KR20100091016A

KR20100091016A - 토마토 웅성불임에 대한 ｄｎａ 마커 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20100091016A
Application number: KR1020090010286A
Authority: KR
Inventors: 강병철; 정희진; 권진경; 최도일
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2009-02-09
Filing date: 2009-02-09
Publication date: 2010-08-18
Also published as: KR101242434B1

Abstract

본 발명은 토마토의 웅성불임에 관여하는 유전자, 상기 유전자에 특이적인 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는 토마토의 웅성불임을 진단하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 토마토의 웅성불임을 진단하기 위한 키트, 상기 유전자를 포함하는 토마토의 웅성불임을 진단하기 위한 마이크로어레이, 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 토마토의 웅성불임을 진단하기 위한 방법에 관한 것이다.

토마토, 웅성불임, 프라이머 세트, 키트, 마이크로어레이, marker-assisted selection (MAS)

Description

토마토 웅성불임에 대한 ＤＮＡ 마커 및 이의 용도{DNA marker to genic male sterile in tomato and use thereof}

본 발명은 토마토 웅성불임에 대한 DNA 마커 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 토마토의 웅성불임에 관여하는 유전자, 상기 유전자에 특이적인 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는 토마토의 웅성불임을 진단하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 토마토의 웅성불임을 진단하기 위한 키트, 상기 유전자를 포함하는 토마토의 웅성불임을 진단하기 위한 마이크로어레이, 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 토마토의 웅성불임을 진단하기 위한 방법에 관한 것이다.

작물의 웅성불임은 인위적 혹은 자연적인 유전적 돌연변이를 통해 웅성능력을 상실하는 경우를 가리키는데, 이러한 종류에는 화분 불임성, 웅애불임성, 화분의 기능적 불임성 등으로 나눌 수 있으며, 이러한 웅성불임의 특징을 이용하여 일대 잡종 종자를 생산할 수 있다. 즉, 양성화 식물의 경우 교배에 앞서 수술을 제거하는 제웅 과정을 거쳐야 하는데 이러한 과정이 매우 번거롭고 노동력이 많이 드는 과정이다. 웅성불임성을 가지는 계통을 통해 모계로 하면 제웅을 하지 않고 그대로 인공수분을 하거나 자연 교배를 통해 일대 잡종 계통을 만들 수 있는 장점이 있다.

유전자적웅성불임(GMS)은 꽃가루 생산에 관여하는 핵의 유전자에 열성돌연변이(recessive mutation)가 일어난 것으로 불임성은 열성유전한다. 그러나 이러한 유전자적 웅성불임은 그 유지를 불임계에 이형접합체를 교배하여 가임과 불임이 분리되는 현상을 겪게 되는데 이에 대해 모계의 유지를 위해서 표현형을 관찰하여 제거하는 문제점이 있어, 마커를 통한 선발 과정으로 이를 구별해야 할 필요가 있다. 토마토는 전 세계 주요 작물 중 하나로 다양한 유전자적 웅성불임을 갖고 있다. 그러나 순수한 토마토의 웅성불임 계통을 유지하기 어려워서 상업적으로 이용되고 있지 못한 실정이다. 토마토의 웅성불임에 대해 많은 연구가 진행되었지만 웅성불임에 있어서 화분의 발달에 영향을 미치는 여러 기초적인 메커니즘 및 유전자의 기능 연구 등은 매우 미약한 편이다. 재배종 토마토에서 유전자적 웅성불임은 일반적인 현상으로, 많은 돌연변이 개체들에서 하나의 열성 유전자에 의해 조절된다고 보고 되었다 (Stevens and Rick 1986, Proc Natl Acad Sci USA, 83, 3580-3583; Mutschler et al 1987, Rep Tomato Genet Coop, 37, 5-37). 이러한 돌연변이의 주요인은 웅성불임과 stamenless series 이지만, pms, vms(variable male sterile) 등등 다양하게 보고되었다. 대부분의 웅성불임 돌연변이는 다른 위치에 있는 유전자들에 의해 조절되나 어떠한 것은 allelic으로 존재한다.

토마토에서 화분의 웅성불임과 관련된 유전자는 대략 45 개 정도 존재하는 것으로 알려져 있으며, 이중 토마토 염색체 2번과 연관된 웅성불임 표현형은 총 9 개이다. 이중 ms-10³⁵는 웅성불임 식물체 2-517에 있으며 이 유전자는 웅성불임관련 유전자 ms-10과 allelic 으로 존재한다. ms-10³⁵의 표현형적인 특징으로는 약이 작으며 생육이 약한 특징과 함께 그 색이 창백한 특징을 가지고 있으며 생육저하로 인해 상대적으로 주두가 튀어나오는 특징을 가지고 있다. 또한 감수분열 기간에 화분의 형성이 제대로 되지 않아 화분 모세포가 비어 있는 특징을 가지고 있다.

웅성불임과 관련되어 화분의 생장과 형성, 개약, 열개 등의 현상은 주로 애기장대에서 연구되었다. 특히, 화분의 초기 형성과 생장, 개약과 관련된 유전자들이 동정되고 연구되었는데, 특히 꽃의 기관이 형성된 이후 AGAMOUS 유전자에 억제 조절되는 유전자는 SPOROCYTELESS(SPL)/NOZZLE(NZZ)로써 이 유전자에 돌연변이가 생기면 화분의 형성과정에서 원시 포자형성세포로부터 소포자 모세포의 형성이 되지 않으며 또한 원시벽세포로부터 tapetum과 내측벽층으로 분화가 되지 않는 것으로 관찰되었다 (Yang 등, 1999, Genes Dev. 13, 2108-2117). 또한 MYB 전사 요인과 bHLH 전사 요인 역시 초기 화분 형성에 중요한 역할을 하는 것으로 연구되었다. 또한, myb33 myb65 중복 돌연변이체와 dysfunctional tapetum 1(dyt1)의 돌연변이체 역시 tapetum이 감수분열 시기에 비정상적인 것으로 연구되었다 (Millar and Gubler, 2005, Plant Cell, 17, 705-721). 더불어, MALE STERILE 1(MS1)과 ABORTED MICROSPORES (AMS) 역시 정상적인 tapetum 기능과 전사 요인에 관여함이 연구되었다 (Ito and Shinozaki, 2002, Plant Cell Physiol., 43, 1285-1292). 이와 더불어 여러 개의 repeat receptor-like protein kinases (LRR-RLKs) 정상 화분 형성 과정 에 중요한데, 이러한 유전자는 redundant하게 존재하는 BARELYANY MERISTERM 1(BAM1)과 BAM2가 대표적이며 이러한 유전자의 중복 돌연변이체의 경우 화분모세포의 형성이 정상적으로 되지 않으며 (Hord et al., 2006, Plant Cell, 18, 1667-1680), 또한 excess microsporocyte1 (ems1) 과 extrasporogenous cell (exs)와 tapetum determinant1 (tpd1)등의 연구를 통해서도 이러한 연구가 뒷받침 되었다 (Albrecht et al., 2005, Plant Cell, 17, 3337-3349). 이러한 연구 결과를 살펴본 결과 많은 종류의 유전자가 화분의 형성에 중요한 역할을 담당하고 있으며 단 한 개의 유전자의 변화를 통해서도 웅성불임이 야기됨을 알 수 있다. 하지만 이러한 유전자에 대해서 토마토에서는 유사한 연구 결과가 보고되고 있지 않다.

분자마커는 isozyme, RFLP, AFLP, RAPD, SSR, SNP 등 고밀도 유전자 지도작성을 위해 발전되어 왔다. 이들 중 이들 중 SNP는 염기서열의 차이를 이용한 분자마커로 유전적으로 매우 가까운 계통들 간에도 구분이 가능한 가장 앞선 분자표지로 유전적 거리가 가까운 육성 계통간의 차이를 구분하는데 적용할 수 있다.

또한 현재 전세계적으로 토마토의 토마토의 유전체 분석 프로젝트가 진행 중이며, 이미 축적된 정보가 많으므로 BAC 염기서열을이용해서 SNP 분자마커 개발이 가능하다.

한국특허등록 제10-0671213호에는 고추 세포질웅성불임성 안정화 관련 유전자와 연관된 분자표지의 개발 및 이를 이용한 안정화 관련 유전인자 판별 방법이 개시되어 있으며, 한국특허등록 제10-0399333호에는 새로운 유전자형의 CMS 무 계통의 식물체, 이를 이용하여 잡종 종자를 생산하는 방법 및 상기 NWB-CMS 무 계통 의 식물체 선발용 DNA 표지인자가 개시되어 있다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 토마토의 웅성불임 유전자 ms-10 ³⁵ 특이적 분자 표지 개발과 웅성불임 관여 유전자를 규명하고 이를 활용할 수 있는 분자유전학적 기술을 확립하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 토마토의 웅성불임에 관여하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자에 특이적인 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는 토마토의 웅성불임을 진단하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 토마토의 웅성불임을 진단하기 위한 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 토마토의 웅성불임을 진단하기 위한 마이크로어레이를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 토마토의 웅성불임을 진단하기 위한 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 토마토의 웅성불임과 가임 교배 집단을 재료로 하여 ms-10³⁵ 유전자에 대한 분자표지들을 개발하였다. 이를 통해 웅성불임 집단을 초기 단 계에서 선발할 수 있게 되었으며, 또한 이를 여교잡 육종 등에 이용하여 F₁ 잡종강세 토마토를 개발할 수 있을 것으로 예상된다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 토마토의 웅성불임에 관여하는 유전자를 제공한다. 상기 유전자는 MYB 트랜스크립터 (MYB transcriptor), SP2G (Self pruning 2G), 2-옥소글루타레이트 탈수소효소 (2-oxoglutarate dehydrogenase), 징크 핑거 패밀리 (zinc finger family), 퍼옥시다아제 (peroxidase), S-좌위 렉틴 단백질 키나아제 (S-locus lectin protein kinase), 및 S-좌위 수용체 키나아제 (S-locus receptor kinase)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명은 또한, 토마토의 웅성불임에 관여하는 유전자에 특이적인 토마토의 웅성불임을 진단하기 위한 프라이머 세트를 제공한다. 구체적으로는, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 세트, 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 세트, 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 세트, 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 세트, 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드 세트, 서열번호 11 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드 세트, 서열번호 13 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드 세트, 서열번호 15 및 서열번호 16의 올리고뉴클레오티드 세트 및 서열번호 17 및 서열번호 18의 올리고뉴클레오티드 세트로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고 뉴클레오티드 세트를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 세트, 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 세트, 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 세트, 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 세트, 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드 세트, 서열번호 11 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드 세트, 서열번호 13 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드 세트, 서열번호 15 및 서열번호 16의 올리고뉴클레오티드 세트 및 서열번호 17 및 서열번호 18의 올리고뉴클레오티드 세트를 모두 포함할 수 있다.

본 명세서에 있어서, 프라이머 세트는 마커와 상호교환하여 사용된다.

상기 마커는 모두 SNP 마커이며, 예를 들면, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 세트는 C2_At4g05090에 특이적이며, 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 세트는 Noncoding 2에 특이적이다.

본 발명의 프라이머 세트는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1 내지 서열번호 18의 서열 내의 각각 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상, 27개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(23개 뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 서열번호 2의 프라이머(26개 뉴클레오티드)는 서열번호 2의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 토마토의 웅성불임을 진단하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에서, 프라이머 세트는 전술한 바와 같으며, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 중합효소, dNTPs, 완충액 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 유전자를 포함하는 토마토의 웅성불임을 진단하기 위한 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, "마이크로어레이"란 기판 상에 폴리뉴클레오티드의 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있는 마이크로어레이를 의미한다. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. 마이크로어레이에 관하여는 예를 들면, 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있으며, 이들 특허의 내용은 참조에 의하여 본 명세서에 포함된다. 상기 유전자에 대하여는 상기 기재한 바와 같다.

용어 "기판"은 혼성화 특성을 보유하고, 혼성화의 배경 수준이 낮게 유지되는 조건하에 유전자 프로브가 부착될 수 있는 임의의 기판을 말한다. 통상적으로, 상기 기판은 미세역가(microtiter) 플레이트, 막(예를 들면, 나일론 또는 니트로셀룰로오스) 또는 미세구(비드) 또는 칩일 수 있다. 막에 적용 또는 고정 전에, 핵산 프로브를 변형시켜 고정화를 촉진시키거나 혼성화 효율을 개선시킬 수 있다. 상기 변형은 단독중합체 테일링(homopolymer tailing), 지방족기, NH₂ 기, SH 기 및 카르복실기와 같은 상이한 반응성 작용기와의 커플링, 또는 바이오틴, 합텐 또는 단백질과의 커플링을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한,

토마토 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 토마토의 웅성불임을 진단하기 위한 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 토마토 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발 하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.

본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

재료 및 방법

식물 재료 및 웅성불임 유전 분석

토마토의 웅성불임 유전자의 위치를 확인하기 위하여 실험에 사용한 집단으로는 모본으로 웅성불임 유전자 ms-10 ³⁵ 를 나타내는 2-517과 부본으로 웅성 웅성가임인 T-1082를 교배하였다. 웅성불임유전자의 유전 양상을 연구하기 위해서 두 교배 조합으로부터 얻어진 F₁을 자식하여 F₂ 집단을 구성하였다. 이를 토대로 총 94개의 F₂와 F₁과 웅성불임 2-517과 교배하여 여교잡 집단을 작성하였다. 웅성불임의 유전분석을 하기 위해서 약(葯)의 색깔 및 모양, 주두의 돌출 여부, 종자가 있는 열매의 유무에 따라 표현형을 F₂ 집단에서 관찰하였다.

Genomic DNA 추출

식물체의 genomic DNA는 2개의 잎(leaf disc)을 CTAB (Hexadecyltrimethylammonium bromide) 방법을 이용하여 추출하였다. 2개의 잎을 2개의 bead와 같이 하나의 1.5 ml 튜브에 넣어 조직분쇄기(tissue lyser)를 이용하여 분쇄하였다. 그 다음 600 ㎕의 CTAB 완충액와, 반스푼 정도의 폴리비닐피롤리돈 (PVP), 12 ㎕ 2-머캅토에탄올을 넣고 1 시간 동안 65℃ water bath에서 가열하였 다. 그 다음 클로로포름과 이소아밀알코올을 24:1로 섞은 용액에 넣고 가볍게 흔들어준 다음 13,000 g로 15분간 원심분리하였다. 새 튜브에 상층액 층을 옮기고 같은 부피의 이소프로필 알코올을 넣었다. -20℃에서 2 시간 정도 탈수반응을 시킨 다음 DNA를 13,000 g로 원심분리하여 응축시킨 후 70% 에탄올로 씻은 후 상온에서 말리고 3차 증류수에 용해시켰다. 추출한 DNA는 NanoDrop

ND-1000 (Nanodrop Technologies, USA)을 이용하여 농도를 측정하였다.

BAC 클론 염기서열 분석 및 프라이머 디자인

KRIBB(한국생명공학연구원)으로부터 토마토 염색체 2번 67 cM (TG 38) 부분에서 72.5 cM (T1625) 부분에 상응하는 BAC 11개 (C02HBa0090O01, C02Mbo0019I01 to0329G05, C02HBa0161P02 to031A21, to059M17, to075O22, to323A14, C02HBa0204D01, C02HBa0167J21, C02Mbo0008E03)의 염기서열을 확보하여 SeqManII 프로그램을 이용하여 세 개의 contig를 연결하였다. 69 cM peroxidase 유전자 (위치) 주변 마커를 중심으로 11개의 BAC contig를 분석하였으며 FGENESH, BLAST, PIPmaker 등을 통해 유전자들의 위치, 종류 등을 분석하였다. BAC 염기서열로부터 intron-based 마커 (SGN Intron Finder:www.sgn.cornell.edu) 10개 또는non-coding region 등에서 총 33 쌍의 프라이머를 제작하였다.

PCR 및 HRM

토마토 웅성불임 ms-10 ³⁵ 의 고밀도 유전자 지도 작성을 위해서 프라이머를 이용하여 F₂집단의 부모친과 F₁의 genomic DNA를 PCR을 이용하여 다형성이 있는지 확인하였다. PCR은 1X PCR 완충액(500 mM KCl, 100 mM Tris-Cl pH 8.3, 15 mM MgCl₂), 프라이머 0.4 pM, 주형 DNA 50 ng, dNTPs 0.2 mM, Taq 중합효소 1U으로 구성되며 총 부피가 25 ㎕가 되도록 수행하였다. PCR 조건은 94℃에서 4분 동안 변성시키고, 94℃에서 1분, 59℃에서 1분, 72℃에서 2분의 3단계를 40번 반복하였다. 그 후 72℃에서 5분 동안 마지막으로 합성하였다. PCR 반응은 thermocycler (My Cycler^TM)으로 수행하였다. PCR 산물이 500 bp 미만인 것을 선택하였으며, 같은 프라이머를 이용하여 HRM을 수행하여 다형성 존재여부를 확인하였다.

웅성불임관련 SNP 분자표지 마커를 개발하기 위해서 HRM을 실시하였다. 총 부피는 20 ㎕로 하였으며 genomic DNA 주형은 50 ng, 1x PCR 완충액, 2.0 mM MgCl_2,70 mM KCl, 100 mM Tris-Cl, 2.5 mM dNTPs, 1.25 μM SYTO9 (Invitrogen, USA), 10 pmol 프라이머 (Bioneer, Korea), Desai et al. (1995, Biotechniques. 19, 780-784) 방법으로 추출한 0.2U의 home-made Taq DNA 중합효소를 첨가하였다.

PCR 조건은 95℃에서 4분 동안 변성시키고, 94℃에서 15초, 55℃에서 15초, 72℃에서 30초의 3단계를 50번 반복하였다. PCR이 수행된 이후 70℃에서 95℃까지 초당 0.1℃씩 올려가면서 HRM 분석을 하였다. HRM 분석을 위해 real time PCR 기기로 Rotor-Gene 6000 real-time rotary analyzer를 이용하였으며 melting curve 등 HRM 분석은 software version 1.7(Corbett Research)을 사용하였다.

연관 분석 (Linkage analysis)

F₂ 집단의 표현형 및 HRM 결과를 토대로 ms-10 유전자의 정밀 지도를 작성하였다. 9 개의 마커를 이용하여 MapMaker 소프트웨어를 이용하여 유전적 거리 분석을 하였다.

실시예 1: 웅성불임 표현형 조사 및 유전 분석

토마토 웅성불임 ms-10 ³⁵ 을 확인하기 위하여 웅성불임계통 (2-517)을 부본으로 사용하고 웅성 가임계통 (2-1082)을 모본으로 사용하여 F₁ 개체를 획득하여 다시 자가교배를 통해 총 94개의 F₂집단을 구성하였다. 또한 F₁ 개체와 부본간의 여교배를 통하여 여교잡 집단을 구성하였다.

웅성불임을 조사하기 위해 기준으로 정한 표현형은 꽃의 크기, 약의 색깔, 주두의 돌출, 종자의 생성 등 총 네 가지의 표현형을 기준으로 웅성불임 여부를 조사하였다. 각 표현형은 각 개체당 3개의 꽃 모양을 비교하여 조사를 하였으며, 웅성불임의 특징을 가진 개체의 경우에는 개화 전, 개화 중, 개화 후기로 나누어 조사를 하였다. 이를 통해 확인한 웅성불임의 개체들의 특징은 꽃의 크기가 웅성 가임 개체에 비해 확연히 작았으며, 꽃잎과 수술의 색깔 역시 웅성 가임 개체는 노란색인 반면 웅성불임 개체는 창백한 빛깔을 띄었다. 또한 약의 정상 생장이 이루어 지지 않아 상대적으로 주두가 돌출되는 특징을 지니었다 (도 1).

꽃의 크기와 약의 색깔을 이용한 웅성불임 개체를 선발과는 달리 주두가 돌출되는 표현형은 웅성불임 형질과는 다르게 나타났다. 네 개의 개체에서 (40, 54, 71, 80번의 경우) 웅성불임의 표현형의 특징 중 하나인 주두가 돌출되어 있는 것으로 표현형이 나타났으나 꽃의 크기나 약의 색깔은 정상적이었으며 화분의 모양은 정상으로 나타났으며 가임의 형태로 종자가 생겼다.

이를 토대로 유전 분석을 종합한 결과, 전체 94개의 개체 중에서 웅성 불임 개체는 6개로 나타났으며 웅성 가임의 형태는 88개체로 나타났다. 이는 웅성가임과 불임 개체간 유전비율은 15:1로 나타났으며 두 개의 열성 유전자가 관여되어 있는 것으로 생각된다.

표 1. 웅성불임 가임과 불임개체의 F₂개체의 유전집단 분리

실시예 2: 웅성불임 유전자 관련 마커 개발

웅성불임 유전자 ms-10 ³⁵ 와 근접한 마커를 개발하기 위해 토마토 BAC 염기서 열로부터 SNP 마커 개발을 위한 프라이머를 제작하였다. 1992년 Tansksley 보고에 따라, ms-10 ³⁵ 유전자가 위치할 것으로 추정되는 염색체 2번 long arm의 peroxidase 마커 주변으로부터 약 11개의 BAC contig (유전자 지도의 67 cM에서 72.5 cM)를 연결하였다. SeqManII 프로그램을 이용하여 전체 11개의 BAC 서열이 contig가 3개로 이루어졌음을 확인하게 되었다 (표 2).

표 2. 웅성불임 유전자의 관련 BAC contig 및 마커 개발

가장 큰 contig는 총 758,417 bp의 염기서열로 되어 있으며 FGENESH를 이용하여 유전자를 예상한 결과 총 109개의 유전자가 확인되었다. 또한 contig 1과 연결되지 않는 두 개의 다른 contig가 있는 것으로 확인되었으며 서로 align이 되지 않는 것으로 미루어 볼 때 각각의 contig들 사이에는 physical gap이 존재하는 것으로 판단되었다. 이 중에서 ms-10 ³⁵ 유전자 연관 마커의 존재 위치를 파악하기 위해 각각의 BAC 염기서열을 바탕으로 SGN Intron Finder(www.sgn.cornell.edu) 프로그램을 이용한 intron based 프라이머와 non-coding 지역의 프라이머를 제작하여 일반 PCR을 수행하였다. 이 중에서 정확한 HRM을 수행하기 위해 PCR 산물이 single band로 존재하며 그 크기가 500 bp 미만으로 나오는 것을 선발하였다. 웅성불임 개체와 웅성 가임 개체의 genomic DNA를 근간으로 HRM 분석을 수행하여 다형성을 확인하였고 선발된 9개의 프라이머 조합으로 94 개체의 F₂ 집단을 이용하여 HRM을 통해 유전분석을 실시하였다.

실시예 3: 웅성불임 유전자 지도에서의 ms-10 ³⁵ 유전자 위치 확인

다형성을 보인 SNP 분자 표지 마커를 이용하여 집단에 적용하였고 Carthagene 1.0 소프트 웨어를 이중에서 연관 표지 순서별로 유전자 지도를 작성하였다. 다형성을 보인 분자표지 마커를 통해 유전형을 분석하였으며 분자표지인 C2_At04g05090, Noncoding region 2, Noncoding region 14번에서 ms-10 ³⁵ 유전자와 0 cM으로 Co-segregate되는 것을 확인하였다 (도 2).

표 3. 웅성불임 관련 프라이머 염기서열 및 유전자 지도 위치

실시예 4: 후보 유전자 서치

세 개의 연관된 분자표지 마커는 contig 1에 모두 위치하였으며 BAC contig의 411 kb에서 682 kb사이에 각각 위치하는 것을 확인하였다 (표 3, 도 3). 이 연관된 BAC contig를 FGENESH와 BLAST 서치를 통해 분석한 결과, 유전자가 25개가 있는 것으로 확인되었다. 연관 위치의 유전자 중에는 MYB 트랜스크립터 (MYB transcriptor), SP2G (Self pruning 2G), 2-옥소글루타레이트 탈수소효소 (2-oxoglutarate dehydrogenase), 징크 핑거 패밀리 (zinc finger family), 퍼옥시다아제 (peroxidase), S-좌위 렉틴 단백질 키나아제 (S-locus lectin protein kinase), S-좌위 수용체 키나아제 (S-locus receptor kinase) 등이 존재하는 것으로 확인되었으며 이들은 화분의 생장과 직간접적으로 관여되는 것으로 예측되며, 이들의 분석을 통해 ms-10³⁵의 유전자에 대한 규명을 하고자 한다.

도 1은 F₂ 개체 중 웅성불임 개체와 웅성가임 개체의 꽃과 화분의 모양을 보여준다.

A: F₂ 개체 중 표현형이 웅성불임 개체로 꽃의 크기가 작고, 꽃과 화분의 색이 웅성가임의 밝은 노란색이다. 또한 주두가 튀어 나온 특징을 가지고 있다.

B: F₂ 개체 중 표현형이 웅성가임 개체로 정상적인 형태의 꽃과 화분의 모양.

도 2는 HRM 분석법을 이용한 94개 F₂ 개체의 다형성 확인 결과이다. A: COS II 마커 C2_At4g05090, B: Noncoding Region 2, C: Noncoding Region 14.

도 3은 웅성불임 유전자 ms-10³⁵의 고밀도 유전자 지도를 보여준다.

<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> DNA marker to genic male sterile in tomato and use thereof <130> PN09020 <160> 18 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 1 tcctttcccc ctctgtcaat tgc 23 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 2 cacttcagtt ctcttctttt ttttaa 26 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 3 accacacctc tcaattcaaa cattac 26 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 4 caactatctg gatcagatgc cttg 24 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 5 gattgtttgt ttgttcttct tgagg 25 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 6 cacgcataag cgatattagt ttctag 26 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 7 gaagactgga tcctatgtca actgg 25 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 8 tccacgtact tctggttagg tcg 23 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 9 cgaccaataa gaaagagacg tgtc 24 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 10 gcgatttgtc acatagaata tacatctc 28 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 11 ggaagtcgaa atcaagaaag taac 24 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 12 gtttcagtat cgcttgagaa gc 22 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 13 gaactgctgt tgaaatggct aaag 24 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 14 tacaatgggc aaattaagaa ggg 23 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 15 acggcagtgt tacgttaagt tggag 25 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 16 tattgatgga gcgatcgaac tcttc 25 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 17 taagctctgt tctggatctc agtttctc 28 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 18 tcacatctga attctgatct atgcaaag 28

Claims

MYB 트랜스크립터 (MYB transcriptor), SP2G (Self pruning 2G), 2-옥소글루타레이트 탈수소효소 (2-oxoglutarate dehydrogenase), 징크 핑거 패밀리 (zinc finger family), 퍼옥시다아제 (peroxidase), S-좌위 렉틴 단백질 키나아제 (S-locus lectin protein kinase), 및 S-좌위 수용체 키나아제 (S-locus receptor kinase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 토마토의 웅성불임에 관여하는 유전자.
서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 세트, 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 세트, 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 세트, 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 세트, 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드 세트, 서열번호 11 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드 세트, 서열번호 13 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드 세트, 서열번호 15 및 서열번호 16의 올리고뉴클레오티드 세트 및 서열번호 17 및 서열번호 18의 올리고뉴클레오티드 세트로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는 토마토의 웅성불임을 진단하기 위한 프라이머 세트.
제2항의 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 토마토의 웅성불임을 진단하기 위한 키트.
제1항의 유전자를 포함하는 토마토의 웅성불임을 진단하기 위한 마이크로어레이.
토마토 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제2항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 토마토의 웅성불임을 진단하기 위한 방법.
제5항에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질로 표지되어 있는 것인 방법.