培养20天，叶片外植体诱导形成不定芽，所用的诱导培养基为：每升含有BAP（苄氨基嘌呤）0.5μmol、TDZ（N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲）0.1μmol、IBA（3-吲哚丁酸）0.1μmol、蔗糖30g、琼脂5.5g，其余为MS培养基，pH为5.8，将上述各成份混合均匀后灭菌备用，诱导系数为50.5；
c、芽的继代增殖：将不定芽丛切成块，转入继代的培养基上，在温度25±1℃、光照强度50μmol·m-2·s-1、光照时间12h·d-1的条件下，培养30天，从生芽生长健壮成芽苗，所用的继代的培养基为：每升含有BAP（苄氨基嘌呤）0.1μmol、NAA（萘乙酸）0.1μmol、蔗糖30g、琼脂5.5g、其余为MS培养基，pH为5.8，将上述各成份混合均匀后灭菌备用；
d、生根培养：将高2–3cm的芽苗分切转入生根培养基上，在温度25±1℃、光照强度50μmol·m-2·s-1、光照时间12h·d-1的条件下，培养25天后，生根的试管苗形成（如图1-D所示，根系生长良好），所述的生根培养基为：每升含有NAA（萘乙酸）1.0μmol、蔗糖30g、琼脂5.5g、其余为1/2MS培养基，pH为5.8，将上述各成份混合均匀后灭菌备用；
e、试管苗移栽：将长好根的试管苗移栽到移栽基质中，放置于遮荫温室中培养，浇水保湿，其他按常规条件进行培养，由此得到光萼唇柱苣苔幼苗（如图1-E所示，20天后试管苗移栽成活），所用的移栽基质为：腐质土和蛭石按质量比2∶1混合均匀。
本实施例从取外植体到幼苗的获得，总计需要90天左右，并且光萼唇柱苣苔幼苗的成活率可达95%以上，大大的加快了光萼唇柱苣苔幼苗的获取，并由于是组织培养的方法，因此可以快速大量的获得光萼唇柱苣苔幼苗。
Claims (2)
1.一种光萼唇柱苣苔组织培养及快速繁殖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、外植体消毒处理：以光萼唇柱苣苔(Chirita anachoreta Hance)植株叶片为外植体，清洗消毒干净后得到消毒后的外植体；
b、不定芽的初代诱导：将消毒后的外植体接种到诱导培养基上，在温度25±1℃、光照强度50μmol·m-2·s-1、光照时间12h·d-1的条件下培养，外植体诱导形成不定芽，所用的诱导培养基为：每升含有苄氨基嘌呤0.1～0.5μmol、N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲0.1μmol、3-吲哚丁酸0.1μmol、蔗糖30g、琼脂5.5g，其余为MS培养基，pH为5.8；
c、芽的继代增殖：将不定芽丛切成块，转入继代的培养基上，在温度25±1℃、光照强度50μmol·m-2·s-1、光照时间12h·d-1的条件下培养，从生芽生长健壮成芽苗，所用的继代的培养基为：每升含有苄氨基嘌呤0.1μmol、萘乙酸0～0.1μmol、蔗糖30g、琼脂5.5g、其余为MS培养基，pH为5.8；
d、生根培养：将高2～3cm的芽苗分切转入生根培养基上，在温度25±1℃、光照强度50μmol·m-2·s-1、光照时间12h·d-1的条件下培养，形成生根的试管苗，所述的生根培养基为：每升含有萘乙酸0.5～1.0μmol、蔗糖30g、琼脂5.5g、其余为1/2MS培养基，pH为5.8；
e、试管苗移栽：将长好根的试管苗移栽到移栽基质中，放置于遮荫温室中培养，浇水保湿，其他按常规条件进行培养，由此得到光萼唇柱苣苔幼苗，所用的移栽基质为：腐质土和蛭石按质量比2∶1混合均匀；
所述的清洗消毒干净是先用清水将外植体冲洗干净，再使用质量分数0.1％升汞溶液消毒5-6分钟，无菌水冲洗干净；
所述的1/2MS培养基是把MS培养基的微量元素减少到原来的1/2，其余成份不变。
2.根据权利要求1所述的光萼唇柱苣苔组织培养及快速繁殖的方法，其特征在于，所述的光萼唇柱苣苔为野生的光萼唇柱苣苔。
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