CN109588315A - 一种苔藓植物外植体的消毒方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种杀菌效果好、消毒废液不污染环境且对人体无害、毒性小、不易损伤苔藓植物的苔藓植物外植体的消毒方法。该消毒方法通过对苔藓外植体清洗后，接着将外植体依次经过酒精、次氯酸钠、酒精、次氯酸钠浸泡消毒处理，然后利用无菌水清洗干净后放入培养皿中，培养14‑21天至培养基表面形成原丝体和茎叶体，剪取培养基表面形成的原丝体和茎叶体，并依次经过酒精、次氯酸钠、酒精、次氯酸钠浸泡消毒处理，最后再利用无菌水清洗干净后即可得到无菌的苔藓外植体，该消毒方法操作简单、所需外植体量少、操作门槛低、不使用高污染消毒剂、对环境无害，试验效果好。适合在植物组织培养技术领域推广应用。

Description

一种苔藓植物外植体的消毒方法
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其是一种苔藓植物外植体的消毒方法。
背景技术
苔藓植物一般生长在较阴暗，较潮湿的土壤、林下、沼泽、岩石及树皮等阴面，通过配子体叶片等微孔吸收大气中的营养物质，同时由于苔藓一般为丛生，植株间紧密生长，因此外植体上附着大量微生物，且不易清除。并且由于苔藓植物外植体大多是单层细胞构成，细胞容易因为消毒过度而死亡，一些稀缺苔藓植物不容易获得孢蒴，苔藓生物量少，采集不易等，这些因素都极大地阻碍了苔藓组织培养的发展，以及对苔藓种质资源的保护和利用。外植体消毒是进行组织培养的第一步，现有的方法，多采用升汞进行消毒，浓度过高易造成外植体死亡，且容易残留，不易清洗消除，消毒效果不太理想，并且升汞是高毒性污染物，对人体伤害大，排出环境易造成土壤重金属残留。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种杀菌效果好、消毒废液不污染环境且对人体无害、毒性小、不易损伤苔藓植物的苔藓植物外植体的消毒方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：该苔藓植物外植体的消毒方法，包括以下步骤：
A、苔藓植物外植体的选取：挑选健壮的、生长旺盛的外植体，将外植体的假根部分切除后，放入流水中冲洗时间为3-8min；
B、将经过步骤A处理过后的外植体放入超声波震荡仪中清洗1-2h；
C、将经过步骤B处理过后的外植体浸泡在浓度为500mg/l的氨苄青霉素钠溶液中，并且在避光条件下恒温浸泡1-2h，所述氨苄青霉素钠溶液的温度为3.5-4.5度；
D、将经过步骤C处理过后的外植体依次经过如下浸泡处理：首先，放入浓度为75％酒精中浸泡一段时间后，利用无菌水清洗一段时间后接着放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后再放入浓度为75％酒精中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后再放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡一段时间，最后再利用无菌水清洗干净备用；
E、将经过步骤D处理过后的外植体放入培养皿中，培养皿底部装有无菌过滤棉，并在培养皿中加入营养液，加入的营养液量将培养皿底部放置的无菌过滤棉完全湿润即可，所述营养液由6-BA、氨苄青霉素钠、knop无机培养液组成，其中6-BA的浓度为0.1mg/L，氨苄青霉素钠的浓度为500mg/L；
F、将培养皿置于培养箱中培养14-21天至培养基表面形成原丝体和茎叶体，培养箱的温度为23-25度；每天24d中在黑暗中培养的时间为6-10小时，其余时间为光照下培养；
G、剪取培养基表面形成的原丝体和茎叶体，并依次经过如下浸泡处理：首先，放入浓度为75％酒精中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后接着放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后再放入浓度为75％酒精中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后再放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡一段时间，最后再利用无菌水清洗干净后即可得到无菌的苔藓外植体。
进一步的是，在步骤A中，将外植体的假根部分切除后放入流水中冲洗时间为5min。
进一步的是，在步骤B中，将外植体放入超声波震荡仪中清洗2h，所述超声波震荡仪的超声波清洗频率为40kHz。
进一步的是，在步骤C中，将外植体浸泡在浓度为500mg/l的氨苄青霉素钠溶液中，并且在避光条件下恒温浸泡1h，所述氨苄青霉素钠溶液的温度为4度。
进一步的是，在步骤D中，将外植体依次经过如下浸泡处理：首先，放入浓度为75％酒精中浸泡5s，利用无菌水清洗5s后接着放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡10s，利用无菌水清洗5s后再放入浓度为75％酒精中浸泡5s，利用无菌水清洗一段时间后再放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡10s，最后再利用无菌水清洗干净备用。
进一步的是，所述无菌过滤棉的形状与培养皿底部形状相同，所述无菌过滤棉的厚度为0.5cm。
进一步的是，所述knop无机培养液的溶剂为水，溶质包括(Ca(NO3)2·4H2O、KNO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7(H2O)，所述Ca(NO3)2·4H2O的浓度为1g/L，KNO3的浓度为0.25g/L，KH2PO4的浓度为0.25g/L，MgSO4·7H2O的浓度为0.25g/L、ZnSO4·7H2O的浓度为0.003g/L，pH＝5.8。
进一步的是，在步骤F中，将培养皿置于培养箱中培养15天，培养箱的温度为23-25度；每天24d中在黑暗中培养的时间为8小时，其余时间为光照下培养。
进一步的是，在步骤G中，剪取培养基表面形成的原丝体和茎叶体，并依次经过如下浸泡处理：首先，放入浓度为75％酒精中浸泡5s，利用无菌水清洗5s后接着放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡10s，利用无菌水清洗5s后再放入浓度为75％酒精中浸泡5s，利用无菌水清洗5s后再放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡5s，最后再利用无菌水清洗干净后即可得到无菌的苔藓外植体。
本发明的有益效果是：该苔藓植物外植体的消毒方法的通过挑选健壮的、生长旺盛的外植体，将外植体的假根部分切除后，放入流水中冲洗时间为3-8min；接着放入超声波震荡仪中清洗1-2h；然后将外植体浸泡在浓度为500mg/l的氨苄青霉素钠溶液中，并且在避光条件下恒温浸泡1-2，接着将外植体依次经过如下浸泡处理：首先，放入浓度为75％酒精中浸泡一段时间后，利用无菌水清洗一段时间后接着放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后再放入浓度为75％酒精中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后再放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡一段时间，最后再利用无菌水清洗干净后放入培养皿中，培养皿底部装有无菌过滤棉，并在培养皿中加入营养液，加入的营养液量将培养皿底部放置的无菌过滤棉完全湿润即可，接着将培养皿置于培养箱中培养14-21天至培养基表面形成原丝体和茎叶体，剪取培养基表面形成的原丝体和茎叶体，并依次经过如下浸泡处理：首先，放入浓度为75％酒精中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后接着放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后再放入浓度为75％酒精中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后再放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡一段时间，最后再利用无菌水清洗干净后即可得到无菌的苔藓外植体，本发明通过苔藓独特而极强的再生能力，通过低浓度，多循环的消毒手段及无碳源添加等多种措施，本发明所述苔藓植物外植体的消毒方法操作简单、所需外植体量少、操作门槛低、不使用高污染消毒剂、对环境无害，试验效果好，适合苔藓植物及其他脆弱植株体无菌材料的消毒获取。
附图说明
图1为利用本发明所述的苔藓植物外植体的消毒方法对原丝体消毒后获得的苔藓生长一个月后的生长情况图；
图2为利用本发明所述的苔藓植物外植体的消毒方法对茎叶体消毒后获得的苔藓生长一个月后的生长情况图；
图3为采用传统方法消毒后获得的苔藓生长一个月后的生长情况图。
具体实施方式
苔藓植物是植物中最简单最低等的高等植物，拥有独特的生态位和再生能力。在营养需求上，苔藓植物主要通过配子体的吸附作用吸收大气中的养分。作为自养型生物，苔藓可以在不添加碳源的简单无机离子培养基中生长，如knop培养基。在再生能力上，大部分苔藓植物和蕨类等孢子植物在其再生体系中通过原丝体为枢纽可进行互相转化。大部分苔藓植物在转化上的规律可概括为，孢子体可发育成为原丝体，原丝体再进一步可继续分化出芽胞，经芽胞再分化形成假根和配子体植株。同时配子体在损伤状态时会在伤口处产生原丝体，芽胞通过一定处理也可以再分化出原丝体。本发明通过苔藓独特而极强的再生能力，通过低浓度，多循环的消毒手段及无碳源添加等多种措施，提出了一种针对脆弱苔藓植物的无菌外植体消毒技术。该技术操作简单、所需外植体量少、操作门槛低、不使用高污染消毒剂、对环境无害，试验效果好，适合苔藓植物及其他脆弱植株体无菌材料的获取。具体的，本发明所述的苔藓植物外植体的消毒方法，包括以下步骤：
A、苔藓植物外植体的选取：挑选健壮的、生长旺盛的外植体，将外植体的假根部分切除后，放入流水中冲洗时间为3-8min；
B、将经过步骤A处理过后的外植体放入超声波震荡仪中清洗1-2h；
C、将经过步骤B处理过后的外植体浸泡在浓度为500mg/l的氨苄青霉素钠溶液中，并且在避光条件下恒温浸泡1-2h，所述氨苄青霉素钠溶液的温度为3.5-4.5度；
D、将经过步骤C处理过后的外植体依次经过如下浸泡处理：首先，放入浓度为75％酒精中浸泡一段时间后，利用无菌水清洗一段时间后接着放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后再放入浓度为75％酒精中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后再放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡一段时间，最后再利用无菌水清洗干净备用；
E、将经过步骤D处理过后的外植体放入培养皿中，培养皿底部装有无菌过滤棉，并在培养皿中加入营养液，加入的营养液量将培养皿底部放置的无菌过滤棉完全湿润即可，所述营养液由6-BA、氨苄青霉素钠、knop无机培养液组成，其中6-BA的浓度为0.1mg/L，氨苄青霉素钠的浓度为500mg/L；
F、将培养皿置于培养箱中培养14-21天至培养基表面形成原丝体和茎叶体，培养箱的温度为23-25度；每天24d中在黑暗中培养的时间为6-10小时，其余时间为光照下培养；
G、剪取培养基表面形成的原丝体和茎叶体，并依次经过如下浸泡处理：首先，放入浓度为75％酒精中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后接着放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后再放入浓度为75％酒精中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后再放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡一段时间，最后再利用无菌水清洗干净后即可得到无菌的苔藓外植体。
该苔藓植物外植体的消毒方法的通过挑选健壮的、生长旺盛的外植体，将外植体的假根部分切除后，放入流水中冲洗时间为3-8min；接着放入超声波震荡仪中清洗1-2h；然后将外植体浸泡在浓度为500mg/l的氨苄青霉素钠溶液中，并且在避光条件下恒温浸泡1-2，接着将外植体依次经过如下浸泡处理：首先，放入浓度为75％酒精中浸泡一段时间后，利用无菌水清洗一段时间后接着放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后再放入浓度为75％酒精中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后再放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡一段时间，最后再利用无菌水清洗干净后放入培养皿中，培养皿底部装有无菌过滤棉，并在培养皿中加入营养液，加入的营养液量将培养皿底部放置的无菌过滤棉完全湿润即可，接着将培养皿置于培养箱中培养14-21天至培养基表面形成原丝体和茎叶体，剪取培养基表面形成的原丝体和茎叶体，并依次经过如下浸泡处理：首先，放入浓度为75％酒精中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后接着放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后再放入浓度为75％酒精中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后再放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡一段时间，最后再利用无菌水清洗干净后即可得到无菌的苔藓外植体，本发明通过苔藓独特而极强的再生能力，通过低浓度，多循环的消毒手段及无碳源添加等多种措施，本发明所述苔藓植物外植体的消毒方法操作简单、所需外植体量少、操作门槛低、不使用高污染消毒剂、对环境无害，试验效果好，适合苔藓植物及其他脆弱植株体无菌材料的消毒获取。
为了保证外植体的清洗效果和清洗效率，在步骤A中，将外植体的假根部分切除后放入流水中冲洗时间为5min，为了进一步保证外植体的清洗效果和清洗效率，在步骤B中，将外植体放入超声波震荡仪中清洗2h，所述超声波震荡仪的超声波清洗频率为40kHz。
为了保证苔藓外植体的消毒效果同时不损伤外植体，在步骤C中，将外植体浸泡在浓度为500mg/l的氨苄青霉素钠溶液中，并且在避光条件下恒温浸泡1h，所述氨苄青霉素钠溶液的温度为4度。进一步的，在步骤D中，将外植体依次经过如下浸泡处理：首先，放入浓度为75％酒精中浸泡5s，利用无菌水清洗5s后接着放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡10s，利用无菌水清洗5s后再放入浓度为75％酒精中浸泡5s，利用无菌水清洗一段时间后再放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡10s，最后再利用无菌水清洗干净备用；
为了保证苔藓外植体的正常生长，在步骤E中，所述无菌过滤棉的形状与培养皿底部形状相同，所述无菌过滤棉的厚度为0.5cm。在步骤E中，所述knop无机培养液的溶剂为水，溶质包括(Ca(NO3)2·4H2O、KNO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7(H2O)，所述Ca(NO3)2·4H2O的浓度为1g/L，KNO3的浓度为0.25g/L，KH2PO4的浓度为0.25g/L，MgSO4·7H2O的浓度为0.25g/L、ZnSO4·7H2O的浓度为0.003g/L，pH＝5.8。进一步的是，在步骤F中，将培养皿置于培养箱中培养15天，培养箱的温度为23-25度；每天24d中在黑暗中培养的时间为8小时，其余时间为光照下培养。
为了使得到的苔藓无菌率更高，在步骤G中，剪取培养基表面形成的原丝体和茎叶体，并依次经过如下浸泡处理：首先，放入浓度为75％酒精中浸泡5s，利用无菌水清洗5s后接着放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡10s，利用无菌水清洗5s后再放入浓度为75％酒精中浸泡5s，利用无菌水清洗5s后再放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡5s，最后再利用无菌水清洗干净后完成消毒。
实施例
实例一：
A、挑选120株健壮的、生长旺盛的真藓外植体，将外植体的假根部分切除后，放入流水中冲洗5min；
B、再放入超声波震荡仪中清洗1h，将夹杂在茎干与叶片汇合处的污垢彻底清洗干净，超声波震荡仪的超声波清洗频率为40kHz；
C、然后将清洗干净的外植体浸泡在500mg/L氨苄青霉素溶液，并在避光、4度条件下浸泡1h；
D、接着将外植体放入浓度为75％酒精中浸泡5s，利用无菌水清洗5s后接着放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡10s，利用无菌水清洗5s后再放入浓度为75％酒精中浸泡5s，利用无菌水清洗5s后再放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡10s，最后再利用无菌水清洗3遍；
E、接着放入培养皿中，每个培养皿中放入4-5株外植体，每个培养皿底部装有无菌过滤棉，并在培养皿中加入营养液，所述无菌过滤棉的形状与培养皿底部形状相同，所述无菌过滤棉的厚度为0.5cm，加入的营养液量将培养皿底部放置的无菌过滤棉完全湿润即可，所述营养液由6-BA、氨苄青霉素钠、knop无机培养液组成，其中6-BA的浓度为0.1mg/L，氨苄青霉素钠的浓度为500mg/L，所述knop无机培养液的溶剂为水，溶质包括(Ca(NO3)2·4H2O、KNO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7(H2O)，所述Ca(NO3)2·4H2O的浓度为1g/L，KNO3的浓度为0.25g/L，KH2PO4的浓度为0.25g/L，MgSO4·7H2O的浓度为0.25g/L、ZnSO4·7H2O的浓度为0.003g/L，pH＝5.8；
F、接着将培养皿置于培养箱中培养15天至培养基表面形成原丝体和茎叶体，培养箱的温度为23-25度；每天24d中在黑暗中培养的时间为8小时，其余时间为光照下培养；
G、培养结束后，剪取培养基表面形成的原丝体和茎叶体，并依次经过如下浸泡处理：首先，放入浓度为75％酒精中浸泡5s，利用无菌水清洗5s后接着放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡10s，利用无菌水清洗5s后再放入浓度为75％酒精中浸泡5s，利用无菌水清洗5s后再放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡5s，最后再利用无菌水清洗干净后完成消毒。
实例二：
A、挑选120株健壮的、生长旺盛的真藓外植体，将外植体的假根部分切除后，放入流水中冲洗5min；
B、再放入超声波震荡仪中清洗2h，将夹杂在茎干与叶片汇合处的污垢彻底清洗干净，超声波震荡仪的超声波清洗频率为40kHz；
C、然后将清洗干净的外植体浸泡在500mg/L氨苄青霉素溶液，并在避光、4度条件下浸泡2h；
D、接着将外植体放入浓度为75％酒精中浸泡5s，利用无菌水清洗5s后接着放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡10s，利用无菌水清洗5s后再放入浓度为75％酒精中浸泡5s，利用无菌水清洗5s后再放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡10s，最后再利用无菌水清洗3遍
E、接着放入培养皿中，每个培养皿中放入4-5株外植体，每个培养皿底部装有无菌过滤棉，并在培养皿中加入营养液，所述无菌过滤棉的形状与培养皿底部形状相同，所述无菌过滤棉的厚度为0.5cm，加入的营养液量将培养皿底部放置的无菌过滤棉完全湿润即可，所述营养液由6-BA、氨苄青霉素钠、knop无机培养液组成，其中6-BA的浓度为0.1mg/L，氨苄青霉素钠的浓度为500mg/L，所述knop无机培养液的溶剂为水，溶质包括(Ca(NO3)2·4H2O、KNO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7(H2O)，所述Ca(NO3)2·4H2O的浓度为1g/L，KNO3的浓度为0.25g/L，KH2PO4的浓度为0.25g/L，MgSO4·7H2O的浓度为0.25g/L、ZnSO4·7H2O的浓度为0.003g/L，pH＝5.8；
F、接着将培养皿置于培养箱中培养15天至培养基表面形成原丝体和茎叶体，培养箱的温度为23-25度；每天24d中在黑暗中培养的时间为8小时，其余时间为光照下培养；
G、培养结束后，剪取培养基表面形成的原丝体和茎叶体，并依次经过如下浸泡处理：首先，放入浓度为75％酒精中浸泡5s，利用无菌水清洗5s后接着放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡10s，利用无菌水清洗5s后再放入浓度为75％酒精中浸泡5s，利用无菌水清洗5s后再放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡5s，最后再利用无菌水清洗干净后完成消毒。
实例三：
A、挑选120株健壮的、生长旺盛的真藓外植体，将外植体的假根部分切除后，放入流水中冲洗5min；
B、再放入超声波震荡仪中清洗1h，将夹杂在茎干与叶片汇合处的污垢彻底清洗干净，超声波震荡仪的超声波清洗频率为40kHz；
C、然后将清洗干净的外植体浸泡在500mg/L氨苄青霉素溶液，并在避光、4度条件下浸泡1h；
D、接着将外植体放入浓度为75％酒精中浸泡5s，利用无菌水清洗5s后接着放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡10s，最后再利用无菌水清洗3遍；
E、接着放入培养皿中，每个培养皿中放入4-5株外植体，每个培养皿底部装有无菌过滤棉，并在培养皿中加入营养液，所述无菌过滤棉的形状与培养皿底部形状相同，所述无菌过滤棉的厚度为0.5cm，加入的营养液量将培养皿底部放置的无菌过滤棉完全湿润即可，所述营养液由6-BA、氨苄青霉素钠、knop无机培养液组成，其中6-BA的浓度为0.1mg/L，氨苄青霉素钠的浓度为500mg/L，所述knop无机培养液的溶剂为水，溶质包括(Ca(NO3)2·4H2O、KNO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7(H2O)，所述Ca(NO3)2·4H2O的浓度为1g/L，KNO3的浓度为0.25g/L，KH2PO4的浓度为0.25g/L，MgSO4·7H2O的浓度为0.25g/L、ZnSO4·7H2O的浓度为0.003g/L，pH＝5.8；
F、接着将培养皿置于培养箱中培养15天至培养基表面形成原丝体和茎叶体，培养箱的温度为23-25度；每天24d中在黑暗中培养的时间为8小时，其余时间为光照下培养；
G、培养结束后，剪取培养基表面形成的原丝体和茎叶体，并依次经过如下浸泡处理：首先，放入浓度为75％酒精中浸泡5s，利用无菌水清洗5s后接着放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡5s，最后再利用无菌水清洗干净后完成消毒。
实例四：
A、挑选120株健壮的、生长旺盛的真藓外植体，将外植体的假根部分切除后，放入流水中冲洗5min；
B、再放入超声波震荡仪中清洗1h，将夹杂在茎干与叶片汇合处的污垢彻底清洗干净，超声波震荡仪的超声波清洗频率为40kHz，；
C、然后将清洗干净的外植体浸泡在500mg/L氨苄青霉素溶液，并在避光、4度条件下浸泡1h；
D、接着将外植体放入浓度为75％酒精中浸泡5s，利用无菌水清洗5s后接着放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡10s，利用无菌水清洗5s后再放入浓度为75％酒精中浸泡5s，利用无菌水清洗5s后再放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡10s，最后再利用无菌水清洗3遍；
E、接着放入培养皿中，每个培养皿中放入4-5株外植体，每个培养皿底部放置有培养基，清洗后的外植体接种在培养基上，所述培养基由琼脂、蔗糖、knop无机培养液组成，其中琼脂的浓度为5g/L，蔗糖的浓度为2g/L，所述knop无机培养液的溶剂为水，溶质包括(Ca(NO3)2·4H2O、KNO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7(H2O)，所述Ca(NO3)2·4H2O的浓度为1g/L，KNO3的浓度为0.25g/L，KH2PO4的浓度为0.25g/L，MgSO4·7H2O的浓度为0.25g/L、ZnSO4·7H2O的浓度为0.003g/L，pH＝5.8；
F、接着将培养皿置于培养箱中培养15天至培养基表面形成原丝体和茎叶体，培养箱的温度为23-25度；每天24d中在黑暗中培养的时间为8小时，其余时间为光照下培养；
G、培养结束后，剪取培养基表面形成的原丝体和茎叶体，并依次经过如下浸泡处理：首先，放入浓度为75％酒精中浸泡5s，利用无菌水清洗5s后接着放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡10s，利用无菌水清洗5s后再放入浓度为75％酒精中浸泡5s，利用无菌水清洗5s后再放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡5s，最后再利用无菌水清洗干净后完成消毒。
实例五：
A、挑选120株健壮的、生长旺盛的真藓外植体，将外植体的假根部分切除后，放入流水中冲洗5min；
B、再放入超声波震荡仪中清洗1h，将夹杂在茎干与叶片汇合处的污垢彻底清洗干净，超声波震荡仪的超声波清洗频率为40kHz；
C、然后将清洗干净的外植体浸泡在500mg/L氨苄青霉素溶液，并在避光、4度条件下浸泡1h；
D、接着将外植体放入浓度为75％酒精中浸泡5s，利用无菌水清洗5s后接着放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡10s，利用无菌水清洗5s后再放入浓度为75％酒精中浸泡5s，利用无菌水清洗5s后再放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡10s，利用无菌水清洗5s后再放入浓度为75％酒精中浸泡5s，利用无菌水清洗5s后再放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡10s，最后再利用无菌水清洗3遍；
E、接着放入培养皿中，每个培养皿中放入4-5株外植体，每个培养皿底部装有无菌过滤棉，并在培养皿中加入营养液，所述无菌过滤棉的形状与培养皿底部形状相同，所述无菌过滤棉的厚度为0.5cm，加入的营养液量将培养皿底部放置的无菌过滤棉完全湿润即可，所述营养液由6-BA、氨苄青霉素钠、knop无机培养液组成，其中6-BA的浓度为0.1mg/L，氨苄青霉素钠的浓度为500mg/L，所述knop无机培养液的溶剂为水，溶质包括(Ca(NO3)2·4H2O、KNO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7(H2O)，所述Ca(NO3)2·4H2O的浓度为1g/L，KNO3的浓度为0.25g/L，KH2PO4的浓度为0.25g/L，MgSO4·7H2O的浓度为0.25g/L、ZnSO4·7H2O的浓度为0.003g/L，pH＝5.8；
F、接着将培养皿置于培养箱中培养15天至培养基表面形成原丝体和茎叶体，培养箱的温度为23-25度；每天24d中在黑暗中培养的时间为8小时，其余时间为光照下培养；
G、培养结束后，剪取培养基表面形成的原丝体和茎叶体，并依次经过如下浸泡处理：首先，放入浓度为75％酒精中浸泡5s，利用无菌水清洗5s后接着放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡10s，利用无菌水清洗5s后再放入浓度为75％酒精中浸泡5s，利用无菌水清洗5s后再放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡10s，利用无菌水清洗5s后再放入浓度为75％酒精中浸泡5s，利用无菌水清洗5s后再放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡5s，最后再利用无菌水清洗干净后完成消毒。
实例六：
A、挑选120株健壮的、生长旺盛的真藓外植体，将外植体的假根部分切除后，接着将外植体放入浓度为75％酒精中浸泡5s，利用无菌水清洗5s后接着放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡10s，利用无菌水清洗5s后再放入浓度为75％酒精中浸泡5s，利用无菌水清洗5s后再放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡5s，最后再利用无菌水清洗3遍；
B、接着放入培养皿中，每个培养皿中放入4-5株外植体，每个培养皿底部放置有培养基，清洗后的外植体接种在培养基上，所述培养基由琼脂、蔗糖、knop无机培养液组成，其中琼脂的浓度为5g/L，蔗糖的浓度为2g/L，所述knop无机培养液的溶剂为水，溶质包括(Ca(NO3)2·4H2O、KNO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7(H2O)，所述Ca(NO3)2·4H2O的浓度为1g/L，KNO3的浓度为0.25g/L，KH2PO4的浓度为0.25g/L，MgSO4·7H2O的浓度为0.25g/L、ZnSO4·7H2O的浓度为0.003g/L，pH＝5.8；
C、接着将培养皿置于培养箱中培养15天至培养基表面形成原丝体和茎叶体，培养箱的温度为23-25度；每天24d中在黑暗中培养的时间为8小时，其余时间为光照下培养；
D、培养结束后，剪取培养基表面形成的原丝体和茎叶体，并依次经过如下浸泡处理：首先，放入浓度为75％酒精中浸泡5s，利用无菌水清洗5s后接着放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡10s，利用无菌水清洗5s后再放入浓度为75％酒精中浸泡5s，利用无菌水清洗5s后再放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡5s，最后再利用无菌水清洗干净后完成消毒。
表1为上述六个实施例以及采用传统方法得到的无菌苔藓的无菌率、死亡率、难易程度的实验数据表，传统方法每个方法处理的外植体数量均为120株，所述无菌率是指消毒后未被污染的苔藓总数占总消毒苔藓总数的比例，死亡率是指消毒后死亡的苔藓总数占总消毒苔藓总数的比例，难易程度是指通过消毒获得无菌外植体的难易程度；
表1
由上表得出，实施例一条件下，综合效果最优，其无菌率较高，死亡率也较低，也容易获得无菌的外植体。
图1为利用本发明所述的苔藓植物外植体的消毒方法对原丝体消毒后获得的苔藓生长一个月后的生长情况图；图2为利用本发明所述的苔藓植物外植体的消毒方法对茎叶体消毒后获得的苔藓生长一个月后的生长情况图；图3为采用传统方法消毒后获得的苔藓生长一个月后的生长情况图；从三个图可以明显看出，采用传统方法消毒后获得的苔藓很容易被污染，消毒效果较差，而采用本发明所述的苔藓植物外植体的消毒方法消毒后获得的苔藓生长情况良好，没有被污染的情况，消毒效果非常好。

Claims (9)

1.一种苔藓植物外植体的消毒方法，其特征在于包括以下步骤：
A、苔藓植物外植体的选取：挑选健壮的、生长旺盛的外植体，将外植体的假根部分切除后，放入流水中冲洗时间为3-8min；
B、将经过步骤A处理过后的外植体放入超声波震荡仪中清洗1-2h；
C、将经过步骤B处理过后的外植体浸泡在浓度为500mg/l的氨苄青霉素钠溶液中，并且在避光条件下恒温浸泡1-2h，所述氨苄青霉素钠溶液的温度为3.5-4.5度；
D、将经过步骤C处理过后的外植体依次经过如下浸泡处理：首先，放入浓度为75％酒精中浸泡一段时间后，利用无菌水清洗一段时间后接着放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后再放入浓度为75％酒精中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后再放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡一段时间，最后再利用无菌水清洗干净备用；
E、将经过步骤D处理过后的外植体放入培养皿中，培养皿底部装有无菌过滤棉，并在培养皿中加入营养液，加入的营养液量将培养皿底部放置的无菌过滤棉完全湿润即可，所述营养液由6-BA、氨苄青霉素钠、knop无机培养液组成，其中6-BA的浓度为0.1mg/L，氨苄青霉素钠的浓度为500mg/L；
F、将培养皿置于培养箱中培养14-21天至培养基表面形成原丝体和茎叶体，培养箱的温度为23-25度；每天24d中在黑暗中培养的时间为6-10小时，其余时间为光照下培养；
G、剪取培养基表面形成的原丝体和茎叶体，并依次经过如下浸泡处理：首先，放入浓度为75％酒精中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后接着放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后再放入浓度为75％酒精中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后再放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡一段时间，最后再利用无菌水清洗干净后即可得到无菌的苔藓外植体。
2.如权利要求1所述的苔藓植物外植体的消毒方法，其特征在于：在步骤A中，将外植体的假根部分切除后放入流水中冲洗时间为5min。
3.如权利要求1所述的苔藓植物外植体的消毒方法，其特征在于：在步骤B中，将外植体放入超声波震荡仪中清洗2h，所述超声波震荡仪的超声波清洗频率为40kHz。
4.如权利要求1所述的苔藓植物外植体的消毒方法，其特征在于：在步骤C中，将外植体浸泡在浓度为500mg/l的氨苄青霉素钠溶液中，并且在避光条件下恒温浸泡1h，所述氨苄青霉素钠溶液的温度为4度。
5.如权利要求1所述的苔藓植物外植体的消毒方法，其特征在于：在步骤D中，将外植体依次经过如下浸泡处理：首先，放入浓度为75％酒精中浸泡5s，利用无菌水清洗5s后接着放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡10s，利用无菌水清洗5s后再放入浓度为75％酒精中浸泡5s，利用无菌水清洗一段时间后再放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡10s，最后再利用无菌水清洗干净备用。
6.如权利要求1所述的苔藓植物外植体的消毒方法，其特征在于：在步骤E中，所述无菌过滤棉的形状与培养皿底部形状相同，所述无菌过滤棉的厚度为0.5cm。
7.如权利要求1所述的苔藓植物外植体的消毒方法，其特征在于：步骤E中，所述knop无机培养液的溶剂为水，溶质包括(Ca(NO3)2·4H2O、KNO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7(H2O)，所述Ca(NO3)2·4H2O的浓度为1g/L，KNO3的浓度为0.25g/L，KH2PO4的浓度为0.25g/L，MgSO4·7H2O的浓度为0.25g/L、ZnSO4·7H2O的浓度为0.003g/L，pH＝5.8。
8.如权利要求1所述的苔藓植物外植体的消毒方法，其特征在于：在步骤F中，将培养皿置于培养箱中培养15天，培养箱的温度为23-25度；每天24d中在黑暗中培养的时间为8小时，其余时间为光照下培养。
9.如权利要求1所述的苔藓植物外植体的消毒方法，其特征在于：在步骤G中，剪取培养基表面形成的原丝体和茎叶体，并依次经过如下浸泡处理：首先，放入浓度为75％酒精中浸泡5s，利用无菌水清洗5s后接着放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡10s，利用无菌水清洗5s后再放入浓度为75％酒精中浸泡5s，利用无菌水清洗5s后再放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡5s，最后再利用无菌水清洗干净后即可得到无菌的苔藓外植体。
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