CN109548506A - 一种小桐子转基因苗育种法 - Google Patents

一种小桐子转基因苗育种法 Download PDF

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Abstract

一种小桐子转基因苗育种法，包括以下步骤：(1)小桐子种子苗生长出两片子叶时作为预备砧木；小桐子转基因苗作为接穗；(2)将接穗在多菌灵溶液中浸泡；(3)去掉预备砧木的顶端，从下胚轴正中向下劈开切口，制成砧木；将接穗下部削成楔形，插入切口；(4)将琼脂糖水溶液滴入切口；用封口膜包裹，覆盖塑料膜后置于温室育种；(5)两周后去除塑料膜，在遮荫条件下继续育种两天，去除遮荫再继续育种。本发明方法通过将小桐子转基因苗嫁接至健壮的小桐子种子苗上，从而育成健壮的小桐子转基因苗，并能大大加快小桐子转基因育种进程。

Description

一种小桐子转基因苗育种法
技术领域
本发明涉及嫁接种植技术领域，特别涉及一种小桐子转基因苗育种法。
背景技术
小桐子经过农杆菌介导转化外源基因获得转基因再生株，经分子检测外源基因已经转入小桐子中，转化的转基因苗是经过组织培养形成的植株；由于外源基因表达的原因，可能导致转基因苗根系发育较差或不生根，从而导致移栽时存活率低。
发明内容
本发明的目的是提供一种小桐子转基因苗育种法，针对不容易生根的小桐子转基因苗，将小桐子转基因苗嫁接至健壮的小桐子种子苗上，提高成活率。
本发明的方法包括以下步骤：
1、将小桐子种子播种在用水浇透的土壤中；当小桐子种子苗生长出两片子叶时，将其作为预备砧木；准备组织培养方法获得的小桐子转基因苗作为接穗；
2、将接穗在质量浓度为0.1～0.3％的多菌灵溶液中浸泡至少1h；
3、用刀去掉预备砧木的顶端，从下胚轴正中向下将预备砧木劈开1～1.5cm的切口，制成砧木；将浸泡后的接穗下部削成与砧木切口相配合的楔形，然后将楔形部分插入砧木的切口处；
4、将温度42～45℃的琼脂糖水溶液滴入切口处，使琼脂糖凝胶覆盖切口；所述的琼脂糖水溶液的质量浓度为0.3～0.4％，琼脂糖水溶液在温度降至35～45℃时形成凝胶；将塑料膜覆盖在接穗及砧木外，以防止水分蒸发太快，并将接穗及砧木置于温度28～35℃和湿度≥85％的温室内，开始育种；
5、育种两周后去除塑料膜，在遮荫条件下继续育种两天，然后去除遮荫，再继续育种5天，完成嫁接育种。
上述的组织培养方法获得的小桐子转基因苗为文献一种通过优化卡那霉素浓度和延迟筛选时间来提高农杆菌介导的小桐子转化效率的方法记载的方法制成。
上述方法完成嫁接育种后的小桐子转基因苗的成活率90％以上。
本发明方法通过将小桐子转基因苗嫁接至健壮的小桐子种子苗上，从而育成健壮的小桐子转基因苗，并能大大加快小桐子转基因育种进程。
具体实施方式
下面结合实例对本发明方法进行实例说明。
本发明实施例中，组织培养方法获得的小桐子转基因苗依据的文献为：
Stable genetic transformation of Jatropha curcas via Agrobacteriumtumefaciens-mediated gene transfer using leaf explants(农杆菌介导的小桐子叶片的遗传转化体系研究)；Nitish Kumar,Vijay Anand K Gopalakrishnan,SudheerPamidimarri et al.，Industrial Crops and Products，2010，32(1):41-47；
或者为：
Establishment of an Agrobacteriuim-mediated cotyledon disctransformation method for Jatropha curcas(农杆菌介导的小桐子子叶遗传转化方法的建立)；Meiru Li,Hongqing Li,Huawu Jiang,et al.,Plant Cell,Tissue and OrganCulture，2008，92(2):173–181；
或者为：
Establishment of bispyribac selection protocols for Agrobacteriumtumefaciens-and Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of the oilseed plant Jatropha curcas L.(根癌农杆菌和发根农杆菌介导的通过双草醚筛选的小桐子遗产转化方法的建立)；Masataka Kajikawa,Kaoru Morikawa,Masayo Inoue et al.，Plant Biotechnology 29:145-153 2012；
或者为：
Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation protocol ofJatropha curcas L.using leaf and hypocotyl segments(农杆菌介导的小桐子叶片和下胚轴段遗传转化方法)；Pratibha Misra,Dibya Dolridge Toppo,Manoj Kumar Mishraet al.，Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology,2012,21(1):128–133；
或者为：
An efficient protocol for Agrobacterium-mediated transformation ofthe biofuel plant Jatropha curcas by optimizing kanamycin concentration andduration of delayed selection(一种通过优化卡那霉素浓度和延迟筛选时间来提高农杆菌介导的小桐子转化效率的方法)；Fu Qiantang，Li chaoqiong，Tang Mingyong etal.，Plant Biotechnology Reports，2015，9:405-416。
本发明实施例中采用的多菌灵为市购产品。
本发明实施例中采用的琼脂糖为市购产品。
本发明实施例中采用琼脂糖溶于90℃水中，制成琼脂糖溶液，当温度降至42～45℃时滴入切口处。
本发明实施例中采用的土壤为泥炭土。
本发明实施例中用水浇透是指：用水将土壤全部浇湿后，用手握紧土壤不出现滴水。
本发明实施例中小桐子种子苗生长出两片子叶是指：小桐子种子苗最先生长出的两片叶子完全挣脱种皮，且黄变绿。
实施例1
将小桐子种子播种在用水浇透的土壤中；当小桐子种子苗生长出两片子叶时，将其作为预备砧木；准备组织培养方法获得的小桐子转基因苗作为接穗；
将接穗在质量浓度为0.1％的多菌灵溶液中浸泡至少1h；
用刀去掉预备砧木的顶端，从下胚轴正中向下将预备砧木劈开1cm的切口，制成砧木；将浸泡后的接穗下部削成与砧木切口相配合的楔形，然后将楔形部分插入砧木的切口处；
将温度45℃的琼脂糖水溶液滴入切口处，使琼脂糖凝胶覆盖切口；所述的琼脂糖水溶液的质量浓度为0.4％，琼脂糖水溶液在温度降至35～45℃时形成凝胶；将塑料膜覆盖在接穗及砧木外，以防止水分蒸发太快，并将接穗及砧木置于温度28℃和湿度85～90％的温室内，开始育种；
育种两周后去除塑料膜，在遮荫条件下继续育种两天，然后去除遮荫，再继续育种5天，完成嫁接育种，小桐子转基因苗的成活率94％；
根据《一种通过优化卡那霉素浓度和延迟筛选时间来提高农杆菌介导的小桐子转化效率的方法》，该方法培养时的生根率85％，移栽的存活率也约为85％，所以总存活率约为72％左右，在时间上，从转基因苗生根需要一个月，移栽需要一个月，总共两个月左右；较本申请的方法时间长，存活率低。
实施例2
方法同实施例1，不同点在于：
(1)将接穗在质量浓度为0.2％的多菌灵溶液中浸泡至少1h；
(2)将预备砧木劈开1.2cm的切口；
(3)将温度44℃的琼脂糖水溶液滴入切口处，使琼脂糖凝胶覆盖切口；所述的琼脂糖水溶液的质量浓度为0.3％；将接穗及砧木置于温度30℃和湿度85～88％的温室内；
(4)小桐子转基因苗的成活率92％。
实施例3
方法同实施例1，不同点在于：
(1)将接穗在质量浓度为0.3％的多菌灵溶液中浸泡至少1h；
(2)将预备砧木劈开1.5cm的切口；
(3)将温度43℃的琼脂糖水溶液滴入切口处，使琼脂糖凝胶覆盖切口；所述的琼脂糖水溶液的质量浓度为0.3％；将接穗及砧木置于温度35℃和湿度87～90％的温室内；
(4)小桐子转基因苗的成活率93％。

Claims (2)

1.一种小桐子转基因苗育种法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将小桐子种子播种在用水浇透的土壤中；当小桐子种子苗生长出两片子叶时，将其作为预备砧木；组织培养方法获得的小桐子转基因苗作为接穗；
(2)将接穗在质量浓度为0.1～0.3％的多菌灵溶液中浸泡至少1h；
(3)用刀去掉预备砧木的顶端，从下胚轴正中向下将预备砧木劈开1～1.5cm的切口，制成砧木；将浸泡后的接穗下部削成与砧木切口相配合的楔形，然后将楔形部分插入砧木的切口处；
(4)将温度42～45℃的琼脂糖水溶液滴入切口处，使琼脂糖凝胶覆盖切口；所述的琼脂糖水溶液的质量浓度为0.3～0.4％，琼脂糖水溶液在温度降至35～45℃时形成凝胶；并用封口膜包裹好嫁接处以免感染，再将塑料膜覆盖在接穗及砧木外，以防止水分蒸发太快，并将接穗及砧木置于温度25～32℃和湿度≥85％的温室内，开始育种；
(5)育种两周后去除塑料膜，在遮荫条件下继续育种两天，然后去除遮荫，再继续育种5天，完成嫁接育种。
2.根据权利要求1所述的一种小桐子转基因苗育种法，其特征在于完成嫁接育种后的小桐子转基因苗的成活率90％以上。
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