CN113396822B - 野生四合木愈伤组织诱导方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种野生四合木愈伤组织诱导培养基，包括1/2MS盐、MES、吲哚丁酸IBA、蔗糖、琼脂，所述1/2MS盐、MES、吲哚丁酸IBA、蔗糖、琼脂在培养基中的终浓度为2.3g/l、0.25g/l、3mg/l、10g/l和7g/l，并加入KOH调节pH到5.75‑5.85。本发明还公开了一种野生四合木愈伤组织诱导培养方法，以四合木幼枝为外植体材料，75％酒精消毒1分钟、10％的次氯酸钠溶液处理16分钟，再通过30％的过氧化氢溶液处理10分钟，之后转后培养基中，在16h光照/8h黑暗的培养条件下，1/2MS+3mg/L IBA诱导四合木外植体愈伤；通过以上消毒方式进行愈伤消毒和以上培养基愈伤培养，可以得到理想的愈伤组织，能够为挽救四合木等类似濒危物种提供一定的帮助。

Description

野生四合木愈伤组织诱导方法

技术领域

本发明涉及四合木愈伤组织诱导培养基及诱导方法，属于植物培养领域。

背景技术

四合木（Tetraena mongolica Maxim）是蒺藜科（Zygophyllaceae）四合木属的一种强旱生肉质叶矮小灌木。根据研究，四合木源于蒙古南大陆热带地区，距今7000万年第三纪以前的残遗植物，现在已经濒临灭绝，被称为植物界的“大熊猫”。目前，野生四合木仅存在于我国内蒙古自治区鄂尔多斯高原西北部，库布其沙漠以南、卓资山的山麓地带，少量延伸到相邻的乌达低山残丘区。四合木的根系发达，可以很好的进行防风固沙，减少水土流失，所以四合木在荒漠植物中地位重要。由于四合木长期在严酷、恶劣自然生境中繁衍进化，有着如耐干旱、耐贫瘠等许多特殊的抗逆基因，因此四合木有着极大的科研价值。

沙漠环境恶劣，生长的植物种类并不多。四合木枝条的含油量很高，易燃烧，因此在当地成为了良好的木柴和牲畜饲料，曾经被人类大规模的砍伐。之后，由于城市建设，四合木和其他的荒漠植物的生存环境受到了极大的影响。目前，四合木被列为国家二级和内蒙古一级珍稀濒危植物。

研究植物的繁育技术是保护珍稀濒危植物的重要内容之一。无性繁殖技术，具有保持母株原有优良特性、提早开花结实和简单易行、成本低等优点，对于保护四合木提供了有效的方法。目前，在四合木的无性繁殖方面，相关实验报道相对很少。

植物进行无性繁殖时的生根方式有多种，扈顺、周志刚等人利用扦插实验发现四合木的生根方式为愈伤组织生根。这种生根方式中，需要先诱导生成愈伤组织后再生成不定根。只有生根，四合木才能在土壤中生存。扦插时幼枝上带有叶片能大幅度提高根的生成，适量添加外源激素也会促进不定根的生成。

李天然等以四合木的茎尖、花芽为材料，在添加了0.5mg /L的2,4-D、0.1 mg/L6-BA、500 mg/L的水解酪蛋白、3%蔗糖的1/2MS培养基诱导出愈伤组织。何丽君等在他的基础上对四合木的种子进行消毒培养出四合木的无菌苗。以其外植体进行离体培养，表明胚状体的发生2,4-D和6-BA是不可缺少的。

植物组织培养过程中的染菌是制约组培育苗发展的主要因素，对于实验和生产都有极大的影响。如果出现无菌操作不严格，无菌室杂菌含量过高，植株幼苗及外植体表面不完全消毒，培养瓶、接种工具灭菌时间短，消毒剂浓度低或放置时间过长，导致部分失效，接种人员自身的消毒不严等诸多情况，随着时间的延长，均有造成培养基的污染的可能性。当组培瓶内感染杂菌后，常会出现不同形状，色彩和大小的杂菌落。随着菌落的不断生长，杂菌在生长中会分泌的次生代谢产物及色素，使得培养基部分染色，同时，杂菌还会分泌毒素影响或杀死植物材料，造成严重的后果。

虽然组织培养的材料用无菌苗的效果最好，但是在实际实验和日常生产中，由于一些特殊环境或者种子稀少等原因，也经常会使用野外材料。而野外植物表面，经常会携带大量微生物，需要把材料表面和组织内的各种微生物杀灭干净而达到不影响外植体组织活力的。这对于植物外植体的消毒造成了极大的困难。

在利用野生植物作为外植体进行组培的试验中，佘小涵利用70%的酒精溶液和0.1%的HgCl溶液对野外直杆蓝桉茎段进行消毒，构建出植物快繁体系。但由于在本实验期间，升汞被列为禁药，所以不能用升汞消毒。

因此，本方案针对野生的四合木作为研究对象，研究其愈伤方法，希望能够为挽救四合木等类似濒危物种提供一定的帮助。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种野生四合木愈伤组织诱导培养基。

本发明的第二个目的在于提供野生四合木愈伤组织诱导方法。

本发明的第一个目的由如下技术方案实施：野生四合木愈伤组织诱导培养基，包括1/2MS盐、MES、吲哚丁酸IBA、蔗糖、琼脂，所述1/2MS盐、MES、吲哚丁酸IBA、蔗糖、琼脂在培养基中的终浓度为2.3g/L、0.25 g/L、3mg/L、10 g/L和7g/L，并加入KOH调节pH到5.75-5.85。

本发明的第二个目的由如下技术方案实施：野生四合木愈伤方法，包括如下步骤：

1）、四合木茎段准备：选取的野生四合木茎段，保留上面的叶子，用小刷子将茎段表面清洗干净；用解剖刀切成约3cm左右大小的四合木样本，放在烧杯中用自来水冲洗30min左右，后用无菌水清洗至少3遍；

2）、样本消毒：将诱导培养基、75％酒精溶液，10％次氯酸钠溶液紫外消毒20min以上后，将所述四合木样本先用75％酒精溶液处理1min，用无菌水清洗至少3遍；而后用30%的过氧化氢溶液处理10min；用无菌水清洗至少3遍；再用10％次氯酸钠溶液浸泡16min，之后转移到诱导培养基中；

3）愈伤培养：在16h光照/8h黑暗的培养条件下进行培养，培养条件为：温度22℃，空气湿度11％，正常光照。

本发明的优点：

（1）以四合木幼枝为外植体材料，75%酒精消毒1分钟、10%的次氯酸钠溶液处理16分钟，再通过30%的过氧化氢溶液处理10分钟的污染率最低，是有效的外植体消毒方式。

（2）在16h光照/8h黑暗的培养条件下，1/2MS + 3mg/L IBA是诱导四合木外植体愈伤组织的理想培养基。

通过以上消毒方式进行愈伤消毒和以上培养基愈伤培养，可以得到理想的愈伤组织，能够为挽救四合木等类似濒危物种提供一定的帮助。

附图说明：

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1中采取第一组消毒实验处理后的结果；

图2为中实施例1中采取第二组消毒实验处理后的结果；

图3为实施例1中采用第三组消毒实验处理后的结果。

图2中，1-9号分别为用2% 8min、2% 16min、2% 24min、5% 8min、5% 16min、5%24min、10% 8min、10%16min、10% 24min的NaClO溶液与75％酒精溶液、10％过氧化氢溶液对四合木外植体消毒的结果；

图3中，1-4号分别是浓度为1 mg/L、2 mg/L、3 mg/L和5 mg/L的IBA激素对四合木外植体愈伤组织诱导情况的结果。

具体实施方式：

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实施例用到的实验材料、药品和仪器如下：

1、实验材料

实验所用的四合木植物材料于2021年4月11日、17日、23日分别取自乌海市四合木核心保护区(N115º00'-116º40'，E41º50'-43º10')，选取生长良好，无病虫害的外植体放入纸袋内带回实验室。

2、药品和仪器

2.1 实验试剂

本研究所用试剂如表1所示。

表1 实验药品

Table 1: experimental drugs

药品名称公司名称
	Murashige & Skoog medium (with vitamins) 北京酷来博科技有限公司 蔗糖天津市风船化学试剂有限公司 Agar Powder（琼脂粉）Chembase MES, Freeacid 北京酷来博科技有限公司 吲哚丁酸（IBA）北京酷来博科技有限公司

2.2 培养基

本研究所用培养基的成分如表2所示。

表2 1/2MS培养基的配方(1L)

Table 2 Formula of 1/2MS medium(1L)

药品	剂量
		1/2MS盐	2.3g
蔗糖（浓度1%）	10g
		MES	0.25g
琼脂	7g
		pH	5.75-5.85

放入高压灭菌锅，120℃，101.3kPa条件下灭菌20分钟

2.3 实验仪器

本研究所用实验仪器如表3所示。

表3：实验仪器

Table 3: experimental instruments

仪器名称型号制造厂商
	高压灭菌锅 HVE-50 德国HICLAVE pH计 P8-10 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司 超净工作台 CBS-VS-1350T 北京市康倍斯有限公司

实施例1

该实施例先对野生四合木的消毒进行分析：

（1）测试75％酒精和10％NaClO溶液消毒效果

选取适量的四合木茎段，保留上面的叶子，用小刷子将茎段表面的清洗干净。用解剖刀切成约3cm左右大小，放在烧杯中用自来水冲洗30分钟左右，用无菌水清洗3遍。

将培养基，75％酒精溶液，10％次氯酸钠溶液和其他操作用品放入超净工作台紫外消毒20分钟。

将四合木茎段用75％酒精溶液处理6分钟，用无菌水清洗3遍。再用10％NaClO溶液浸泡10分钟，使用无菌水充分清洗多遍，移入培养基（该实施例中培养基IBA含量为3mg/L）中。

（2）测试75％酒精溶液、2％，5％ 10％NaClO溶液，10％过氧化氢溶液的消毒效果。

选取适量的四合木茎段，保留上面的叶子，用小刷子将茎段表面的清洗干净。用解剖刀切成约3cm左右大小，放在烧杯中用自来水冲洗30分钟以上，用无菌水清洗3遍。

将培养基，75％酒精溶液，次氯酸钠溶液和其他操作用品放入超净工作台紫外消毒20分钟。

先用酒精浸泡8分钟，无菌水清洗3遍；

之后再用10%过氧化氢浸泡10min，利用无菌水将四合木外植体清洗3遍；

最后按表格，使用次氯酸钠溶液进行消毒。

表4：次氯酸钠的浓度、消毒时间

Table 4: concentration and disinfection time of sodium hypochlorite

次氯酸钠浓度	2%	5%	10%
					8	8	8
消毒时间(min)	16	16	16
					24	24	24

使用无菌水经过多次冲洗后，再将四合木外植体接种到培养基（该实施例中培养基IBA含量为3mg/L）内。

（3）测试75％酒精溶液，10％NaClO溶液和不同浓度的过氧化氢溶液组合的消毒效果。

选取适量的四合木茎段，去掉上面的叶子，用细小毛刷将茎段表面的清洗干净。用解剖刀切成约1cm左右大小，放在烧杯中用自来水冲洗30分钟左右，冲洗后使用无菌水清洗3遍。

将75％酒精溶液，NaClO溶液和过氧化氢溶液，培养基，无菌水和实验操作器械放入超净工作台紫外消毒20分钟。

用75%的酒精溶液浸泡1分钟，偶尔摇晃，让再使用无菌水清洗3遍。

用10%的NaClO溶液浸泡16分钟，适当摇晃，使用无菌水将外植体清洗3遍。

最后用10%的过氧化氢溶液、20%的过氧化氢溶液、 30%的过氧化氢溶液按组浸泡10分钟，适当摇晃，使用无菌水多次冲洗后，将四合木外植体接种到培养基（该实施例中培养基IBA含量为3mg/L）内。

结果分析：

实施例1中，为了获得有效对四合木外植体进行消毒，实验采用了3种消毒方式，结果如下。

第一种为通过外植体75％酒精和10％NaClO溶液消毒方法，处理了27个外植体，经过7天培养，污染25个，无污染2个。

第二种为通过75％酒精溶液、2％，5％ 10％NaClO溶液，10％过氧化氢溶液的消毒方法，处理了27个外植体，经过7天培养，污染27个，无污染0个。

第三种为通过75％酒精溶液，10％NaClO溶液和不同浓度的过氧化氢溶液组合的消毒方法，处理了54个外植体，经过7天培养，污染24个，无污染30个。

在使用75％酒精和10％NaClO溶液对四合木外植体消毒的实验中，27个瓶只有2瓶未被感染，其余瓶长了菌。而两瓶未染菌的植物材料，活性也受到了极大的影响，推测是由于酒精消毒处理时间过长，导致植物材料受损过于严重，致使其逐渐失活。综合考虑，75％酒精溶液处理6分钟和10％次氯酸钠溶液处理10分钟的组合无法达到实验目的。图1为使用了75％酒精和10％NaClO溶液对四合木外植体消毒后未染菌的一瓶的图片。

在使用75％酒精溶液、2％，5％ 10％NaClO溶液，10％过氧化氢溶液的消毒实验时，由于在使用75％酒精和10％NaClO溶液对四合木外植体消毒的实验结果不理想，在这次实验的消毒处理中加入10％过氧化氢。实验结果全部长菌，并且根据后期观察发现，这次经过处理的四合木植物材料失绿现象严重，其中包括了2％次氯酸钠溶液处理8分钟的组合。综合第一次实验结果，只是提升次氯酸钠溶液的作用时间并不能达到实验目的。并且，为了降低对四合木外植体的影响，75%酒精溶液的作用时间需要降低。

75％酒精溶液、2％、5％、10％NaClO溶液，10％过氧化氢溶液的消毒效果如图2所示。

结合上述两组试验的结果，最终做了实施例1中的第3组试验，在使用75％酒精溶液，10％NaClO溶液和不同浓度的过氧化氢溶液组合的实验中，为了实验后具有说服力，每瓶培养瓶接种3个四合木的外植体材料。

使用75％酒精溶液，10％NaClO溶液和不同浓度的过氧化氢溶液对四合木外植体进行消毒，未染菌的实验结果如表5所示。

表5 四合木外植体消毒结果（单位：瓶）

过氧化氢溶液浓度	未染菌数目
		10%	1
20%	0
		30%	3

通过实验，发现使用30％的过氧化氢溶液的消毒的污染率较低。而在之后都长出了愈伤组织，说明在消毒的同时，四合木外植体材料仍然保持着活性。

实施例2

在实施例得到的优选消毒配方和消毒工艺前提下，配置 1/2MS培养基。在表2的基础上加入激素IBA浓度分别为1 ml/L、2 ml/L、3 ml/L、5 ml/L各3瓶，总计9瓶。

将消毒处理后的四合木外植体材料移入培养瓶内，培养条件：温度：22℃，空气湿度：11％，光照培养。

结果分析：

为了诱导四合木的愈伤组织，以四合木幼枝为材料，在1/2MS培养基中添加了不同浓度的IBA激素对四合木外植体进行诱导，实验结果如图3。

由图3可知，在激素IBA1 mg/L，2 mg/L，3 mg/L，5 mg/L的处理中，使用3 mg/L IBA的培养瓶出现的愈伤组织最明显。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.野生四合木愈伤组织诱导方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）、四合木茎段准备：选取的野生四合木茎段，保留上面的叶子，将茎段表面清洗干净；用解剖刀切成四合木样本，冲洗，后用无菌水清洗至少3遍；

2）、样本消毒：将诱导培养基、75％酒精溶液，10％次氯酸钠溶液紫外消毒后，将所述四合木样本先用75％酒精溶液处理1min，用无菌水清洗至少3遍；而后用10％次氯酸钠溶液浸泡16min；用无菌水清洗至少3遍；再用30%的过氧化氢溶液处理10min，之后转移到诱导培养基中；

3）愈伤培养：在16h光照/8h黑暗的培养条件下进行培养，培养条件为：温度22℃，空气湿度11％，正常光照。

2.根据权利要求1所述野生四合木愈伤组织诱导方法，其特征在于，所述诱导培养基包括1/2MS盐2.3g/L、MES 0.25 g/L、吲哚丁酸IBA 3mg/L、蔗糖10 g/L、琼脂7g/L，并加入KOH调节pH到5.75-5.85。

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