CN108040876A - 一种多肉植物的组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多肉植物的组织培养方法，包括：1）将多肉植物的叶片进行灭菌消毒，接着将叶片切碎作为外植体，然后将外植体外植体置于基础培养基中进行初次诱导以得到愈伤组织；2）将愈伤组织置于诱导培养基中进行二次诱导以催生不定芽；3）将具有不定芽的愈伤组织切块以得到愈伤组织块且愈伤组织块至少具有两个不定芽，接着将愈伤组织块置于增殖培养基中进行增殖培养以得到增殖芽块；4）将增殖芽块置于生根培养基中进行生根培养以得到组织培养苗；5）将组织培养苗炼苗。该多肉植物的组织培养方法具有优异的成活率以及繁殖率。
Description
技术领域
本发明涉及组织培养方法，具体地，涉及一种多肉植物的组织培养方法。
背景技术
多肉植物亦称多浆植物、肉质植物，在园艺上有时称多肉花卉，但以多肉植物这个名称最为常用。多肉植物是指植物营养器官的某一部分，如茎或叶或根（少数种类兼有两部分）具有发达的薄壁组织用以贮藏水分，在外形上显得肥厚多汁的一类植物。
多肉植物的繁殖方式常用的为：嫁接、扦插与播种；无论上述何种繁殖方式，均存在成活率低与繁殖效率低的缺陷，进而限制了多肉植物栽培。
发明内容
本发明的目的是提供一种多肉植物的组织培养方法，该多肉植物的组织培养方法具有优异的成活率以及繁殖率。
为了实现上述目的，本发明提供了一种多肉植物的组织培养方法，包括：
1）将多肉植物的叶片进行灭菌消毒，接着将叶片切碎作为外植体，然后将外植体外植体置于基础培养基中进行初次诱导以得到愈伤组织；
2）将愈伤组织置于诱导培养基中进行二次诱导以催生不定芽；
3）将具有不定芽的愈伤组织切块以得到愈伤组织块且愈伤组织块至少具有两个不定芽，接着将愈伤组织块置于增殖培养基中进行增殖培养以得到增殖芽块；
4）将增殖芽块置于生根培养基中进行生根培养以得到组织培养苗；
5）将组织培养苗炼苗；
其中，步骤1）-4）的培养条件均至少符合以下条件：无菌且透气；基础培养基为含有NAA（1-萘乙酸）、6-KT（激动素）和IAA（吲哚-3-乙酸）的MS培养基；诱导培养基为含有6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）、蛋白胨、摩西球囊霉的MS培养基；增殖培养基为含有玉米素、水解酪蛋白、活性炭的MS培养基；生根培养基含有1/2MS培养基。
在上述技术方案中，本发明采取多肉植物的叶片作为外植体，然后依次经过初次诱导、二次诱导、增殖培养、生根培养、炼苗以得到成熟的多肉植物，在各个培养工序中采用特定的培养基进而使得得到的多肉植物具有优异的成活率和高产率，在此基础上能够大面积的进行培育多肉植物，从而为多肉植物的推广奠定了坚实的基础。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供了一种多肉植物的组织培养方法，包括：
1）将多肉植物的叶片进行灭菌消毒，接着将叶片切碎作为外植体，然后将外植体外植体置于基础培养基中进行初次诱导以得到愈伤组织；
2）将愈伤组织置于诱导培养基中进行二次诱导以催生不定芽；
3）将具有不定芽的愈伤组织切块以得到愈伤组织块且愈伤组织块至少具有两个不定芽，接着将愈伤组织块置于增殖培养基中进行增殖培养以得到增殖芽块；
4）将增殖芽块置于生根培养基中进行生根培养以得到组织培养苗；
5）将组织培养苗炼苗；
其中，步骤1）-4）的培养条件均至少符合以下条件：无菌且透气；基础培养基为含有NAA、6-KT和IAA的MS培养基；诱导培养基为含有6-BA、蛋白胨、摩西球囊霉的MS培养基；增殖培养基为含有玉米素、水解酪蛋白、活性炭的MS培养基；生根培养基含有1/2MS培养基。
在本发明的基础培养基中，各组分的含量可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高多肉植物的成活率和繁殖效率，优选地，在基础培养基中，NAA的含量为0.5-0.8mg/L，6-KT的含量为0.2-0.4mg/L，IAA的含量为0.3-0.5mg/L。
在本发明的诱导培养基中，各组分的含量可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高多肉植物的成活率和繁殖效率，优选地，在诱导培养基中，6-BA的含量为0.1-0.3mg/L，蛋白胨的含量为1.5-2.5mg/L，摩西球囊霉的孢子含量为1000-1200个/L。
在本发明的增殖培养基中，各组分的含量可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高多肉植物的成活率和繁殖效率，优选地，在增殖培养基中，玉米素的含量为0.8-1.5mg/L，水解酪蛋白的含量为0.6-1mg/L，活性炭的含量为0.2-0.4mg/L。
在本发明的各种培养基中，为了更好地为各个组织提供优异的养分以及适宜的培养条件，优选地，基础培养基、诱导培养基、增殖培养基以及生根培养基均含有6.5-7.0g/L的琼脂和25-30g/L的蔗糖，且pH值为6.0-7.0。
在本发明的步骤1）中，灭菌消毒的具体条件可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高多肉植物的成活率和繁殖效率，优选地，在步骤1）中，灭菌消毒具体为：先将叶片置于60-70重量%酒精水溶液中浸泡30-60s，接着将其置于3-5重量%次氯酸钠水溶液中浸泡3-4min，最后通过蒸馏水进行清洗3-5次。
在本发明的步骤1）中，外植体的大小可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高多肉植物的成活率和繁殖效率，优选地，在步骤1）中，外植体的长度为0.35-0.45cm，宽度为0.15-0.3cm。
在本发明的步骤1）中，初次诱导的条件可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高多肉植物的成活率和繁殖效率，优选地，初次诱导满足以下条件：先暗培养1-2天，接着转入光暗交替的条件下培养4-6天；其中，光暗交替条件为：光照时间为12-14h/天，黑暗时间为10-12h/天，光照强度为1800-2000lux，培养温度为21-23℃，相对湿度为50-60%。
在本发明的步骤2）中，二次诱导的条件可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高多肉植物的成活率和繁殖效率，优选地，在步骤2）中，二次诱导于光暗交替的条件下进行直至不定芽的高度超过1cm；其中，光暗交替条件为：光照时间为12-14h/天，黑暗时间为10-12h/天，光照强度为1800-2000lux，培养温度为21-23℃，相对湿度为50-60%。
在本发明的步骤3）中，增殖培养的条件可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高多肉植物的成活率和繁殖效率，优选地，在步骤3）中，增殖培养于光暗交替的条件下进行直至增殖芽块上增殖出的新不定芽的高度为2cm以上；其中，光暗交替条件为：光照时间为12-14h/天，黑暗时间为10-12h/天，光照强度为1800-2000lux，培养温度为21-23℃，相对湿度为50-60%。
在本发明的步骤4）中，生根培养的条件可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高多肉植物的成活率和繁殖效率，优选地，在步骤4）中，生根培养于光暗交替的条件下进行直至组织培养苗的高度为4cm以上；其中，光暗交替条件为：光照时间为12-14h/天，黑暗时间为10-12h/天，光照强度为1800-2000lux，培养温度为21-23℃，相对湿度为50-60%。
在本发明中，无菌且透气条件的获取可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高多肉植物的成活率和繁殖效率，优选地，步骤1）-4）中的无菌且透气条件通过以下操作获得：培养环境为带防菌透气膜的组培瓶。其中，透气膜的具体条件也可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高多肉植物的成活率和繁殖效率，更优选地，透气膜至少满足以下条件：孔隙为0.2-0.3um，开孔率80-90﹪。
在本发明中，炼苗的条件可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高多肉植物的成活率和繁殖效率，优选地，炼苗的条件为：光照时间为12-14h/天，黑暗时间为10-12h/天，光照强度为1800-2000lux，温度为21-23℃，相对湿度为75-85%，时间为5-7天。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。在以下实施例中，MS培养基以及1/2MS培养基的基本组分参见表1和2；其中，表1中为MS培养基以及1/2MS培养基中不同浓度组分的统计表，表2中为MS培养基以及1/2MS培养基中相同浓度组分的统计表。
表1
表2
实施例1
1）将多肉植物（翡翠珠）的叶片进行灭菌消毒（先将叶片置于65重量%酒精水溶液中浸泡40s，接着将其置于4重量%次氯酸钠水溶液中浸泡4min，最后通过蒸馏水进行清洗4次），接着将所述叶片切碎作为外植体（长度为0.4cm，宽度为0.2cm），然后将所述外植体外植体置于基础培养基中进行初次诱导（先暗培养1.5天，接着转入光暗交替的条件下培养5天；其中，光暗交替条件为：光照时间为13h/天，黑暗时间为11h/天，光照强度为1900lux，培养温度为22℃，相对湿度为55%）以得到愈伤组织；
2）将所述愈伤组织置于诱导培养基中进行二次诱导（于光暗交替的条件下进行直至不定芽的高度超过1cm；其中，光暗交替条件为：光照时间为13h/天，黑暗时间为11h/天，光照强度为1900lux，培养温度为22℃，相对湿度为55%）以催生不定芽；
3）将具有不定芽的愈伤组织切块以得到愈伤组织块且所述愈伤组织块至少具有两个不定芽，接着将所述愈伤组织块置于增殖培养基中进行增殖培养（于光暗交替的条件下进行直至增殖芽块上增殖出的新不定芽的高度为2cm以上；其中，光暗交替条件为：光照时间为13h/天，黑暗时间为11h/天，光照强度为1900lux，培养温度为22℃，相对湿度为55%）以得到增殖芽块；
4）将所述增殖芽块置于生根培养基中进行生根培养（于光暗交替的条件下进行直至组织培养苗的高度为4cm以上；其中，光暗交替条件为：光照时间为13h/天，黑暗时间为11h/天，光照强度为1900lux，培养温度为22℃，相对湿度为55%）以得到组织培养苗；
5）将所述组织培养苗炼苗（光照时间为13h/天，黑暗时间为11h/天，光照强度为1800-2000lux，温度为22℃，相对湿度为80%，时间为6天）；
其中，步骤1）-4）的培养条件均至少符合以下条件：无菌且透气，于带防菌透气膜的组培瓶中进行，透气膜满足以下条件：孔隙为0.25um，开孔率85﹪；基础培养基为含有0.7mg/LNAA、0.3mg/L 6-KT和0.4mg/L IAA的MS培养基；诱导培养基为含有0.2mg/L 6-BA、2mg/L蛋白胨、1100个孢子/L摩西球囊霉的MS培养基；增殖培养基为含有1mg/L玉米素、0.8mg/L水解酪蛋白、0.3mg/L活性炭的MS培养基；所述生根培养基含有1/2MS培养基；上述各培养基的pH均为6.5。
实施例2
1）将多肉植物（玉蝶）的叶片进行灭菌消毒（先将叶片置于60-70重量%酒精水溶液中浸泡30-60s，接着将其置于4重量%次氯酸钠水溶液中浸泡3.5min，最后通过蒸馏水进行清洗4次），接着将所述叶片切碎作为外植体（长度为0.4cm，宽度为0.2cm），然后将所述外植体外植体置于基础培养基中进行初次诱导（先暗培养1天，接着转入光暗交替的条件下培养4-6天；其中，光暗交替条件为：光照时间为12h/天，黑暗时间为10h/天，光照强度为1900lux，培养温度为21℃，相对湿度为50%）以得到愈伤组织；
2）将所述愈伤组织置于诱导培养基中进行二次诱导（于光暗交替的条件下进行直至不定芽的高度超过1cm；其中，光暗交替条件为：光照时间为12h/天，黑暗时间为10h/天，光照强度为1800lux，培养温度为21℃，相对湿度为50%）以催生不定芽；
3）将具有不定芽的愈伤组织切块以得到愈伤组织块且所述愈伤组织块至少具有两个不定芽，接着将所述愈伤组织块置于增殖培养基中进行增殖培养（于光暗交替的条件下进行直至增殖芽块上增殖出的新不定芽的高度为2cm以上；其中，光暗交替条件为：光照时间为12h/天，黑暗时间为10h/天，光照强度为1800lux，培养温度为21℃，相对湿度为50%）以得到增殖芽块；
4）将所述增殖芽块置于生根培养基中进行生根培养（于光暗交替的条件下进行直至组织培养苗的高度为4cm以上；其中，光暗交替条件为：光照时间为12h/天，黑暗时间为10h/天，光照强度为1800lux，培养温度为21℃，相对湿度为50%）以得到组织培养苗；
5）将所述组织培养苗炼苗（光照时间为12h/天，黑暗时间为10h/天，光照强度为1800lux，温度为21℃，相对湿度为75%，时间为5天）；
其中，步骤1）-4）的培养条件均至少符合以下条件：无菌且透气，于带防菌透气膜的组培瓶中进行，透气膜满足以下条件：孔隙为0.2um，开孔率80﹪；基础培养基为含有0.5mg/LNAA、0.2mg/L 6-KT和0.3mg/L IAA的MS培养基；诱导培养基为含有0.1mg/L 6-BA、1.5mg/L蛋白胨、1000个孢子/L摩西球囊霉的MS培养基；增殖培养基为含有0.8mg/L玉米素、0.6mg/L水解酪蛋白、0.2mg/L活性炭的MS培养基；所述生根培养基含有1/2MS培养基；上述各培养基的pH均为6。
实施例3
1）将多肉植物（冬美人）的叶片进行灭菌消毒（先将叶片置于70重量%酒精水溶液中浸泡60s，接着将其置于5重量%次氯酸钠水溶液中浸泡4min，最后通过蒸馏水进行清洗5次），接着将所述叶片切碎作为外植体（长度为0.45cm，宽度为0.3cm），然后将所述外植体外植体置于基础培养基中进行初次诱导（先暗培养2天，接着转入光暗交替的条件下培养6天；其中，光暗交替条件为：光照时间为14h/天，黑暗时间为12h/天，光照强度为2000lux，培养温度为23℃，相对湿度为60%）以得到愈伤组织；
2）将所述愈伤组织置于诱导培养基中进行二次诱导（于光暗交替的条件下进行直至不定芽的高度超过1cm；其中，光暗交替条件为：光照时间为14h/天，黑暗时间为12h/天，光照强度为2000lux，培养温度为23℃，相对湿度为60%）以催生不定芽；
3）将具有不定芽的愈伤组织切块以得到愈伤组织块且所述愈伤组织块至少具有两个不定芽，接着将所述愈伤组织块置于增殖培养基中进行增殖培养（于光暗交替的条件下进行直至增殖芽块上增殖出的新不定芽的高度为2cm以上；其中，光暗交替条件为：光照时间为14h/天，黑暗时间为12h/天，光照强度为2000lux，培养温度为23℃，相对湿度为60%）以得到增殖芽块；
4）将所述增殖芽块置于生根培养基中进行生根培养（于光暗交替的条件下进行直至组织培养苗的高度为4cm以上；其中，光暗交替条件为：光照时间为14h/天，黑暗时间为12h/天，光照强度为2000lux，培养温度为23℃，相对湿度为60%）以得到组织培养苗；
5）将所述组织培养苗炼苗（光照时间为14h/天，黑暗时间为12h/天，光照强度为2000lux，温度为23℃，相对湿度为85%，时间为7天）；
其中，步骤1）-4）的培养条件均至少符合以下条件：无菌且透气，于带防菌透气膜的组培瓶中进行，透气膜满足以下条件：孔隙为0.3um，开孔率90﹪；基础培养基为含有0.8mg/LNAA、0.4mg/L 6-KT和0.5mg/L IAA的MS培养基；诱导培养基为含有0.3mg/L 6-BA、2.5mg/L蛋白胨、1200个孢子/L摩西球囊霉的MS培养基；增殖培养基为含有1.5mg/L玉米素、1mg/L水解酪蛋白、0.4mg/L活性炭的MS培养基；所述生根培养基含有1/2MS培养基；上述各培养基的pH均为7。
应用例
取上述各实施例中100株的炼苗后的幼苗于基质中进行培养直至50%以上的植株生长出10个叶片，然后统计幼苗的成活率（W），同时计算10个多肉植物叶片在一个组织培养周期后能够获取的成活多肉植株的数量（N），具体结果如表1所示。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (10)
1.一种多肉植物的组织培养方法，其特征在于，包括：
1）将多肉植物的叶片进行灭菌消毒，接着将所述叶片切碎作为外植体，然后将所述外植体外植体置于基础培养基中进行初次诱导以得到愈伤组织；
2）将所述愈伤组织置于诱导培养基中进行二次诱导以催生不定芽；
3）将具有不定芽的愈伤组织切块以得到愈伤组织块且所述愈伤组织块至少具有两个不定芽，接着将所述愈伤组织块置于增殖培养基中进行增殖培养以得到增殖芽块；
4）将所述增殖芽块置于生根培养基中进行生根培养以得到组织培养苗；
5）将所述组织培养苗炼苗；
其中，步骤1）-4）的培养条件均至少符合以下条件：无菌且透气；所述基础培养基为含有NAA、6-KT和IAA的MS培养基；所述诱导培养基为含有6-BA、蛋白胨、摩西球囊霉的MS培养基；所述增殖培养基为含有玉米素、水解酪蛋白、活性炭的MS培养基；所述生根培养基含有1/2MS培养基。
2.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，在所述基础培养基中，所述NAA的含量为0.5-0.8mg/L，所述6-KT的含量为0.2-0.4mg/L，所述IAA的含量为0.3-0.5mg/L；
在所述诱导培养基中，所述6-BA的含量为0.1-0.3mg/L，所述蛋白胨的含量为1.5-2.5mg/L，所述摩西球囊霉的孢子含量为1000-1200个/L；
在所述所述增殖培养基中，所述玉米素的含量为0.8-1.5mg/L，所述水解酪蛋白的含量为0.6-1mg/L，所述活性炭的含量为0.2-0.4mg/L。
3.根据权利要求2所述的组织培养方法，其特征在于，所述基础培养基、诱导培养基、增殖培养基以及生根培养基均含有6.5-7.0g/L的琼脂和25-30g/L的蔗糖，且pH值为6.0-7.0。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的组织培养方法，其特征在于，在步骤1）中，所述灭菌消毒具体为：先将所述叶片置于60-70重量%酒精水溶液中浸泡30-60s，接着将其置于3-5重量%次氯酸钠水溶液中浸泡3-4min，最后通过蒸馏水进行清洗3-5次。
5.根据权利要求1-3中任意一项所述的组织培养方法，其特征在于，在步骤1）中，所述外植体的长度为0.35-0.45cm，宽度为0.15-0.3cm。
6.根据权利要求1-3中任意一项所述的组织培养方法，在步骤1）中，所述初次诱导满足以下条件：先暗培养1-2天，接着转入光暗交替的条件下培养4-6天；其中，光暗交替条件为：光照时间为12-14h/天，黑暗时间为10-12h/天，光照强度为1800-2000lux，培养温度为21-23℃，相对湿度为50-60%。
7.根据权利要求6所述的组织培养方法，其特征在于，在步骤2）中，所述二次诱导于光暗交替的条件下进行直至不定芽的高度超过1cm；其中，光暗交替条件为：光照时间为12-14h/天，黑暗时间为10-12h/天，光照强度为1800-2000lux，培养温度为21-23℃，相对湿度为50-60%。
8.根据权利要求7所述的组织培养方法，其特征在于，在步骤3）中，所述增殖培养于光暗交替的条件下进行直至增殖芽块上增殖出的新不定芽的高度为2cm以上；其中，光暗交替条件为：光照时间为12-14h/天，黑暗时间为10-12h/天，光照强度为1800-2000lux，培养温度为21-23℃，相对湿度为50-60%。
9.根据权利要求8所述的组织培养方法，其特征在于，在步骤4）中，所述生根培养于光暗交替的条件下进行直至组织培养苗的高度为4cm以上；其中，光暗交替条件为：光照时间为12-14h/天，黑暗时间为10-12h/天，光照强度为1800-2000lux，培养温度为21-23℃，相对湿度为50-60%。
10.根据权利要求1-3中任意一项所述的组织培养方法，其特征在于，步骤1）-4）中的无菌且透气条件通过以下操作获得：培养环境为带防菌透气膜的组培瓶；
优选地，透气膜至少满足以下条件：孔隙为0.2-0.3um，开孔率80-90﹪；
更优选地，所述炼苗的条件为：光照时间为12-14h/天，黑暗时间为10-12h/天，光照强度为1800-2000lux，温度为21-23℃，相对湿度为75-85%，时间为5-7天。
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