CN114190277A - 一种促进大根兰试管开花和结实的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种促进大根兰试管开花和结实的方法，属于植物快繁技术领域。本发明的技术方案包括以下步骤：以大根兰无菌苗的根状茎为外植体，进行增殖培养，取增殖根状茎转移至开花诱导培养基，诱导至花苞盛开，进行人工授粉培养至结实，即可得到大根兰种子。本发明可使大根兰的整个生活史由3‑8年缩短至2年内完成，为腐生兰类野生种质资源的研究、开发和可持续利用等提供技术。

Description

一种促进大根兰试管开花和结实的方法
技术领域
本发明属于植物快繁技术领域，尤其涉及一种促进大根兰试管开花和结实的方法。
背景技术
腐生兰又称完全菌根异养型兰(Fully Mycoheterotrophic orchids)，无绿叶，不能进行光合作用制造有机物，依靠与其共生的真菌提供营养。近年来，腐生兰独特的生活方式引起了生物学家的广泛关注。同时，腐生兰具有重要的药用价值，其观赏价值也被逐渐认识。
大根兰(Cymbidium macrorhizon)为兰科兰属植物，是一种腐生兰，分布在我国四川、云南、贵州和广西的海拔400-2100米左右的林下或林缘。在自然条件下，其种子萌发需要共生真菌参与，从萌发到开花结实通常需要4年以上，极为耗时，科技人员也很难跟踪研究植株的整个生活史。腐生兰试管开花结实体系的建立，将进一步促进腐生兰与其共生真菌、营养来源以及系统演化等热点问题的系统解决，并为腐生兰的资源保护及再生研究提供技术支撑，也为腐生兰试管花卉的开发提供更多可能。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种促进大根兰试管开花和结实的方法，使大根兰的整个生活史在2年内完成，为腐生兰类野生种质资源的研究、开发和可持续利用等提供技术。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
一种促进大根兰试管开花和结实的方法，包括以下步骤：以大根兰无菌苗的根状茎为外植体，进行增殖培养，取增殖根状茎转移至开花诱导培养基，诱导至花苞盛开，进行人工授粉培养至结实；
所述开花诱导培养基包括：花宝3号3.0g/L、维生素B6 0.5mg/L、维生素B1 0.1mg/L、烟酸0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇100mg/L、NAA 1.0-2.0mg/L、椰子汁200-300mL/L、蔗糖30g/L、琼脂5.6g/L、活性炭1.0g/L。
优选的是，所述根状茎外植体来源于大根兰种子萌发的无菌苗；更优选的是所述根状茎外植体长1.0-2.0cm。
优选的是，所述增殖培养时，增殖培养基包括：花宝1号3.0g/L、维生素B6 0.5mg/L、维生素B1 0.1mg/L、烟酸0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇100.0mg/L、6-BA 5.0-10.0mg/L、KT 2.0-5.0mg/L、椰子汁100-200mL/L、蔗糖20g/L、琼脂5.6g/L。
更优选的是，所述增殖培养时暗培养，温度为23±2℃。
更优选的是，所述增殖培养时间为6个月以上，增殖倍数达到4倍以上后转移至开花诱导培养基。
优选的是，所述开花诱导培养时光/暗周期为6h:18h，温度为20±2℃。
优选的是，所述花苞盛开2-3d后，进行人工授粉。
更优选的是，所述人工授粉包括：用镊子取出花粉块，置于同一朵花的凹槽状柱头上。
优选的是，所述人工授粉后，调整光/暗周期为12h:12h，温度为23±2℃。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种促进大根兰试管开花和结实的方法，通过对大根兰根状茎进行开花诱导培养，5个月左右即可见到根状茎向顶部伸长，向顶部伸长的根状茎过半个月可以明显看到花苞出现，花苞出现20d左右花朵盛开；花朵盛开后进行瓶内无菌人工授粉，3d后子房开始膨大，9个月左右，果荚膨大，产生的种子可直接播种。利用本发明的技术方案，可将大根兰的生活史由3-8年缩短至2年。
附图说明
图1：本发明诱导大根兰根状茎分化的试管开花；
图2：本发明人工授粉得到了大根兰试管内结实；
图3：试管结实种子TTC染色的种子活力情况；
图4：试管结实种子无菌萌发的种子活力情况。
具体实施方式
本发明提供了一种促进大根兰试管开花和结实的方法，包括以下步骤：以大根兰无菌苗的根状茎为外植体，进行增殖培养，取增殖根状茎转移至开花诱导培养基，诱导至花苞盛开，进行人工授粉培养直至结实。
本发明开花诱导培养基包括：花宝3号3.0g/L、维生素B6 0.5mg/L、维生素B10.1mg/L、烟酸0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇100mg/L、NAA 1.0-2.0mg/L、椰子汁200-300mL/L、蔗糖30g/L、琼脂5.6g/L、活性炭1.0g/L；进一步优选开花诱导培养基中NAA1.5mg/L，椰子汁250mL/L。花宝3号为开花肥，氮磷钾含量为10-30-20，作为诱导培养基成分之一，能够促进大根兰开花；NAA作为细胞生长素，亦能够诱导大根兰开花；添加活性炭，可为根状茎营造地下黑暗生长环境，保护根状茎的生长；在开花诱导培养基内添加高浓度的椰子汁和蔗糖，除促进大根兰开花外，还可进一步促进后期果荚发育，确保种子正常生长。
本发明优选根状茎外植体来源于大根兰种子萌发的无菌苗。进一步优选，所述根状茎外植体长1.0-2.0cm；更优选长1.5cm。作为一种可实施方式，将大根兰种子直接撒播在无菌萌发培养基上培育成无菌苗，萌发培养基包括：花宝1号3.0g/L、维生素B6 0.5mg/L、维生素B1 0.1mg/L、烟酸0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇100mg/L、NAA 0.1-0.5mg/L、蔗糖20g/L和琼脂5.6g/L；培养温度为23±2℃，暗培养，获得1.0-2.0cm的根状茎外植体。
本发明优选增殖培养时，增殖培养基包括：花宝1号3.0g/L、维生素B6 0.5mg/L、维生素B1 0.1mg/L、烟酸0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇100.0mg/L、6-BA 5.0-10.0mg/L、KT2.0-5.0mg/L、椰子汁100-200mL/L、蔗糖20g/L、琼脂5.6g/L；进一步优选增殖培养基中6-BA7.5mg/L、KT 3.5mg/L、椰子汁150mL/L。花宝1号氮磷钾含量为7-6-19，可满足大根兰新生根状茎在生长和增殖过程中对相关元素的需求；6-BA、KT能够诱导根状茎增殖。
本发明优选增殖培养时暗培养，温度为23±2℃。根状茎转入增殖培养基培养1个月左右，即可观察到根状茎的明显伸长，并逐步出现分叉状增殖生长，进一步优选增殖培养时间为6个月以上，增殖倍数达到4倍以上后，获得的大量生长良好的根状茎转移至开花诱导培养基。
本发明优选开花诱导培养时光/暗周期为6h:18h，温度为20±2℃。大根兰为腐生兰，在根状茎的生长和增殖过程中对光的需求不高，但在开花时期，随着花葶伸出地面，花葶经光照之后会变绿，能发挥光合作用，故大根兰在花期实为半腐生植物，在诱导花开阶段时，增加光照，可促进开花。增殖根状茎转入开花诱导培养基5个月左右，即可观察到根状茎向顶部伸长，向顶部伸长的根状茎过半个月可以明显看到花苞出现，花苞出现20d左右花朵盛开(图1)，花苞出现比例30％左右，同一根状茎偶尔出现2朵花。
本发明优选诱导大根兰花苞盛开2-3d后，进行人工授粉；进一步优选人工授粉包括：用镊子取出花粉块，置于同一朵花的凹槽状柱头上，完成授粉后盖上瓶盖，3d后观察到子房开始膨大，表明自花授粉成功。更优选人工授粉在超净工作台内进行，镊子进行消毒杀菌。
本发明优选人工授粉后，调整光/暗周期为12h:12h，温度为23±2℃。花朵经人工授粉子房膨大后，增加光照时间，可进一步延长绿色果荚的光合作用时间。授粉成功后9个月左右，果荚膨大，果荚表面光滑，具3条墨绿色棱，果荚全长5.0cm以上，其中果柄、宿存柱头长1.0cm左右，果荚中部宽1.0cm左右，单果鲜重达0.6g以上。
本发明优选无菌萌发培养基、增殖培养基和开花诱导培养基pH为5.6-5.8，进一步优选pH为5.8。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种促进大根兰试管开花和结实的方法，包括以下步骤：
1、外植体的获得
将大根兰种子直接撒播在无菌萌发培养基上培育成无菌苗，得根状茎；选择长度为1.5cm的根状茎作外植体；
2、根状茎增殖
将大根兰根状茎转至根状茎增殖培养基(每升含花宝1号3.0g、维生素B6 0.5mg、维生素B1 0.1mg、烟酸0.5mg、甘氨酸2.0mg、肌醇100mg、6-BA 7.5mg、KT 3.5mg、椰子汁150mL、蔗糖20g、琼脂5.6g)，灭菌前调整培养基pH至5.8，转入后1个月左右，即可观察到根状茎的明显伸长，并逐步出现分叉状增殖生长。当培养六个月时，根状茎增殖倍数可达4倍以上，此时获得的大量生长良好的根状茎可以作为后续花芽诱导的材料。培养条件为：温度为23±2℃，暗培养。
3、试管开花诱导
将生长良好的根状茎转至开花诱导培养基(每升含花宝3号3.0g、维生素B60.5mg、维生素B1 0.1mg、烟酸0.5mg、甘氨酸2.0mg、肌醇100mg、NAA 1.5mg、椰子汁250mL、蔗糖30g、琼脂5.6g、活性炭1.0g)，灭菌前调整培养基pH至5.8，接10瓶左右，每瓶3丛根状茎。转入后5个月左右，即可观察到根状茎向顶部伸长，向顶部伸长的根状茎过半个月可以明显看到花苞出现，花苞出现20d左右花朵盛开，如图1所示，花苞出现比例30％左右，同一根状茎偶尔出现2朵花。培养条件为：温度为20±2℃，光周期6h:18h。
4、人工授粉
选取花朵已开放2-3天的大根兰瓶苗，在超净台内用已灭菌的镊子取出花粉块，置于同一朵花的凹槽状柱头上。完成授粉后盖上瓶盖，放置于组培室内培养观察，3d后观察到子房开始膨大，表明自花授粉成功。培养条件为：温度为23±2℃，光周期12h:12h。
5、试管结实
自花授粉成功后9个月左右，果荚膨大如图2所示，果荚表面光滑，具3条墨绿色棱，果荚全长约5.2cm，其中果柄长约1.2cm，宿存柱头长约0.8cm，果荚中部宽1.1cm，单果鲜重0.6471g。
实施例2
一种促进大根兰试管开花和结实的方法，包括以下步骤：
1、外植体的获得
将大根兰种子直接撒播在无菌萌发培养基上培育成无菌苗，得根状茎；选择长度为1.0cm的根状茎作外植体；
2、根状茎增殖
将大根兰根状茎转至根状茎增殖培养基(每升含花宝1号3.0g、维生素B6 0.5mg、维生素B1 0.1mg、烟酸0.5mg、甘氨酸2.0mg、肌醇100mg、6-BA 5.0mg、KT 2.0mg、椰子汁100mL、蔗糖20g、琼脂5.6g)，灭菌前调整培养基pH至5.8。培养条件为：温度为23±2℃，暗培养。
3、试管开花诱导
当培养六个月时，根状茎增殖倍数可达4倍以上，将生长良好的根状茎转至开花诱导培养基(每升含花宝3号3.0g、维生素B6 0.5mg、维生素B1 0.1mg、烟酸0.5mg、甘氨酸2.0mg、肌醇100mg、NAA 1.0mg、椰子汁200mL、蔗糖30g、琼脂5.6g、活性炭1.0g)，灭菌前调整培养基pH至5.6。培养条件为：温度为20±2℃，光周期6h:18h。
4、人工授粉
选取花朵已开放2-3天的大根兰瓶苗，在超净台内用已灭菌的镊子取出花粉块，置于同一朵花的凹槽状柱头上，完成授粉后盖上瓶盖。培养条件为：温度为23±2℃，光周期12h:12h。
实施例3
一种促进大根兰试管开花和结实的方法，包括以下步骤：
1、外植体的获得
将大根兰种子直接撒播在无菌萌发培养基上培育成无菌苗，得根状茎；选择长度为2.0cm的根状茎作外植体；
2、根状茎增殖
将大根兰根状茎转至根状茎增殖培养基(每升含花宝1号3.0g、维生素B6 0.5mg、维生素B1 0.1mg、烟酸0.5mg、甘氨酸2.0mg、肌醇100mg、6-BA 10.0mg、KT 5.0mg、椰子汁200mL、蔗糖20g、琼脂5.6g)，灭菌前调整培养基pH至5.7。培养条件为：温度为23±2℃，暗培养。
3、试管开花诱导
当培养六个月时，根状茎增殖倍数可达4倍以上，将生长良好的根状茎转至开花诱导培养基(每升含花宝3号3.0g、维生素B6 0.5mg、维生素B1 0.1mg、烟酸0.5mg、甘氨酸2.0mg、肌醇100mg、NAA 2.0mg、椰子汁300mL、蔗糖30g、琼脂5.6g、活性炭1.0g)，灭菌前调整培养基pH至5.7。培养条件为：温度为20±2℃，光周期6h:18h。
4、人工授粉
选取花朵已开放2-3天的大根兰瓶苗，在超净台内用已灭菌的镊子取出花粉块，置于同一朵花的凹槽状柱头上。完成授粉后盖上瓶盖，放置于组培室内培养观察，3d后观察到子房开始膨大，表明自花授粉成功。培养条件为：温度为23±2℃，光周期12h:12h。
实施例4
试管结实种子的活力评估
(1)TTC染色评估法：将实施例1果荚中大根兰种子取出，混合均匀，装入1.5mL离心管中，用1％吐温80溶液浸种24h后，吸出溶液，加水清洗3次后再加入1％TTC染液，在室温(23±2℃)下避光静置48h。吸取染色后的种子滴在载玻片上，置于体视显微镜下。随机挑选3个视野，有活力种胚被染成橙色或者粉红色，无活力种胚不着色。分别计数每个视野的种子总数和有活力种子总数，计算种子活力：种子活力＝(有活力种子总数/统计种子总数)×100％。
活力检测结果如下：大根兰的种子已具有较好的成熟度，饱满率达98.4％，种胚发育饱满，着色率为9.9％。图3为1％TTC染色24h后种子着色情况。
(2)无菌播种法：在超净台内，将实施例1采集的无菌果荚的部分种子直接散播在无菌萌发培养基表面，跟踪观察种子无菌萌发情况，种胚突破种皮即视为萌发。所述无菌萌发培养基包括以下组分的水溶液：花宝1号3.0g/L、维生素B6 0.5mg/L、维生素B1 0.1mg/L、烟酸0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇100mg/L、NAA 0.1-0.5mg/L、蔗糖20g/L和琼脂5.6g/L，灭菌前调整培养基pH至5.8。培养温度为23±2℃，暗培养。
萌发结果：种子接种24d后种胚膨大开始萌发，33d种胚突破种皮，38d开始出现假根，100d左右出现增殖现象。接种80天后统计的萌发率为7.28％。图4表示种胚突破种皮。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种促进大根兰试管开花和结实的方法，其特征在于，包括以下步骤：以大根兰无菌苗的根状茎为外植体，进行增殖培养，取增殖根状茎转移至开花诱导培养基，诱导至花苞盛开，进行人工授粉培养至结实；
所述开花诱导培养基包括：花宝3号3.0g/L、维生素B60.5mg/L、维生素B10.1mg/L、烟酸0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇100mg/L、NAA1.0-2.0mg/L、椰子汁200-300mL/L、蔗糖30g/L、琼脂5.6g/L、活性炭1.0g/L。
2.根据权利要求1所述的促进大根兰试管开花和结实的方法，其特征在于，所述根状茎外植体来源于大根兰种子萌发的无菌苗。
3.根据权利要求1或2所述的促进大根兰试管开花和结实的方法，其特征在于，所述根状茎外植体长1.0-2.0cm。
4.根据权利要求1所述的促进大根兰试管开花和结实的方法，其特征在于，所述增殖培养时，增殖培养基包括：花宝1号3.0g/L、维生素B60.5mg/L、维生素B10.1mg/L、烟酸0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇100.0mg/L、6-BA 5.0-10.0mg/L、KT 2.0-5.0mg/L、椰子汁100-200mL/L、蔗糖20g/L、琼脂5.6g/L。
5.根据权利要求1或4所述的促进大根兰试管开花和结实的方法，其特征在于，所述增殖培养时暗培养，温度为23±2℃。
6.根据权利要求1或4所述的促进大根兰试管开花和结实的方法，其特征在于，所述增殖培养时间为6个月以上，增殖倍数达到4倍以上后转移至开花诱导培养基。
7.根据权利要求1所述的促进大根兰试管开花和结实的方法，其特征在于，所述开花诱导培养时光/暗周期为6h:18h，温度为20±2℃。
8.根据权利要求1所述的促进大根兰试管开花和结实的方法，其特征在于，所述花苞盛开2-3d后，进行人工授粉。
9.根据权利要求1或8所述的促进大根兰试管开花和结实的方法，其特征在于，所述人工授粉包括：用镊子取出花粉块，置于同一朵花的凹槽状柱头上。
10.根据权利要求1或8所述的促进大根兰试管开花和结实的方法，其特征在于，所述人工授粉后，调整光/暗周期为12h:12h，温度为23±2℃。
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