CN1133364C

CN1133364C - 非洲菊离体快速繁殖的方法

Info

Publication number: CN1133364C
Application number: CNB011298219A
Authority: CN
Inventors: 黄群声; 李玲; 张铭光
Original assignee: South China Normal University
Current assignee: South China Normal University
Priority date: 2001-10-29
Filing date: 2001-10-29
Publication date: 2004-01-07
Anticipated expiration: 2021-10-29
Also published as: CN1344489A

Abstract

非洲菊离体快速繁殖的方法，它在现有技术三步骤-外植体消毒、诱导不定芽发生和培养生根的基础上进行如下改进：在步骤(1)-外植体消毒中，在对花托进行表面消毒之前，先对花蕾进行低温处理；步骤(2)-诱导不定芽发生中的培养基采用苯基脲类细胞分裂素；步骤(3)-培养生根中先用生长素溶液浸泡试管苗基部，再用不含激素的固体培养基培养。该方法能明显提高非洲菊的无性繁殖系数，而且操作简便。

Description

非洲菊离体快速繁殖的方法

(一)技术领域

本发明涉及一种植物组织培养方法，具体地讲，是指一种采用组织培养技术对非洲菊离体培养进行快速繁殖的方法。

(二)背景技术

植物组织培养是指用植物的任何器官、组织或细胞，在人工控制条件下进行无菌培养生长发育的过程。该技术取材少，培养植物材料成本低，生长周期短，管理方便。利用植物组织培养这种快速繁殖技术，能在短时间内繁衍出大量保持母本生物特性和遗传性状的植株。据了解，我国快速繁殖的植物已有近千种。通常使用的基本培养基有数种，如MS、B5、White、N6等。在组织培养中，植物外植体要在植物生长物质的作用下，经过诱导脱分化、恢复细胞分裂的能力、影响再分化、促进器官形成等过程。植物外植体繁殖系数的大小，直接影响着生产后代植株的数量和质量。

非洲菊(Gerbera jamesonil，又名扶郎花)，属于菊科中的非洲菊属，目前世界上大约有80多种，是一种观赏价值较高、国内外热销的鲜切花及盆栽名优花卉，每年市场需求量上百万株。但非洲菊是异花传粉植物，种子后代寿命短、发芽率低且变异率高，不能保持原品种种性，同时分株繁殖系数低(每株仅分5～6株)，且容易退化和传播病害，所以常规的繁殖菊花方法难以进行大规模生产。有关非洲菊无性繁殖幼苗的组织培养方法在国内已有报道[如黄济明，倪跃元，林满红.非洲菊的快速繁殖.园艺学报，1987，14(1)：125；鲁雪华，林勇，郭文杰.非洲菊小花托的离体培养.亚热带植物通讯，1996，25(2)：21；刘群良，黄皑冰，李华养等.非洲菊组织培养快繁技术的研究.广东园艺，2001，2(1)：21等]，其方法一般包括如下步骤：(1)外植体消毒：以花托为外植体先后采用75％乙醇和0.1-0.2％升汞表面消毒各1分钟和10-20分钟(加入表面活性剂数滴)；(2)诱导不定芽发生：将已经过表面消毒的外植体切成0.3-1厘米长的方块，分别放在1/2的MS、B5或White固体培养基中25-40天以诱导不定芽发生，培养基中应加入0.1-10mg/L的苄基嘌呤类细胞分裂素和0.1-2mg/L的吲哚类或萘类生长素，其培养条件为：温度25±2℃，光照强度2000±50Lx，光照时间12-16小时/天；(3)培养生根：将高度为3-7厘米的不定芽分切成单株，在生根固体培养基(一般采用1/2MS基本培养基)上培养，培养基中应加入0.1-5mg/L的吲哚类或萘类生长素，培养条件同步骤(2)，25-50天可以诱导不定根产生。由于非洲菊品种多，各品种间由花托诱导出不定芽的能力差异很大，由花托直接诱导的出芽率极低，所以该方法同样不利于非洲菊的快速繁殖。

在调节控制植物材料离体培养过程中，其繁殖系数除与植物材料本身的特性以及营养、光照、温度等培养条件有关外，植物生长物质也起着重要的作用，其中影响最显著的是生长素类和细胞分裂素类物质。另有报道指出，在对木本植物的芽进行离体培养前，进行低温预处理一段时间有益于离体培养生长(黄学林，李筱菊编著.高等植物组织离体培养的形态建成及其调控，北京：科学出版社，1995，78)，但目前未有草本植物方面的相同报道。

(三)发明的内容

本发明的目的在于针对非洲菊已有组织培养方法的不足，提供一种快速繁殖的新方法，它能够明显提高非洲菊的无性繁殖系数，而且操作简便。

为了实现本发明的目的，本发明在现有组织培养方法包括外植体消毒、诱导不定芽发生和培养生根三个步骤的基础上进行如下改进：在步骤(1)——外植体消毒步骤中，在花托表面消毒之前，首先对花蕾进行低温处理，处理温度为9±2℃，处理时间为1-5天。

本发明的进一步改进是：在低温处理的基础上，步骤(2)——诱导不定芽发生步骤中，所用的培养基采用苯基脲类细胞分裂素替换苄基嘌呤类细胞分裂素，以提高诱导不定芽发生的能力。

本发明的更佳方案是：在上述两步改进的基础上，同时在步骤(3)——培养生根步骤中，改变生长素类物质处理试管苗的方法，以缩短试管苗不定根发生的时间，即：首先用吲哚类或萘类生长素溶液浸泡试管苗基部，然后再转入不含激素的1/2MS固体培养基上培养。

在本方法中，步骤(1)——外植体消毒步骤低温处理的优选时间为3天；步骤(2)——诱导不定芽发生步骤采用的培养基中，苯基脲类细胞分裂素可以采用2-氯-4-吡啶基-N-苯基脲(简称CPPU)、(4-吡喃)-1，1-嘌呤氨基-9-氢吡喃基-9H嘌呤-4-氢吡喃基(简称TDZ)等，最好是采用2-氯-4-吡啶基-N-苯基脲(简称CPPU)，其在基本培养基中的含量为：0.5-2mg/L，最好是1mg/L；步骤(3)——培养生根步骤中，吲哚类生长素可采用吲哚乙酸、吲哚丁酸等，萘类生长素采用萘乙酸。生长素类物质溶液含量为2mg/L-15mg/L，其优选范围为5-10mg/L，试管苗基部浸泡的时间为1天，在固体培养基中的继续培养时间为5-15天。

由于本发明采用低温预处理方法，促进了非洲菊的离体培养生长，又进一步采用苯基脲类细胞分裂素，提高了诱导不定芽发生的能力，还改变生长素类物质处理试管苗的方法以缩短试管苗不定根发生的时间、提高不定根质量，所以大大地提高了非洲菊的离体繁殖系数，有利于非洲菊的快速繁殖，达到了本发明的目的。

本发明具有如下的优点和效果：

1、经实验证明，与常规方法比较，在接种前对花蕾进行1～5天的9±2℃低温处理，切取花托培养30天，不定芽的诱导频率及每块外植体产生的芽数均比常规法高；步骤(2)中，采用苯基脲类细胞分裂素替换苄基嘌呤类细胞分裂素，使培养基中的浓度减低，不定芽诱导率提高；提高生根培养基中生长素类物质的浓度，采用浸泡法处理，不定根发生时间缩短，生根率增加，每株试管苗的生根数得到提高，而且长势良好，保证了试管苗不定根质量。

2、本发明方法与已有的常规方法相比，无需增加专用设备，操作简便。

(四)具体的实施方式

下面结合实施例对本发明进行进一步的说明：

实施例1：

取清心橙红品种非洲菊花托42个作为外植体，首先将花蕾置于9±2℃的环境中处理5天，然后按照常规法取出花托进行表面消毒和接种培养，其培养基为1/2MS，含有0.5mg/L吲哚乙酸和10mg/L 6-苄基腺嘌呤，培养30天时发现，已有18个外植体发芽，不定芽诱导率达41.9％，平均每个外植体发生3.3个芽。切割不定芽培养成苗，得到健康的幼苗，其不定根的生长状况较好。而采用常规方法培养(不经低温处理)的对照组，其不定芽的发生率仅为22.2％，其不定根发生少，生长慢，明显差于本发明方法。

实施例2：

其它操作及对照组同实施例1，清心橙红外植体为56个，低温处理花蕾的时间为3天，培养30天有24个外植体发芽，芽诱导率达42.9％，平均每个外植体有6个芽形成，经培养生根，其不定根的生长状况较好，不定芽诱导率和不定根生长状况都明显优于对照组。

实施例3：

其它操作及对照组同实施例1，非洲菊采用清心大红品种，低温处理时间为1天，培养30天不定芽发生率达到14.3％，平均每个花托外植体形成的花芽数2个，经培养生根，其不定根的生长状况一般。而对照组的不定芽诱导率仅为5％，平均每个花托外植体形成的花芽数1个，不定根的生长困难，明显差于本发明方法。

实施例4：

其它同实施例3，非洲菊采用清心大红品种，步骤(2)的培养基为1/2B5，培养30天不定芽发生率达到12.5％，平均每个花托外植体形成的花芽数2个，其不定根的生长状况一般。而对照组的不定芽诱导率仅为5.8％，平均每个花托外植体形成的花芽数1个，不定根发生困难，已形成的不定根生长缓慢，明显差于本发明方法。

实施例5：

其它同实施例3，步骤(2)的培养基为1/2White，培养30天不定芽发生率达到13.0％，平均每个花托外植体形成的花芽数1.6个，有不定根发生，生长状态一般。而对照组的不定芽诱导率仅为5.8％，平均每个花托外植体形成的花芽数1个，不定根发生困难，已形成的不定根生长缓慢，明显差于本发明方法。

实施例6：

其它同实施例1，非洲菊采用清心橙红品种，低温处理的时间为3天，步骤(2)中采用的培养基为1/2MS，其中细胞分裂素采用1mg/L的2-氯-4-吡啶基-N-苯基脲(简称CPPU)，结果不定芽诱导率为43％，经步骤(3)培养，不定根生长状况好，不定根产生数量多，生长快和壮实。而采用常规方法(没有低温处理，细胞分裂素为10mg/L 6-苄基腺嘌呤)的对照组，其不定芽诱导率为34.7％，不定根生长状况较差，明显差于本发明方法。

实施例7：

其它同实施例6，非洲菊采用黑心橙红品种，低温处理的时间为3天，细胞分裂素采用0.5mg/L的2-氯-4-吡啶基-N-苯基脲(简称CPPU)，结果其不定芽诱导率为20％，不定根生长状况较好，而对照组的不定芽诱导率为12.4％，不定根生长状况较弱，两者均明显差于本发明方法。

实施例8：

其它同实施例6，非洲菊采用黑心橙红品种，低温处理的时间为3天，细胞分裂素采用2mg/L的2-氯-4-吡啶基-N-苯基脲(简称CPPU)，结果其不定芽诱导率为22.2％，不定根生长状况较好，而对照组的不定芽诱导率为8.3％，不定根生长状况较弱，两者均明显差于本发明方法。

实施例9：

其它同实施例8，非洲菊采用黑心橙红品种，低温处理的时间为3天，细胞分裂素采用2mg/L的(4-吡喃)-1，1-嘌呤氨基-9-氢吡喃基-9H嘌呤-4-氢吡喃基(简称TDZ)，结果其不定芽诱导率为20.3％，不定根生长状况较好，而对照组的不定芽诱导率为8.3％，不定根生长状况较弱，两者均明显差于本发明方法。

实施例10：

其它同实施例6，非洲菊采用清心粉红品种，步骤(3)中用2mg/L萘乙酸溶液浸泡试管苗基部1天，然后在1/2MS固体培养基中继续培养，结果15天其不定根诱导率为50％，根生长好，而三个步骤均采用常规方法的对照组，其不定根诱导率为20％，根发生很少，生长极慢，明显差于本发明方法。

实施例11：

其它同实施例10，步骤(3)中用15mg/L吲哚乙酸溶液浸泡试管苗基部1天，培养15天其不定根诱导率为88％，不定根生长较好，而三个步骤均采用常规方法的对照组，其不定根诱导率为20％，不定根发生少，根生长慢，明显差于本发明方法。

实施例12：

其它同实施例10，步骤(3)中用5mg/L吲哚丁酸溶液浸泡试管苗基部1天，然后在1/2MS固体培养基中继续培养，培养15天其不定根诱导率为93％，不定根发生多，每株试管苗生长的根数有2条，根生长好，有须根。而三个步骤均采用常规方法的对照组，其不定根诱导率为18％，不定根发生少，根生长慢，明显差于本发明方法。

实施例13：

其它同实施例10，非洲菊采用清心粉红品种，步骤(3)中用10mg/L吲哚丁酸溶液浸泡试管苗基部1天，然后在1/2MS固体培养基中继续培养15天，其不定根诱导率为100％，每株试管苗生长的根数有2.2条。根长，发育好，须根多，苗壮叶绿。而三个步骤均采用常规方法的对照组，其不定根诱导率为34％，每株试管苗生根数为1.3条，根细短小，须根少，生长慢，明显差于本发明方法。

Claims

1、一种非洲菊离体快速繁殖的方法，包括外植体消毒、诱导不定芽发生和培养生根三个步骤，其特征在于：在步骤(1)——外植体消毒步骤中，在花托表面消毒之前，首先对花蕾进行低温处理，处理的温度为9±2℃，处理时间为1-5天。

2、如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)——诱导不定芽发生步骤中，所用培养基采用的细胞分裂素为苯基脲类细胞分裂素。

3、如权利要求2所述的方法，其特征在于：在步骤(3)——培养生根步骤中，首先用吲哚类或萘类生长素溶液浸泡试管苗基部，然后再将试管苗转入不含激素的1/2MS固体培养基上培养。

4、如权利要求3所述的方法，其特征在于：在步骤(2)——诱导不定芽发生步骤中，苯基脲类细胞分裂素在基本培养基中的含量为0.5-2mg/L；步骤(3)——培养生根步骤中，生长素采用吲哚乙酸、吲哚丁酸或萘乙酸，生长素溶液中生长素含量为2mg/L-15mg/L，试管苗基部浸泡的时间为1天，在固体培养基中的继续培养时间为5+15天。

5、如权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(1)——外植体消毒步骤中，对花蕾进行低温处理的时间为3天；步骤(2)——诱导不定芽发生步骤中，苯基脲类细胞分裂素采用2-氯-4-吡啶基-N-苯基脲，其在基本培养基中的含量为1mg/L；步骤(3)——培养生根步骤中，生长素溶液中生长素含量为5-10mg/L。