CN106035082B - 一种西瓜的快速繁殖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种西瓜的快速繁殖的方法，属于植物组织培养的技术领域。本发明要解决现有西瓜繁殖技术存在再生周期长、基因型限制大的技术问题。本发明方法如下：一、西瓜种子经消毒后浸泡，再播种于营养钵中，待子叶未展开前，去除顶顶芽及侧芽；二、将诱导液滴加两片子叶的连接处，然后培养至直到西瓜茎尖生长点分化处膨大出不定芽为止；三、暗培养；四，光照培养至不定芽丛长出后，转移到伸长培养基中；五、待不定芽伸长(2.5～3.5)cm，去除不定芽后插到生根培养基中培养，获得再生植株；六、驯化再生植株。本发明方法的基因型限制小，整个再生周期短，从植株播种到收获种子，只需3‑4个月。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养的技术领域；具体涉及一种西瓜的快速繁殖的方法。
背景技术
西瓜(学名：Citrullus lanatus(Thunb.)Matsum.et Nakai)一年生蔓生藤本；茎、枝粗壮，具明显的棱沟。果实大型，近于球形或椭圆形，肉质，多汁，果皮光滑，色泽及纹饰各式。种子多数，卵形，黑色、红色，两面平滑，基部钝圆，通常边缘稍拱起，花果期夏季。
西瓜为夏季之水果，果肉味甜，能降温去暑；种子含油，可作消遣食品；果皮药用，有清热、利尿、降血压之效。
随着植物基因工程的发展，农杆菌介导的茎尖转基因方法的出现使得转基因技术有了大突破。茎尖不定芽方法与组培方法相比较，要求环境低、周期短、效率高，可以在较短时期内获得大量的植株，对植物功能基因组的研究意义重大。
在西瓜遗传转化过程中，从外植体的选择，到染菌除菌、褐化、继代、筛选剂等各个环节也都影响最终的转化效率等。与其他方法相比，茎尖不定芽转基因方法最大限度的保持了甜瓜植株的完整性，依赖其自身植株的正常生长，考虑根对激素等敏感性问题，要注意激素的配比情况，从而达到获得转化植株的目的，整个转化过程脱离了植物组织培养条件下各种因素的限制。
发明内容
本发明要解决现有西瓜繁殖技术存在再生周期长、基因型限制大的技术问题；而提供了一种西瓜的快速繁殖的方法。
为解决上述技术问题，本发明中一种西瓜的快速繁殖的方法是由下述步骤完成的：
步骤一、西瓜种子经消毒后浸泡，再播种于营养钵中，待子叶未展开前，去除顶顶芽及侧芽；
步骤二、将诱导液滴加两片子叶的连接处，然后培养至直到西瓜茎尖生长点分化处膨大出不定芽为止；
步骤三、将步骤二获得幼苗进行暗培养1～2天；
步骤四，然后光照培养至不定芽丛长出后，转移到伸长培养基中；
步骤五、待不定芽伸长(2.5～3.5)cm，去除不定芽后插到生根培养基中培养，获得再生植株；
步骤六、驯化再生植株，获得西瓜再生苗。
步骤一中西瓜种子浸泡是将饱满的西瓜种子在(55～60)℃水中浸泡，并不断搅拌，至水温为室温，室温下浸泡12～24h。
步骤二中诱导液由1/2MS+0.5mg/L6-BA(6苄基腺嘌呤)+0.05％表面活性剂SILWET-L77,pH值为5.7。
步骤三暗黑培养是置于25～26℃、黑暗、湿度为80％～90％的条件下培养。
步骤四中光照培养:25℃，光照16h/d，黑暗8h/d，光照强度为2000lx。
步骤四中所述伸长培养基的组成为：MS+0.05mg/LBA+0.01mg/IAA+7.5g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8。
步骤五中所述生根培养基的组成为：MS+0.1mg/LIAA+7.5g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8。
步骤六中将生根的西瓜苗取出，修剪后栽植到营养土中驯化；所述营养土是由蛭石与草炭按1:1质量比混合而成的。
本发明方法的基因型限制小，整个再生周期短，从植株播种到收获种子，只需3-4个月。
附图说明
图1是诱导剂滴加位置示意图，图1中箭头所指的是滴加位置，1表示子叶；
图2是具体实施方式一中步骤一处理后；
图3是具体实施方式一中去除胚子叶前端和胚根部分；
图4是具体实施方式一中步骤二培养后；
图5是对比例中1/2MS培养基中培养；
图6是对比例中组织培养；
图7是具体实施方式一中再生植株的移载成活。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式中一种西瓜的快速繁殖的方法是由下述步骤完成的：步骤一、选取西瓜品系100粒饱满的种子M-2，在60℃水中浸泡，并不断搅拌，至水温为室温，再在室温下浸泡12h，播种营养钵中，暗培养至50％种子露白后光照培养5天，待子叶未展开前，用刀片小心去除顶顶芽及侧芽(如图2)；
暗黑培养是置于25℃、黑暗、湿度为90％的条件下培养；光照培养:25℃，光照16h/d，黑暗8h/d，光照强度为2000lx。
步骤二、将诱导液滴加两片子叶的连接处(如图1所示)，然后培养至直到西瓜茎尖生长点分化处膨大出不定芽为止(图3)；
诱导液由1/2MS+1.0mg/L6-BA(6苄基腺嘌呤)+0.05％表面活性剂SILWET-L77,pH值为5.7。
步骤三、将步骤二获得幼苗进行暗培养1～2天；
暗黑培养是置于25℃、黑暗、湿度为90％的条件下培养。
步骤四，然后光照培养至不定芽丛长出后，转移到伸长培养基中(图4)；
光照培养:25℃，光照16h/d，黑暗8h/d，光照强度为2000lx；所述伸长培养基的组成为：MS+0.05mg/LBA+0.01mg/LIAA+7.5g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8。
步骤五、待不定芽伸长3.0cm，去除不定芽后插到生根培养基中培养，获得再生植株(图5)；
所述生根培养基的组成为：MS+0.1mg/LIAA+7.5g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8。
步骤六、将生根的西瓜苗取出，修剪后栽植到营养土(以质量计，蛭石：草炭＝1:1)中驯化，获得西瓜再生苗，2周后与实生苗长势相同(图7)。
采用下述试验验证发明效果：
试验一、不同西瓜品种不定芽诱导的影响
诱导液由1/2MS+1.0mg/L6-BA(6苄基腺嘌呤)+0.05％表面活性剂SILWET-L77,pH值为5.7。
处理方法：每个处理设3次重复，每次重复10个外植体。培养条件:温度25℃，光照16h/d，黑暗8h/d，光照强度为2000lx。每7～10d继代一次，30d后统计不定芽数目，计算再生频率和每外植体再生芽数。
结果如表1所示：
表1不同基因型萌发率和分化率比较
由表1可知，本申请的诱导剂配方对不同品种的西瓜均有效果
试验二、不同诱导剂不定芽诱导的影响
采用不同诱导剂对西瓜W-1品种进行处理，处理方法同试验一，不同诱导剂的配方如表2所述，结果见表3。
表2不同诱导剂配方表
表3不同激素浓度产生不定芽数目的比较(W-1品种)
由表3可知，配方3诱导剂(即具体实施方式一所述的诱导剂)的效果最佳。
试验三、不同繁殖方法子叶节组织培养试验
对比例：西瓜繁殖方法的步骤如下：
(1)取材灭菌，将西瓜种子剥去壳后。用70％酒精灭菌30s,再用0.05％升汞消毒10分钟，在超净工作台上用灭菌水洗3－4次。每次泡1分钟，接种到1/2MS培养基中，获得多个苗，5天后(图5)，获得无菌苗，然后用刀片去除胚子叶前端，接种到启动培养基中。
(2)启动培养，将灭菌后切好的胚块放在启动培养基中培养。首先在28℃下暗培养2d，然后至人工气候箱培养，培养条件为白天28℃，晚上25℃，黑暗8h/d，光照16h/d，光照强度为2000Lx,光照条件，培养10天。培养基组成为1/8MS+BA1.5mg/L+IAA0.1mg/L，琼脂中(其中每升含蔗糖30g、琼脂7.5g，pH值5.8)，培养时间为10d，获得启动培养胚块(图6)。
(3)不定芽培养，将步骤(2)所得的所得的启动培养胚块均匀切成四小块，并转移到不定芽培养基中培养，培养条件为：白天28℃，晚上25℃，黑暗8h/d，光照16h/d，光照强度为2000Lx，培养时间为20天，获得不定芽培养胚块；
其中不定芽培养基组成为：MS基本培养基+BA1.0mg/L+IAA0.1mg/L+7.5g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH5.8，然后转移到MS+BA1.0mg/L+IAA0.1mg/L见有不定芽丛长出后，转移到伸长培养基中MS+0.05mg/L BA+IAA0.1mg/L。
(4)伸长培养，将启动培养获得的胚块均匀切成四小块，转移到伸长培养基中培养(图5)。培养条件为：白天28℃，晚上25℃，黑暗8h/d，光照16h/d，光照强度为2000Lx，培养20天，获得伸长培养胚块。
(5)去除步骤(4)所得伸长胚块中长于3cm的不定芽并移植到生根培养基中，培养条件为：白天28℃，晚上25℃，黑暗8h/d，光照16h/d，光照强度为2000Lx光照条件，培养10天，获得再生植株；
所述生根培养基，组成是：MS基本培养基+IAA0.1mg/L+7.5g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH5.8。
(6)再生植株驯化，将生根的西瓜苗取出，适当修剪，然后栽植到营养土蛭石：草炭＝1:1中，注意保温保湿，2周后与实生苗长势相同。
对具体实施方式一和对比例所提供的方法的效果进行了测定。对西瓜再生植株培育过程中，繁殖系数、再生频率、外植体再生芽数及培植周期进行了测定和统计，结果见表1。
表1不同方法培植再生植株的效果
| 繁殖系数 | 再生频率 | 外植体再生芽数 | 培植周期 | |
| 具体实施方式一 | 5 | 80 | 6 | 54d |
| 对比例 | 3 | 70 | 3 | 67d |
从表1可知，本发明所提供的方法在繁殖系数、再生频率及外植体再生芽数方面明显优于对比例，而培植周期却比传统方法短13天。
Claims (6)
1.一种西瓜的快速繁殖的方法，其特征在于该繁殖方法是由下述步骤完成的：
步骤一、西瓜种子经消毒后浸泡，再播种于营养钵中，待子叶未展开前，去除顶芽及侧芽；
步骤二、将诱导液滴加两片子叶的连接处，然后培养至直到西瓜茎尖生长点分化处膨大出不定芽为止，诱导液由1/2MS+0.5mg/L 6-BA+0.05％表面活性剂SILWET-L77，pH值为5.7；
步骤三、将步骤二获得幼苗进行暗培养1～2天；
步骤四，然后光照培养至不定芽丛长出后，转移到伸长培养基中；
步骤五、待不定芽伸长(2.5～3.5)cm，去除不定芽后插到生根培养基中培养，获得再生植株；
步骤六、驯化再生植株，获得西瓜再生苗；
其中，步骤四中所述伸长培养基的组成为：MS+0.05mg/L BA+0.01mg/L IAA+7.5g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8；
步骤五中所述生根培养基的组成为：MS+0.1mg/L IAA+7.5g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤一中西瓜种子浸泡是将饱满的西瓜种子在(55～60)℃水中浸泡，并不断搅拌，至水温为室温，室温下浸泡12～24h。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤三暗黑培养是置于25～26℃、黑暗、湿度为80％～90％的条件下培养。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤四中光照培养:25℃，光照16h/d，黑暗8h/d，光照强度为2000lx。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤六中将生根的西瓜苗取出，修剪后栽植到营养土中驯化。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述营养土是由蛭石与草炭按1:1质量比混合而成的。
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