CN108739405B - 一种珠子参的组织培养与离体再生方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种珠子参的组织培养与离体再生方法，包括外植体的选择与消毒、愈伤组织的诱导、芽的分化诱导以及生根诱导等步骤。本发明对珠子参的组织培养及无性系的建立展开了探索，确立了无菌材料的获得、愈伤组织的诱导、愈伤的分化成芽、生根等理想培养条件，最终成功建立了珠子参组培苗的无性繁殖体系，为实现对珠子参野生资源的保护、栽培、对种苗的需求以及基因库的建立奠定了技术基础，解决野生珠子参产量低、供应少和自然栽培周期长的问题。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种珠子参的组织培养与离体再生方法。
背景技术
珠子参(Panax japonicus var.major)系五加科人参属多年生草本植物，其根状茎入药为珠子参，具有补肺、养阴、活络和止血的作用，常用于治疗气阴两虚、烦热口渴、虚劳咳嗽、跌扑损伤、关节疼痛、咳血、吐血和外伤出血等症。珠子参主要成分是皂苷类化合物，包括竹节参皂苷Ⅴ、Ⅳ、Ⅳa、Ⅳa甲酯，人参皂苷Rb1、Rc、Rd、Re、Rg1、Rg2及珠子参苷R1、R2等，其中4(R)-珠子参苷R1具有治疗胰岛素抵抗活性，能显著降低肥胖小鼠体重。药理研究表明，珠子参总皂苷具有抗炎、中枢抑制、增强免疫功能、抗脑缺血、抗肿瘤等作用，具有很高的药用价值。
在野外，珠子参自然分布集中于2600-3000m高海拔地区，为典型的阴生C3植物，对光、温度等生态因子十分敏感，适应性差，生长适温为16-20℃，生长期夜间温度不低于8℃，喜肥湿润，忌强光直射，耐寒惧高温，自然生境主要为阴湿的针阔叶林、阔叶灌木、竹叶林以及杂灌丛。我国陕西、四川、云南、湖北、甘肃、贵州、西藏等地有其分布，是秦巴山区特色中药材“太白七药”之一。
珠子参根状茎呈串珠状，生长周期长，药材更新慢。自然条件下，种子结实率低、不易采收，且胚为后熟类型，有较长的休眠期，采用种子育苗一般需要2年才可移栽，种植4年才能收获。生产中多采用根茎直播繁殖，其根状茎有休眠芽，从愈缩茎的节间处切断，形成独根茎做为繁殖体，4年以上根茎萌芽率低，不宜作为繁殖材料，通常选1-3年生根茎作为繁殖体。
近年来随着珠子参药用范围不断扩大，需求量也逐年增加，现有药源远不能满足市场需求。长期以来，珠子参野生资源由于大量采挖早已濒临枯竭，人工种植一直停留在引种驯化栽培初级阶段，种植成本高，产量低。由于种苗的缺乏，珠子参很难实现规模化生产，提高产量。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种方法，即一种珠子参的组织培养与离体再生方法，可实现珠子参组培苗的大量繁殖，解决珠子参种植成本高，产量低的问题。
本发明采用的技术方案如下：
(1)外植体的选择与消毒：选择当年生根茎或者当年新发的幼苗茎段为外植体，用软毛刷在自来水下洗去泥土，再蘸取少量洗洁精刷洗1-2min，自来水下冲洗1-2h，然后置于超净工作台上用75％酒精(体积浓度)消毒8-10s，无菌水冲洗2遍，再用0.1％升汞溶液消毒10-15min，适当摇晃，使外植体与消毒液充分接触，最后倒掉升汞溶液，用无菌水冲洗6次，洗净备用；
(2)愈伤组织的诱导：将消毒好的外植体在无菌操作下剪切并接种，当年生幼苗的茎段切成1-1.5cm长，圆球形根茎切做两半，接种时平放，以切面接触培养基，两种外植体所接培养基相同，均为愈伤组织诱导培养基：MS+6-BA 0-2.0mg/L+2,4-D 0-2.0mg/L+NAA 0-1.0mg/L+蔗糖25-30g/L+琼脂4-5g/L；培养条件：温度25±2℃，空气相对湿度50％-60％，光照强度2000Lx，光照时间12小时/天；
(3)芽的分化：将步骤(2)中诱导出的愈伤组织接种至分化培养基上，培养30-40天后可分化出许多小芽，所述分化培养基为：1/2MS+TDZ 0.5-2.0mg/L+NAA 0-0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4.5g/L；培养条件：温度25±2℃，空气相对湿度50％-60％，光照强度2000Lx，光照时间12小时/天；
(4)生根培养：将步骤(3)中诱导出的珠子参小芽切下，接种至生根培养基中，培养15-20天便开始生根；所述生根培养基为：1/2MS+IBA 0.1-2.0mg/L+NAA 0-1.0mg/L+蔗糖25-30g/L+琼脂4-5g/L；培养条件：温度25±2℃，空气相对湿度50％-60％，光照强度2000Lx，光照时间12小时/天；
上述方法中，步骤(2)、(3)、(4)所用培养基都经过高温湿热灭菌，灭菌条件为121℃/25min；
上述方法中，步骤(2)、(3)、(4)的培养条件为：温度25±2℃，空气相对湿度50％-60％，光照强度2000Lx，光照时间12小时/天；
上述方法中，步骤(2)所述的愈伤组织诱导培养基优选为：MS+6-BA 0.1-2.0mg/L+2,4-D 0.5-2.0mg/L+NAA 0-1.0mg/L+蔗糖25-30g/L+琼脂4-5g/L；
上述方法中，步骤(3)中所述的芽分化诱导培养基优选为：1/2MS+TDZ 1.0-1.5mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖25-30g/L+琼脂4-5g/L；
上述方法中，步骤(4)中所述的生根培养基优选为：1/2MS+IBA 0.1-1.0mg/L+NAA0.5-1.0mg/L+蔗糖25-30g/L+琼脂4-5g/L；
本发明还提供了一种用于珠子参愈伤组织诱导的培养基，所述培养基包含以下成分：MS+6-BA 0-2.0mg/L+2,4-D 0-2.0mg/L+NAA 0-1.0mg/L+蔗糖25-30g/L+琼脂4-5g/L；
优选地，所述培养基包含以下成分：MS+6-BA 1.0mg/L+2,4-D 1.5mg/L+NAA1.0mg/L+蔗糖25g/L+琼脂5.0g/L；
优选地，所述培养基包含以下成分：MS+6-BA 0.1mg/L+2,4-D 2.0mg/L+蔗糖25g/L+琼脂5.0g/L；
优选地，所述培养基包含以下成分：MS+6-BA 0.3mg/L+2,4-D 0.5mg/L+蔗糖25g/L+琼脂5.0g/L；
优选地，所述培养基包含以下成分：MS+6-BA 0.5mg/L+2,4-D 2.0mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4.5g/L；
优选地，所述培养基包含以下成分：MS+6-BA 2.0mg/L+2,4-D 2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4.5g/L。
本发明的优点在于以珠子参根茎或幼苗茎段为外植体，通过外植体的消毒、愈伤组织的诱导、芽的分化、以及生根培养等过程获得了珠子参离体再生植株，建立了有效的珠子参组培快繁体系，为实现珠子参规模化种植解决种苗问题，提供了一种可行的技术方案。
附图说明
图1为本发明组织培养与离体再生方法获得的珠子参愈伤分化小芽。
具体实施方式
实施例1
(1)外植体的选择与消毒：选择珠子参当年生根茎，在自来水下将泥土洗净，用软毛刷蘸取少量洗洁精刷洗，自来水冲洗2h，放入烧杯中转至超净工作台上，加入75％酒精轻轻摇晃10s，倒掉酒精，无菌水洗2遍，加入0.1％升汞溶液没过外植体，适当摇晃，消毒15min后倒掉升汞，用无菌水清洗6次，洗净备用。
(2)愈伤组织的诱导：将消毒好的珠子参根茎在无菌操作下切成两半，以平放的方式接入愈伤组织诱导培养基，根茎切面与培养基接触，培养20天后，根茎切面边缘开始产生愈伤组织。培养条件：温度25±2℃，空气相对湿度50％-60％，光照强度2000Lx，光照时间12小时/天，培养30天后统计外植体消毒灭菌率和愈伤组织诱导率。所用愈伤组织诱导培养基为MS+6-BA 2.0mg/L+2,4-D 2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4.5g/L；
(3)芽的分化：将步骤(2)中诱导出的愈伤组织接种至分化培养基上，培养30-40天后可分化出许多小芽，所述分化培养基为：1/2MS+TDZ 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4.5g/L；培养条件：温度25±2℃，空气相对湿度50％-60％，光照强度2000Lx，光照时间12小时/天，培养30天后统计分化率。
(4)生根培养：将步骤(3)中诱导出的珠子参小芽切下，接种至生根培养基中：1/2MS+IBA0.5mg/L+NAA1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4.5g/L，培养15-20天便开始生根；培养条件：温度25±2℃，空气相对湿度50％-60％，光照强度2000Lx，光照时间12小时/天，培养30天后统计生根率。
实施例2-5按实施例1的步骤进行，不同点仅在于步骤(2)中的愈伤组织诱导培养基成分不同，实施例2-5步骤(2)中愈伤组织诱导培养基分别为：
①MS+6-BA 0.5mg/L+2,4-D 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4.5g/L；
②MS+6-BA 0.3mg/L+2,4-D 0.5mg/L+蔗糖25g/L+琼脂5.0g/L；
③MS+6-BA 0.1mg/L+2,4-D 2.0mg/L+蔗糖25g/L+琼脂5.0g/L；
④MS+6-BA 1.0mg/L+2,4-D 1.5mg/L+NAA1.0mg/L+蔗糖25g/L+琼脂5.0g/L。
实施例1-5培养结果如下：
由结果可知，本发明的消毒方法具有很好的灭菌效果，愈伤组织诱导率高，愈伤组织分化成苗率可达90％以上，所得小苗95％以上均能正常生根。
Claims (6)
1.一种珠子参的组织培养与离体再生方法，其特征在于，按以下步骤进行：
(1)外植体的选择与消毒：选择当年生根茎或者当年新发的幼苗茎段为外植体，用软毛刷在自来水下洗去泥土，再蘸取少量洗洁精刷洗1-2min，自来水下冲洗1-2h，然后置于超净工作台上用体积浓度75％酒精消毒8-10s，无菌水冲洗2遍，再用0.1％升汞溶液消毒10-15min，适当摇晃，使外植体与消毒液充分接触，最后倒掉升汞溶液，用无菌水冲洗6次，洗净备用；
(2)愈伤组织的诱导：将消毒好的外植体在无菌操作下剪切并接种，当年生幼苗的茎段切成1.0-1.5cm长，圆球形根茎切做两半，接种时平放，以切面接触培养基，两种外植体所接培养基相同，均为愈伤组织诱导培养基：MS+6-BA 0.1-2.0mg /L+2,4-D 0.5-2.0mg /L+NAA0-1.0mg/L+蔗糖25-30g/L+琼脂4-5g/L；培养条件：温度25±2℃，空气相对湿度50％-60％，光照强度2000Lx，光照时间12小时/天；
(3)芽的分化：将步骤(2)中诱导出的愈伤组织接种至分化培养基上，培养30-40天后可分化出许多小芽，所述分化培养基为：1/2MS+TDZ 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4.5g/L；培养条件：温度25±2℃，空气相对湿度50％-60％，光照强度2000Lx，光照时间12小时/天；
(4)生根培养：将步骤(3)中诱导出的珠子参小芽切下，接种至生根培养基中，生根培养基为：1/2MS+IBA0.5mg/L+NAA1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4.5g/L；培养条件：温度25±2℃，空气相对湿度50％-60％，光照强度2000Lx，光照时间12小时/天。
2.根据权利要求1所述的一种珠子参的组织培养与离体再生方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养基的成分为：MS+6-BA1.0mg/L+2,4-D 1.5mg/L+NAA 1.0mg/L+蔗糖25g/L+琼脂5.0g/L。
3.根据权利要求1所述的一种珠子参的组织培养与离体再生方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养基的成分为：MS+6-BA0.1mg/L+2,4-D 2.0mg/L+蔗糖25g/L+琼脂5.0g/L。
4.根据权利要求1所述的一种珠子参的组织培养与离体再生方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养基的成分为：MS+6-BA0.3mg/L+2,4-D 0.5mg/L+蔗糖25g/L+琼脂5.0g/L。
5.根据权利要求1所述的一种珠子参的组织培养与离体再生方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养基的成分为：MS+6-BA0.5mg/L+2,4-D 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4.5g/L。
6.根据权利要求1所述的一种珠子参的组织培养与离体再生方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养基的成分为：MS+6-BA2.0mg/L+2,4-D 2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4.5g/L。
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