CN101536672B

CN101536672B - 中药滇黄芩的一种器官发生方法

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Publication number: CN101536672B
Application number: CN2009100221963A
Authority: CN
Inventors: 步怀宇; 岑举人; 王英娟; 赵宇玮; 贾敬芬
Original assignee: Northwest University
Current assignee: Northwest University
Priority date: 2009-04-24
Filing date: 2009-04-24
Publication date: 2012-05-09
Anticipated expiration: 2029-04-24
Also published as: CN101536672A

Abstract

本发明提供了一种利用植物组织培养技术培养滇黄芩，获得稳定遗传稳定再生植株的方法。该方法将茎切成段接种于愈伤诱导培养基MSP1上诱导愈伤组织，生长旺盛的愈伤组织转移到分化培养基MSP2诱导芽的分化，将组培芽苗接种于生根培养基MSP3生根。用植物组织培养技术获得滇黄芩的再生植株，经RAPD检测不同继代次数再生植株遗传稳定，并且通过HPLC对滇黄芩再生植株中黄芩苷的含量进行测定。本发明具有以下优点：取材容易，极易获得无菌材料，变异率低，增值系数高，组培苗生根率达到100％，具有工业化生产前景。

Description

中药滇黄芩的一种器官发生方法

技术领域

本发明涉及中药滇黄芩的一种器官发生方法，属于生物组培育苗技术领域。

背景技术

中药滇黄芩为唇形科黄芩属(Scutellaria)植物滇黄芩(Scutellaria amoenaC.H.Wright)的根，国家三级重点保护野生药材，是西南地区药用黄芩的主流品种，主要用于治疗各种炎症、以及胃痉挛和解除乌头中毒引起的多种中枢神经症状，药用历史悠久，现收载于《云南省药品标准》。

滇黄芩主要含：黄芩素(baicalein)，汉黄芩素(wogonin)，黄芩苷(baicalin)，汉黄芩苷(wogonoside)及31种黄酮类化合物。药理研究证明黄酮类化合物是黄芩属药用植物的主要有效成分，其中含量较高并具有明显药理作用的是黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素。4种成分均有抗氧化清除自由基的作用。黄芩素是其中已知主要成分中最强的自由基清除剂。黄芩苷与黄芩素对人免疫缺陷病毒(HIV)逆转录酶的活性和成人白血病病毒(MLV)逆转录酶有抑制作用倍受人们关注。赵晶(赵晶.两种抗人免疫缺陷病毒天然产物结构修饰的研究.北京协和医学院，1998)研究发现，黄芩素抑制HIV-RT活性较黄芩苷强。黄芩素、黄芩苷和汉黄芩苷有强烈的抗炎活性，其中黄芩素和黄芩苷的作用较强；黄芩苷对临床眼科常见的多种细菌均有不同程度的抑菌作用。此外，研究表明黄芩苷具有一定的免疫调节功能(孔祥鹤，魏朔南，滇黄芩的研究进展及作为黄芩药用的探讨，中国野生植物资源，2008，27(6)：8-11)。

近年来对中国药典收录的正品黄芩及其有效成分药理学特性的研究日趋深入。但相关研究报道多是正品黄芩，其他种类黄芩的研究报道很少。药典以黄芩中具有明显药理作用的黄芩苷的含量作为检测黄芩的质量标准。滇黄芩中黄芩苷含量经HPLC测定为17.90％，高于黄芩的13.16％(刘美兰，杨立新，万元浩，左风，RP-HPLC法测定7种药用黄芩中黄芩苷和汉黄芩苷的含量，药物分析杂志，2002，22(2)：102-108)，因此，滇黄芩是高质量的黄芩替代品，具有较大的药用价值及开发潜力。目前滇黄芩以野生资源为主，因种子直播后出苗不齐，未能形成规模化种植(孔祥鹤，魏朔南，滇黄芩的研究进展及作为黄芩药用的探讨，中国野生植物资源，2008，27(6)：8-11)。植物组织培养技术在保护药用植物野生资源、生产药物有效成分方面发挥了重要的作用。赵振玲等((赵振玲，刘其宁，肖植文，吴学英，杜刚，滇黄芩体胚诱导与植株再生，西南农业学报，2006，19(4)：714-718)和李娅琼等(李娅琼，游春，杨冠，滇黄芩快速繁殖研究，中药材，2007，30(7)：761-762)曾分别报道过滇黄芩体胚诱导再生植株和组培快繁，但未见滇黄芩器官发生途径再生植株的报道。本发明以滇黄芩不带腋芽茎段为材料，建立离体再生体系，克服了滇黄芩种子直播后出苗不齐，未能形成规模化种植的缺点，实现了滇黄芩组培途径的多样化，能在短期内生产出大量滇黄芩组培苗，满足工厂化生产的需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种滇黄芩器官发生的方法，以不带腋芽茎段为外植体，经诱导愈伤、分化丛生芽、继代及植株再生的步骤，快速获得大量遗传稳定的组培苗，克服了滇黄芩种子直播后出苗不齐，未能形成规模化种植的缺点，实现了滇黄芩组培途径的多样化，能在短期内生产出大量滇黄芩组培苗，满足工厂化生产的需求。

本发明实现过程如下：

一种滇黄芩器官发生方法，包括如下步骤：

(1)愈伤组织诱导：将茎切成段接种于愈伤诱导培养基MSP1上诱导愈伤组织；

(2)分化丛生芽：将生长旺盛的愈伤组织转移到分化培养基MSP2诱导芽的分化；

(3)继代及植株再生：将组培芽苗接种于生根培养基MSP3生根；

上述步骤中培养基组分及含量配比如下：

愈伤诱导培养基MSP1：

MS培养基

6-BA 2mg/L

NAA 0.5mg/L

蔗糖 30g/L

琼脂 7g/L

pH 5.8-6.2

分化培养基MSP2：

MS培养基

6-BA 2mg/L

NAA 0.2mg/L

蔗糖 30g/L

琼脂 7g/L

pH 5.8-6.2

生根培养基MSP3：

1/2MS培养基

IBA 0.2mg/L

蔗糖 30g/L

琼脂 7g/L

pH 5.8-6.2。

将茎段外植体清水冲洗后，75％乙醇浸泡30s，然后0.1％HgCl₂浸泡8min灭菌，无菌水冲洗5次，置于无菌滤纸上吸干水分。将叶片切成0.5cm×0.5cm小块，茎段切成0.5cm长的切段，接种于附加培养基MSP1上进行愈伤组织诱导。7d后陆续长出愈伤组织。

将生长旺盛的愈伤组织转移到新鲜分化培养基MSP2上诱导芽的分化。

将分化出芽点的滇黄芩愈伤组织分成大小均匀的小块，继代培养，分化丛生芽。待生长状态良好的小苗长至2～3cm，切下接种于培养基MSP3上诱导生根。将所得到的完整再生植株进行植株扩增繁殖及连续继代培养，以40d为继代周期。

诱导愈伤、分化丛生芽、继代及植株再生的温度25±2℃，光照强度30～40mol·m^-2·s^-1，16h/8h光/暗培养。

分别称取不同继代次数的扦插再生苗叶片0.5g，采用CTAB法提取基因组DNA。选用随机引物对所提取的DNA样品进行RAPD分析。

分别取继代30天的滇黄芩再生植株地下(根)、地上部分(茎叶)，进行HPLC测定。

本发明的优点与积极效果：本发明以不带腋芽茎段为外植体，诱导产生愈伤组织，获得高效稳定的间接器官再生体系。取材容易，极易获得无菌材料，变异率低。而且通过改良培养基成分及其激素种类与配比含量，提高了芽苗质量，从而使每株外植体的繁殖系数大幅度提高。以此方法可快速高效地繁殖出其大量稳定的组培试管苗，每40d为一个周期，每块茎段的繁殖系数可达150-190。该器官发生方式能在短期内生产出大量滇黄芩组培苗，满足工厂化生产的需求。

附图说明

图1为不带腋芽的茎段诱导出的愈伤组织；

图2为分化丛生芽；

图3为再生完整植株；

图4为不同继代次数的再生植株RAPD扩增结果。

具体实施方式

本发明使用的缩略语对应的中文名称如下：

6-BA(6-苄基嘌呤)NAA(萘乙酸)IBA(3-吲哚丁酸)

本发明使用的MS培养基按手册通用方法配制，组成与含量如下：大量元素：NH₄NO₃ 1650mg/L，KNO₃ 1900mg/L，CaCl₂·2H₂O 440mg/L，MgSO₄·7H₂O 370mg/L，KH₂PO₄ 1700mg/L；微量元素：KI 0.83mg/L，H₃BO₃6.2mg/L，MnSO₄·4H₂O 22.3mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg/L，Na₂MnO₄·2H₂O0.25mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L，FeSO₄·7H₂O(27.8)mg/L+Na₂-EDTA·2H₂O(27.3)mg/L；有机成分：肌醇100mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇(维生素B6)0.5mg/L，盐酸硫胺素(维生素B1)0.5mg/L，甘氨酸2mg/L。

以下通过实施例进一步描述本发明。

实施例1：以西北大学生物园中试种的滇黄芩，选取新发出的植株不带腋芽茎段为外植体。清水冲洗后，75％乙醇浸泡30s，然后0.1％HgCl₂浸泡8min灭菌，无菌水冲洗5次，置于无菌滤纸上吸干水分。将叶片切成0.5cm×0.5cm小块，茎段切成0.5cm长的切段，接种于附加6-BA2.0mg/L和NAA0.5mg/L的MS培养基上进行愈伤组织诱导。滇黄芩茎段接种到培养基上3d后，两端开始膨大启动脱分化，约10d后，整个外植体明显膨大(图1)，可见浅黄色的愈伤组织，诱导率达100％。愈伤组织生长初期多为浅黄色，逐渐转化为黄绿色，增殖速度快。

将茎段愈伤组织继代培养在6-BA2.0mg/L，NAA0.2mg/L的MS培养基上，愈伤组织由生长初期的黄色，逐渐转化为黄绿色，表面长出绿色的芽点，芽点生长迅速且其表面分化出大量的丛生芽(图2)。培养20d左右时，芽不断增多，整块愈伤组织遍布丛生芽和小苗。

将增殖后生长状态良好、长约2～3cm的丛生苗培养在IBA 0.2mg/L的1/2MS培养基上，生根率均为100％，数目较多，且根系相对粗壮(图3)。

分别提取连续5次继代试管苗(继代周期40d)的基因组DNA，利用上海生工公司生产的40条RAPD随机引物(编号S21～S40，S101～S120)对不同继代次数的滇黄芩组培再生植株进行RAPD分析。39条随机引物可扩增出清晰的扩增产物，条带数在1～12条之间，总条带为205条，平均5.27条。S34引物未能扩增出条带。39条引物中只有S105扩增产物在不同继代次数的滇黄芩再生苗中表现明显的条带数目差异，其中在第一代和第二代扩增出4条产物带，在继代培养3次后，第2条扩增条带消失，只扩增三条带。其余38条引物扩增条带数目完全相同，特征带型表现一致(图4)。从RAPD分析结果可以看出，滇黄芩茎段经离体再生和多次继代培养后，DNA水平上存在一定程度变异，但变异程度相当小。可见滇黄芩离体培养时间没有引起植物体细胞无性系的明显变异，它的继代培养是一种遗传相对稳定的快繁方式。

组织培养继代30天的滇黄芩再生植株，分别取地下(根)、地上部分(茎叶)55℃，24h烘干，研钵捣成细粉备用。精密称取100mg干粉，加入70％乙醇1.5mL，称重，超声(80Hz，45℃)60min，称重，用70％乙醇补足重量；13,000rpm离心，精密移取上清0.5mL，加入甲醇4.5ml稀释，作为供试品溶液。

精密称取经五氧化二磷减压干燥至恒重的黄芩苷对照品6mg，置10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再吸取1mL上述溶液置10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得黄芩苷0.06mg·mL^-1的对照品溶液。精密移取黄芩苷对照品溶液用甲醇稀释，配成浓度为3.0、6.0、12.0、18.0、24.0、30.0μg/mL的对照品溶液。将上述对照品溶液按色谱条件平行测定3次(20.0μL进样)，记录峰面积。以平均峰面积Y对浓度C(μg/mL)进行线性回归，黄芩苷回归方程和相关系数分别为Y＝60355X-12822，r＝0.9992。

制备滇黄芩再生植株供试品溶液，每次进样20.0μL测定，以3次平均峰面积通过回归方程计算，得到每个样品中黄芩苷的含量。结果表明滇黄芩地下部分根的黄芩苷含量为0.12％。地上部分的黄芩苷含量为0.43％，高出地下部分的黄芩苷的含量。

实施例2：以西北大学生物园中试种的滇黄芩，选取新发出的植株不带腋芽茎段为外植体。清水冲洗后，75％乙醇浸泡30s，然后0.1％HgCl₂浸泡8min灭菌，无菌水冲洗5次，置于无菌滤纸上吸干水分。将叶片切成0.5cm×0.5cm小块，茎段切成0.5cm长的切段，接种于附加6-BA2.0mg/L和NAA0.5mg/L的MS培养基上进行愈伤组织诱导。滇黄芩茎段接种到培养基上3d后，两端开始膨大启动脱分化，约10d后，整个外植体明显膨大，可见浅黄色的愈伤组织，诱导率达100％。愈伤组织生长初期多为浅黄色，逐渐转化为黄绿色，增殖速度快。

将茎段愈伤组织继代培养在6-BA2.0mg/L，NAA0.2mg/L的MS培养基上，愈伤组织由生长初期的黄色，逐渐转化为黄绿色，表面长出绿色的芽点，芽点生长迅速且其表面分化出大量的丛生芽。培养20d左右时，芽不断增多，整块愈伤组织遍布丛生芽和小苗。

将增殖后生长状态良好、长约2～3cm的丛生苗培养在MS培养基上，生根率为86.2％，数目较少，根系相对细小。

以上述方法可快速稳定地繁殖出大量的滇黄芩组培试管苗，每40d为一个周期，每块茎段的繁殖系数可达150-190，该器官发生方式能在短期内生产出大量滇黄芩组培苗，满足工厂化生产的需求。

Claims

1.一种滇黄芩器官发生方法，包括如下步骤：

(3)继代及植株再生：将组培芽苗接种于生根培养基MSP3生根；

上述步骤中培养基组分及含量配比如下：

愈伤诱导培养基MSP1：

MS培养基

6-BA 2mg/L

NAA 0.5mg/L

蔗糖 30g/L

琼脂 7g/L

pH 5.8-6.2

分化培养基MSP2：

MS培养基

6-BA 2mg/L

NAA 0.2mg/L

蔗糖 30g/L

琼脂 7g/L

pH 5.8-6.2

生根培养基MSP3：

1/2MS培养基

IBA 0.2mg/L

蔗糖 30g/L

琼脂 7g/L

pH 5.8-6.2。

2.根据权利要求1所述滇黄芩器官发生方法，其特征在于：将茎外植体清水冲洗后，75％乙醇浸泡30s，然后0.1％HgCl₂浸泡8min灭菌，无菌水冲洗并吸干水分，切成约0.5cm长的切段，接种于愈伤诱导培养基MSP1进行组织诱导。

3.根据权利要求1所述滇黄芩器官发生方法，其特征在于：将分化出芽点的滇黄芩愈伤组织分成大小均匀的小块，继代培养，分化丛生芽，待生长状态良好的小苗长至2～3cm，切下接种于生根培养基MSP3上诱导生根。

4.根据权利要求1-3任意之一所述滇黄芩器官发生方法，其特征在于：诱导愈伤、分化丛生芽、继代及植株再生的温度25±2℃，光照强度30～40mol·m^-2·s^-1，16h/8h光/暗培养。