CN115777534B - 一种基于体细胞胚发生的高效诱导凤梨多倍体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于体细胞胚发生的高效诱导凤梨多倍体的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、胚性愈伤组织诱导：将凤梨外植体接种于培养基A中并继代，将继代愈伤组织接种于培养基B中进行胚性愈伤组织诱导；S2、多倍体诱导：使用秋水仙素对胚性愈伤组织进行处理，期间对胚性愈伤组织进行机械处理(划伤口和震荡培养)，然后转入培养基C中继续培养以获得再生植株；S3、多倍体初步鉴定：观察比较经秋水仙素诱导的再生植株与对照二倍体再生植株的形态学特征，初步筛选出发生变异植株；S4、流式细胞仪倍性分析：取变异植株的叶片，使用流式细胞仪进行倍性鉴定。本发明可以提高凤梨多倍体植株诱导效率，优化诱导流程，减少诱导成本。
Description
技术领域
本发明属于植物多倍体育种技术领域，尤其涉及一种基于体细胞胚发生的高效诱导凤梨多倍体的方法。
背景技术
凤梨(Ananas comosus L.)为凤梨科凤梨属植物，虽然在我国的种植已久，但国内培育的凤梨新品种并不多，主要是引进品种，我国凤梨种质资源相对缺乏，育种工作发展较慢，急需一套优良的育种方法。而多倍体诱导是一种非常重要的方法，多倍体植物一般具有抗性好、果实大、营养物质含量高等优点，能有效提高凤梨经济价值，因此多倍体诱导对凤梨育种非常重要。其中在小麦、棉花、香蕉等植物中多倍体诱导技术已经比较成熟，而凤梨多倍体研究还较滞后。
凤梨自交不亲和，很难获得种子，无法通过种子进行多倍体诱导；且凤梨芽大，用于多倍体诱导工作量大且效率低；而凤梨组织培养技术已较成熟，利用组织培养技术诱导多倍体会有较好效果，但是普通的愈伤组织诱导效率低且植株多为嵌合体。有研究([1]龚明霞.观赏凤梨组织培养和多倍体资源的创建[D].华南农业大学.)使用凤梨的愈伤组织进行多倍体诱导，其直接将愈伤组织浸泡于秋水仙素中，秋水仙素很难浸入愈伤组织，很难诱导获得多倍体植株。
体细胞胚发生是体细胞获得胚性能力、形成完整植株的离体再生方式，在很大程度上体现了细胞的全能性，短时期内可获得大量再生植株，稳定性好。因此，提出一种基于体细胞胚发生的高效诱导凤梨多倍体的方法，将为凤梨多倍体育种奠定理论及实践基础。
发明内容
基于此，本发明提供了一种基于体细胞胚发生的高效诱导凤梨多倍体的方法，利用较低浓度的秋水仙素对凤梨的体细胞胚进行多倍体诱导，获得了凤梨的多倍体植株。
一种基于体细胞胚发生的高效诱导凤梨多倍体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、胚性愈伤组织诱导：采集凤梨的吸芽作为外植体，清洗后切割，接种于培养基A中使其长出愈伤组织，在愈伤组织的表面均匀地划伤口，继代数次后，将愈伤组织切成黄豆大小，并在其表面再次均匀地划伤口，然后将处理后的愈伤组织接种于培养基B中进行胚性愈伤组织诱导；
S2、多倍体诱导：使用秋水仙素对胚性愈伤组织进行处理，将处理后的胚性愈伤组织转入培养基C中继续培养，使愈伤组织进行分化以获得再生植株。
S3、多倍体初步鉴定：待再生植株生长到3-5cm，以凤梨二倍体植株为对照，观察比较经秋水仙素诱导的再生植株与对照二倍体再生植株的形态学特征，初步筛选出发生变异植株；
S4、流式细胞仪倍性分析：取变异植株的叶片，使用流式细胞仪进行倍性鉴定，从而筛选出凤梨多倍体植株。
相比于现有技术，本发明以划伤口的方式对愈伤组织进行机械处理，并进行愈伤组织体细胞胚诱导，进而基于体细胞胚发生进行多倍体诱导。本发明具有遗传稳定性高，繁殖效率高的有点，可有效解决传统诱导方法效率相对较低，较多嵌合体，较少纯合多倍体的缺点，为凤梨多倍体育种奠定理论及实践基础。
进一步的，培养基A包含如下组分：MS培养基、30g/L蔗糖、7.0g/L琼脂、2.0mg/L 6-BA和2.5mg/L NAA。培养基A用于愈伤组织诱导。
进一步的，培养基B包含如下组分：MS培养基、30g/L蔗糖、7.0g/L琼脂、0.5mg/L 6-BA和5mg/L 2,4-D。培养基B用于体细胞胚诱导。
进一步的，培养基C包含如下组分：MS培养基、30g/L蔗糖、7.0g/L琼脂、2.0mg/L 6-BA和1.0mg/L NAA。培养基C用于诱导愈伤组织分化。
进一步的，步骤S1中胚性愈伤组织诱导的诱导条件如下：光照强度为2000Lx，光照处理16h，黑暗处理8h，培养温度为24±2℃，培养15d。
进一步的，步骤S2中秋水仙素对胚性愈伤组织的处理方法为浸泡法，所述浸泡法步骤如下：在胚性愈伤组织的表面均匀地划伤口，随后在黑暗条件下置于秋水仙素溶液中浸泡24～72h，浸泡过程中在恒温摇床上以50次/min进行震荡。所述秋水仙素溶液的浓度为0.01％～0.10％。
本发明通过以划伤口、震荡等方式对愈伤组织进行机械处理，使秋水仙素充分地进入愈伤组织，从而提高了凤梨多倍体植株诱导的成功率。
进一步的，步骤S2中秋水仙素对胚性愈伤组织的处理方法为混培法，所述混培法步骤如下：在胚性愈伤组织的表面均匀地划伤口，随后接种到添加有秋水仙素的培养基B中培养10～30d。所述培养基B中的秋水仙素浓度为0.01％～0.10％。
进一步的，步骤S4中使用流式细胞仪进行倍性鉴定的具体步骤为：称取变异植株叶片0.5g置于0.5mL的Partec HR-A溶液中切碎，放置2-5min后，用30μm的PartecCelltricsTM微孔膜进行过滤，再向滤液中加入2mL的Partec HR-B溶液，用Partec倍性分析仪测定样品上样，从而测定变异植株和对照植株的DNA含量，获取DNA含量分布曲线。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)体细胞胚发生是体细胞获得胚性能力、形成完整植株的离体再生方式，胚性愈伤组织在很大程度上体现了细胞的全能性，本发明采用凤梨的胚性愈伤组织进行多倍体诱导有利于短时期内获得大量再生植株，稳定性好；
(2)传统的凤梨多倍体诱导方法将凤梨再生植株作为诱导材料，需要将愈伤组织培育成再生植株再进行诱导，如果诱导失败，则浪费培育的人力物力，效率较低，本发明直接采用凤梨胚性愈伤组织进行诱导，减少了诱导失败的成本，优化了培育流程，提高了诱导效率；
(3)本发明通过采用在外植体和愈伤组织表面划伤口和震荡培养的机械处理，刺激外植体和愈伤组织生长，并能使培养基中的培养成分更充分地被外植体和愈伤组织吸收，从而提高了凤梨多倍体植株的诱导率。
附图说明
图1为本发明凤梨多倍体诱导及鉴定方法流程图；
图2是本发明一实施例的愈伤组织生长状况图；
图3是本发明一实施例的胚性愈伤组织生长状况图；
图4是本发明一实施例的四倍体凤梨再生植株；
图5是本发明对比例的二倍体凤梨再生植株；
图6是本发明一实施例的凤梨再生植株的流式细胞仪倍性分析图；
图7是本发明对比例的凤梨再生植株的流式细胞仪倍性分析图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与术语本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在限制本发明。
本发明中，涉及到数值区间，如无特别说明，上述数值区间内视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本发明中涉及的百分比含量，如无特别说明，对于固液混合和固相-固相混合均指质量百分比，对于液相-液相混合指体积百分比。本发明中涉及的百分比浓度，如无特别说明，均指终浓度。所述终浓度，指添加成分在添加该成分后的体系中的占比。本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。
实施例1：
一种基于体细胞胚发生的高效诱导凤梨多倍体的方法，包括以下步骤：
(1)胚性愈伤组织诱导
采集凤梨茎基粗0.5cm以上、发育正常的吸芽作为外植体，清洗后切割，接种于培养基A中使其长出愈伤组织，在获得的愈伤组织的表面均匀地划伤口，继代数次获得足够的愈伤组织后，将愈伤组织切成黄豆大小，并在其表面均匀地划伤口，然后接种于培养基B中进行胚性愈伤组织诱导，胚性愈伤组织诱导的光照强度为2000Lx、光照处理16h、黑暗处理8h、培养温度为24±2℃，培养15天，每瓶接种5块愈伤组织，共10瓶，重复3次；
培养基A的成分为MS培养基、2.0mg/L 6-BA、2.5mg/L NAA、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂；
培养基B的成分为MS培养基、30g/L蔗糖、7.0g/L琼脂、0.5mg/L 6-BA和5mg/L 2,4-D。
(2)秋水仙素配制
称取1g秋水仙素晶体先用乙醇溶解，后加入无菌水定容至20mL，配制成浓度为5％的母液过滤灭菌后置于离心管中；再将5％的秋水仙素分别配制成浓度为0.01％、0.05％、0.1％的溶液待用。
(3)多倍体诱导
在步骤(1)中诱导获得的胚性愈伤组织的表面上均匀地划伤口，然后置于浓度为0.01％的秋水仙素溶液中，在黑暗条件下浸泡24h，浸泡过程中在恒温摇床上以50/次/min进行震荡培养，使秋水仙素溶液更好地渗透进凤梨胚性愈伤组织中。将浸泡后的胚性愈伤组织转入培养基C中继续培养，使愈伤组织进行分化以获得再生植株，处理过程中观察并记录植株生长状况、成活率和变异率情况；
培养基C的成分为：MS培养基、30g/L蔗糖、7.0g/L琼脂、2.0mg/L 6-BA和1.0mg/LNAA。
死亡率(％)＝(死亡的胚性愈伤组织块数/接种的胚性愈伤组织块数)×100
诱导率(％)＝(多倍体植株数/接种的胚性愈伤组织块数)×100
(4)多倍体初步鉴定(形态学观察)：待再生植株生长到3-5cm，以凤梨二倍体植株为对照，观察比较经秋水仙素诱导的再生植株与对照二倍体再生植株的形态学特征，包括再生植株的生长情况、叶片颜色、叶片长度、叶片宽度、叶片厚度和植株形态等，初步筛选出发生形态变异的植株。
(5)流式细胞仪倍性分析：取变异植株的叶片，使用流式细胞仪进行倍性鉴定，从而筛选出凤梨多倍体植株。
实施例2：
一种基于体细胞胚发生的高效诱导凤梨多倍体的方法，包括以下步骤：
(1)胚性愈伤组织诱导
采集凤梨茎基粗0.5cm以上、发育正常的吸芽作为外植体，清洗后切割，接种于培养基A中使其长出愈伤组织，在获得的愈伤组织的表面均匀地划伤口，继代数次获得足够的愈伤组织后，将愈伤组织切成黄豆大小，并在其表面均匀地划伤口，然后接种于培养基B中进行胚性愈伤组织诱导，胚性愈伤组织诱导的光照强度为2000Lx、光照处理16h、黑暗处理8h、培养温度为24±2℃，培养15天，每瓶接种5块愈伤组织，共10瓶，重复3次；
培养基A的成分为MS培养基、2.0mg/L 6-BA、2.5mg/L NAA、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂；
培养基B的成分为MS培养基、30g/L蔗糖、7.0g/L琼脂、0.5mg/L 6-BA和5mg/L 2,4-D。
(2)秋水仙素配制
称取1g秋水仙素晶体先用乙醇溶解，后加入无菌水定容至20mL，配制成浓度为5％的母液过滤灭菌后置于离心管中；再将5％的秋水仙素分别配制成浓度为0.01％、0.05％、0.1％的溶液待用。
(3)多倍体诱导
在步骤(1)中诱导获得的胚性愈伤组织的表面上均匀地划伤口，然后接种于含有浓度为0.01％的秋水仙素的培养基B中，培养10d后，再转入培养基C中继续培养，使愈伤组织进行分化以获得再生植株，处理过程中观察并记录植株生长状况、成活率和变异率情况；
培养基C的成分为：MS培养基、30g/L蔗糖、7.0g/L琼脂、2.0mg/L 6-BA和1.0mg/LNAA。
死亡率(％)＝(死亡的胚性愈伤组织块数/接种的胚性愈伤组织块数)×100
诱导率(％)＝(多倍体植株数/接种的胚性愈伤组织块数)×100
(4)多倍体初步鉴定(形态学观察)：待再生植株生长到3-5cm，以凤梨二倍体植株为对照，观察比较经秋水仙素诱导的再生植株与对照二倍体再生植株的形态学特征，包括再生植株的生长情况、叶片颜色、叶片长度、叶片宽度、叶片厚度和植株形态等，初步筛选出发生形态变异的植株。
(5)流式细胞仪倍性分析：取变异植株的叶片，使用流式细胞仪进行倍性鉴定，从而筛选出凤梨多倍体植株。
实施例3～10：
一种基于体细胞胚发生的高效诱导凤梨多倍体的方法，实施例3～10与实施例1的区别在于使用的秋水仙素溶液浓度不同，以及浸泡处理的时间不同，具体区别见表1。
实施例11～18：
一种基于体细胞胚发生的高效诱导凤梨多倍体的方法，实施例11～18与实施例2的区别在于使用的秋水仙素溶液浓度不同，以及混培培养的时间不同，具体区别见表1。
对比例1：
对比例1与实施例1的区别在于，将实施例1中步骤(3)替换为：在步骤(1)中诱导获得的胚性愈伤组织的表面上均匀地划伤口，不需进行机械震荡培养，然后置于不含秋水仙素的培养基B中培养20d，再转入培养基C中继续培养，使愈伤组织进行分化以获得再生植株；
对比例1与实施例2的区别在于，将实施例2中步骤(3)替换为：在步骤(1)中诱导获得的胚性愈伤组织的表面上均匀地划伤口，然后置于不含秋水仙素的培养基B中培养20d，再转入培养基C中继续培养，使愈伤组织进行分化以获得再生植株；
培养基C的成分为：MS培养基、30g/L蔗糖、7.0g/L琼脂、2.0mg/L 6-BA和1.0mg/LNAA；
其他步骤与培养条件同实施例1。
对比例2：
对比例2与实施例1的区别在于，将实施例1中步骤(3)替换为：不在步骤(1)中诱导获得的胚性愈伤组织的表面划伤口，直接置于0.01％秋水仙素浸泡24h，不进行机械震荡培养，再转入培养基C中继续培养，使愈伤组织进行分化以获得再生植株；
培养基C的成分为：MS培养基、30g/L蔗糖、7.0g/L琼脂、2.0mg/L 6-BA和1.0mg/LNAA；
其他步骤与培养条件同实施例1。
对比例3：
对比例3与实施例2的区别在于，将实施例2中步骤(3)替换为：不在步骤(1)中诱导获得的胚性愈伤组织的表面划伤口，直接置于含0.01％秋水仙素的培养基B中培养10d，再转入培养基C中继续培养，使愈伤组织进行分化以获得再生植株；
培养基C的成分为：MS培养基、30g/L蔗糖、7.0g/L琼脂、2.0mg/L 6-BA和1.0mg/LNAA；
其他步骤与培养条件同实施例2。
对比例4：
对比例4与实施例1的区别在于，步骤(1)中的愈伤组织不进行胚性愈伤组织诱导，并将实施例1的步骤(3)替换为：步骤(1)获取的愈伤组织不划伤口，直接置于0.01％秋水仙素浸泡24h，不再进行震荡培养，再转入培养基C中继续培养，使愈伤组织进行分化以获得再生植株；
培养基C的成分为：MS培养基、30g/L蔗糖、7.0g/L琼脂、2.0mg/L 6-BA和1.0mg/LNAA；
其他步骤与培养条件同实施例1。
对比例5：
对比例5与实施例2的区别在于，步骤(1)中的愈伤组织不进行胚性愈伤组织诱导，并将实施例2的步骤(3)替换为：步骤(1)获取的愈伤组织不划伤口，直接置于含0.01％秋水仙素的培养基B中培养10d，再转入培养基C中继续培养，使愈伤组织进行分化以获得再生植株；
培养基C的成分为：MS培养基、30g/L蔗糖、7.0g/L琼脂、2.0mg/L 6-BA和1.0mg/LNAA；
其他步骤与培养条件同实施例2。
实验例1:
称取实施例1～18新鲜变异植株和对照植株叶片，每份0.5g，依次置于0.5mL的Partec HR-A溶液中切碎，放置2～5min后，用30μm的Partec CelltricsTM微孔膜进行过滤，再向滤液中加入2mL的Partec HR-B溶液，用Partec倍性分析仪测定样品上样。测定变异植株和对照植株的DNA含量，倍性分析仪自动测定DNA含量分布曲线。每个样品重复3次。经由多倍体初步鉴定和流式细胞仪倍性分析两次鉴定得出各实施例的多倍体诱导率和再生多倍体植株数，具体见表1。
表1.实施例1～18凤梨多倍体诱导及鉴定结果
由表1可知愈伤组织死亡率、多倍体植株数和诱导率的主要影响因素为秋水仙素的处理方法、浓度以及两种方法的处理时间和愈伤组织的机械处理(划伤口和震荡)。其中未做胚性愈伤组织诱导、划伤口或震荡培养的组织的多倍体诱导率均为0.00％，做了胚性愈伤组织诱导、划伤口和震荡培养的胚性愈伤组织的多倍体诱导率随秋水仙素的处理方法、浓度以及两种方法的处理时间的不同而不同。在混培法中凤梨胚性愈伤组织的死亡率(34.78％-95.65％)普遍高于浸泡法中愈伤组织的死亡率(26.09％-46％)；但是混培法中再生植株的最高诱导率(40.00％)高于浸泡法中再生植株的最高诱导率(18.00％)；混培法获得的多倍体植株也比浸泡法多，分别为58棵和46棵。在浸泡法中秋水仙素浓度为0.01％和0.05％时，诱导率随处理时间升高而升高；秋水仙素浓度为0.10％时，诱导率随时间增加而降低，最佳处理时间为24h(诱导率18.00％)；凤梨浸泡法最适处理条件为0.1％秋水仙素浸泡24h。在混培法中处理10d的诱导率均较低，其中秋水仙素浓度为0.01％和0.05％时诱导率为0；处理20d时诱导率均分别达到了同一秋水仙素浓度下的最高值，三个秋水仙素浓度(0.01％、0.05％、0.10％)下的诱导率分别为20.00％、24.00％、40.00％；秋水仙素浓度过低、处理时间过短和过长对死亡率和诱导率都会有影响，凤梨混培法最适处理条件为0.1％秋水仙素混培20d。综合比较浸泡法和混培法，混培法获得的变异植株明显比浸泡法多，因此混培法更适合凤梨多倍体诱导。
依据多倍体的倍性特征发掘凤梨四倍体，观察比较秋水仙素处理的再生植株和对照再生植株的叶长、叶宽、叶色、叶厚来进行变异植株的初步筛选。观察发现，如图4和图5所示，经过秋水仙素处理的再生植株叶片明显比对照再生植株叶片更宽、更厚、颜色更深；相较对照再生植株，经过秋水仙素处理的再生植株总体生长更矮、茎干更粗壮，可初步筛选出多倍体植株。
再根据倍性分析仪测定的DNA含量分布曲线可以看出已测的变异再生植株叶片细胞DAN含量增加。如图6和图7所示，可以看到对比例1的再生植株叶片和变异再生植株叶片DNA含量分布曲线图中有两个主峰；变异再生植株DNA含量分布曲线图最高的主峰的峰值约为100，对照植株DNA含量分布曲线图主峰的峰值约为50，变异植株的主峰约是对照植株主峰的2倍，由此可以说明变异植株为四倍体植株。
Claims (3)
1.一种基于体细胞胚发生的高效诱导凤梨多倍体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、胚性愈伤组织诱导：采集凤梨的吸芽作为外植体，清洗后切割，接种于培养基A中使其长出愈伤组织，并在愈伤组织的表面均匀地划伤口，继代数次后，将愈伤组织切成黄豆大小，并在其表面再次均匀地划伤口，然后将处理后的愈伤组织接种于培养基B中进行胚性愈伤组织诱导；所述培养基A的组分为：MS培养基、30g/L蔗糖、7.0g/L琼脂、2.0mg/L 6-BA和2.5mg/L NAA；所述培养基B的组分为：MS培养基、30g/L蔗糖、7.0g/L琼脂、0.5mg/L 6-BA和5mg/L 2,4-D；
S2、多倍体诱导：使用秋水仙素通过浸泡法或混培法对胚性愈伤组织进行处理，将处理后的胚性愈伤组织转入培养基C中继续培养，使愈伤组织进行分化以获得再生植株；所述秋水仙素溶液的浓度为0.01％～0.10％；所述培养基C的组分为：MS培养基、30g/L蔗糖、7.0g/L琼脂、2.0mg/L 6-BA和1.0mg/L NAA；浸泡法处理步骤为：在胚性愈伤组织的表面均匀地划伤口，随后在黑暗条件下置于秋水仙素溶液中浸泡24～72h，浸泡过程中在恒温摇床上以50次/min进行震荡；混培法处理步骤为在胚性愈伤组织的表面均匀地划伤口，随后接种到添加有浓度为0.01％～0.10％的秋水仙素的培养基B中培养20～30d；
S3、多倍体初步鉴定：待再生植株生长到3-5cm，以凤梨二倍体植株为对照，观察比较经秋水仙素诱导的再生植株与对照二倍体再生植株的形态学特征，初步筛选出发生变异植株；
S4、流式细胞仪倍性分析：取变异植株的叶片，使用流式细胞仪进行倍性鉴定，从而筛选出凤梨多倍体植株。
2.根据权利要求1所述的一种基于体细胞胚发生的高效诱导凤梨多倍体的方法，其特征在于，步骤S1中胚性愈伤组织诱导的诱导条件如下：光照强度为2000Lx，光照处理16h，黑暗处理8h，培养温度为24±2℃，培养15d。
3.根据权利要求1所述的一种基于体细胞胚发生的高效诱导凤梨多倍体的方法，其特征在于，步骤S4中使用流式细胞仪进行倍性鉴定的具体步骤为：称取变异植株叶片0.5g置于0.5mL的Partec HR-A溶液中切碎，放置2-5min后，用30μm的Partec CelltricsTM微孔膜进行过滤，再向滤液中加入2mL的Partec HR-B溶液，用Partec倍性分析仪测定样品上样，从而测定变异植株和对照植株的DNA含量，获取DNA含量分布曲线。
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