KR20220041540A

KR20220041540A - 토마토 화분 발달 관련 유전자 교정용 가이드 rna 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20220041540A
Application number: KR1020200124890A
Authority: KR
Inventors: 오재현; 박지희; 이연희; 박상렬; 서은정; 한정헌; 김경환; 설영주; 정황원; 홍준기; 이성경
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2020-09-25
Filing date: 2020-09-25
Publication date: 2022-04-01
Also published as: KR102496764B1

Abstract

본 발명은 토마토 화분 발달 관련 유전자 교정용 가이드 RNA(gRNA) 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로는 토마토 유래 AMS-like 유전자 교정용 가이드 RNA 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, gRNA를 이용하여 화분 발달 관련 유전자를 knock-out 시킴으로써 웅성불임체 제조에 응용 가능하여, 토마토 교잡종자 생산비용을 절감할 수 있다.

Description

토마토 화분 발달 관련 유전자 교정용 가이드 RNA 및 이의 용도{Guide RNA for editing AMS-like gene and use thereof}

본 발명은 토마토 화분 발달 관련 유전자 교정용 가이드 RNA(gRNA) 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로는 토마토 유래 AMS-like 유전자 교정용 가이드 RNA 및 이의 용도에 관한 것이다.

작물의 웅성불임은 인위적 혹은 자연적인 유전적 돌연변이를 통해 웅성능력을 상실하는 경우를 가리킨다. 이는 일종의 돌연변이로 웅성기관, 즉 수술의 결함으로 수정능력이 있는 화분을 생산하지 못하는 현상이다.

웅성불임 종류는 화분 불임성, 웅애불임성, 화분의 기능적 불임성 등으로 나눌 수 있으며, 이러한 웅성불임의 특징을 이용하여 일대 잡종 종자를 생산할 수 있다. 즉, 양성화 식물의 경우 교배에 앞서 수술을 제거하는 제웅 과정을 거쳐야 하는데 이러한 과정이 매우 번거롭고 노동력이 많이 드는 과정이다. 웅성불임성을 가지는 계통을 통해 모계로 하면 제웅을 하지 않고 그대로 인공수분을 하거나 자연 교배를 통해 일대 잡종 계통을 만들 수 있는 장점이 있다. 유전자적 웅성불임(GMS)은 화분 생산에 관여하는 핵의 유전자에 열성돌연변이가 일어난 것으로, 불임성은 열성유전한다. 그러나 이러한 유전자적 웅성불임은 그 유지를 불임계에 이형접합체를 교배하여 가임과 불임이 분리되는 현상을 겪게 되는데 이에 대해 모계의 유지를 위해서 표현형을 관찰하여 제거해야 한다는 문제점이 있다.

한편, 토마토(Solanum lycopersicum)는 전 세계 주요 작물 중 하나로 세계적으로 가공용 토마토의 소비가 꾸준히 늘어 종자소요량이 증가하고 있다. 하지만, 종자생산 비용이 판매비 보다 높아 효율적인 종자생산체계 마련이 시급한 실정이다. 토마토는 다양한 유전자적 웅성불임을 갖고 있으나, 순수한 토마토의 웅성불임 계통을 유지하기 어려워서 상업적으로 활발하게 이용되지 못하고 있다.

토마토의 웅성불임에 대해 많은 연구가 진행되었다. 하지만 웅성불임에 있어서 화분의 발달에 영향을 미치는 여러 기초적인 메커니즘 및 유전자의 기능 연구 등은 매우 미약한 편이다. 재배종 토마토에서 유전자적 웅성불임은 일반적인 현상으로, 많은 돌연변이 개체들에서 하나의 열성 유전자에 의해 조절된다고 보고되었다. 토마토에서 화분의 웅성불임과 관련된 유전자는 대략 45 개 정도 존재하는 것으로 알려져 있다.

이에, 본 발명자들은 교잡종자 생산비용을 대폭 절감할 수 있는 토마토 웅성불임 활용체계 구축하여 웅성불임 토마토 생산하기 위해 노력한 결과, 토마토 유전자 교정용 가이드 RNA를 이용하여 AMS-like 유전자가 높은 확률로 유전자 서열에 변이가 일어남을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허 제10-1242434호

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 토마토 화분의 활성을 저하시키는 토마토 화분 발달 관련 AMS-like 유전자 교정용 가이드 RNA, 이를 포함하는 벡터 및 형질전환 식물체를 제공하고, 상기 형질전환 식물체 제조방법을 제공하는 것이다.

상기의 과제를 해결하기 위해, 서열번호 3과 동일하거나 상보적인 염기서열로 이루어진 토마토 유전자 교정용 가이드 RNA를 제공한다.

상기 토마토 유전자는 서열번호 1로 이루어진 AMS-like 유전자일 수 있다.

또한, 본 발명은 가이드 RNA를 포함하는 토마토 유전자 교정용 벡터를 제공한다.

상기 벡터는 cas9 단백질을 암호화하는 염기서열을 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 가이드 RNA 또는 상기 유전자 교정용 벡터를 포함하는 토마토 유전자 교정용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 벡터를 형질도입하여 토마토 유전자가 교정된 형질전환 식물체를 제공한다.

상기 식물체는 웅성불임 변이체일 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 3과 동일하거나 상보적인 염기서열로 이루어진 가이드 RNA를 포함하는 토마토 유전자 교정용 벡터를 준비하는 단계; 및 상기 벡터를 식물체에 형질도입하여 토마토 유전자를 교정하는 단계를 포함하는, 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

상기 식물체는 웅성불임 변이체일 수 있다.

본 발명에 따르면, gRNA를 이용하여 화분 발달 관련 유전자를 knock-out 시킴으로써 웅성불임체 제조에 응용 가능하여, 토마토 교잡종자 생산비용을 절감할 수 있다.

도 1은 AMS-like 유전자 선정 gRNA 위치를 나타낸 것이다.
도 2는 AMS-like 유전자의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 3은 AtTDF1-like 유전자 선정 gRNA 위치를 나타낸 것이다.
도 4는 AtTDF1-like 유전자의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 5는 토마토 유전자 편집체 제작을 위한 gRNA, CRISPR/Cas9 vector 모식도이다.
도 6은 AMS-like gRNA 부위 증폭산물과 및 AtTDF1-like gRNA 부위 증폭산물의 염기서열을 분석한 결과이다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 교잡종자 생산비용을 대폭 절감할 수 있는 토마토 웅성불임 활용체계 구축하여 웅성불임 토마토 생산하기 위해 노력한 결과, 토마토 유전자 교정용 가이드 RNA를 이용하여 AMS-like 유전자가 높은 확률로 유전자 서열에 변이가 일어남을 확인함으로써 완성되었다.

본 발명은 일 관점에서, 서열번호 3과 동일하거나 상보적인 염기서열로 이루어진 토마토 유전자 교정용 가이드 RNA에 관한 것이다.

본 발명의 "가이드 RNA(guide RNA, gRNA)"란 RNA(ribonucleic acid)의 한 종류로, 인간이나 동식물의 특정 유전자를 교정하는 유전자 교정(genome editing)에서 교정하려는 DNA를 인식하여 찾아내는 RNA를 의미한다.

유전자 교정 기술로는 유전자 가위(engineered nuclease)가 있으며, 유전자 가위의 종류로 CRISPR-Cas9이 있다.

본 발명에서 "CRISPR-Cas9"이란 미생물의 면역체계로 알려진 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 시스템을 이용해 원하는 유전자 염기서열을 절단하도록 고안된 것으로서, 고정적 구성요소로서 Cas9 단백질을 포함하고, 가변적 구성요소로서 타겟 유전자에 특이적인 가이드 RNA를 포함한다. 이때 가이드 RNA는 20bp 길이의 타겟유전자 부위와 서열의 3‘쪽에 PAM서열(5’- NGG -3’)이 존재해야 한다. 가이드 RNA가 타겟 유전자를 인식하면 가이드 RNA에 Cas9 단백질이 결합하여 뉴클레아제로 작용하여 타겟 유전자 부위중 PAM 서열로부터 상위 3-4bp 사이를 절단함으로써 DNA 이중가닥 손상(DNA double strand break, DSB)을 유발한다. 이중가닥 손상으로 인해 염기서열의 교정이 발생할 수 있다.

상기 가이드 RNA는 토마토 유래 AMS-like 유전자(3473bp, Solyc08g062780.1.1)의 특정서열을 표적으로 하며, 상기 AMS-like 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

상기 AMS-like 유전자는 토마토 화분 발달 관련 유전자의 일종으로, 웅성불임 변이체에 유용하게 활용될 수 있다.

본 발명의 다른 관점에서, 상기 가이드 RNA를 포함하는 토마토 유전자 교정용 벡터에 관한 것이다.

본 발명의 유전자 교정용 벡터는 토마토 유전자, 구체적으로는 AMS-like 유전자를 교정하기 위해 특이적으로 인식하는 가이드 RNA가 도입된 식물형질 전환용 벡터를 의미한다.

본 발명에 따른 벡터는 cas9 단백질을 암호화하는 염기서열을 더 포함할 수 있다.

상기 벡터는 목적하는 유전자의 발현 억제 또는 유전자의 발현이 증진될 수 있도록, 발현조절 서열과 기능적으로 연결될 수 있다. 예를 들어, 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한, 벡터는 선택성 마커를 포함할 수 있으며, 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다.

본 발명의 벡터는 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 온실배양 토마토 형질전환체의 gDNA를 추출하여 AMS_check_F/R로 PCR을 수행하고 증폭된 산물은 pGEM T-easy 벡터에 클로닝하여 염기서열을 분석하였다. 그 결과, AMS-like 유전자는 allele 분석에서 각각 9개 이상의 염기가 결손된 것을 확인하였으나, AtTDF1-like 유전자는 유전자 서열의 변이가 일어나지 않음을 확인하였다(도 6). 즉, 서열번호 3과 동일하거나 상보적인 염기서열로 이루어진 gRNA의 형질도입이 토마토의 AMS-like 유전자의 서열변이(유전자 교정)을 효율적으로 유도함을 확인하였다.

본 발명의 또 다른 관점에서, 상기 가이드 RNA 또는 상기 유전자 교정용 벡터를 포함하는 토마토 유전자, 구체적으로는 AMS-like 유전자 교정용 조성물을 제공한다.

본 발명의 AMS-like 유전자 교정용 조성물은 서열번호 3과 동일하거나 상보적인 염기서열로 이루어진 토마토 유전자 교정용 가이드 RNA 또는 이를 포함하는 유전자 교정용 벡터를 포함한다.

본 발명의 또 다른 관점에서, 상기 벡터를 형질도입하여 토마토 유전자, 구체적으로는 AMS-like 유전자가 교정된 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명에서 “형질전환”은 유전물질인 DNA를 다른 계통의 살아 있는 세포에 주입했을 때, DNA가 그 세포에 들어가 유전형질을 변화시키는 현상으로, 형질변환, 형전환, 또는 형변환 이라고도 한다.

본 발명에서 상기 벡터로 식물체를 "형질전환"하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로는, 아그로박테리움을 이용한 형질전환방법, 미세사출법(microprojectile bombardment), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method), 및 아그로박테리아 분사법(Agrobacteria spraying method)을 이용할 수 있다.

본 발명에서 "식물체"는 성숙한 식물체뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 있는 식물 세포, 식물 조직 및 식물의 종자 등을 모두 포함하는 의미로서 이해된다.

본 발명에서 상기 식물체는 토마토, 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 또는 당근을 포함하는 채소 작물류; 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 또는 수수를 포함하는 식량 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 또는 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 또는 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 또는 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 또는 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나이며, 구체적으로는 토마토, 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 또는 당근을 포함하는 채소 작물류이며, 더욱 구체적으로는 토마토일 수 있다.

따라서 본 발명의 “식물체”는 AMS-like 유전자 교정(서열변이), 구체적으로 유전자의 삽입 또는 결손이 유도되어, 웅성불임 변이체로 형질전환된 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 관점에서, 서열번호 3과 동일하거나 상보적인 염기서열로 이루어진 가이드 RNA를 포함하는 토마토 유전자 교정용 벡터를 준비하는 단계 및 상기 벡터를 식물체에 형질도입하여 토마토 유전자를 교정하는 단계를 포함하는 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

본 발명에서 토마토 유전자, 구체적으로 AMS-like 유전자 교정은 식물체에 형질도입된 가이드 RNA에 의해 AMS-like 유전자를 특정영역에 삽입 또는 결손을 유도하는 것을 의미한다. 구체적으로, 유전자 가위 시스템의 cas9 단백질을 이용하여 유전자를 교정하는 것일 수 있다.

따라서 본 발명의 방법은 식물체에 cas9 단백질을 추가적으로 처리되거나 또는 cas9 단백질을 발현하는 벡터를 형질도입하는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 유전자 교정용 벡터는 cas9 단백질를 암호화하는 유전자를 더 포함하여 가이드 RNA와 cas9 단백질를 동시에 형질도입 하는 것일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1] 토마토 화분 발달 관련 유전자 선별

토마토 유래 화분 발달 관련 유전자 중, 하기 표 1의 서열번호 1의 AMS-like 유전자(3473bp, Solyc08g062780.1.1) 및 서열번호 2의 AtTDF1-like 유전자(1196bp, Solyc03g113530.2.1)를 선정하였다.

유전자 명칭	서열
AMS-like (서열번호 1)	ATGGAGAGGCTTAGGCCTATTATGAGCTTAAAAGGCTGGGATTACTGTGTTTTATGGAAGTTGAGTGAAGATCAAAGGTAACGCGGATTTAGAACATTGATTATATGTATTCCCCTTTGAATGGTTTATTGCATATGTGCACATAGTACGAGTGTTCTAGATCCGCCTCTGCCTCTTTTGACAACGAAAGGCCCTTGAGTAATTATGTATGATGCAGGTTTCTTGAATGGATTTGTTGCTGCTGTGGCGGAGCTGAGAAAAATATGCATGGCTGTGGACAAGAGATATTTTTTCCTGATTCTTCTACTTCAACTTGCAGAGATGTTATGTTTCAGCATCCAACAACAACTGCTTGTAATTTACTGGCTCAGGTCCCGCCTTCTCTGGCGCTAGACTGCGGGTACATGTTTGGCCTATACCTTCCTCCTTTCTATTACAAGAAAATTATCCGAATAAAGGGTAGTTCAGTGCACTAAACTCTAGCTATGCACAGTCTGAGAACGAACCATATTGAGACTCTCCTTCATTTCTAACTCTTTGCAATAAAATTGTAGAGTTTATGCACAGACCTTACTATCTAATCAAGCAAAATGGATGAACTTTGTTCCTTTCTCGGAATCAAATATCTCTAATGTAAGAATTGCTTTGTTACTATCGATTTCATTGCATAGCGTTGATCTCCACTGAAAAGCACCTTGTTTCTCTGCATAATGTTGTTTGATGTTAATTGCAGGAAATAATGGGAACTAGAGCTCTGATTCCATCTCCTCTTGGATTGCTCGAGTTGTTCAGTACGCAACAAGTAAAACATATGCTTCCTCCCTCTTACACTCTTTTTCATCTATTACTTGCTTTCTTCCCTATTTTTAATGTTCAACTCCGAGAAAATCATGTCAAAAGCTACAATTACTGTCTTAACTATACTTATAAAAAATATTCATGGAATTAAATACTTTGATGTAAGATATTATATACAAATGAAAGCCTAAAATAGACATGGTAACAAATTTTACAGCTAGCAGAAGATGAGAAAGTGATAGAATTTGTCTCAGCTCAATGCAATATCTACTTGGAGCAGCAAGCTATGATGAATTCAACTTTCTCAAATGGAGTTGAAGAGAACAACACATCAAAGCCTTTCCCAACAGAAGGAGAAAGAGACAGAGACGATCATATAAAAGATTCCCAAAATCATTACAAACAGAGAGTCTCCCCTGCAGCTACATCAGATCACTTGTCATTTGATTTCCCACTTAAACGAAAACAATTGGATTCTTGTTCGATGAACTTCCTTCCACCGTTCAGTACTTATAGCACACCAGAAGTGGATAACAACACAGGAGGGAACATGTTGTTTGATCAGAGCACAAGTGATATGACACATTTTTCGGAGAATAGGTACATGAGTGAGATGGATGCTTATTTACAGAAGCAAATGATGAGAAGCAGTAGTACTCAAGCTGGAATTGATGATGAATCAATCAAACATGATAACGGAAGATCAAATTCGGGATCTGATAGTGATCAAAATGAGGAAGAAGATGATCCCAAGTATAGAAGGAGAAATGGAAAAGGTCCTCAATCCAAGAATCTTATGGCTGAAAGGAAAAGAAGGAAGAAACTAAATGAAAGGCTCTATGCTCTTAGAGCTTTGGTTCCCAAAATCTCCAAGGTAATACATAAACTAACTCCCTTTGTTCCAATTTATACAACTCACTATTCTTTTTAGTCGGTTCCATTAGAATGATACATTTCCTTATTTGACAAATATTTAATCACCTTATCAACTTGGATCTCACTTATTTGACAAAAAATCCTAATGTGTACTCTTTATTTTGTACAAAATCTTCACTCATATTTCTAAAACTACGCACACAGTCAACATTTATGGTCGAATTTATGTACAGTTGGATAGAGCATCTATCCTCGGAGATGCTATTGAATATGTGATGGAATTGGAAAAGCAAGTGAAAGATCTGCAGCTTGAGGTTGAAGAACATTCAGATGACGACGGTACTGGTGGAGGAAGGAATTCGGACCAGATTCACCCCGTAGTTTTAAGCCATAATGGAACTAAAAACAGGCCTAAATCAGATAACGGAAAACTTACAAATGGAAGCCAAAGAGAAATATCAACTAATTCTAATGGCAGCACTGACCCTTCCAGAAAAAATCAAGATGTAGAAGAGAACGACAAATTGCAGCAAATGGAGGTACAACTTGTTCTATTTATATATATACATATGTATAATATACTACCGATTTAACTTATAAACACTCATGACAATAGCTCGTACTAGATTGTCCTTTTAAATATTGCTTCAATAATATGTTTATGTCATTGCATATTGTATCACTAATACCTTGAGCGTTATTTATACACAGTGTTGGTAATAAATAGATGCGAACCCATGATTTAAAGACTTTGGGTACACCAATGTTACCTTTTCAACTACTTCAAATAAAAGTAGTGAAAAAGGGCCTCAACTAAATTCAAACTCTGGTTTCATTAATGGTTCATCTAGCTGCCTTATACCAACAACACAAGGGCCCTCATATGCGAAAAAGGGATTCATCTAGATTCAAACCCTGGTCGCATCAATGGTTCATCTAGCTTGTACCAACAAAACAAGGGTCCTCATATGCTTTTCTTGGGTGTACTGTTAATTATATTCTACAATGATTTTTTTGGTAGTTAACGGGTGCACGTGCACTCCCACTTACTAGTATTGGTCTGCCTCTAGTTATAAATACTCATATTATTTTTGCCACTAACGTCATTTATATAGAGTTTTGATTAAAATCGTGACATGTAGAGTGTTTTTTTTAAAAGAAAATTATAATATTTTCAATCCTTGGAATGACATGAATGTTTGATATATGTTTATTGATGATATGATTAAATTTGTAGCCACAAGTGGAAGTTGCTCAATTAGATGGGAATGAGTTCTTTGTGAAGGTGTTTCGTGAACACAAGGCTGGTGGATTTGTGAGGACTTTGGAGGCTTTGAACTCATTGGGCTTGGAAGTTACCAATGTTAATGCAACTAGGCATACTTGTTTGGTATCAAGTATCTTCAAAGTTGAAGTAAGTCAAAATATTCCTTTTTTTTTCGGAGATCTCACCTTTTTGCTTCCTTACTGACCGTTTGAACAATTCCCAAACTACAATCCTTCACATCTTTCGAGTTCTAAAAATGTTTTTTTTCTTGTTTTAATTTGTATGTTAGCAGAAAAGGGATAATGAAATGGTTCAAGCTGATCATGTGAGGGACACCTTGCTAGAGCTGACAAGAAACCCTAGTAGAGGTTGGTCTGAAATGGGTAGAGCATCATCAGATAATATAAATAATAATAATGCAAATGGCACTACAGATTATCATCAACATCAACTTCATGATCATCACCTAGACAATAATAATCAACATAAGCAAACCAATTCTCATCACTTCCATACACACCACCATCACTAA
AtTDF1-like (서열번호 2)	GTTAAATGGAAAGTAATCTCATGCTTTTCTTGCCTTCTTTTAGGCCATCCATAAGAAGGTTCAAAACTTGAGAGACTAATGTTATTAATTCATATCTCTTCTTCAACATTCATTACTATATATTATAAATGGGAAGACCTCCTTGTTGTAATGATAAGGTACATAATAGAAAATGTAATTGGATAGAAGAGGATGCTAACACATCTACATTTGTCTCAATCAACAAACATGGAATTGGTAATTGGGCAACCATGTCTAAGAAATCAGGACACGGGAGATGTGGTGGGAGGAATCAGAAGCAGAGATGGAACAATCGTCTAAAGCCTGATCTTAAACAGGACAGCTTTACGCCTCAAGAAGAGGAACTGATCATTAAGCTTCATGCCACTATAGGAAGCAGGTGGTCTATAATAGCACAACAACTAGCTGGGAGAACGGATAATGATGTGAAGAACCTGTGGAACACTAAGCTGAAAAAAAAGCTATCTGCAATGGGGATTGATCCTGTTACTCACAAGCCTTTCTCACAAATCCTCACAGACTATGGTAACATTGGTGGCTTTCCGAAAGCCAGAACACGTTTCGTATCTCTTAACAGAGAGCTAAAAGGTGCATTTATGTCTAGACCAGAACAACTTCAACATTCTTTACAAAATTTCCAAAACTTTAACAGCCTTTGTGTGAAGCTGCCTAAAACAGAAGCTTCAGAAGAGTGCTTCTTTAGCAACAATCAAGATTCCAGCAATATTAATCAACCTCCTGTTGATCTGTTCTCCGAGTTACAAGCCATAAAGTTTGTAACAGAAGCCTCAAATTACAATTCCCCAAAGGCAGTTTTCTCCCATAATCCAAATCCTATAACTGATTGCTCTACGTCTTCGCCTTTGTCATCTTCGTCTTCATCATCAGCATCTCATTCATTAGCTGATAATCAAGTAAACTGGTGTGACTATCTTCTTGACGATGAATTTCTTCCATCAAATTTCAAAGCTCAAGAAGATACGTTAACCATAGAAGAAAAGTTAGTGTGTGGTGGAGCTGAGGATGGATCAAACAACGTGCCATCAACTAAGGATTTTGAGAACTCGTTATCTACAAAGGGAACATCATCGTCATCATTTGTCGAAGCCATGTTAGAATGTGAAAATGACATGTTCTTGAACTTCCCTGGCCTCTCTGAGGATCCGTTTTACTAG

[실시예 2] 토마토 유전자 편집체 제작을 위한 gRNA 선정

토마토 유래 AMS-like 유전자 및 AtTDF1-like 유전자를 각각 결손시키기 위한 gRNA(가이드 RNA)를 선정하였다(표 2, 도 1 및 3).

gRNA 명칭	gRNA 서열
g_AMS-like (서열번호 3)	5’-CCGTTCAGTACTTATAGCACACC-3’
g_AtTDF1-like (서열번호 4)	5’-CCTTGTTGTAATGATAAGGTACA-3’

[실시예 3] CRISPR/Cas9 벡터 제조

상기 표 2의 gRNA를 이용하여 Golden gateway 방법을 이용하여 CRISPR/Cas9 벡터를 제조하였다. 벡터의 제조는 상기 제작한 gRNA로 먼저 엔트리 벡터를 만들고, 이를 Cas9 서열(NCBI Reference Sequence: WP_012560673.1) 및 NPTII 서열(GenBank:QGV13007.1)과 함께 cut and ligation 반응을 통해 목표벡터(destination vector)인 pAGM4723에 삽입하였다. 토마토 유전자 편집체 제작을 위한 gRNA, CRISPR/Cas9 벡터 모식도를 도 3에 나타내었다.

제작된 CRISPR/Cas9 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)에 형질전환 후 토마토 자엽에 감염시켜 토마토 유전자 편집체를 제작하고 온실에서 배양하였다. 온실의 온도는 25±2℃이며, 16시간 빛 조건 및 8시간 암 조건의 온실에서 배양하였다.

[실시예 4] 토마토 유전자 편집체 분자생물학적 분석

온실배양 토마토 형질전환체의 gDNA를 추출하여 AMS_check_F/R로 PCR을 수행하고 증폭된 산물은 pGEM T-easy 벡터에 클로닝하여 염기서열을 분석하였다. 그 결과, AMS-like 유전자는 allele 분석에서 각각 9개 이상의 염기가 결손된 것을 확인하였다 (도 6).

반면, 동일한 방법으로 AtTDF1-like^_check_F/R 프라이머를 이용하여 증폭한 PCR 산물의 염기서열 분석 결과, AtTDF1-like 유전자는 유전자 서열의 변이가 일어나지 않음을 확인하였다.

이를 통해, 서열번호 3과 동일하거나 상보적인 염기서열로 이루어진 AMS-like 유전자는 토마토 웅성불임 변이체 제조에 유용하게 활용될 수 있음을 확인할 수 있다.

<110> REPUBLIC OF KOREA <120> Guide RNA for editing AMS-like gene and use thereof <130> DP20200163 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 3473 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AMS-like <400> 1 atggagaggc ttaggcctat tatgagctta aaaggctggg attactgtgt tttatggaag 60 ttgagtgaag atcaaaggta acgcggattt agaacattga ttatatgtat tcccctttga 120 atggtttatt gcatatgtgc acatagtacg agtgttctag atccgcctct gcctcttttg 180 acaacgaaag gcccttgagt aattatgtat gatgcaggtt tcttgaatgg atttgttgct 240 gctgtggcgg agctgagaaa aatatgcatg gctgtggaca agagatattt tttcctgatt 300 cttctacttc aacttgcaga gatgttatgt ttcagcatcc aacaacaact gcttgtaatt 360 tactggctca ggtcccgcct tctctggcgc tagactgcgg gtacatgttt ggcctatacc 420 ttcctccttt ctattacaag aaaattatcc gaataaaggg tagttcagtg cactaaactc 480 tagctatgca cagtctgaga acgaaccata ttgagactct ccttcatttc taactctttg 540 caataaaatt gtagagttta tgcacagacc ttactatcta atcaagcaaa atggatgaac 600 tttgttcctt tctcggaatc aaatatctct aatgtaagaa ttgctttgtt actatcgatt 660 tcattgcata gcgttgatct ccactgaaaa gcaccttgtt tctctgcata atgttgtttg 720 atgttaattg caggaaataa tgggaactag agctctgatt ccatctcctc ttggattgct 780 cgagttgttc agtacgcaac aagtaaaaca tatgcttcct ccctcttaca ctctttttca 840 tctattactt gctttcttcc ctatttttaa tgttcaactc cgagaaaatc atgtcaaaag 900 ctacaattac tgtcttaact atacttataa aaaatattca tggaattaaa tactttgatg 960 taagatatta tatacaaatg aaagcctaaa atagacatgg taacaaattt tacagctagc 1020 agaagatgag aaagtgatag aatttgtctc agctcaatgc aatatctact tggagcagca 1080 agctatgatg aattcaactt tctcaaatgg agttgaagag aacaacacat caaagccttt 1140 cccaacagaa ggagaaagag acagagacga tcatataaaa gattcccaaa atcattacaa 1200 acagagagtc tcccctgcag ctacatcaga tcacttgtca tttgatttcc cacttaaacg 1260 aaaacaattg gattcttgtt cgatgaactt ccttccaccg ttcagtactt atagcacacc 1320 agaagtggat aacaacacag gagggaacat gttgtttgat cagagcacaa gtgatatgac 1380 acatttttcg gagaataggt acatgagtga gatggatgct tatttacaga agcaaatgat 1440 gagaagcagt agtactcaag ctggaattga tgatgaatca atcaaacatg ataacggaag 1500 atcaaattcg ggatctgata gtgatcaaaa tgaggaagaa gatgatccca agtatagaag 1560 gagaaatgga aaaggtcctc aatccaagaa tcttatggct gaaaggaaaa gaaggaagaa 1620 actaaatgaa aggctctatg ctcttagagc tttggttccc aaaatctcca aggtaataca 1680 taaactaact ccctttgttc caatttatac aactcactat tctttttagt cggttccatt 1740 agaatgatac atttccttat ttgacaaata tttaatcacc ttatcaactt ggatctcact 1800 tatttgacaa aaaatcctaa tgtgtactct ttattttgta caaaatcttc actcatattt 1860 ctaaaactac gcacacagtc aacatttatg gtcgaattta tgtacagttg gatagagcat 1920 ctatcctcgg agatgctatt gaatatgtga tggaattgga aaagcaagtg aaagatctgc 1980 agcttgaggt tgaagaacat tcagatgacg acggtactgg tggaggaagg aattcggacc 2040 agattcaccc cgtagtttta agccataatg gaactaaaaa caggcctaaa tcagataacg 2100 gaaaacttac aaatggaagc caaagagaaa tatcaactaa ttctaatggc agcactgacc 2160 cttccagaaa aaatcaagat gtagaagaga acgacaaatt gcagcaaatg gaggtacaac 2220 ttgttctatt tatatatata catatgtata atatactacc gatttaactt ataaacactc 2280 atgacaatag ctcgtactag attgtccttt taaatattgc ttcaataata tgtttatgtc 2340 attgcatatt gtatcactaa taccttgagc gttatttata cacagtgttg gtaataaata 2400 gatgcgaacc catgatttaa agactttggg tacaccaatg ttaccttttc aactacttca 2460 aataaaagta gtgaaaaagg gcctcaacta aattcaaact ctggtttcat taatggttca 2520 tctagctgcc ttataccaac aacacaaggg ccctcatatg cgaaaaaggg attcatctag 2580 attcaaaccc tggtcgcatc aatggttcat ctagcttgta ccaacaaaac aagggtcctc 2640 atatgctttt cttgggtgta ctgttaatta tattctacaa tgattttttt ggtagttaac 2700 gggtgcacgt gcactcccac ttactagtat tggtctgcct ctagttataa atactcatat 2760 tatttttgcc actaacgtca tttatataga gttttgatta aaatcgtgac atgtagagtg 2820 ttttttttaa aagaaaatta taatattttc aatccttgga atgacatgaa tgtttgatat 2880 atgtttattg atgatatgat taaatttgta gccacaagtg gaagttgctc aattagatgg 2940 gaatgagttc tttgtgaagg tgtttcgtga acacaaggct ggtggatttg tgaggacttt 3000 ggaggctttg aactcattgg gcttggaagt taccaatgtt aatgcaacta ggcatacttg 3060 tttggtatca agtatcttca aagttgaagt aagtcaaaat attccttttt ttttcggaga 3120 tctcaccttt ttgcttcctt actgaccgtt tgaacaattc ccaaactaca atccttcaca 3180 tctttcgagt tctaaaaatg ttttttttct tgttttaatt tgtatgttag cagaaaaggg 3240 ataatgaaat ggttcaagct gatcatgtga gggacacctt gctagagctg acaagaaacc 3300 ctagtagagg ttggtctgaa atgggtagag catcatcaga taatataaat aataataatg 3360 caaatggcac tacagattat catcaacatc aacttcatga tcatcaccta gacaataata 3420 atcaacataa gcaaaccaat tctcatcact tccatacaca ccaccatcac taa 3473 <210> 2 <211> 1196 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AtTDF1-like <400> 2 gttaaatgga aagtaatctc atgcttttct tgccttcttt taggccatcc ataagaaggt 60 tcaaaacttg agagactaat gttattaatt catatctctt cttcaacatt cattactata 120 tattataaat gggaagacct ccttgttgta atgataaggt acataataga aaatgtaatt 180 ggatagaaga ggatgctaac acatctacat ttgtctcaat caacaaacat ggaattggta 240 attgggcaac catgtctaag aaatcaggac acgggagatg tggtgggagg aatcagaagc 300 agagatggaa caatcgtcta aagcctgatc ttaaacagga cagctttacg cctcaagaag 360 aggaactgat cattaagctt catgccacta taggaagcag gtggtctata atagcacaac 420 aactagctgg gagaacggat aatgatgtga agaacctgtg gaacactaag ctgaaaaaaa 480 agctatctgc aatggggatt gatcctgtta ctcacaagcc tttctcacaa atcctcacag 540 actatggtaa cattggtggc tttccgaaag ccagaacacg tttcgtatct cttaacagag 600 agctaaaagg tgcatttatg tctagaccag aacaacttca acattcttta caaaatttcc 660 aaaactttaa cagcctttgt gtgaagctgc ctaaaacaga agcttcagaa gagtgcttct 720 ttagcaacaa tcaagattcc agcaatatta atcaacctcc tgttgatctg ttctccgagt 780 tacaagccat aaagtttgta acagaagcct caaattacaa ttccccaaag gcagttttct 840 cccataatcc aaatcctata actgattgct ctacgtcttc gcctttgtca tcttcgtctt 900 catcatcagc atctcattca ttagctgata atcaagtaaa ctggtgtgac tatcttcttg 960 acgatgaatt tcttccatca aatttcaaag ctcaagaaga tacgttaacc atagaagaaa 1020 agttagtgtg tggtggagct gaggatggat caaacaacgt gccatcaact aaggattttg 1080 agaactcgtt atctacaaag ggaacatcat cgtcatcatt tgtcgaagcc atgttagaat 1140 gtgaaaatga catgttcttg aacttccctg gcctctctga ggatccgttt tactag 1196 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> g_AMS-like <400> 3 ccgttcagta cttatagcac acc 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> g_AtTDF1-like <400> 4 ccttgttgta atgataaggt aca 23

Claims

서열번호 3과 동일하거나 상보적인 염기서열로 이루어진 토마토 유전자 교정용 가이드 RNA.
제1항에 있어서, 상기 토마토 유전자는 서열번호 1로 이루어진 AMS-like 유전자인 것을 특징으로 하는, 가이드 RNA.
제1항의 가이드 RNA를 포함하는 토마토 유전자 교정용 벡터.
제3항에 있어서, 상기 토마토 유전자는 서열번호 1로 이루어진 AMS-like 유전자인 것을 특징으로 하는, 벡터.
제3항에 있어서, 상기 벡터는 cas9 단백질을 암호화하는 염기서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 벡터.
제1항의 가이드 RNA 또는 제3항의 유전자 교정용 벡터를 포함하는 토마토 유전자 교정용 조성물.
제3항 또는 제5항의 벡터를 형질도입하여 토마토 유전자가 교정된 형질전환 식물체.
제7항에 있어서, 상기 형질전환 식물체는 웅성불임 변이체인 것을 특징으로 하는, 식물체.
서열번호 3과 동일하거나 상보적인 염기서열로 이루어진 가이드 RNA를 포함하는 토마토 유전자 교정용 벡터를 준비하는 단계; 및
상기 벡터를 식물체에 형질도입하여 토마토 유전자를 교정하는 단계를 포함하는, 형질전환 식물체의 제조방법.
제9항에 있어서, 상기 토마토 유전자는 서열번호 1로 이루어진 AMS-like 유전자인 것을 특징으로 하는, 형질전환 식물체의 제조방법.
제9항에 있어서, 상기 형질전환 식물체는 웅성불임 변이체인 것을 특징으로 하는, 형질전환 식물체의 제조방법.