CN113133409B - 七福神的组织培养工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了七福神的组织培养工艺，属于植物组织培养技术领域，包括以下步骤：母株预处理、外植体处理、初代培养、继代培养、细菌培养、增殖培养和生根培养。该组织培养工艺，专用于对七福神进行栽培繁殖，相较于直接套用其他多肉植物的组织培养工艺，通过对培养基的组成的改变，以及对培养条件的优化，能够获得芽数更多的七福神生根苗，且所得生根苗长势良好，生长壮硕，可用直接用于生根培养；且最终经过生根培养得到的苗种根系粗壮，植株较高，且叶片数量适中，适于直接栽种。

Description

七福神的组织培养工艺
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种七福神的组织培养工艺。
背景技术
七福神(Echeveria secunda)是景天科拟石莲属的多肉植物，原产墨西哥。喜温暖干燥和阳光充足环境。不耐寒，耐半阴和干旱，怕积水和烈日暴晒，茎短，叶卵形，较厚，淡粉绿色，表面被白粉，叶端圆钝。以肥沃、疏松和排水良好的沙质壤土为宜。生长适温为18～25℃，冬季温度不低于5℃。七福神同多数石莲属的多肉植物一样，可采用扦插的方式进行栽培。但采用这种传统的方法进行栽培，繁殖时间长且繁殖系数低。目前未见关于七福神的专用组织培养工艺，在实验中发现，虽然采用其他多肉品种的组织培养方法也可对七福神进行繁殖，但因受到生长周期、成活率的限制，不利于投入生产。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题是：提供一种专用于七福神的适用于投入生产的组织培养工艺。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：七福神的组织培养工艺，包括以下步骤：
1)母株预处理：选择母本后于制种前5-7d停止浇水，使基质干燥；
2)外植体处理：从母本上切取顶芽、幼嫩叶片、老叶片中的一种或几种，消毒处理后得到外植体；
3)初代培养：将外植体接种于初代培养基上进行无菌培养30-35d；
4)继代培养：取步骤3)所得继代培养的无菌材料，接种于继代培养基上进行无菌培养30-35d，得到第二代培养材料；重复上述过程2次，直至得到第四代培养材料；
5)细菌培养：将第四代培养材料置于有菌环境下静置培养20-25d，得到增殖培养材料；
6)增殖培养：切除增殖培养材料上玻璃化、黄化、老叶及基部褐变、须根、死亡组织，然后按2-3芽/团进行切割，得到团块，团块接种于增殖培养基上培养30-42d，得到生根苗；
7)生根培养：筛选株高15-20mm且叶片数≥5的生根苗，接种于生根培养基上培养14-30d。
本发明的有益效果在于：本发明提供的组织培养工艺，专用于对七福神进行栽培繁殖，相较于直接套用其他多肉植物的组织培养工艺，本发明提供的组织培养工艺，能够获得芽数更多的七福神生根苗，且所得生根苗长势良好，生长壮硕，可用直接用于生根培养，经过生根培养所得苗种根系粗壮，植株较高，且叶片数量适中，该组织培养工艺能够脱离实验环境，投入生产使用。
附图说明
图1所示为本发明具体实施方式的实验例2的七福神增殖培养效果；
图2所示为本发明具体实施方式的实验例2的七福神增殖培养效果；
图3所示为本发明具体实施方式的实验例3的七福神生根培养效果；
图4所示为本发明具体实施方式的实验例3的七福神生根培养效果。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
本发明的七福神的组织培养工艺，包括以下步骤：
1)母株预处理：选择母本后于制种前5-7d停止浇水，使基质干燥；
基质干燥的标准为：基质表面以下5-10mm厚的土层干燥均匀一致，用手捏呈散沙状，不粘手；
2)外植体处理：从母本上切取顶芽、幼嫩叶片、老叶片中的一种或几种，消毒处理后得到外植体；
3)初代培养：将外植体接种于初代培养基上进行无菌培养30-35d；
4)继代培养：取步骤3)所得继代培养的无菌材料，按芽的生长方向切割，保持2-3芽/团，然后接种于继代培养基上进行无菌培养30-35d，得到第二代培养材料；
将第二代培养材料，按芽的生长方向切割，保持2-3芽/团，然后接种于继代培养基上进行无菌培养30-35d，得到第三代培养材料；
将第三代培养材料，按芽的生长方向切割，芽保持2-3芽/团，幼嫩叶片和老叶片均为单叶，然后接种于继代培养基上进行无菌培养30-35d，得到第四代培养材料；
5)细菌培养：将第四代培养材料置于有菌环境下静置放置20-25d，得到增殖培养材料；
6)增殖培养：切除增殖培养材料上玻璃化、黄化、老叶及基部褐变、须根、死亡组织，然后按2-3芽/团进行切割，切割后得到的团块直径6-10mm，高度5-20mm，切割后得到的团块接种于增殖培养基上培养30-42d，得到生根苗；
7)生根培养：筛选株高15-20mm且叶片数≥5的生根苗，接种于生根培养基上培养14-30d。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：本发明提供的组织培养工艺，专用于对七福神进行栽培繁殖，相较于直接套用其他多肉植物的组织培养工艺，本发明提供的组织培养工艺，通过对培养基的组成的改变，以及对培养条件的优化，能够获得芽数更多的七福神生根苗，且所得生根苗长势良好，生长壮硕，可用直接用于生根培养；同时通过在继代培养和增殖培养之间增加细菌培养的过程，能够提升所得生根苗种的合格率，保证最终经过生根培养得到的苗种根系粗壮，植株较高，且叶片数量适中，该组织培养工艺能够脱离实验环境，投入生产使用。
进一步的，所述消毒处理为：将切取后得到的组织置于0.5‰的洗衣粉溶液中漂洗5-10min，再用清水冲洗2-3遍；然后用1‰的HgCl2溶液进行浸泡消毒，再用无菌水浸泡清洗3-5次，每次3-5min；然后切除组织截面变色部分；
其中，顶芽消毒8-10min，幼嫩叶片消毒6-8min，老叶片消毒7-9min。
进一步的，所述步骤3)初代培养期间光照强度300-500lx，光照时间12h/d，相对湿度为60-65％，有光照时的温度为26±1℃，无光照时的温度为18-27℃。
进一步的，所述步骤4)继代培养期间光照强度1500-2000lx，光照时间12h/d，相对湿度为60-65％，有光照时的温度为25±1℃，无光照时的温度为18-27℃。
进一步的，所述步骤5)细菌培养期间无光照，相对湿度为40-60％，温度为30±1℃。
进一步的，所述步骤6)增殖培养期间光照强度1500-2000lx，光照时间12±1h/d，相对湿度为60-65％，有光照时的温度为23-24℃，无光照时的温度为18-26℃。
进一步的，所述步骤7)生根培养期间光照强度800-1200lx，光照时间12h/d，相对湿度为60-70％，有光照时的温度为22-23℃，无光照时的温度为18-23℃。
从上述描述可知，步骤4)-7)中需要严格按上述培养条件进行培养，适宜的培养条件会显著提高后期的生根率和成活率，减少变异、拔节、徒长、多心等异常现象的产生。
进一步的，所述初代培养基：MS+CPPU 0.1-0.2mg/L+KT(激动素)0.2-0.3mg/L+NAA0.05-0.1mg/L+蔗糖27-30g/L+琼脂7-8g/L，pH5.5-6。优选的，所述初代培养基：MS+CPPU0.1mg/L+KT 0.3mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH6。
进一步的，所述继代培养基：MS+ZT 0.1-0.2mg/L+KT 0.3-0.5mg/L+NAA 0.05-0.1mg/L+蔗糖27-30g/L+琼脂7-8g/L，pH5.5-6。优选的，所述继代培养基：MS+ZT 0.1mg/L+KT 0.3mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8。
进一步的，所述增殖培养基：MS+ZT 0.1-0.2mg/L+NAA 0.1-0.2mg/L+蔗糖27-30g/L+琼脂7-8g/L，pH5.5-6。优选的，所述增殖培养基：MS+ZT 0.2mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8。
进一步的，所述生根培养基：1/2MS+ZT 0.1-0.2mg/L+NAA 0.05-0.1mg/L+蔗糖25-30g/L+琼脂7-8g/L，pH5.8-6。优选的，所述生根培养基：1/2MS+ZT 0.1mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖25g/L+琼脂7g/L，pH6.0。
实施例1：
七福神的组织培养工艺，包括以下步骤：
1)母株预处理：选择颜色呈淡粉绿色，叶卵形、较厚、叶端圆钝，无病、虫、害的母本，然后于制种前7d停止浇水，使基质干燥，整盆植株呈轻微萎焉状；
干燥后基质表面以下10mm厚的土层干燥均匀一致，用手捏呈散沙状，不粘手；
2)外植体处理：从母本上切取顶芽，消毒处理后得到外植体；
消毒处理为：将切取后得到的组织置于0.5‰的洗衣粉溶液中漂洗10min，再用清水冲洗3遍；然后用1‰的HgCl2溶液进行浸泡消毒10min，再用无菌水浸泡清洗5次，每次4min；然后切除组织截面变色部分；
3)初代培养：将外植体接种于初代培养基上进行无菌培养35d；
初代培养期间光照强度300-500lx，光照时间12h/d，相对湿度为60-65％，有光照时的温度为26±1℃，无光照时的温度为18-27℃；
初代培养基：MS+CPPU 0.1mg/L+KT 0.3mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH6.0；
4)继代培养：取步骤3)所得继代培养的无菌材料，按芽的生长方向切割，保持2-3芽/团，接种于继代培养基上进行无菌培养30-35d，得到第二代培养材料；再重复上述过程2次，直至得到第四代培养材料；
继代培养期间光照强度1500-2000lx，光照时间12h/d，相对湿度为60-65％，有光照时的温度为25±1℃，无光照时的温度为18-27℃；
继代培养基：MS+ZT 0.1mg/L+KT 0.3mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8；
5)细菌培养：将第四代培养材料置于有菌环境下静置培养20-25d，得到增殖培养材料；细菌培养期间无光照，相对湿度为40-60％，温度为30±1℃；
6)增殖培养：切除增殖培养材料上玻璃化、黄化、老叶及基部褐变、须根、死亡组织，然后按2-3芽/团进行切割(团块直径6—10mm，芽高度5-20mm)，得到团块接种于增殖培养基上培养30-42d，得到生根苗；
增殖培养期间光照强度1500-2000lx，光照时间12±1h/d，相对湿度为60-65％，有光照时的温度为23-24℃，无光照时的温度为18-26℃；
增殖培养基：MS+ZT 0.2mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8；
7)生根培养：筛选株高15-20mm且叶片数≥5的生根苗，接种于生根培养基上培养21d；
生根培养期间光照强度800-1200lx，光照时间12h/d，相对湿度为60-70％，有光照时的温度为22-23℃，无光照时的温度为18-23℃；
生根培养基：1/2MS+ZT 0.1mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖25g/L+琼脂7g/L，pH6.0。
实施例2：
实施例2与实施例1的不同仅在于步骤2)不同，实施例2的步骤2)为：
2)外植体处理：从母本上切取幼嫩叶片，消毒处理后得到外植体；
消毒处理为：将切取后得到的组织置于0.5‰的洗衣粉溶液中漂洗5min，再用清水冲洗2遍；然后用1‰的HgCl2溶液进行浸泡消毒8min，再用无菌水浸泡清洗3次，每次3min；然后切除组织截面变色部分。
实施例3：
实施例3与实施例1的不同仅在于步骤2)不同，实施例2的步骤2)为：
2)外植体处理：从母本上切取老叶片，消毒处理后得到外植体；
消毒处理为：将切取后得到的组织置于0.5‰的洗衣粉溶液中漂洗10min，再用清水冲洗3遍；然后用1‰的HgCl2溶液进行浸泡消毒9min，再用无菌水浸泡清洗4次，每次5min；然后切除组织截面变色部分。
对比例1：
对比例1与实施例1的不同仅在于步骤2)中消毒时间的不同，对比例1中用1‰的HgCl2溶液进行浸泡消毒5min。
对比例2：
对比例2与实施例2的不同在于初代培养基、继代培养基、增殖培养基和生根培养基的不同，对比例2中的培养基均为玉露组织培养中所用培养基；对比例2中的培养基具体为：
初代培养基：MS+6-BA 1mg/L+KT 1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH6.0；
继代培养基：MS+KT 1mg/L+NAA 1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8；
增殖培养基：MS+6-BA 0.15mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8；
生根培养基：1/2MS+IBA 0.1mg/L+蔗糖25g/L+琼脂7g/L，pH6.0。
对比例3：
对比例3与实施例2的不同仅在于，对比例3不包括步骤5)细菌培养，即步骤4)所得第四代培养材料直接切除第四代培养材料上玻璃化、黄化、老叶及基部褐变、须根、死亡组织，然后按2-3芽/团进行切割，得到团块接种于增殖培养基上培养。
实验例1：
实施例1-3和对比例1-3的外植体经初代培养后的结果见表1所示。
表1
处理组 试验数量 芽萌动时间 真菌污染率 死亡率 成活率
实施例1 10 第6天 0 0 100％
实施例2 16 第15天 0 0 100％
实施例3 18 第15天 0 0 100％
对比例1 10 第5天 30％ 10％ 90％
对比例2 14 第15 0 0 100％
对比例3 13 第14 0 0 100％
可以看出，延长HgCl2溶液浸泡消毒的时间能够显著提高初代培养的成活率。
实验例2：
随机取一瓶实施例2和对比例2的团块经增殖培养后的生根苗，结果见表2和图1-2所示。实施例2参照图1，对比例2参照图2。
表2
处理 原团块数 平均根数 备注
实施例2 60 1.32 芽多，长势好，芽壮，可以直接生根
对比例2 60 0.48 芽壮，长势好，可直接生根
从表2以及图1-2中可以看出，本发明通过对培养的改进，在增殖极端可显著提升生根苗数量(芽数)且所得芽壮长势好。传统的培养基虽然也能够获得长势健壮的芽，但数量较少，一般繁殖可用，但产业化批量生产时效率较低。
实验例3：
实施例3和对比例3的生根苗接种于生根培养基上培养28d后，随机各取其中两瓶，对其生长状态进行检查，苗种合格率见表3所示。对比例3所得苗种根壮，叶片数量适中，适宜直接进行栽种；而对比例3中出现了较多矮小、无根或叶片数过多过少的苗种。合格苗标准参照图3，不合格苗标准参照图4。
表3
处理 原生根苗数 合格苗数 合格率
实施例3-1 52 49 94％
实施例3-2 53 51 96％
对比例3-1 54 37 69％
对比例3-2 50 36 72％
从表3以及图3-4中可以看出，在相同的培养条件下，从无菌环境中取出后，进行一端时间无培养的细菌培养，能够显著提升最终苗种生长和生根效果。
综上所述，本发明提供的组织培养工艺，专用于对七福神进行栽培繁殖，相较于直接套用其他多肉植物的组织培养工艺，本发明提供的组织培养工艺，在培养基中加入一定量的ZT(玉米素)代替部分传统常用于多肉的生长素，配合对培养条件的优化，能够获得芽数更多的七福神生根苗，且所得生根苗长势良好，生长壮硕，可用直接用于生根培养；同时在继代培养以及之前，通过无菌的操作和环境，提升成活率，再通过在继代培养和增殖培养之间增加细菌培养的过程，降低因环境突然改变对组织的刺激，上述处理步骤的配合，能够提升所得七福神生根苗种的合格率，保证最终经过生根培养得到的苗种根系粗壮，植株较高，且叶片数量适中，易于栽种，该组织培养工艺能够脱离实验环境，投入生产使用。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (6)

1.七福神的组织培养工艺，其特征在于，包括以下步骤：
1)母株预处理：选择母本后于制种前5-7d停止浇水，使基质干燥；
2)外植体处理：从母本上切取顶芽、幼嫩叶片、老叶片中的一种或几种，消毒处理后得到外植体；
3)初代培养：将外植体接种于初代培养基上进行无菌培养30-35d；
4)继代培养：取步骤3)所得继代培养的无菌材料，接种于继代培养基上进行无菌培养30-35d，得到第二代培养材料；重复上述过程2次，直至得到第四代培养材料；
5)细菌培养：将第四代培养材料置于有菌环境下静置培养20-25d，得到增殖培养材料；
6)增殖培养：切除增殖培养材料上玻璃化、黄化、老叶及基部褐变、须根、死亡组织，然后按2-3芽/团进行切割，得到的团块接种于增殖培养基上培养30-42d，得到生根苗；
7)生根培养：筛选株高15-20mm且叶片数≥5的生根苗，接种于生根培养基上培养14-30d；
所述消毒处理为：将切取后得到的组织置于0.5‰的洗衣粉溶液中漂洗5-10min，再用清水冲洗2-3遍；然后用1‰的HgCl2溶液进行浸泡消毒，再用无菌水浸泡清洗3-5次，每次3-5min；然后切除组织截面变色部分；
其中，顶芽消毒8-10min，幼嫩叶片消毒6-8min，老叶片消毒7-9min；
所述初代培养基为：MS+CPPU 0.1-0.2mg/L+KT 0.2-0.3mg/L+NAA 0.05-0.1mg/L+蔗糖27-30g/L+琼脂7-8g/L，pH5.5-6；
所述继代培养基为：MS+ZT 0.1-0.2mg/L+KT 0.3-0.5mg/L+NAA 0.05-0.1mg/L+蔗糖27-30g/L+琼脂7-8g/L，pH5.5-6；
所述增殖培养基为：MS+ZT 0.1-0.2mg/L+NAA 0.1-0.2mg/L+蔗糖27-30g/L+琼脂7-8g/L，pH5.5-6；
所述生根培养基为：1/2MS+ZT 0.1-0.2mg/L+NAA 0.05-0.1mg/L+蔗糖25-30g/L+琼脂7-8g/L，pH5.8-6。
2.根据权利要求1所述的七福神的组织培养工艺，其特征在于，所述步骤3)初代培养期间光照强度300-500lx，光照时间12h/d，相对湿度为60-65％，有光照时的温度为26±1℃，无光照时的温度为18-27℃。
3.根据权利要求1所述的七福神的组织培养工艺，其特征在于，步骤4)继代培养期间光照强度1500-2000lx，光照时间12h/d，相对湿度为60-65％，有光照时的温度为25±1℃，无光照时的温度为18-27℃。
4.根据权利要求1所述的七福神的组织培养工艺，其特征在于，步骤5)细菌培养期间无光照，相对湿度为40-60％，温度为30±1℃。
5.根据权利要求1所述的七福神的组织培养工艺，其特征在于，步骤6)增殖培养期间光照强度1500-2000lx，光照时间12±1h/d，相对湿度为60-65％，有光照时的温度为23-24℃，无光照时的温度为18-26℃。
6.根据权利要求1所述的七福神的组织培养工艺，其特征在于，步骤7)生根培养期间光照强度800-1200lx，光照时间12h/d，相对湿度为60-70％，有光照时的温度为22-23℃，无光照时的温度为18-23℃。
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