CN101157936A - 一种诱导甘草产生毛状根的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种诱导甘草产生毛状根的方法。本发明所提供的诱导甘草产生毛状根的方法，是将甘草子叶节与含有Ri质粒的发根农杆菌共培养，然后，以含有头孢霉素的无菌水冲洗之后转入到诱导培养基中诱导培养，在甘草子叶节上生长出甘草毛状根。本发明首次以甘草子叶节为受体材料，通过发根农杆菌介导实现甘草发根的诱导，既缩短了甘草发根出现的时间，4天即可以产生出发根；又提高了转化效率，达到96％以上。并且，发根中活性成分如甘草黄酮高，达到1.6％；为利用甘草发根培养物来生产有用的甘草酸和甘草黄酮奠定了良好的基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种诱导甘草产生毛状根的方法。
背景技术
甘草是我国重要的传统中药，具有清热解毒、润肺祛痰、缓急止痛、补气益脾胃、调和诸药等功效，被誉为“百草之王”，其药用价值是任何其他资源不能替代的。甘草的主要药效成分包括甘草酸和甘草黄酮，其中甘草酸是非常珍贵的解毒剂，可防治病毒性肝炎、高血脂、癌症和艾滋病等疾病；甘草黄酮具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗溃疡、抗衰老、保肝等药理作用。甘草不仅是重要药材，还广泛应用于日用化工品及食品领域，其中甘草酸是一种天然甜味剂，而甘草黄酮是一类天然抗菌剂和防腐剂。
随着甘草的不断开发利用，国内国际两个市场2006年～2008年的需求总量为9万～10万吨，但全国甘草总产量只有2.5万～3万吨，市场缺口高达6.5万～7万吨。需求告急，短缺已趋白热化，严重地影响了企业生产和医院用药。2001年9月我国为了保护日益匮乏的甘草资源，限制了对野生甘草的采挖，甘草原料缺乏加剧。目前，人工栽培还是甘草生产的主要途径，然而人工栽培周期长，并受地域限制，不能满足市场需求，品质方面也存在一些问题，特别是在有效成分量上，人工甘草与野生甘草存在相当的距离。因此甘草资源匮乏及其质量的严重下降成为限制甘草深度开发利用的瓶颈，迫切需要寻找新的解决再生甘草资源的有效途径。
随着生物工程技术的不断提高，利用发根农杆菌诱导药用植物产生毛状根，并对毛状根进行离体培养，迅速大量的提取有效成分，是药用植物资源可持续发展的有效途径之一。甘草发根的诱导研究早在八十年代已经开始，并已成为该领域的一个研究热点。目前，关于如何提高甘草发根诱导效率的研究不是很多，大部分报道只注重对影响发根生长因素的研究。陈士云(陈士云，桂耀林 发根土壤杆菌体外转化甘草子叶及下胚轴.武汉植物学研究1991.9.04 301)等采用几种不同发根农杆菌介导甘草下胚轴和子叶发根的诱导，得到了甘草毛状根，各菌株介导的转化效率及不同外植体的诱导效率均有很大差异，最高的诱导率由A15834介导的甘草下胚轴产生，为93％，但每个外植体产生的发根数量少；燕飞(燕飞，梁玉玲，崔东亚，张慧，朱宝成.发根农杆菌转化胀果甘草的研究.河北大学学报(自然科学版).2004年05期)等用R1601发根农杆菌介导甘草下胚轴转化的最高诱导率为56.49％；杨世海(杨世海，刘晓峰，沈昕等，甘草Ri质粒转化及不同理化因子对甘草毛状根生长的影响，中国中药杂志，2006，31(11)：875)等报道用LAB9402介导甘草发根转化，最高诱导率为85.2％。这些研究所采用的外植体均为甘草子叶和下胚轴，诱导率大多较低，其发根的出现时间约为8-10天左右。杜旻(杜旻，向德军，丁家宜等.甘草毛状根培养系统的建立及化学成分分析植物资源与环境学报，2001，10(1)：7～10)等通过A15834和R1000两种发根农杆菌介导产生了甘草发根，所用的外植体为甘草幼茎，最高诱导率仅为39.5％。
综上所述，目前所公开的甘草发根方法的诱导率大多不是很高，发根出现的时间偏长，每个外植体上产生的平均发根数量少，不能满足生产实际需要。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效、稳定、快速的用发根农杆菌介导转化甘草，诱导甘草发根产生的方法。
本发明所提供的诱导甘草产生毛状根的方法，是将甘草子叶节与含有Ri质粒的发根农杆菌共培养，然后，以含有头孢霉素的无菌水冲洗之后转入到诱导培养基中诱导培养，在甘草子叶节上生长出甘草毛状根。
其中，发根农杆菌在与甘草子叶节共培养前，先在固体YEB培养基中28℃培养两天，然后选取单克隆到液体YEB培养基中振荡培养，收集菌液，离心收集菌体；将收集到的菌体以等同于YEB液体培养基体积的MS液体培养基混匀。甘草子叶节来源于甘草种子萌发后三天的无菌苗。
在本发明方法中，共培养所用的共培养基为含有50-300μmol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基；优选为含有200μmol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基。共培养的时间为1-3天，优选为2天。诱导培养基为含有100-1000mg/L头孢霉素的MS固体培养基；优选为含有500mg/L头孢霉素的MS固体培养基。
本发明首次以甘草子叶节为受体材料，通过发根农杆菌介导实现甘草发根的诱导，既缩短了甘草发根出现的时间，诱导培养4天即可以产生出发根；又提高了转化效率，达到96％以上。并且，发根中活性成分甘草总黄酮高，含量可达到发根干重的1.6％，使生药根的两倍多(生药根为0.7％左右)，为利用甘草发根培养物来生产甘草总黄酮奠定了良好的基础。
附图说明
图1为发根农杆菌介导Ri质粒转化甘草子叶节后甘草发根产生的照片；
图2为Ri质粒转化后甘草发根的southern杂交结果。
具体实施方式
本发明用发根农杆菌介导对甘草进行基因转化，诱导发根产生的方法主要操作如下：将甘草子叶节与含有Ri质粒的发根农杆菌共培养，将Ri质粒上带有的T-DNA区转移到受体基因组中。
其中，发根农杆菌应先涂布于固体YEB培养基，28℃培养2天后，选取单克隆菌斑于液体YEB培养基中，28℃振荡培养至一定浓度，再取少量菌液至YEB培养基中扩大培养，然后，将菌液离心收集，去上清，加入同体积的MS液体培养基混匀。甘草种子萌发三天后的子叶节在其中浸染20分钟后，取出用无菌滤纸吸干，接入共培养培养基，共培养2天后，无菌水冲洗，转入无激素的MS固体培养基(含有500mg/L头孢霉素)进行诱导培养。4天后即有发根出现，得到的甘草发根转接入无激素的MS固体培养基中继代生长。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1、用本发明的方法进行甘草发根的诱导
本实施例中，以甘草Glycyrrhiza uralensis种子萌发三天后的子叶节为受体材料；以发根农杆菌A4为介导菌株，该菌株含Ri质粒，无抗性。
具体操作步骤如下：
1、将发根农杆菌A4菌液涂布于YEB固体培养上，28℃培养2天后长出单克隆；
2、随机挑取发根农杆菌A4克隆菌落在液体YEB培养基中，28℃振荡培养至OD600≈0.6-0.9，再取1ml菌液至100ml YEB液体培养基中振荡培养至OD600≈0.5-0.7，收集菌液，3500rpm离心10分钟收集菌体；
3、将收集到的菌体以等同于YEB液体培养基体积并含有200μmol/L乙酰丁香酮的MS液体培养基混匀；
4、将甘草的成熟种子消毒后于1/2MS培养基上萌发三天，从无菌苗上切取带有1mm左右下胚轴和子叶的部分，纵向剖开分成两半，各带一片子叶，然后切去三分之一的子叶部分，保留三分之二的子叶和子叶节(保留部分子叶是为了在培养过程中给子叶节提供营养，发根的发生部位在子叶节处)。以上外植体在上述菌液中浸染20分钟后，取出用无菌滤纸吸干，接入含有200μmol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基，共培养2天；
5、将共培养后的甘草子叶节以含有500mg/L头孢霉素的无菌水冲洗三次，无菌滤纸吸干，转入含有500mg/L头孢霉素的MS固体培养基上培养；4天后即有发根仅在子叶节部分出现，而子叶部分经如此短时间的培养并不会出现发根，并且只有极少数子叶培养10天左右会在伤口处出现少量发根，但看起来仅为一些白点，而这时候子叶节上面的发根已经伸长并向培养基里生长。
6、12天后将从子叶节处得到的甘草发根根尖2-3cm处转接入含有200mg/L头孢霉素的MS固体培养基中除菌并继代培养。
按上述方法，对供试材料进行了遗传转化，共处理500个子叶节，结果有480个外植体成功的诱导出发根，平均每个外植体上的发根数为10根左右，转化效率达到96％。发根农杆菌介导Ri质粒转化甘草子叶节后甘草发根产生的照片如图1所示。
实施例2、发根系的分子检测
随机选取实施例1中得到的3个甘草发根株系，用CTAB法提取总DNA，采用地高辛标记的Ri质粒上与根形成有关的rolC基因片段作探针，进行southern杂交。杂交结果显示，所得到的发根株系全部为阳性，证明发根农杆菌中的T-DNA区已成功整合进甘草根的基因组DNA中。如图2所示，1-3分别为不同的转基因发根系，其中探针为地高辛标记的rolC基因片段；4为未转基因的阴性对照(普通甘草组培根)；5为阳性对照发根农杆菌A4的Ri质粒。
实施例3、发根系中的总黄酮含量检测
以紫外分光光度计检测发根系中的甘草总黄酮含量：取经继代培养20天的甘草发根样品于60℃烘至恒重，粉碎，过60目筛，精密称取0.1g粉末，以甲醇为溶剂超声波提取两次，每次30min，离心，合并滤液定容至10ml，取100μl，加入1ml甲醇和0.5m110％氢氧化钠，定容至2ml，以柚皮苷为标准品，用紫外分光光度计在420nm波长处进行检测，并计算其总黄酮占发根的干重百分比。
结果表明，发根中活性成分甘草总黄酮高，含量可达到发根干重的1.6％，是野生甘草生药根的两倍多(生药根为0.7％左右)。
Claims (6)
1.一种诱导甘草产生毛状根的方法，是将甘草子叶节与含有Ri质粒的发根农杆菌共培养，然后，以含有头孢霉素的无菌水冲洗之后转入到诱导培养基中诱导培养，在甘草子叶节上生长出甘草毛状根。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述发根农杆菌在与甘草子叶节共培养前，先在固体YEB培养基中28℃培养两天，然后选取单克隆到液体YEB培养基中振荡培养，收集菌液，离心收集菌体；将收集到的菌体以等同于YEB液体培养基体积的MS液体培养基混匀。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述甘草子叶节来源于甘草种子萌发后三天的无菌苗。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：共培养所用的共培养基为含有50-300μmol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基；优选为含有200μmol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：共培养的时间为1-3天，优选为2天。
6.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述诱导培养基为含有100-1000mg/L头孢霉素的MS固体培养基；优选为含有500mg/L头孢霉素的MS固体培养基。
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