CN117617122B - 一种小黄姜脱毒及薄层培养的组合培养基和培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物的组织培养技术领域，具体涉及一种小黄姜脱毒及薄层培养的组合培养基和培养方法。本发明提供了一种小黄姜脱毒及薄层培养组合培养基，所述组合培养基包括初代培养基、丛芽诱导培养基与增殖和生根培养基；本发明提供了一种小黄姜脱毒及薄层培养的培养方法，将小黄姜的茎尖接种于初代培养基进行初代培养，得到脱毒组培苗；对所述脱毒组培苗进行细胞薄层培养，得到脱毒植株。本发明的技术方案丛芽诱导培养中的丛芽出芽数量多，脱毒植株的扩繁系数为21，显著提高了扩繁系数和扩繁效率。
Description
技术领域
本发明属于植物的组织培养技术领域，具体涉及一种小黄姜脱毒及薄层培养的组合培养基和培养方法。
背景技术
姜(Zingiber offcinaleRoscoe)为姜科多年生草本植物，又称生姜、黄姜等，在我国中部、东南至西南各省区广为栽培。
姜分为小种姜、大种姜、山姜(野姜)等品种，习惯把小种生姜叫“小黄姜”，小黄姜具有切面纯黄色，味辛辣浓，肉细嫩，味香，纤维较细等独特优点，深受人们的喜爱。
长期的无性繁殖导致病毒和病菌在种姜体内积累，并传到下一代姜苗中，使生姜抗逆性降低，生活力下降，生长缓慢，品种种性退化，品质差。目前中国专利CN107529398A-一种生姜脱毒繁育方法中公开了一种生姜脱毒苗的制备方法，生姜根茎萌发的幼芽进行组培，得到脱毒苗，利用脱毒苗的茎叶进行扩繁，分枝数量最高为6。目前生姜的脱毒组培中存在繁殖系数低的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种小黄姜脱毒及薄层培养的组合培养基和培养方法，应用本发明提供的组合培养基进行小黄姜脱毒和细胞薄层培养，脱毒彻底、增殖扩繁效率显著提高，能够获得大量小黄姜脱毒植株。
为了解决上述问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种小黄姜脱毒及薄层培养的组合培养基，所述组合培养基包括初代培养基、丛芽诱导培养基与增殖和生根培养基；
所述初代培养基以SH培养基为基本培养基，还包括：1～3mg/L 6-BA、0.1～1.5mg/LNAA、0.1～1.5mg/LGA3、30g/L蔗糖和5.5g/L琼脂；
所述丛芽诱导培养基以SH培养基为基本培养基，还包括：2～4mg/L 6-BA、0.1～1mg/LNAA、30g/L蔗糖和5.5g/L琼脂；
所述增殖和生根培养基以SH培养基为基本培养基，还包括：2～4mg/L 6-BA、0.1～1mg/LNAA、30g/L蔗糖和5.5g/L琼脂。
优选的，所述初代培养基的pH值为5.8～6.0；所述丛芽诱导培养基的pH值为5.8～6.0；所述增殖和生根培养基的pH值为5.8～6.0。
本发明提供了一种小黄姜的培养方法，所述培养方法采用上述技术方案所述组合培养基，包括以下步骤：
将小黄姜的茎尖接种于初代培养基进行初代培养，得到脱毒组培苗；
对所述脱毒组培苗茎基部往上0～0.5cm位置进行横切片，得到薄层培养切片材料；将所述切片材料接种于丛芽诱导培养基中进行薄层丛芽诱导培养，得到丛芽；
将所述丛芽接种于增殖和生根培养基进行增殖和生根培养，得到脱毒植株。
优选的，所述小黄姜的茎尖长度为1～3mm。
优选的，所述小黄姜的茎尖的培养方法包括：选取外表无病症的姜芽，在所述姜芽中剥取长度为1～3mm的茎尖。
优选的，剥取姜芽得到茎尖前，还包括对姜芽进行消毒；
所述消毒的方式包括：先用质量浓度70％～75％酒精浸泡30～45s，用无菌水冲洗3～4次；再用质量浓度为0.1％升汞溶液浸泡2～4min；最后用无菌水冲洗6～8次。
优选的，所述初代培养、薄层丛芽诱导培养与增殖和生根培养的温度分别为(25±2)℃。
优选的，所述初代培养先进行暗培养再进行光培养，所述暗培养的时间为2～3d；所述光培养的时间为27～28d；所述初代培养的时间30d；光培养中的光照强度为1500～1800lux，光照时间为12h/d。
优选的，所述薄层丛芽诱导培养先进行暗培养再进行光培养，所述暗培养的时间为2～3d；所述光培养的时间为27～28d；光照强度为1500～1800lux，光照时间为12h/d。
优选的，所述薄层丛芽诱导培养的时间为30d，所述增殖和生根培养的时间为30d。
本发明的有益效果：本发明提供了一种小黄姜脱毒及薄层培养组合培养基，所述组合培养基包括初代培养基、丛芽诱导培养基与增殖和生根培养基；
所述初代培养基以SH培养基为基本培养基，还包括：1～3mg/L 6-BA、0.1～1.5mg/LNAA、0.1～1.5mg/LGA3、30g/L蔗糖和5.5g/L琼脂；
所述丛芽诱导培养基以SH培养基为基本培养基，还包括：2～4mg/L 6-BA、0.1～1mg/LNAA、30g/L蔗糖和5.5g/L琼脂；
所述增殖和生根培养基以SH培养基为基本培养基，还包括：2～4mg/L 6-BA、0.1～1mg/LNAA、30g/L蔗糖和5.5g/L琼脂。
在本发明提供的组合培养基中，6-BA(6-苄氨基嘌呤)刺激细胞分裂促进小黄姜生长和发育，促进芽的形成；NAA(1-萘乙酸)促进小黄姜发芽和生长；GA3(赤霉素)进茎的生长；6-BA、NAA、赤霉素共同作用下利于诱导小黄姜芽的形成，提高小黄姜的扩繁系数，获得小黄姜脱毒及薄层培养植株。
本发明还提供了一种小黄姜脱毒及薄层培养的培养方法，将小黄姜的茎尖接种于初代培养基进行初代培养，得到脱毒组培苗；对所述脱毒组培苗茎基部往上0～0.5cm位置进行横切片，得到薄层培养切片材料；将所述切片材料接种于丛芽诱导培养基中进行薄层丛芽诱导培养，得到丛芽；将所述丛芽接种于增殖和生根培养基进行增殖和生根培养，得到脱毒植株。本发明利用脱毒及薄层培养相结合的方案显著提高了脱毒植株的扩繁系数，实施例结果表明：本发明获得的脱毒植株的扩繁系数为21，扩繁效率显著提高。可见，本发明的技术方案不仅有效，而且显著提升了扩繁效率，还具有操作简单和成本低廉的优势。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为小黄姜脱毒苗细胞薄层切取范围；
图2为小黄姜薄层培养过程。
具体实施方式
本发明提供了一种小黄姜脱毒及薄层培养的组合培养基，所述组合培养基包括初代培养基、丛芽诱导培养基和增殖和生根培养基。
在本发明中，所述初代培养基以SH培养基为基本培养基，还包括1～3mg/L6-BA、0.1～1.5mg/LNAA、0.1～1.5mg/LGA3、30g/L蔗糖和5.5g/L琼脂；更优选以SH培养基为基本培养基，还仅含有：1～3mg/L 6-BA、0.1～1.5mg/L NAA、0.1～1.5mg/LGA3、30g/L蔗糖和5.5g/L琼脂。在本发明中，所述初代培养基中6-BA的浓度为1～3mg/L，优选为1.5～2.5mg/L，更优选为2mg/L；所述初代培养基中NAA的浓度为0.1～1.5mg/L，优选为0.2～1mg/L，更优选为0.4mg/L；所述初代培养基中GA3的浓度为0.1～1.5mg/L，优选为0.3～1mg/L，更优选为0.5mg/L；所述初代培养基中蔗糖的浓度为30g/L；所述初代培养基中琼脂的浓度为5.5g/L。本发明中6-BA、NAA和GA3在适当浓度配比下能够共同促进小黄姜的茎尖分化形成芽，进而获得脱毒组培苗。
在本发明中，所述初代培养基的pH值为5.8～6.0。
在本发明中，所述丛芽诱导培养基以SH培养基为基本培养基，还包括：2～4mg/L6-BA、0.1～1mg/LNAA、30g/L蔗糖和5.5g/L琼脂；更优选以SH培养基，还仅含有：2～4mg/L6-BA、0.1～1mg/LNAA、30g/L蔗糖和5.5g/L琼脂。在本发明中，所述诱导培养基中6-BA的浓度为2～4mg/L，优选为2.5～3.5mg/L，更优选为3mg/L；所述诱导培养基中NAA的浓度为0.1～1mg/L，优选为0.15～0.5mg/L，更优选为0.2mg/L；所述诱导培养基中蔗糖的浓度为30g/L；所述诱导培养基中琼脂浓度为5.5g/L琼脂。本发明诱导培养基中添加NAA和6-BA的作用为共同促进小黄姜的薄层材料分化形成丛芽。
在本发明中，所述诱导培养基的pH值优选为5.8～6.0。
在本发明中，所述增殖和生根培养基以SH培养基为基本培养基，还包括：2～4mg/L6-BA、0.1～1mg/LNAA、30g/L蔗糖和5.5g/L琼脂；更优选以SH培养基为基本培养基，还仅含有：2～4mg/L 6-BA、0.1～1mg/LNAA、30g/L蔗糖和5.5g/L琼脂。在本发明中，所述增殖和生根培养基中6-BA浓度为2～4mg/L，优选为2～3.5mg/L，更优选为2mg/L；所述增殖和生根培养基中NAA浓度为0.1～1mg/L，优选为0.3～0.6mg/L，更优选为0.4mg/L；所述增殖和生根培养基中蔗糖的浓度优选为30g/L；所述增殖和生根培养基中琼脂浓度优选为5.5g/L。本发明中，6-BA能够刺激细胞分裂促进小黄姜生长和发育，促进芽的形成；NAA能够促进小黄姜发芽和生根。
在本发明中，所述增殖和生根培养基的pH值优选为5.8～6.0。
本发明对上述培养基中的各个组分来源没有特殊的限定，采用常规的市售产品即可。
本发明所述SH培养基是适用于植物组织培养的培养基，其配方为硝酸钾2500mg/L、磷酸二氢铵(NH4H2PO4)300mg/L、硫酸镁(MgSO4)195mg/L、无水氯化钙(CaCl2)151mg/L、硫酸锌(ZnSO4·7H2O)1mg/L、碘化钾(KI)1mg/L、硼酸(H3BO3)5mg/L、钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)0.1mg/L、氯化钴(CoCl2·6H2O)0.1mg/L、硫酸锰(MnSO4·H2O)10mg/L、硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.2mg/L、乙二胺四乙酸二钠(Na2·EDTA·2H2O)37.3mg/L、烟酸(VB5)0.5mg/L、盐酸硫胺素(VB1)0.4mg/L、盐酸吡哆醇(VB6)0.5mg/L、甘氨酸2mg/L和肌醇100mg/L。
本发明配制初代培养基时，制备方法为：先配置SH培养基的母液，计算出每升初代培养基中的SH培养基母液添加量，SH培养基母液中加入1～3mg 6-BA、0.1～1.5mg NAA、0.1～1.5mg GA3和30g的蔗糖后用水定容至1L，调节pH值为5.8后加入5.5g琼脂。
本发明配制丛芽诱导培养基时，制备方法为：先配置SH培养基母液，计算出每升丛芽诱导培养基中的SH培养基母液添加量，SH培养基母液中加入2～4mg6-BA、0.1～1mg NAA和30g的蔗糖后用水定容至1L，调节pH值为5.8后加入5.5g琼脂。
本发明配制增殖和生根培养基时，制备方法为：先配置SH培养基的母液，计算出每升增殖和生根培养基中的SH培养基母液添加量，SH培养基母液中加入2～4mg 6-BA、0.1～1mg NAA和30g蔗糖后用水定容至1L，调节pH值为5.8后加入5.5g琼脂。
本发明还提供了一种小黄姜脱毒及薄层培养的培养方法，所述培养方法采用上述技术方案所述的组合培养基，包括以下步骤：
将小黄姜的茎尖接种于初代培养基进行初代培养，得到脱毒组培苗；对所述脱毒组培苗茎基部往上0～0.5cm位置进行横切片，得到薄层培养切片材料；将所述切片材料接种于丛芽诱导培养基中进行薄层丛芽诱导培养，得到丛芽；
将所述丛芽接种于增殖和生根培养基进行增殖和生根培养，得到脱毒植株。
本发明将小黄姜的茎尖接种于初代培养基进行初代培养，得到脱毒组培苗。本发明所述小黄姜的茎尖的培养方法优选包括：对小黄姜的姜种进行催芽，得到姜芽；在所述姜芽中剥取长度为1～3mm的茎尖。本发明以小黄姜的姜芽作为外植体。本发明对姜芽进行消毒和剥取，得到茎尖。本发明所述消毒和剥取优选在超净工作台内完成。本发明所述消毒的试剂优选为质量浓度70％～75％酒精和质量浓度为0.1％升汞溶液，更优选为质量浓度75％酒精和质量浓度为0.1％升汞溶液。本发明所述消毒方式先用70％～75％酒精优选浸泡30～45s，进一步优选为30～35s，更优选为30s，再优选用无菌水冲洗3～4次；再优选用质量浓度为0.1％升汞溶液浸泡2～4min，更优选为3min；最后优选用无菌水冲洗6～8次，更优选为冲洗7次。本发明所述70％～75％酒精和0.1％升汞溶液的用量均优选淹没小黄姜姜芽即可。本发明从姜芽中剥取得到的小黄姜茎尖长度优选为1～3mm。
得到茎尖后，本发明将小黄姜的茎尖接种于初代培养基进行初代培养，得到脱毒组培苗。
在本发明中，所述初代培养的温度优选为25±2℃。
本发明所述初代培养优选先进行暗培养再进行光培养，所述暗培养的时间优选为2～3d；所述光培养的时间优选为27～28d；本发明所述初代培养的时间以暗培养和光培养的总时间计。在本发明中，所述初代培养时间优选为30d。本发明所述初代培养优选先进行暗培养2d后再进行光培养28d或优选先进行暗培养3d后再进行光培养27d。
在本发明中，所述小黄姜初代培养中光培养的光照时间优选为12h/d；所述光照强度优选为1500～1800lux。本发明所述茎尖组织培养小黄姜的茎尖分化形成脱毒苗。本发明所述脱毒是利用茎尖进行组培实现的，脱毒原理：根据病毒在植物体内分布不均匀，顶端生长点分生组织不带病毒或检测不到病毒的特点，通过茎尖剥离脱毒并获得无毒苗。
得到脱毒组培苗后，本发明对所述脱毒组培苗茎基部往上0～0.5cm位置进行横切片，得到薄层培养切片材料；将所述切片材料接种于丛芽诱导培养基中进行薄层丛芽诱导培养，得到丛芽。
本发明所述切片时优选先去除叶片和根，再在靠近茎基部往上0～0.5cm位置进行横切，以得到的横切片作为薄层培养切片材料。本发明在靠近茎基部往上0～0.5cm位置进行横切片是为了促进切片材料的发芽和生根。
得到切片材料后，本发明将所述切片材料接种于丛芽诱导培养基中进行薄层丛芽诱导培养，得到丛芽。本发明所述切片材料的大小优选为0.5cm左右，切片的厚度优选为1～2mm；之所以限定厚度是由于横切片过厚，切口上层感受激素浓度比实际浓度低，导致生长周期长，出芽慢；横切片过薄，切后易愈伤化，横切片向内卷曲，不利于丛芽诱导。发明所述丛芽诱导培养的温度优选为25±2℃。本发明所述薄层丛芽诱导培养优选先进行暗培养再进行光培养，所述暗培养的时间优选为2～3d；所述光培养的时间优选为27～28d，光照强度优选为1500～1800lux，光照时间为12h/d。本发明所述薄层丛芽诱导培养的时间优选为30d，当所述薄层丛芽诱导培养中暗培养的时间优选为2d，光培养的时间优选为28d或当暗培养的时间优选为3d，光培养的时间优选为27d。
得到丛芽后，本发明将所述丛芽接种于增殖和生根培养基进行增殖和生根培养，得到脱毒植株。本发明所述丛芽的长度和芽点数无具体要求，薄层丛芽诱导培养结束后转接至增殖和生根培养基中即可。本发明所述薄层增殖和生根培养的温度优选为25±2℃。本发明所述薄层增殖和生根培养优选在光条件下进行，光条件下的光照强度优选为3000～4000lux，更优选为3200～3800lux。本发明光培养中的光照时间优选为12h/d。本发明所述增殖和生根培养的时间优选为30d。
薄层细胞培养(TCL，thin cell layer culture)最初是指从外植体表皮部位撕下长5mm、宽1mm、厚3～6层细胞(包括表皮层细胞和数层薄壁细胞)接种于适宜的培养基中进行培养的方法，而现在将把外植体横切成大约1mm厚的薄片进行培养的方法统称为薄层培养(transverse TCL，tTCL)。它最早是由Tran Than Van在1970年以Nautilocalyx lynchii的表皮组织为外植体获得根和芽的分化建立的一种培养系统。本发明的薄层细胞培养技术方案适用于小黄姜的培养需求，本发明茎尖组织培养和薄层细胞培养相结合方式实现了小黄姜组培苗的脱毒，提高了小黄姜组培的繁殖系数。
本发明利用植物组织薄层培养技术和外植体消毒技术提高培养方法的脱毒效率和繁殖效率。本发明提供的小黄姜脱毒及薄层培养的培养方法，操作简单、成本低廉，为小黄姜的脱毒苗的组培奠定技术基础。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1和对比例1、对比例2、对比例3应用的是同一批次采集的小黄姜的姜种，姜种催芽后得到姜芽；实施例1和对比例1、对比例2、对比例3应用的姜芽长势一致。
实施例1一种小黄姜脱毒及薄层培养的培养方法，步骤如下：
S1外植体处理：选取外表无病症小黄姜的姜芽，剥去姜芽最外层组织后浸泡于有效成分75％百菌清1000倍液中30min，清洁剂清洗后置于流水下冲洗20min后备用。
S2茎尖初代培养：将S1得到姜芽置于超净工作台内，利用质量浓度为75％酒精消毒30s，无菌水清洗3次；再用质量浓度0.1％升汞处理3min，无菌水清洗6～8次；之后剥取长度为0.1～0.3mm的茎尖，接种于初代培养基上，先进行暗培养2d后再进行光培养28d，光培养中光照强度为1500～1800lux，光照时间为12h/d，培育到形成脱毒组培苗；初代培养基组成为：以SH培养基为基本培养基，还含有2mg/L6-BA、0.4mg/LNAA、0.5mg/LGA3、蔗糖30g/L和琼脂5.5g/L，pH值为5.8。
S3薄层丛芽诱导：将S2得到的健壮脱毒组培苗，去取叶片和根之后，切开第一根生根位置的茎基部，保留上部分，用于切薄片；即切片的位置为小黄姜茎基部往上0～0.5cm的位置，小黄姜薄层切取的位置如图1所示。将所得到的切片材料接种至丛芽诱导培养基上进行薄层丛芽诱导培养直至形成丛芽；丛芽诱导培养基组成为：以SH培养基为基本培养基，还含有3.0mg/L6-BA、0.2mg/LNAA、30g/L蔗糖和5.5g/L琼脂。薄层丛芽诱导培养在光暗交替条件下进行，光培养中的光照强度为1500～1800lux，光照时间为12h/d；培养温度为(25±2)℃，薄层丛芽诱导培养时间为30d。
S4丛芽增殖和生根培养：将S3所得到的丛芽接种到增殖和生根培养基进行增殖和生根培养。增殖和生根培养基的组成为：以SH培养基为基本培养基，还仅含有2mg/L6-BA、0.4mg/LNAA、30g/L蔗糖和5.5g/L琼脂。增殖和生根培养培养在光条件下进行，光照强度为3000～4000lux，光照时间为12h/d；培养温度为(25±2)℃，增殖和生根培养培养时间为30d。增殖和生根培养丛芽生长正常，分化出新的芽点并长新根，可得到健壮的脱毒植株。
图2为实施例1小黄姜薄层培养过程，其中：A为切好的薄层材料；B为薄层丛芽诱导培养10d情况；C为薄层丛芽诱导培养20d情况；D为丛芽增殖与生根阶段培养30d情况。
对比例1
S1外植体处理：同实施例1。S2茎尖初代培养：同实施例1。
S3丛芽诱导：将S2所得到的脱毒组培苗接种到丛芽诱导培养基进行丛芽诱导。丛芽诱导培养基的组成同实施例1。
丛芽诱导在光条件下进行，光照强度为1500～1800lux，光照时间为12h/d；培养温度为(25±2)℃，丛芽诱导培养时间为30d。
S4丛芽增殖和生根培养：同实施例1。
对实施例1和对比例1的S3丛芽诱导结束后的芽点数和扩繁系数进行计算，计算公式如下：
扩繁系数(％)＝S3丛芽诱导结束后形成的总苗数/初始接种苗数；
结果见表1。根据表1可知，本发明实施例1将小黄姜茎尖制备成脱毒苗后，再将脱毒苗切成薄片进行培养，较于对比例1直接接种茎尖培养，实施例1的扩繁系数为21，扩繁系数显著提高，提升了扩繁效率。实施例1扩繁系数21的来源，一株脱毒苗可切三个薄层，一个薄层经过30d薄层丛芽诱导后可长出7个芽点，一株脱毒苗切的三个薄层共计有21个芽点。对比例1扩繁系数为3，一株脱毒苗经过30d丛芽诱导，可长出3个芽点。
表1实施例1和对比例1的芽点数和扩繁系数结果
| 扩繁方式 | 分株繁殖 | 薄层培养 |
| 培养周期 | 30d | 30d |
| 扩繁系数 | 3 | 21 |
对比例2
S1外植体处理：同实施例1。S2茎尖初代培养：同实施例1。区别在于，初代培养基组成为：以MS培养基为基本培养基，还含有2mg/L6-BA、0.4mg/LNAA、0.5mg/LGA3、蔗糖30g/L和琼脂5.5g/L，pH值为5.8。
S3薄层丛芽诱导：同实施例1。区别在于，丛芽诱导培养基组成为：以MS培养基为基本培养基，还含有3.0mg/L6-BA、0.2mg/LNAA、30g/L蔗糖和5.5g/L琼脂。薄层丛芽诱导培养在光暗交替条件下进行，光培养中的光照强度为1500～1800lux，光照时间为12h/d；培养温度为(25±2)℃，薄层丛芽诱导培养时间为30d。
S4丛芽增殖和生根培养：将S3所得到的丛芽接种到增殖和生根培养基进行增殖和生根培养。增殖和生根培养基的组成为：以MS培养基为基本培养基，还仅含有2mg/L6-BA、0.4mg/LNAA、30g/L蔗糖和5.5g/L琼脂。增殖和生根培养培养在光条件下进行，光照强度为3000～4000lux，光照时间为12h/d；培养温度为(25±2)℃，增殖和生根培养培养时间为30d。增殖和生根培养丛芽生长正常，分化出新的芽点并长新根，可得到健壮的脱毒植株。
对比例2基本培养基为MS培养基。所述MS培养基是适用于植物组织培养的培养基，其配方为硝酸铵(NH4NO3)1650mg/L、硝酸钾(KNO3)1900mg/L、磷酸二氢钾(KH2PO4)170mg/L、七水合硫酸镁(MgSO4·7H2O)370mg/L、无水氯化钙(CaCl2)440mg/L、硫酸锰(MnSO4·4H2O)22.3mg/L、七水合硫酸锌(ZnSO4·7H2O)8.6mg/L、碘化钾(KI)0.83mg/L、硼酸(H3BO3)6.2mg/L、钼酸钠(NaMoO4·2H2O)0.25mg/L、氯化钴(CoCl2·6H2O)0.025mg/L、硫酸铜(CuSO4)0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠盐(Na2-EDTA)37.3mg/L、七水合硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)27.8mg/L、烟酸(VB5)0.5mg/L、盐酸硫胺素(VB1)0.1mg/L、盐酸吡哆醇(VB6)0.5mg/L、甘氨酸2mg/L、肌醇100mg/L。
对实施例1和对比例2的薄层丛芽诱导培养第30d的出芽数进行统计。结果见表2。根据表2可知，基础培养基中应用SH比MS培养基更加适合小黄姜丛芽的诱导。实施例1中出芽数为21个，一株脱毒苗可切三个薄层，一个薄层可长出7个芽点，一株脱毒苗切的三个薄层共计有21个芽点。对比例2中出芽数为9个，一株脱毒苗可切三个薄层，一个薄层可长出3个芽点，一株脱毒苗切的三个薄层共计有9个芽点。
表2实施例1与对比例2的出芽数结果
对比例3
S1外植体处理：同实施例1。
S2茎尖初代培养：同实施例1。
S3薄层丛芽诱导：同实施例1。
将S3所得到的切片材料接种至丛芽诱导培养基上进行薄层丛芽诱导培养直至形成丛芽；丛芽诱导培养基组成为：以SH培养基为基础培养基，还含有3.0mg/L6-BA、0.2mg/LIBA、30g/L蔗糖和5.5g/L琼脂。丛芽诱导培养先进行暗培养2d后再进行光培养28d，光培养中光照强度为1500～1800lux，光照时间为12h/d，培养温度为(25±2)℃，培养时间为30d。
对比例3只进行到薄层丛芽诱导培养。
对实施例1和对比例3的薄层丛芽诱导培养第30d的出芽数进行统计。结果见表3。根据表3可知，诱导培养基中应用NAA比IBA培养基更加适合小黄姜丛芽的诱导。实施例1中出芽数为21个，一株脱毒苗可切三个薄层，一个薄层可长出7个芽点，一株脱毒苗切的三个薄层共计有21个芽点。对比例3中出芽数为9个，一株脱毒苗可切三个薄层，一个薄层可长出3个芽点，一株脱毒苗切的三个薄层共计有9个芽点。
表3实施例1和对比例3的出芽数结果
综上所述，利用本发明的培养方法可以获得的小黄姜脱毒及薄层培养植株，建立了小黄姜脱毒及薄层培养技术体系，出芽数多，繁殖系数高，实现脱毒苗的快速繁殖和生长。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (11)
1.一种小黄姜脱毒及薄层培养的组合培养基，其特征在于，所述组合培养基包括初代培养基、丛芽诱导培养基与增殖和生根培养基；
所述初代培养基的组成为：SH培养基、1~3mg/L 6-BA、0.1~0.4mg/L NAA、0.1~0.5mg/LGA3、30g/L蔗糖和5.5g/L琼脂；
所述丛芽诱导培养基的组成为：SH培养基、2~4mg/L 6-BA、0.1~0.2mg/L NAA、30g/L蔗糖和5.5g/L琼脂；
所述增殖和生根培养基的组成为：SH培养基、2~4mg/L 6-BA、0.3~1mg/L NAA、30g/L蔗糖和5.5g/L琼脂；
所述SH培养基的配方为硝酸钾 2500mg/L、磷酸二氢铵(NH4H2PO4)300mg/L、硫酸镁(MgSO4)195mg/L、无水氯化钙(CaCl2)151mg/L、七水硫酸锌 (ZnSO4·7H2O)1mg/L、碘化钾(KI)1mg/L、硼酸(H3BO3)5mg/L、钼酸钠二水合物(Na2MoO4·2H2O)0.1mg/L、六水合氯化钴(CoCl2·6H2O)0.1mg/L、硫酸锰一水合物（MnSO4·H2O）10mg/L、五水硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.2mg/L、乙二胺四乙酸二钠二水合物(Na2·EDTA·2H2O)37.3mg/L、烟酸(VB5)0.5mg/L、盐酸硫胺素(VB1)0.4mg/L、盐酸吡哆醇(VB6)0.5mg/L、甘氨酸2mg/L和肌醇100mg/L。
2.根据权利要求1所述组合培养基，其特征在于，所述初代培养基的pH值为5.8~6.0；所述丛芽诱导培养基的pH值为5.8~6.0；所述增殖和生根培养基的pH值为5.8~6.0。
3.根据权利要求1所述组合培养基，其特征在于，所述初代培养基的组成为：SH培养基、2mg/L 6-BA、0.4mg/L NAA、0.5mg/LGA3、30g/L蔗糖和5.5g/L琼脂；
所述丛芽诱导培养基的组成为：SH培养基、3mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA、30g/L蔗糖和5.5g/L琼脂；
所述增殖和生根培养基的组成为：SH培养基、2mg/L 6-BA、0.4mg/L NAA、30g/L蔗糖和5.5g/L琼脂。
4.一种小黄姜的培养方法，其特征在于，所述培养方法采用权利要求1~3任一项所述组合培养基，包括以下步骤：
将小黄姜的茎尖接种于初代培养基进行初代培养，得到脱毒组培苗；
对所述脱毒组培苗茎基部往上0~0.5cm位置进行横切片，得到薄层培养切片材料；将所述切片材料接种于丛芽诱导培养基中进行薄层丛芽诱导培养，得到丛芽；
将所述丛芽接种于增殖和生根培养基进行增殖和生根培养，得到脱毒植株。
5.根据权利要求4所述培养方法，其特征在于，所述小黄姜的茎尖长度为1~3mm。
6.根据权利要求4或5所述培养方法，其特征在于，所述小黄姜的茎尖的培养方法包括：选取外表无病症的姜芽，在所述姜芽中剥取长度为1~3mm的茎尖。
7.根据权利要求6所述培养方法，其特征在于，剥取姜芽得到茎尖前，还包括对姜芽进行消毒；
所述消毒的方式包括：先用质量浓度70%~75%酒精浸泡30~45s，用无菌水冲洗3~4次；再用质量浓度为0.1%升汞溶液浸泡2~4min；最后用无菌水冲洗6~8次。
8.根据权利要求4所述培养方法，其特征在于，所述初代培养、薄层丛芽诱导培养与增殖和生根培养的温度分别为25±2℃。
9.根据权利要求4所述培养方法，其特征在于，所述初代培养先进行暗培养再进行光培养，所述暗培养的时间为2~3d；所述光培养的时间为27~28d；所述初代培养的时间30d；光培养中的光照强度为1500~1800lux，光照时间为12h/d。
10.根据权利要求4所述培养方法，其特征在于，所述薄层丛芽诱导培养先进行暗培养再进行光培养，所述暗培养的时间为2~3d；所述光培养的时间为27~28d；光照强度为1500~1800lux，光照时间为12h/d。
11.根据权利要求4所述培养方法，其特征在于，所述薄层丛芽诱导培养的时间为30d，所述增殖和生根培养的时间为30d。
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