CN115918539A

CN115918539A - 一种贵州地宝兰试管开花及结实的方法

Info

Publication number: CN115918539A
Application number: CN202211660730.5A
Authority: CN
Inventors: 付传明; 柴胜丰; 冼康华; 黄宁珍; 苏江; 刘宝骏; 何金祥
Original assignee: Guangxi Institute of Botany of CAS
Current assignee: Guangxi Institute of Botany of CAS
Priority date: 2022-12-23
Filing date: 2022-12-23
Publication date: 2023-04-07
Anticipated expiration: 2042-12-23
Also published as: CN115918539B

Abstract

本发明公开一种贵州地宝兰试管开花及结实的方法，以贵州地宝兰离体根状茎为材料，先用多效唑溶液浸泡预处理后，再转移至包含有多效唑和6‑苄基腺嘌呤、萘乙酸、硝酸银、香蕉汁等的1/2MS或1/4MS培养基中，在促进根状茎分化成苗的同时，诱导花芽分化并在试管内开花；然后选择健壮的开花植株进行试管内人工授粉，培养获得贵州地宝兰种子。本发明方法操作简单，成本低廉，在试管内筛选贵州地宝兰优良花株，与传统的选择育种技术比较，可以缩短3年左右的时间，大大提高育种效率，并不受季节限制的周年生产种子，高效且无病虫害，为贵州地宝兰物种保育及新品种培育利用开辟了一条新的途径。

Description

一种贵州地宝兰试管开花及结实的方法

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种贵州地宝兰试管开花及结实的方法。

背景技术

花的形成是一个高度复杂的生物学过程，植物生理学和遗传学的研究己充分表明，花的形成受到诸多因子的调控，是高等植物所特有的一种生理现象。在绝大多数情况中，植物必须在营养生长阶段积累一定的营养，同时受到外界环境刺激才能进行花芽分化进而开花。

兰科植物（Orchid）中的很多种类是濒于灭绝的极度濒危物种，同时又是观赏价值较高的花卉之一，但这些物种通常生长期较长，自然生殖存在障碍，难以完成授粉结实，即使结实获得种子，根据不同环境条件和属、种和杂交种的基因组成方面的差异，从种子萌发到开花完成一个生殖周期通常需要3~10年，增加了物种保育和品种培育难度及周年投入成本，限制了兰科花卉产业的快速发展。因此，缩短兰科植物的开花年限和提高生殖效率，已成为植物生理学家与园艺学家的研究热点。

贵州地宝兰（Geodorum eulophioides Schltr.）为我国黔桂交接地区特有兰科濒危物种，首次被发现并命名是在1921年，德国植物分类学家Schlechter在贵州罗甸采集到唯一一份标本。此后80多年来，人们就没有在野外发现过该种，直到2004年，由广西的植物考察队在广西乐业县雅长林区重新发现贵州地宝兰，轰动了植物学界。尽管近年来贵州地宝兰野生种群陆续被发现和报道，但现存的资源量仍十分有限，野外植株个体数量估测不超过800株，呈典型的单株生长或小种群分布，受威胁严重，被评为濒危（EN）等级，并被列入《全国极小种群野生植物拯救保护工程规划（2011-2015年）》名录，是我国确定要优先保护的极小种群野生物种之一。另一方面，贵州地宝兰花大且花瓣呈玫瑰红色，在国产地宝兰种类中是独一无二的，是开发高档兰科花卉和培育新品种难得的好材料，具有极高的观赏价值和科研价值。

贵州地宝兰自然状态下开花率低，果实和种子产量少，从种子萌发生长到开花通常需要3~5年，给开展物种保育和培育花卉新品种工作带来了困难。植物试管开花和结实是一种新型的植物生物技术，是指采用细胞或组织培养的技术，在培养器皿中实现植物的开花并结实的过程，可以缩短生殖年限，加快繁育进程，对自然繁殖率低下的珍稀濒危和有较大应用价值的物种尤其适用，目前贵州地宝兰试管开花及结实的研究未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种贵州地宝兰试管开花及结实的方法，是在离体条件下诱导贵州地宝兰花芽分化进而开花，人工授粉高效获得种子，从而缩短贵州地宝兰的生殖年限，为其物种保育和品种选育及种苗繁育提供技术支撑。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种贵州地宝兰试管开花及结实的方法，包括以下步骤：

（1）材料选择：

选取生长健壮、绿色带绒毛的离体根状茎；

（2）材料预处理：

将根状茎浸泡在诱导剂中，置于摇床上振荡培养2~4h；

所述诱导剂为含多效唑（PP₃₃₃）0.5~1.0 mg/L的无菌溶液；

（3）根状茎的分化和花芽诱导培养：

将根状茎从诱导剂中取出，用无菌滤纸吸干表面水分，然后用无菌镊子分成长0.5~1.5 cm的单粒根状茎，接种在分化与花芽诱导培养基上，培养60~120 d后，根状茎分化成带叶片的植株，逐步诱导形成花芽并开放；

所述分化与花芽诱导培养基为：1/2~1/4MS+多效唑0.5~1.5 mg/L+6-苄基腺嘌呤2.0~4.0 mg/L+萘乙酸0.1~0.5 mg/L+硝酸银0.2~1.0mg/L+香蕉汁50~100g/L+活性炭1.0~2.0g/L+蔗糖20~30g/L+琼脂3.5~4.0g/L，pH值为5.8~6.2；

（4）人工授粉结实：

选取开放3~5 d的花朵进行人工授粉，转接到壮苗培养基上，培养120~180 d获得蒴果；

所述壮苗培养基为：1/2~1/4MS+萘乙酸0.1~0.5 mg/L+硝酸银0.2~1.0mg/L+蔗糖20~30g/L+琼脂3.5~4.0g/L，pH值为5.8~6.2。

本发明方法中，步骤（1）所述根状茎为无菌离体材料，是由贵州地宝兰自然居群的蒴果进行表面消毒和无菌播种萌发培养获得原球茎,原球茎在增殖培养基上培养1~2代后得到根状茎。

所述蒴果是开花后生长120~180d的饱满果荚，优选为开花后生长150~180d的饱满果荚。

所述蒴果表面消毒包括：将蒴果在自来水下用软毛刷刷洗掉外表的灰尘和杂物，再用体积分数70~80%的酒精浸泡60~120 s后，无菌水漂洗1~2次，然后用质量分数0.1~0.2%的升汞（HgCl₂）溶液消毒10~15 min，无菌水漂洗5~6次。

所述无菌播种萌发培养具体为：在超净工作台内，将表面消毒的蒴果切开，将种子接种于萌发培养基上，种子萌发培养得到原球茎，原球茎经过1~2代的增殖培养后得到根状茎；

所述萌发培养基为：1/2~1/8MS+香蕉汁30~50 g/L+活性炭0.5~1.5 g/L+蔗糖20~30g/L +琼脂3.5~4.0 g/L，pH值为5.8~6.2。

在萌发培养条件下培养，种子逐步萌发得到原球茎，将得到的原球茎转接到增殖培养基上，原球茎生长形成健壮的根状茎团。

萌发培养条件为：先在黑暗条件下培养10~30d，然后进行光照培养，光照强度为1500~2500lx，光照时间为10~16 h /d。

增殖培养基为：1/2~1/4MS+香蕉汁50~80 g/L+6-苄基腺嘌呤1.0~3.0 mg/L+萘乙酸0.1~0.3 mg/L+活性炭1.0 g/L+蔗糖20g/L +琼脂3.5 g/L上，pH值为5.8~6.0；优选的，原球茎增殖培养基为：1/2MS+香蕉汁50g/L+6-苄基腺嘌呤2.0~3.0 mg/L+萘乙酸0.2~0.3 mg/L+活性炭1.0 g/L+蔗糖20g/L +琼脂3.5 g/L上，pH值为5.8。

本发明方法，步骤（2）将健壮的根状茎团浸泡在诱导剂中，置于转速110 r/min的摇床上振荡培养2~4h进行预处理，优选为振荡培养2~3 h，更优为选振荡培养2 h；

所述摇床为恒温振荡摇床；

所述诱导剂优选为含多效唑（PP₃₃₃）1.0 mg/L的无菌溶液。

本发明方法中，步骤（3）是将经过预处理的根状茎团取出，用无菌滤纸吸干表面水分，然后用无菌镊子分成长0.5~1.5 cm的单粒根状茎，接种在分化与开花诱导培养基上，培养60~90 d后，根状茎分化成带叶片的植株，逐步形成花芽并开放。

所述分化与花芽诱导培养基优选为：1/2~1/4MS+多效唑1.0~1.5 mg/L+6-苄基腺嘌呤2.5~3.0 mg/L+萘乙酸0.3~0.5 mg/L+硝酸银0.5~1.0mg/L+香蕉汁70~90g/L+活性炭1.0~1.5g/L+蔗糖20~30g/L+琼脂3.5~3.8 g/L，pH值为5.8；

更优选为：1/2MS+多效唑1.0 mg/L+6-苄基腺嘌呤2.5 mg/L+萘乙酸0.3 mg/L+硝酸银0.5 mg/L+香蕉汁80g/L+活性炭1.0g/L+蔗糖20g/L+琼脂3.5 g/L，pH值为5.8。

所述香蕉汁是用成熟香蕉去掉皮后放入榨汁机内加水打匀制成。

所述多效唑、6-苄基腺嘌呤、萘乙酸、硝酸银均为分析纯。

步骤（3）所述花芽从植株顶部叶腋处生长出的花梗上形成并逐渐开放，花朵形态正常，每个花梗上可形成1~3朵花，花芽诱导率达到28.2%。

步骤（2）中的多效唑无菌溶液和步骤（3）中的无菌滤纸和接种针都是在121℃、压力10⁵Pa的条件下灭菌20~25 min，冷却后备用。

本发明方法中，步骤（4）所述壮苗培养基优选为：1/2~1/4MS+萘乙酸0.2~0.5 mg/L+硝酸银0.5~1.0mg/L+蔗糖20~30g/L+琼脂3.5~3.8g/L，pH值为5.8；

更优选为：1/2MS+萘乙酸0.5 mg/L+硝酸银0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂3.5g/L，pH值为5.8。

步骤（4）中人工授粉为异花授粉，是以不同开花株或同株不同花朵为父母亲本，具体是用无菌接种针将父本的花粉涂抹在母本柱头凹槽内。

本发明方法中，步骤（3）和（4）所述培养，所用的光源为复合波长的日光灯，光照强度为1500~3000 lx，优选为1500~2500 lx，培养的光照时间为10~16 h/d，优选为12~14 h/d，培养温度为25~27℃，环境湿度为60~70%。

贵州地宝兰种子萌发培养和增殖培养方法已有文献报导，本发明方法技术创新主要是：所选的试验材料是根状茎，根状茎的预处理、分化与开花诱导培养，以及人工授粉结实培养方法。

本发明是以广西雅长兰科植物国家级自然保护区内的贵州地宝兰自然居群的成熟蒴果进行表面消毒和无菌播种萌发，培养形成的大量根状茎为材料，先用多效唑溶液浸泡预处理后，再转移至包含有多效唑和6-苄基腺嘌呤、萘乙酸、硝酸银、香蕉汁等的1/2MS或1/4MS 培养基中，能在促进根状茎分化成苗的同时，诱导花芽形成并开放，花芽诱导率高，花朵形态正常，人工授粉结实率高。本发明操作简单高效，可不受季节限制的诱导试管内开花并结实，周年生产种子用于贵州地宝兰种苗繁殖。

本发明方法不必经过栽培过程，就可以在试管内筛选贵州地宝兰优良花株，与传统的选择育种技术比较，可以缩短3年左右的时间，大大提高育种效率，为贵州地宝兰物种保育及新品种培育利用开辟了一条新的途径。

附图说明

图1为实施例中贵州地宝兰在原生居群中开花的照片；

图2为实施例1贵州地宝兰无菌播种萌发获得根状茎的照片；

图2（a）为实施例1贵州地宝兰种子无菌萌发的原球茎，（b）为原球茎生长形成根状茎，( c) 为选取的根状茎材料；

图3为实施例1中贵州地宝兰试管花朵照片；

图4为实施例1中贵州地宝兰试管结实照片。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明内容作进一步的说明，但不是对本发明的限定。

实施例1

一种贵州地宝兰试管开花及结实的方法，包括以下步骤：

（1）贵州地宝兰无菌播种萌发获得根状茎，其过程如图2所示：

在位于广西雅长兰科植物国家级自然保护区内的贵州地宝兰原生居群中，如图1所示，选取无病虫侵扰、无开裂的蒴果。采用兰科植物蒴果常规消毒方法进行表面消毒后，在超净工作台内，切开蒴果，取出种子，将种子播种到种子萌发培养基上，培养60~90d后种子萌发形成白色或绿色的原球茎，如图2（a）所示；原球茎经过1~2代的增殖培养后得到根状茎，如图2（b）所示；

蒴果表面消毒：将蒴果在自来水下用软毛刷刷洗掉外表的灰尘和杂物，再用体积分数70~80%的酒精浸泡60~120s后，无菌水漂洗1~2次，然后用质量分数0.1~0.2%的升汞（HgCl₂）溶液消毒10~15 min，无菌水漂洗5~6次；

萌发培养基为：1/2MS+香蕉汁50 g/L+活性炭1.0 g/L+蔗糖20g/L +琼脂3.5 g/L上，pH值为5.8；

在萌发培养条件下培养，种子逐步萌发得到原球茎，萌发培养条件为先在黑暗条件下培养10~30d，然后进行光照培养，光照强度为1500~2500lx，光照时间为10~16 h /d；将得到的原球茎转接到增殖培养基上培养50~80d形成根状茎；

增殖培养基为：1/2MS+香蕉汁50 g/L+6-苄基腺嘌呤2.0 mg/L+萘乙酸0.2 mg/L+活性炭1.0 g/L+蔗糖20g/L +琼脂3.5 g/L上，pH值为5.8，原球茎生长形成健壮的根状茎团；选取生长健壮、绿色带绒毛的根状茎作为材料，如图2( c) 所示；

（2）根状茎预处理

将健壮的根状茎浸泡到诱导剂中，置于转速110 r/min的恒温振荡摇床上振荡培养2h，诱导剂为含多效唑（PP₃₃₃）0.5 mg/L的无菌溶液；

（3）根状茎的分化和开花诱导培养

在超净工作台内，将经过预处理的根状茎团取出，用无菌滤纸吸干表面水分后，用无菌镊子分成长1.0 cm的单粒离体根状茎接种在分化与开花诱导培养基上；

分化与开花诱导培养基为：1/2MS+多效唑0.5 mg/L+6-苄基腺嘌呤2.0 mg/L+萘乙酸0.1 mg/L+硝酸银0.2 mg/L+香蕉50 g/L+活性炭1.0 g/L+蔗糖 20 g/L +琼脂3.5 g/L上，pH值为5.8；

每瓶接种10粒根状茎材料，培养60~90 d后，根状茎分化成带叶片的植株，并逐渐在植物的顶部叶腋处生长出的花梗上形成花芽并开放，每个花梗上可形成1~3朵花，花芽诱导率为23.3%（花芽诱导率/%=分化花芽的植株数/根状分化的植株数×100%）；花朵在解剖结构、色泽大小与野生自然状态的花一致，且花期长达1个月，如图3所示，左为花朵侧面，右为正面；

（4）人工授粉结实

对开放3 d的花朵进行人工异花授粉，授粉时用无菌接种针将父本的花粉涂抹在母本柱头凹槽内，然后将母本植株转接到壮苗培养基上；

壮苗培养基为：1/2MS+萘乙酸0.1 mg/L+硝酸银0.2mg/L+蔗糖20g/L+琼脂3.5g/L，pH值为5.8；培养条件为：温度为23~27℃，光照强度为1500~2500lx，光照时间为10~16 h /d，环境湿度优选为60~70%；

5d后观察到子房开始膨大，表明授粉成功，结实率达到62.5%；10 d后花朵逐渐萎蔫，但花梗始终为鲜绿色直到蒴果成熟，如图4所示。

实施例2

一种贵州地宝兰试管开花及结实的方法，包括以下步骤：

（1）贵州地宝兰无菌播种萌发获得根状茎，该步骤同实施例1；

（2）根状茎预处理

将根状茎浸泡到诱导剂中，置于转速110 r/min的恒温振荡摇床上振荡培养2 h，诱导剂为含多效唑（PP₃₃₃）1.0 mg/L的无菌溶液；

（3）根状茎的分化和花芽诱导培养

在超净工作台内，将经过预处理的根状茎团取出，用无菌滤纸吸干表面水分后，用无菌镊子分成长0.5cm的单粒离体根状茎接种在分化与开花诱导培养基上；

分化与开花诱导培养基为：1/2MS+多效唑1.0 mg/L+6-苄基腺嘌呤2.5 mg/L+萘乙酸0.3 mg/L+硝酸银0.5 mg/L+香蕉汁80 g/L+活性炭1.0 g/L+蔗糖20 g/L +琼脂3.5 g/L上，pH值为5.8；

每瓶接种10粒根状茎材料，培养60~90 d后，根状茎分化成带叶片的植株，并逐渐在植物的顶部叶腋处生长出的花枝上形成花芽并开放，花芽诱导率为28.2%；

（4）人工授粉结实

对开放4 d的花朵进行人工异花授粉，授粉时用无菌接种针将父本的花粉涂抹在母本柱头凹槽内，然后将母本植株转接到壮苗培养基上；

壮苗培养基为：1/2MS+萘乙酸0.2 mg/L+硝酸银0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂3.5g/L，pH值为5.8，5d后观察到子房开始膨大，表明授粉成功，结实率达到80%，实施例2效果最好。

实施例3

一种贵州地宝兰试管开花及结实的方法，包括以下步骤：

（2）根状茎预处理

将根状茎浸泡到诱导剂中，置于转速110 r/min的恒温振荡摇床上振荡培养4 h，诱导剂为含多效唑（PP₃₃₃）1.0 mg/L的无菌溶液；

（3）根状茎的分化和花芽诱导培养

在超净工作台内，将经过预处理的根状茎团取出，用无菌滤纸吸干表面水分后，用无菌镊子分成长1.5cm的单粒离体根状茎接种在分化与开花诱导培养基上；

分化与开花诱导培养基为：1/4MS+多效唑1.5 mg/L+6-苄基腺嘌呤4.0 mg/L+萘乙酸0.5 mg/L+硝酸银1.0 mg/L+香蕉汁100 g/L+活性炭2.0 g/L+蔗糖30 g/L +琼脂3.5 g/L上，pH值为6.2；

每瓶接种10粒根状茎材料，培养60~90 d后，根状茎分化成带叶片的植株，并逐渐在植物的顶部叶腋处生长出的花梗上形成花芽并开放，花芽诱导率为16.6%；

（4）人工授粉结实

在超净工作台内，对开放5 d的花朵进行人工异花授粉，授粉时用无菌接种针将父本的花粉涂抹在母本柱头凹槽内，然后将母本植株转接到壮苗培养基上；

壮苗培养基为：1/4MS+萘乙酸0.5 mg/L+硝酸银1.0 mg/L+蔗糖20g/L+琼脂4.0 g/L，pH值为6.2，5d后观察到子房开始膨大，表明授粉成功，结实率达到75.5%。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并非对本发明作任何形式上的限制。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种贵州地宝兰试管开花及结实的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）材料选择：

选取生长健壮、绿色带绒毛的离体根状茎；

（2）材料预处理：

将根状茎浸泡在诱导剂中，置于摇床上振荡培养2~4h；

所述诱导剂为含多效唑0.5~1.0 mg/L的无菌溶液；

（3）根状茎的分化和花芽诱导培养：

将根状茎从诱导剂中取出，用无菌滤纸吸干表面水分，然后分成长0.5~1.5 cm的单粒根状茎，接种在分化与花芽诱导培养基上，培养60~120 d后，根状茎分化成带叶片的植株，逐步诱导出花芽并开放；

所述分化与花芽诱导培养基为：

1/2~1/4MS+多效唑0.5~1.5 mg/L+6-苄基腺嘌呤2.0~4.0 mg/L+萘乙酸0.1~0.5 mg/L+硝酸银0.2~1.0mg/L+香蕉汁50~100g/L+活性炭1.0~2.0g/L+蔗糖20~30g/L+琼脂3.5~4.0g/L，pH值为5.8~6.2；

（4）人工授粉结实：

所述壮苗培养基为：

1/2~1/4MS+萘乙酸0.1~0.5 mg/L+硝酸银0.2~1.0mg/L+蔗糖20~30g/L+琼脂3.5~4.0g/L，pH值为5.8~6.2。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述根状茎为无菌离体材料，是由贵州地宝兰自然居群的蒴果进行表面消毒和无菌播种萌发培养获得原球茎，原球茎在增殖培养基上培养1~2代后得到根状茎。

3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述根状茎浸泡在诱导剂中，置于转速110 r/min的摇床上振荡培养2h；

诱导剂为含多效唑1.0 mg/L的无菌溶液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）所述分化和花芽诱导培养基为：

1/2~1/4MS+多效唑1.0~1.5 mg/L+6-苄基腺嘌呤2.5~3.0 mg/L+萘乙酸0.3~0.5 mg/L+硝酸银0.5~1.0mg/L+香蕉汁70~90g/L+活性炭1.0~1.5g/L+蔗糖20~30g/L+琼脂3.5~3.8 g/L，pH值为5.8。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（3）所述分化和花芽诱导培养基为：

1/2MS+多效唑1.0 mg/L+6-苄基腺嘌呤2.5 mg/L+萘乙酸0.3 mg/L+硝酸银0.5 mg/L+香蕉汁80g/L+活性炭1.0g/L+蔗糖20g/L+琼脂3.5 g/L，pH值为5.8。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4）所述壮苗培养基为：

1/2~1/4MS+萘乙酸0.2~0.5 mg/L+硝酸银0.5~1.0mg/L+蔗糖20~30g/L+琼脂3.5~3.8g/L，pH值为5.8。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤（4）所述壮苗培养基为：

1/2MS+萘乙酸0.5 mg/L+硝酸银0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂3.5g/L，pH值为5.8。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）和（4）的培养温度均为25~27℃，光照强度为1500~3000lx，光照时间为10~16h/d，环境湿度为60~70%。

9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中的多效唑无菌溶液和步骤（3）中的无菌滤纸和接种针都是在121℃、压力10⁵Pa的条件下灭菌20~25 min，冷却后备用。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4）所述人工授粉为异花授粉，是以不同开花株或同株不同花朵为父母亲本。