CN114431145A - 一种基于体细胞胚途径的独蒜兰组织快繁方法 - Google Patents

Abstract

一种基于体细胞胚途径的独蒜兰组织快繁方法，属于组培扩繁技术领域。采用开花结果后的1~3个月的独蒜兰果荚内壁组织为外植体，以B5培养基为初代培养基，诱导形成愈伤组织，并继续培养形成绿色丛生芽，后采用MS作为继代培养基进行增殖扩繁，绿色丛生芽在形态上进一步分化形成原球茎丛，原球茎直径超过0.5cm时采用1/2MS生根培养基诱导生根，生根良好的健壮瓶苗移栽到基质中进行驯化、栽培，最终形成的独蒜兰种苗。上述一种独蒜兰组培快繁方法，可以解决无法从叶片、假鳞茎和根尖等植株组织诱导生成愈伤组织，并进一步组培扩繁独蒜兰健康种苗的难题，可以快速、批量扩繁独蒜兰。

Description

一种基于体细胞胚途径的独蒜兰组织快繁方法

技术领域

本发明属于组培扩繁技术领域，尤其是涉及一种基于体细胞胚途径的独蒜兰组织快繁方法。

背景技术

独蒜兰[Pleione bulbocodioides (Franch.)Rolfe]是兰科独蒜兰属多年生草本植物，独蒜兰属约有20种，中国分布有16种，其中独蒜兰和云南独蒜兰俗称冰球子，和毛慈菇杜鹃兰一起合称为山慈菇，是传统名贵中药材，有清热解毒、化痰散结之效，主要用于治疗臃肿疗毒、瘰疬痰核、蛇虫咬伤等。独蒜兰花型美观，有较高的观赏价值，同时又有极高的药用价值，有较大的市场需求。随着对独蒜兰的深入研究和新产品的开发，市场对独蒜兰的需求不断增大，长期以来，独蒜兰都依靠采挖野生资源满足市场需求，但是人们无节制的采挖和野生环境的破坏，独蒜兰野生资源急剧减少，种质资源生物多样性遭到严重的破坏。独蒜兰果实为蒴果，透水透气性较差，同时独蒜兰种子细小、无胚乳，种子没有贮藏足够的营养物质供其萌发，在自然条件下很难萌发成苗，其有性繁殖率较低，且独蒜兰生长周期长，以种子繁殖到开花结实需要4～5年。因此，独蒜兰种群数量在自然条件下增殖很慢，群落更新能力弱，很难对人为造成的破坏进行恢复。近年来随着野生资源的减少和市场需求的上升以及人们对野生资源保护意识的觉醒，开始对独蒜兰进行人工种植。目前，独蒜兰的繁殖主要是依靠假鳞茎进行无性繁殖，每年增殖2～3倍，繁殖系数较低。植物组织培养通过提供合适的营养物质和环境条件，以植物组织为材料，能快速有效地培育新的植株，实现独蒜兰种质资源快速繁殖。

植物组织培养的理论依据是植物细胞的全能性和植物的再生理论，植物不同组织分化程度不同，其脱分化恢复分裂的能力和形成愈伤组织的再分化能力也不同。因此，在组织培养中，选择合适的外植体是试验能否成功的关键因素。陈之林等人对白花独蒜兰进行了组培快繁研究, 以种子和原球茎为外植体成功获得了组培苗。屈云慧等人以二叶独蒜兰的种子为外植体成功获得了组培苗。易瑾等人利用疣鞘独蒜兰和岩生独蒜兰的种子成功获得了组培苗。张燕等以独蒜兰种子、组培苗的原球茎和叶片为材料进行培养，发现以种子和原球茎为外植体能培养出新的植株，而以叶片为材料则不能得到新的组培苗。吴丽芳等对滇独蒜兰的种子、假鳞茎和叶片进行组织培养，结果表明种子通过培养能得到组培苗，而以假鳞茎和叶片为外植体均未获得组培苗。黄成林等以独蒜兰种子、假鳞茎和假鳞茎细胞悬浮液为材料进行培养，发现假鳞茎培养后虽然能产生愈伤组织增殖小原球茎并萌发叶片，但生长异长，而以假鳞茎细胞悬浮液为材料则不能获得植株，只有以种子为外植体能培养出健康的组培苗。从前人研究可见，以种子和原球茎为外植体能培养出新的植株，而以叶片为材料则不能得到新的组培苗，鳞茎为外植体很难获得植株，本发明提供了一种基于体细胞胚途径的组织快繁技术。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供了一种基于体细胞胚途径的组织快繁技术方案，解决无法从叶片、假鳞茎和根尖等植株组织诱导生成愈伤组织，并进一步组培扩繁独蒜兰健康种苗的难题，实现快速、批量扩繁独蒜兰种苗。

所述的一种独蒜兰组培扩快方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）外植体的选择与灭菌

外植体的选择：选择健康的3~4年的植株，在独蒜兰开花期间进行人工辅助授粉，提高坐果率，经过1~3个月精心培育，在果荚成熟转黄前采摘，要求果荚外皮青绿色，无病斑无伤疤，果荚内壁组织幼嫩、外皮组织未完全纤维化；

外植体的灭菌：果荚用洗洁精水浸泡10~15min，用毛刷刷净种壳表面，并用自来水冲洗15~30min；在超净工作台上用75%酒精表面灭菌处理20~40 s，0.1%升汞浸泡灭菌5~15min，用无菌水冲洗5~6次，无菌滤纸吸干果荚表面水分；

（2）诱导培养

诱导培养基（初代培养基）选用B5，添加0.1~1.0mg/L NAA（萘乙酸），在超净工作台上用手术刀和镊子将灭菌好的果荚两端切除，纵向剖开果荚，将果荚内的未成熟的种子剔除，把果荚内壁组织剥离接种到诱导培养基上，温度为24℃~26℃，放到培养室暗培养30~60天后，待长出愈伤组织后转入光照培养；光照培养的光照强度为1800~2500lx，光照时间为10~14小时/天，直至产生绿色丛生芽；

（3）增殖培养

将绿色芽丛切割分离进行增殖培养（继代培养），平均30~60天增殖一代，每代增殖5~10倍；增殖培养基采用MS或1/2MS，添加0.2~0.8 mg/L 6-BA（6-苄基腺嘌呤）和 0.1~0.6mg/L KT（激动素），设置温度为24℃~26℃，光照强度为1800~2500lx,光照时间为10~14小时/天；

（4）生根培养

经过90~150天培养，绿色丛生芽在形态上进一步分化形成原球茎丛，将原球茎丛在无菌操作台上分割，选取直径超过0.5cm的原球茎，接种至生根培养基；生根培养基选用1/2MS+ 0.2~0.8mg/L 6-BA + 0.1~0.6mg/L KT；培养温度为24℃~26℃，光照强度为1800~2500lx，光照时间为10~14小时/天，生根时间为30~40天；

（5）驯化培养：将生根良好的健壮瓶苗取出组培室，打开瓶盖放置3~5天，将苗倒出洗净培养基，用稀释到800~1000倍的多菌灵浸泡独蒜兰瓶苗根部5~10min，洗净阴干水分，将其移栽到基质中进行驯化栽培。

所述的一种基于体细胞胚途径的独蒜兰组织快繁方法，其特征在于（1）中：选取1~3个月龄的果荚，果荚用洗洁精水浸泡时间为12~13min，用自来水冲洗20~25min；用75%酒精表面灭菌处理25~35 s，0.1%升汞浸泡灭菌8~12min。

所述的一种基于体细胞胚途径的独蒜兰组织快繁方法，其特征在于步骤（2）诱导培养中：NAA的浓度为0.2~0.5mg/L，优选0.4~0.5mg/L；光照强度为2000~2200lx，光照时间为12~13小时/天。

所述的一种基于体细胞胚途径的独蒜兰组织快繁方法，其特征在于步骤（3）增殖培养中：继代培养基采用MS或1/2MS，添加0.3~0.6 mg/L 6-BA和 0.2~0.3 mg/L KT；设置温度为25℃，光照强度为2000~2200lx，光照时间为11~12小时/天。

所述的一种基于体细胞胚途径的独蒜兰组织快繁方法，其特征在于步骤（4）生根培养中：生根培养选用1/2MS+ 0.3~0.5mg/L 6-BA +0.2~0.4mg/L KT；培养温度为25℃，光照强度为2000~2200lx，光照时间为12~13小时/天。

所述的一种基于体细胞胚途径的独蒜兰组织快繁方法，其特征在于步骤（4）生根培养中：当原球茎丛的原球茎直径超过0.5cm时，在无菌操作台上分割成1~2个原球茎为1丛，并接种至生根培养基进行生根，生根时间30~40天。

所述的一种基于体细胞胚途径的独蒜兰组织快繁方法，其特征在于：内壁组织诱导培养前期温度为24℃~26℃，放到培养室暗培养30~60天后，待长出愈伤组织后转入光照培养；以后光照诱导培养、增殖培养和生根培养的温度为24℃~26℃，光照强度为2000~2500lx，光照时间为10~14小时/天。

采用上述技术方案后，本发明具有如下优点：

通过上述独蒜兰组培扩繁方法，可以获得独蒜兰植株，解决独蒜兰以假鳞茎和叶片等植株组织不能通过组培获得再生植株的问题，为独蒜兰提供一种基于体细胞胚途径的独蒜兰组织快繁方法。

相比现有技术，本发明的有益效果为：

（1）本发明采取独蒜兰嫩果荚的内壁组织为外植体，通过诱导形成愈伤组织，并继续培养形成绿色丛生芽，绿色丛生芽在形态上进一步分化形成原球茎丛，原球茎诱导形成根系，经驯化、栽培，最终形成的独蒜兰种苗。解决独蒜兰以假鳞茎和叶片等植株组织不能通过组培获得再生植株的问题，为独蒜兰提供一种基于体细胞胚途径的独蒜兰组织快繁方法。可为活性成分代谢机理、植物细胞的分化、发育、全能性表达和品种改良、突变体筛选等提供良好的体系，在理论和应用上均具有重要意义。

（2）增殖培养和生根培养时，加入适当浓度的6-BA 和 KT，可以提高效果。

（3）经增殖培养，当原球茎直径超过0.5cm时诱导生根，组培苗植株营养积累多成活率高。

附图说明

图1为秋花独蒜兰果荚图；

图2为嫩果荚内壁组织诱导形成愈伤组织图；

图3为愈伤组织培养增殖形成绿色丛生芽（原球茎丛）图；

图4为原球茎生根诱导图。

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图对本发明进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

一种独蒜兰组培扩繁方法，包括以下步骤：

（1）外植体的选择与灭菌。

外植体的选择：选择健康的3年的秋花独蒜兰植株，在开花期间对进行人工辅助授粉。花朵凋谢结出幼嫩果荚后，浇灌0.5%的20-20-20+Te的水溶性能（以色列海法保瑞丰）一次，并采用70%遮阴网覆盖。采取2月龄的秋花独蒜兰绿色果荚进行组培，这时果荚内壁组织幼嫩、外皮组织未转完全黄色和纤维化（见图1）。

外植体的灭菌：果荚用洗洁精水浸泡12min，用毛刷刷净种壳表面，并用自来水冲洗30min；在超净工作台上用75%酒精表面灭菌处理40 s，0.1%升汞浸泡灭菌10min，用无菌水冲洗6次，无菌滤纸吸干果荚表面水分。

（2）诱导培养。

诱导培养基（初代培养基）选用B5+0.5mg/L NAA。在超净工作台上用手术刀和镊子将灭菌好的果荚两端切除，纵向剖开果荚，将果荚内的未成熟的种子剔除，把果荚内壁组织接种入初代培养基上，温度为24℃~26℃，放到培养室暗培养45天后，待长出愈伤组织后转入光照培养（见图2）。光照培养的光照强度为2000~2500lx，光照时间为12小时/天。愈伤组织成芽，进一步培养后产生绿色丛生芽。

（3）增殖培养。

将绿色芽丛切割分离进行增殖培养，继代培养基为MS，添加0.5 mg/L 6-BA和 0.2mg/L KT；设置温度为24℃~26℃，光照强度为1800~2500lx，光照时间为10~14小时/天。45天增殖一代，每代增殖5.5倍（见图3）。

（4）生根培养。

到绿色丛生芽在形态上进一步分化形成原球茎丛。将原球茎丛在无菌操作台上分割，选取直径超过0.5cm的原球茎，并接种至生根培养基；生根培养选用1/2MS+ 0.5mg/L 6-BA + 0.2mg/L KT。培养温度为24℃~26℃，光照强度为2000~2500lx,光照时间为12小时/天（见图4）。生根培养40天，平均生根诱导率68.4%，平均根数4.4根，平均根长2.9cm。

（5）驯化培养。

将生根良好的健壮瓶苗取出组培室，打开瓶盖放置4天，将苗倒出洗净培养基，用稀释到500倍的多菌灵浸泡独蒜兰瓶苗根部5min，洗净阴干水分，将其移栽到基质中进行驯化。在移栽初期的2周，进行遮阴和保持较高湿度，第三周后进行正常管理。

实施例2：

一种独蒜兰组培扩繁方法，包括以下步骤：

（1）外植体的选择与灭菌。

外植体的选择：选择健康的3~4年的独蒜兰植株，开花期间对独蒜兰进行人工辅助授粉，提高坐果率，经过1个月精心培育，采摘果荚，这时果荚内壁组织幼嫩、外皮组织未完全纤维化；

外植体的灭菌：果荚用洗洁精水浸泡10min，用毛刷刷净种壳表面，并用自来水冲洗15min；在超净工作台上用75%酒精表面灭菌处理20 s，0.1%升汞浸泡灭菌5min，用无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干果荚表面水分；

（2）诱导培养。

诱导培养基选用B5，添加0.8mg/L NAA，在超净工作台上用手术刀和镊子将灭菌好的果荚两端切除，纵向剖开果荚，将果荚内的未成熟的种子剔除，把果荚内壁组织接种入初代培养基上，温度为24℃~26℃，放到培养室暗培养30~60天后，待长出愈伤组织后转入光照培养，光照培养的光照强度为1800~2000lx，光照时间为14小时/天，不久即产生绿色丛生芽；

（3）增殖培养。

将绿色芽丛切割分离进行增殖培养，继代培养基是MS + 0.8 mg/L 6-BA + 0.4mg/L KT；设置温度为24℃~26℃，光照强度为1800~2000lx，光照时间为14小时/天。平均45天增殖一代，每代增殖5.2倍。

（4）生根培养。

经过90~150天培养，绿色丛生芽在形态上进一步分化形成原球茎丛；将原球茎丛在无菌操作台上分割，选取直径超过0.5cm的原球茎，并接种至生根培养基；生根培养选用1/2MS+ 0.5mg/L 6-BA +0.4mg/L KT；培养温度为24℃~26℃，光照强度为1800~2200lx，光照时间为14小时/天；生根培养40天，平均生根诱导率66.2%，平均根数4.2根，平均根长2.5cm。

（5）驯化培养：将生根良好的健壮瓶苗取出组培室，打开瓶盖放置3天，将苗倒出洗净培养基，用稀释到800倍的多菌灵浸泡独蒜兰瓶苗根部8min，洗净阴干水分，将其移栽到基质中进行驯化。在移栽初期的2周，进行遮阴和保持较高湿度，第三周后进行正常管理。

实施例3：

一种独蒜兰组培扩繁方法，包括以下步骤：

（1）外植体的选择与灭菌

外植体的选择：选择健康的3~4年的独蒜兰植株，在开花期间对独蒜兰进行人工辅助授粉，经过3个月精心培育，在果荚成熟转黄前采摘，要求果荚外皮青绿色，无病斑无伤疤，果荚内壁组织幼嫩、外皮组织未完全纤维化；

外植体的灭菌：果荚用洗洁精水浸泡15min，用毛刷刷净种壳表面，并用自来水冲洗20min；在超净工作台上用75%酒精表面灭菌处理30 s，0.1%升汞浸泡灭菌15min，用无菌水冲洗6次，无菌滤纸吸干果荚表面水分；

（2）诱导培养

诱导培养基选用B5，添加0.8mg/L NAA，在超净工作台上用手术刀和镊子将灭菌好的果荚两端切除，纵向剖开果荚，将果荚内的未成熟的种子剔除，把果荚内壁组织接种入初代培养基上，温度为24℃~26℃，放到培养室暗培养30~60天后，待长出愈伤组织后转入光照培养，光照培养的光照强度为2200~2500lx，光照时间为10小时/天，不久即产生绿色丛生芽；

（3）增殖培养

将绿色芽丛切割分离进行增殖培养，平均2~3个月增殖一代，每代增殖5~10倍；增殖培养基采用MS，添加1.0 mg/L 6-BA和0.6 mg/L KT；设置温度为24℃~26℃，光照强度为2200~2500lx，光照时间为10小时/天；平均45天增殖一代，每代增殖4.6倍。

（4）生根培养：经过90~150天培养，绿色丛生芽在形态上进一步分化形成原球茎丛；将原球茎丛在无菌操作台上分割，选取直径超过0.5cm的原球茎，并接种至生根培养基；选用1/2MS+ 0.8mg/L 6-BA +0.6mg/L KT配方；培养温度为24℃~26℃，光照强度为2000~2500lx，光照时间为10小时/天；生根培养40天，平均生根诱导率58.6%，平均根数3.6根，平均根长2.1cm。

（5）驯化培养：将生根良好的健壮瓶苗取出组培室，打开瓶盖放置5天，将苗倒出洗净培养基，用稀释到1000倍的多菌灵浸泡独蒜兰瓶苗根部10min，洗净阴干水分，将其移栽到基质中进行驯化。在移栽初期的2周，进行遮阴和保持较高湿度，第三周后进行正常管理。

在独蒜兰原球茎增殖、诱导生根时常加入活性碳吸附有毒物质，防止植物组织褐化甚至死亡。增殖培养基中可以加入琼脂6-8g/L+蔗糖15-30g/L +活性炭0.5~1.0 g/L，pH5.8。生根培养基中可以加入琼脂6-8g/L+蔗糖15-30 g/L +活性炭0.5~1.0 g/L，pH 5.8。

以下通过相应的试验数据进一步证明本发明的有益效果，见表1-3。

注：“0”表示不能生成愈伤组织，“+” 表示诱导愈伤组织效果极弱，，“++” 表示诱导愈伤组织效果弱，“+++” 表示诱导愈伤组织效果一般，“++++” 表示诱导愈伤组织效果较好，“+++++” 表示诱导愈伤组织效果很好。

表1表明：1）叶片组织不能诱导产生诱导愈伤组织，假鳞茎和根尖较难诱导产生诱导愈伤组织，嫩绿果荚内壁组织较易诱导产生诱导愈伤组织；2）采用MS、MSN 、KC 和B5培养基均可的诱导嫩绿果荚内壁组织产生诱导愈伤组织，其中以B5培养基效果最佳。

表2表明：添加植物生长调节剂6- BA、KT可增加是诱导独蒜兰原球茎的诱导、增殖和分化效果， 其中以MS+0.5mg/L 6-BA + 0.2mg/L KT处理效果最佳。

表3 不同植物生长调节剂处理原球茎生根诱导效果

表3表明：添加植物生长调节剂6- BA、KT可促进是原球茎生根， 其中以1/2MS+0.5mg/L 6-BA + 0.2mg/L KT处理效果最佳。

本说明书的实施例所述的内容仅仅是对发明构思的实现形式的列举，仅作说明用途。本发明的保护范围不应当被视为仅限于本实施例所陈述的具体形式，本发明的保护范围也及于本领域的普通技术人员根据本发明构思所能想到的等同技术手段。

Claims (7)

1.一种基于体细胞胚途径的独蒜兰组织快繁方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）外植体的选择与灭菌

外植体的选择：选择健康的3~4年的植株，在独蒜兰开花期间进行人工辅助授粉，提高坐果率，经过1~3个月精心培育，在果荚成熟转黄前采摘，要求果荚外皮青绿色，无病斑无伤疤，果荚内壁组织幼嫩、外皮组织未完全纤维化；

外植体的灭菌：果荚用洗洁精水浸泡10~15min，用毛刷刷净种壳表面，并用自来水冲洗15~30min；在超净工作台上用75%酒精表面灭菌处理20~40 s，0.1%升汞浸泡灭菌5~15min，用无菌水冲洗5~6次，无菌滤纸吸干果荚表面水分；

（2）诱导培养

诱导培养基选用B5，添加0.1~1.0mg/L NAA，在超净工作台上用手术刀和镊子将灭菌好的果荚两端切除，纵向剖开果荚，将果荚内的未成熟的种子剔除，把果荚内壁组织剥离接种到诱导培养基上，温度为24℃~26℃，放到培养室暗培养30~60天后，待长出愈伤组织后转入光照培养；光照培养的光照强度为1800~2500lx，光照时间为10~14小时/天，直至产生绿色丛生芽；

（3）增殖培养

将绿色芽丛切割分离进行增殖培养，平均30~60天增殖一代，每代增殖5~10倍；增殖培养基采用MS或1/2MS，添加0.2~0.8 mg/L 6-BA和 0.1~0.6 mg/L KT，设置温度为24℃~26℃，光照强度为1800~2500lx,光照时间为10~14小时/天；

（4）生根培养

经过90~150天培养，绿色丛生芽在形态上进一步分化形成原球茎丛，将原球茎丛在无菌操作台上分割，选取直径超过0.5cm的原球茎，接种至生根培养基；生根培养基选用1/2MS+ 0.2~0.8mg/L 6-BA + 0.1~0.6mg/L KT；培养温度为24℃~26℃，光照强度为1800~2500lx，光照时间为10~14小时/天，生根时间为30~40天；

（5）驯化培养：将生根良好的健壮瓶苗取出组培室，打开瓶盖放置3~5天，将苗倒出洗净培养基，用稀释到800~1000倍的多菌灵浸泡独蒜兰瓶苗根部5~10min，洗净阴干水分，将其移栽到基质中进行驯化栽培。

2.如权利要求1所述的一种基于体细胞胚途径的独蒜兰组织快繁方法，其特征在于（1）中：选取1~3个月龄的果荚，果荚用洗洁精水浸泡时间为12~13min，用自来水冲洗20~25min；用75%酒精表面灭菌处理25~35 s，0.1%升汞浸泡灭菌8~12min。

3.如权利要求1所述的一种基于体细胞胚途径的独蒜兰组织快繁方法，其特征在于步骤（2）诱导培养中：NAA的浓度为0.2~0.5mg/L，优选0.4~0.5mg/L；光照强度为2000~2200lx，光照时间为12~13小时/天。

4.如权利要求1所述的一种基于体细胞胚途径的独蒜兰组织快繁方法，其特征在于步骤（3）增殖培养中：继代培养基采用MS或1/2MS，添加0.3~0.6 mg/L 6-BA和 0.2~0.3 mg/LKT；设置温度为25℃，光照强度为2000~2200lx，光照时间为11~12小时/天。

5.如权利要求1所述的一种基于体细胞胚途径的独蒜兰组织快繁方法，其特征在于步骤（4）生根培养中：生根培养选用1/2MS+ 0.3~0.5mg/L 6-BA +0.2~0.4mg/L KT；培养温度为25℃，光照强度为2000~2200lx，光照时间为12~13小时/天。

6.如权利要求1所述的一种基于体细胞胚途径的独蒜兰组织快繁方法，其特征在于步骤（4）生根培养中：当原球茎丛的原球茎直径超过0.5cm时，在无菌操作台上分割成1~2个原球茎为1丛，并接种至生根培养基进行生根，生根时间30~40天。

7.如权利要求1所述的一种基于体细胞胚途径的独蒜兰组织快繁方法，其特征在于：内壁组织诱导培养前期温度为24℃~26℃，放到培养室暗培养30~60天后，待长出愈伤组织后转入光照培养；以后光照诱导培养、增殖培养和生根培养的温度为24℃~26℃，光照强度为2000~2500lx，光照时间为10~14小时/天。

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