CN112088774A - 一种植物多倍体的诱导方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种植物多倍体的诱导方法,包括以下步骤:外植体花药的采集、愈伤组织诱导、体细胞胚诱导、多倍体诱导、再生植株诱导、倍性鉴定步骤,利用本发明的培养方法,有效的在橡胶树花药离体培养获得体细胞胚的基础上,科学配置培养基,合理调节培养条件,能快速、高效的获得具有优良性状的橡胶树多倍体。
Description
技术领域
本发明涉及植物遗传育种领域,特别涉及一种植物多倍体的诱导方法。
背景技术
橡胶树的次生代谢物质天然橡胶是制作乳胶制品的主要原料,在社会经济发展中具有重要作用。植物多倍体具有细胞巨大、生长速度快、抗逆性强、次生代谢物含量高等特点,人工诱导橡胶树多倍体是提高橡胶树产胶量和抗逆性的一种有潜力的途径。
目前橡胶树人工诱导多倍体的方法主要有两种。一是使用秋水仙碱连续处理植株的生长点(茎尖、芽点),获得四倍体植株。二是通过化学(秋水仙碱)或物理(高温)手段处理橡胶树发育中的雌雄配子体获得2n花粉或2n卵细胞,然后通过自然授粉或人工授粉与正常卵细胞或者花粉融合,获得三倍体植株。然而,通过秋水仙碱处理生长点的方法得到的大多为嵌合体,而通过理化手段诱导2n配子的发生率极低。
发明内容
鉴于此,本发明提出一种植物多倍体的诱导方法,解决上述问题。
本发明的技术方案是这样实现的:一种植物多倍体的诱导方法:包括以下步骤:
S1、外植体花药的采集:在橡胶树的花序抽出和生长期中,雄花处于黄绿状态时,取雄花用镊子夹碎,使用核酸染料染色,在显微镜观察雄花的发育时期;
S2、愈伤组织诱导:以花粉粒单核居中期到靠边期的花药为外植体,接种于培养基A上培养30~40天,获得愈伤组织,所述培养基A包含以下含量组分:MS培养基、40~60mL/L椰子水、50~90g/蔗糖、1~3.2g/L植物凝胶、0.3~1.5mg/L2,4-二氯苯氧乙酸、0.5~1.8mg/L萘乙酸、0.3~1.5mg/L激动素KT、1~5ug/ml积雪草甙;
S3、体细胞胚诱导:将上述步骤S2中获得的愈伤组织接种于培养基B上,经脉冲光光源照射10~30s后置于培养箱中培养30~50天,获得体细胞胚;
所述培养箱的条件为:培养的24h内,保持氧浓度为3~8%,培养的第2~20天,保持氧浓度为10~20%,培养至第21~50天,保持与室内氧浓度相同;
所述培养基B包含以下含量组分:MS培养基、30~70mL/L椰子水、1~3.2g/L植物凝胶、50~90g/L蔗糖、1.0~3.5g/L活性炭、2~4mg/L激动素KT、0.5~2mg/L细胞分裂素6-BA、0.3~1.3mg/L赤霉素GA3、1~2mg/L脱落酸ABA、0.2~0.5ug/ml泊洛沙姆407;
S4、多倍体诱导:将上述步骤S3获得的体细胞胚在培养基C中浸渍40~60h,获得多倍体诱导后的体细胞胚,所述培养基C包含以下含量组分:2~10mg/mL的秋水仙碱、MS培养基、30~70mL/L椰子水、50~70g/L蔗糖、0.5~1.5g/L植物凝胶、0.3~1.2g/L活性炭、0.1~0.8mg/L激动素KT、0.3~1.5mg/L赤霉素GA3、0.1~0.5mg/L吲哚乙酸IAA;
S5、再生植株诱导:将上述步骤S4获得的诱导后的体细胞胚接种于培养基D上培养30~50天,获得再生植株;
S6、倍性鉴定:取上述步骤S5中获得的再生植株的叶片,采用流式细胞仪进行倍性鉴定。
进一步的,所述步骤S2的培养基A包含以下含量组分:MS培养基、50mL/L椰子水、70g/蔗糖、2.2g/L植物凝胶、1mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、1mg/L萘乙酸、0.8mg/L激动素KT、3ug/ml积雪草甙。
进一步的,所述步骤S3的脉冲光为100纳米超窄带的脉冲光。
进一步的,所述步骤S3的培养箱的条件为:培养的24h内,保持氧浓度为5%,培养的第2~20天,保持氧浓度为15%,培养至第21~50天,保持与室内氧浓度相同。
进一步的,所述步骤S3的培养基B包含以下含量组分:MS培养基、50mL/L椰子水、2.2g/L植物凝胶、70g/L蔗糖、2.2g/L活性炭、3mg/L激动素KT、1mg/L细胞分裂素6-BA、1mg/L赤霉素GA3、1.5mg/L脱落酸ABA、0.4ug/ml泊洛沙姆407。
进一步的,所述步骤S4的液体培养基包含以下含量组分:5mg/mL的秋水仙碱、MS培养基、50mL/L椰子水、60g/L蔗糖、1.0g/L植物凝胶、1.0g/L活性炭、0.5mg/L激动素KT、1mg/L赤霉素GA3、0.2mg/L吲哚乙酸IAA。
进一步的,所述步骤S2和S3在温度为20~30℃的黑暗条件下进行。
进一步的,所述步骤S3和S4在温度为20~30℃,光照时间10~15h/d,光照强度为1200~2500lx的光照条件下进行。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
利用本发明的培养方法,有效的在橡胶树花药离体培养获得体细胞胚的基础上,科学配置培养基,合理调节培养条件,能快速、高效的获得具有优良性状的橡胶树多倍体;首先,选择橡胶树雄花花药为培养部位,具有良好的培养效果;其次,诱导培养采用MS培养基转接采用液体培养基,使得后期多倍体诱导时增大接触面积,使得营养成分分布更加均匀,容易获得多倍体,获得良好的培养效果,而固体培养基以为MS培养基为基础,加入各个营养元素和生长调节剂,而各个原料科学配比,协同发挥作用,使具有很强的细胞分裂素活性,加入积雪草甙促进多肽类物质的体外磷酸化,促进胚性愈伤组织体细胞胚分化,促进组织的萌发和生长;
在体细胞培养过程中,控制培养箱的培养条件,加入泊洛沙姆407与各个营养元素结合,能参与胚性细胞形成过程,配合脉冲光光源,利于促进体细胞胚诱导所需的首要内源激素生长素和细胞分裂素、可溶性蛋白等的合成,能显著快速提高各培养基的吸收,促进组织生长,保证细胞的正常生长和分裂,提高体胚诱导成功率。
附图说明
图1为流式细胞术检测倍性
图2为二倍体染色体计数
图3为四倍体染色体计数
图4为体胚植株移栽实验图
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容,下面提供具体实施例,对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1
一种植物多倍体的诱导方法:包括以下步骤:
S1、外植体花药的采集:在橡胶树的花序抽出和生长期中,选择晴天的早上喷洒硫磺粉或喷施三唑酮烟雾剂防治白粉病,在雄花采集前根据需要可多次喷施,当雄花处于黄绿状态时,取雄花用镊子夹碎,使用核酸染料染色,在显微镜观察雄花的发育时期;
S2、愈伤组织诱导:以花粉粒单核居中期到靠边期的花药为外植体,接种于培养基A上,在20℃的黑暗条件下培养30天,获得愈伤组织,所述培养基A包含以下含量组分:MS培养基、40mL/L椰子水、50g/蔗糖、1g/L植物凝胶、0.3mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、0.5mg/L萘乙酸、0.3mg/L激动素KT、1ug/ml积雪草甙;
S3、体细胞胚诱导:将上述步骤S2中获得的愈伤组织接种于培养基B上,经脉冲光光源照射10s后置于培养箱中,在20℃的黑暗条件下培养30天,获得体细胞胚;
所述培养箱的条件为:培养的24h内,保持氧浓度为3%,培养的第2天,保持氧浓度为10%,培养至第21天,保持与室内氧浓度相同;
所述培养基B包含以下含量组分:MS培养基、30mL/L椰子水、1g/L植物凝胶、50g/L蔗糖、1.0g/L活性炭、2mg/L激动素KT、0.5mg/L细胞分裂素6-BA、0.3mg/L赤霉素GA3、1mg/L脱落酸ABA、0.2ug/ml泊洛沙姆407;
S4、多倍体诱导:将上述步骤S3获得的体细胞胚在液体培养基中浸渍40h,在温度20℃,光照时间10h/d,光照强度为1200lx的光照条件下培养10天,获得多倍体诱导后的体细胞胚,所述液体培养基包含以下含量组分:2mg/mL的秋水仙碱、MS培养基、30mL/L椰子水、50g/L蔗糖、0.5g/L植物凝胶、0.3g/L活性炭、0.1mg/L激动素KT、0.3mg/L赤霉素GA3、0.1mg/L吲哚乙酸IAA;
S5、再生植株诱导:将上述步骤S4获得的诱导后的体细胞胚接种于培养基D上,在温度20℃,光照时间10h/d,光照强度为1200lx的光照条件下培养30天,获得再生植株;
S6、倍性鉴定:取上述步骤S5中获得的再生植株的叶片,采用流式细胞仪进行倍性鉴定。
实施例2
一种植物多倍体的诱导方法:包括以下步骤:
S1、外植体花药的采集:在橡胶树的花序抽出和生长期中,选择晴天的早上喷洒硫磺粉或喷施三唑酮烟雾剂防治白粉病,在雄花采集前根据需要可多次喷施,当雄花处于黄绿状态时,取雄花用镊子夹碎,使用核酸染料染色,在显微镜观察雄花的发育时期;
S2、愈伤组织诱导:以花粉粒单核居中期到靠边期的花药为外植体,接种于培养基A上,在30℃的黑暗条件下培养40天,获得愈伤组织,所述培养基A包含以下含量组分:MS培养基、60mL/L椰子水、90g/蔗糖、3.2g/L植物凝胶、1.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、1.8mg/L萘乙酸、1.5mg/L激动素KT、5ug/ml积雪草甙;
S3、体细胞胚诱导:将上述步骤S2中获得的愈伤组织接种于培养基B上,经脉冲光光源照射10~30s后置于培养箱中,在30℃的黑暗条件下培养50天,获得体细胞胚;
所述培养箱的条件为:培养的24h内,保持氧浓度为3~8%,培养的第20天,保持氧浓度为20%,培养至第50天,保持与室内氧浓度相同;
所述培养基B包含以下含量组分:MS培养基、70mL/L椰子水、3.2g/L植物凝胶、90g/L蔗糖、3.5g/L活性炭、4mg/L激动素KT、2mg/L细胞分裂素6-BA、1.3mg/L赤霉素GA3、2mg/L脱落酸ABA、0.5ug/ml泊洛沙姆407;
S4、多倍体诱导:将上述步骤S3获得的体细胞胚在液体培养基中浸渍60h,在温度30℃,光照时间15h/d,光照强度为2500lx的光照条件下培养15天,获得多倍体诱导后的体细胞胚,所述液体培养基包含以下含量组分:10mg/mL的秋水仙碱、MS培养基、70mL/L椰子水、70g/L蔗糖、1.5g/L植物凝胶、1.2g/L活性炭、0.8mg/L激动素KT、1.5mg/L赤霉素GA3、0.5mg/L吲哚乙酸IAA;
S5、再生植株诱导:将上述步骤S4获得的诱导后的体细胞胚接种于培养基D上,在温度30℃,光照时间15h/d,光照强度为2500lx的光照条件下培养50天,获得再生植株;
S6、倍性鉴定:取上述步骤S5中获得的再生植株的叶片,采用流式细胞仪进行倍性鉴定。
实施例3
一种植物多倍体的诱导方法:包括以下步骤:
S1、外植体花药的采集:在橡胶树的花序抽出和生长期中,选择晴天的早上喷洒硫磺粉或喷施三唑酮烟雾剂防治白粉病,在雄花采集前根据需要可多次喷施,当雄花处于黄绿状态时,取雄花用镊子夹碎,使用核酸染料染色,在显微镜观察雄花的发育时期;
S2、愈伤组织诱导:以花粉粒单核居中期到靠边期的花药为外植体,接种于培养基A上,在25℃的黑暗条件下培养35天,获得愈伤组织,所述培养基A包含以下含量组分:MS培养基、50mL/L椰子水、70g/蔗糖、2.2g/L植物凝胶、1mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、1mg/L萘乙酸、0.8mg/L激动素KT、3ug/ml积雪草甙;
S3、体细胞胚诱导:将上述步骤S2中获得的愈伤组织接种于培养基B上,经脉冲光光源照射10~30s后置于培养箱中,在20~30℃的黑暗条件下培养30~50天,获得体细胞胚;
所述培养箱的条件为:培养的24h内,保持氧浓度为5%,培养的第2天,保持氧浓度为15%,培养至第21天,保持与室内氧浓度相同;
所述培养基B包含以下含量组分:MS培养基、50mL/L椰子水、2.2g/L植物凝胶、70g/L蔗糖、2.2g/L活性炭、3mg/L激动素KT、1mg/L细胞分裂素6-BA、1mg/L赤霉素GA3、1.5mg/L脱落酸ABA、0.4ug/ml泊洛沙姆407;
S4、多倍体诱导:将上述步骤S3获得的体细胞胚在液体培养基中浸渍40~60h,在温度25℃,光照时间13h/d,光照强度为2000lx的光照条件下培养12天,获得多倍体诱导后的体细胞胚,液体培养基包含以下含量组分:5mg/mL的秋水仙碱、MS培养基、50mL/L椰子水、60g/L蔗糖、1.0g/L植物凝胶、1.0g/L活性炭、0.5mg/L激动素KT、1mg/L赤霉素GA3、0.2mg/L吲哚乙酸IAA;
S5、再生植株诱导:将上述步骤S4获得的诱导后的体细胞胚接种于培养基D上,在温度20~30℃,光照时间10~15h/d,光照强度为1200~2500lx的光照条件下培养30~50天,获得再生植株;
S6、倍性鉴定:取上述步骤S5中获得的再生植株的叶片,采用流式细胞仪进行倍性鉴定。
实施例4
一种植物多倍体的诱导方法:包括以下步骤:
S1、外植体花药的采集:在橡胶树的花序抽出和生长期中,选择晴天的早上喷洒硫磺粉或喷施三唑酮烟雾剂防治白粉病,在雄花采集前根据需要可多次喷施,当雄花处于黄绿状态时,取雄花用镊子夹碎,使用核酸染料染色,在显微镜观察雄花的发育时期;
S2、愈伤组织诱导:以花粉粒单核居中期到靠边期的花药为外植体,接种于培养基A上,在20℃的黑暗条件下培养30天,获得愈伤组织,所述培养基A包含以下含量组分:MS培养基、50mL/L椰子水、70g/蔗糖、2.2g/L植物凝胶、1mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、1mg/L萘乙酸、0.8mg/L激动素KT、3ug/ml积雪草甙;
S3、体细胞胚诱导:将上述步骤S2中获得的愈伤组织接种于培养基B上,经脉冲光光源照射10s后置于培养箱中,在20℃的黑暗条件下培养30天,获得体细胞胚;
所述培养箱的条件为:培养的24h内,保持氧浓度为3%,培养的第2天,保持氧浓度为10%,培养至第21天,保持与室内氧浓度相同;
所述培养基B包含以下含量组分:MS培养基、50mL/L椰子水、2.2g/L植物凝胶、70g/L蔗糖、2.2g/L活性炭、3mg/L激动素KT、1mg/L细胞分裂素6-BA、1mg/L赤霉素GA3、1.5mg/L脱落酸ABA、0.4ug/ml泊洛沙姆407;
S4、多倍体诱导:将上述步骤S3获得的体细胞胚在液体培养基中浸渍40h,在温度20℃,光照时间10h/d,光照强度为1200lx的光照条件下培养10天,获得多倍体诱导后的体细胞胚,液体培养基包含以下含量组分:5mg/mL的秋水仙碱、MS培养基、50mL/L椰子水、60g/L蔗糖、1.0g/L植物凝胶、1.0g/L活性炭、0.5mg/L激动素KT、1mg/L赤霉素GA3、0.2mg/L吲哚乙酸IAA;
S5、再生植株诱导:将上述步骤S4获得的诱导后的体细胞胚接种于培养基D上,在温度20℃,光照时间10h/d,光照强度为1200lx的光照条件下培养30天,获得再生植株;
S6、倍性鉴定:取上述步骤S5中获得的再生植株的叶片,采用流式细胞仪进行倍性鉴定。
实施例5
一种植物多倍体的诱导方法:包括以下步骤:
S1、外植体花药的采集:在橡胶树的花序抽出和生长期中,选择晴天的早上喷洒硫磺粉或喷施三唑酮烟雾剂防治白粉病,在雄花采集前根据需要可多次喷施,当雄花处于黄绿状态时,取雄花用镊子夹碎,使用核酸染料染色,在显微镜观察雄花的发育时期;
S2、愈伤组织诱导:以花粉粒单核居中期到靠边期的花药为外植体,接种于培养基A上,在30℃的黑暗条件下培养40天,获得愈伤组织,所述培养基A包含以下含量组分:MS培养基、50mL/L椰子水、70g/蔗糖、2.2g/L植物凝胶、1mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、1mg/L萘乙酸、0.8mg/L激动素KT、3ug/ml积雪草甙;
S3、体细胞胚诱导:将上述步骤S2中获得的愈伤组织接种于培养基B上,经脉冲光光源照射10~30s后置于培养箱中,在30℃的黑暗条件下培养50天,获得体细胞胚;
所述培养箱的条件为:培养的24h内,保持氧浓度为3~8%,培养的第2天,保持氧浓度为20%,培养至第50天,保持与室内氧浓度相同;
所述培养基B包含以下含量组分:MS培养基、50mL/L椰子水、2.2g/L植物凝胶、70g/L蔗糖、2.2g/L活性炭、3mg/L激动素KT、1mg/L细胞分裂素6-BA、1mg/L赤霉素GA3、1.5mg/L脱落酸ABA、0.4ug/ml泊洛沙姆407;
S4、多倍体诱导:将上述步骤S3获得的体细胞胚在液体培养基中浸渍60h,在温度30℃,光照时间15h/d,光照强度为2500lx的光照条件下培养15天,获得多倍体诱导后的体细胞胚,液体培养基包含以下含量组分:5mg/mL的秋水仙碱、MS培养基、50mL/L椰子水、60g/L蔗糖、1.0g/L植物凝胶、1.0g/L活性炭、0.5mg/L激动素KT、1mg/L赤霉素GA3、0.2mg/L吲哚乙酸IAA;
S5、再生植株诱导:将上述步骤S4获得的诱导后的体细胞胚接种于培养基D上,在温度30℃,光照时间15h/d,光照强度为2500lx的光照条件下培养50天,获得再生植株;
S6、倍性鉴定:取上述步骤S5中获得的再生植株的叶片,采用流式细胞仪进行倍性鉴定。
对比例1
本对比例与实施例3的区别在于,所述S2步骤中,培养基A中不含有积雪草甙。
对比例2
本对比例与实施例3的区别在于,所述S3步骤中的培养基B不含有泊洛沙姆407。
对比例3
本对比例与实施例3的区别在于,所述S3步骤中未进行脉冲光光源照射。
一、倍性鉴定
将实施例1~5和对比例1~3获得的再生植株的叶片,采用流式细胞仪进行倍性鉴定,鉴定结果如下:
由上述数据表明,出苗率达到50%,四倍体得率26.66%,综合四倍体得率13.33%,利用本发明的培养方法,有效的在橡胶树花药离体培养获得体细胞胚的基础上,科学配置培养基,合理调节培养条件,能快速、高效的获得具有优良性状的橡胶树多倍体。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种植物多倍体的诱导方法,其特征在于:包括以下步骤:
S1、外植体花药的采集:在橡胶树的花序抽出和生长期中,雄花处于黄绿状态时,取雄花用镊子夹碎,使用核酸染料染色,在显微镜观察雄花的发育时期;
S2、愈伤组织诱导:以花粉粒单核居中期到靠边期的花药为外植体,接种于培养基A上培养30~40天,获得愈伤组织,所述培养基A包含以下含量组分:MS培养基、40~60mL/L椰子水、50~90g/蔗糖、1~3.2g/L植物凝胶、0.3~1.5mg/L2,4-二氯苯氧乙酸、0.5~1.8mg/L萘乙酸、0.3~1.5mg/L激动素KT、1~5ug/ml积雪草甙;
S3、体细胞胚诱导:将上述步骤S2中获得的愈伤组织接种于培养基B上,经脉冲光光源照射10~30s后置于培养箱中培养30~50天,获得体细胞胚;
所述培养箱的条件为:培养的24h内,保持氧浓度为3~8%,培养的第2~20天,保持氧浓度为10~20%,培养至第21~50天,保持与室内氧浓度相同;
所述培养基B包含以下含量组分:MS培养基、30~70mL/L椰子水、1~3.2g/L植物凝胶、50~90g/L蔗糖、1.0~3.5g/L活性炭、2~4mg/L激动素KT、0.5~2mg/L细胞分裂素6-BA、0.3~1.3mg/L赤霉素GA3、1~2mg/L脱落酸ABA、0.2~0.5ug/ml泊洛沙姆407;
S4、多倍体诱导:将上述步骤S3获得体细胞胚在液体培养基中浸渍48h,获得多倍体诱导后的体细胞胚;所述液体培养基包含以下含量组分:2~10mg/mL的秋水仙碱、MS培养基、30~70mL/L椰子水、50~70g/L蔗糖、0.5~1.5g/L植物凝胶、0.3~1.2g/L活性炭、0.1~0.8mg/L激动素KT、0.3~1.5mg/L赤霉素GA3、0.1~0.5mg/L吲哚乙酸IAA;
S5、再生植株诱导:将上述步骤S4获得的诱导后的体细胞胚接种于培养基D上培养30~50天,获得再生植株;
S6、倍性鉴定:取上述步骤S5中获得的再生植株的叶片,采用流式细胞仪进行倍性鉴定。
2.如权利要求1所述的一种植物多倍体的诱导方法,其特征在于:所述步骤S2的培养基A包含以下含量组分:MS培养基、50mL/L椰子水、70g/蔗糖、2.2g/L植物凝胶、1mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、1mg/L萘乙酸、0.8mg/L激动素KT、3ug/ml积雪草甙。
3.如权利要求1所述的一种植物多倍体的诱导方法,其特征在于:所述步骤S3的脉冲光为100纳米超窄带的脉冲光。
4.如权利要求1所述的一种植物多倍体的诱导方法,其特征在于:所述步骤S3的培养箱的条件为:培养的24h内,保持氧浓度为5%,培养的第2~20天,保持氧浓度为15%,培养至第21~50天,保持与室内氧浓度相同。
5.如权利要求1所述的一种植物多倍体的诱导方法,其特征在于:所述步骤S3的培养基B包含以下含量组分:MS培养基、50mL/L椰子水、2.2g/L植物凝胶、70g/L蔗糖、2.2g/L活性炭、3mg/L激动素KT、1mg/L细胞分裂素6-BA、1mg/L赤霉素GA3、1.5mg/L脱落酸ABA、0.4ug/ml泊洛沙姆407。
6.如权利要求1所述的一种植物多倍体的诱导方法,其特征在于:所述步骤S4液体培养基包含以下含量组分:5mg/mL的秋水仙碱、MS培养基、50mL/L椰子水、60g/L蔗糖、1.0g/L植物凝胶、1.0g/L活性炭、0.5mg/L激动素KT、1mg/L赤霉素GA3、0.2mg/L吲哚乙酸IAA。
7.如权利要求1所述的一种植物多倍体的诱导方法,其特征在于:所述步骤S2和S3在温度为20~30℃的黑暗条件下进行。
8.如权利要求1所述的一种植物多倍体的诱导方法,其特征在于:所述步骤S3和S4在温度为20~30℃,光照时间10~15h/d,光照强度为1200~2500lx的光照条件下进行。
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