BRPI0808715A2 - Preparação e uso de explantes de embrião de planta para transformação - Google Patents

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Kevin Lee Deppermann
Erik D Dersch
Jerald D Heise
Angela Ranae Koestel
Cindy L Ludwig
Brian J Martinell
Edward Williams
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Monsanto Technology Llc
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Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PREPARAÇÃO E USO DE EXPLANTES DE EMBRIÃO DE PLANTA PARA TRANSFORMAÇÃO".
Antecedentes da Invenção O presente pedido reivindica a prioridade dos Pedidos de Paten
te Provisórios U.S. Nos de Série 60/894.096, depositado em 9 de março de 2007, e 60/915.066, depositado em 30 de abril de 2007, cujos conteúdos em sua totalidade são aqui incorporados a título de referência.
Campo da Invenção
A invenção refere-se em geral a métodos para preparação e ar
mazenamento de tecido de planta embriônico e seu subsequente uso em regeneração e transformação. A invenção refere-se em geral a métodos para preparação e armazenamento de tecido de planta embriônico diretamente de semente seca e seu subsequente uso em regeneração e transformação. 15 O novo explante resultante pode ser armazenado e pode germinar e/ou ser transformado quando condições apropriadas são providas.
Descrição de Técnica Relacionada
Plantas transformadas podem ser obtidas tratando diretamente tecido meristemático de um embrião de planta (por exemplo, Patente U.S. 20 6.384.301). O tecido meristemático contém células de planta em formação que diferenciam para produzir estruturas de planta múltiplas incluindo caule, raízes, folhas, tecido de linha germinativa e sementes. Embriões de planta podem ser tratados e selecionados ou avaliados para determinar quais daqueles embriões tratados incorporaram a nova informação genética no teci25 do da linha germinativa. As Patentes U.S. Nos 6.384.301 e 7.002.058 e Publicação U.S. 20060059589 descrevem métodos de transformar geneticamente sojas (Glycine Max) usando transferência de gene mediada por bactéria diretamente nas células meristemáticas de embriões de soja.
Em procedimentos de transformação de soja típicos, as sementes são hidratadas/embebidas para amaciar o revestimento da semente e permitir extração do tecido do explante. Após hidratação o embrião ou tecido embriônico é excisado da semente. Quando meristemas são usados como o explante, tecido de folha primário pode ser removido para expor o meristema do embrião da soja. Esforço considerável é envolvido na excisão dos embriões, transferência do material genético para os embriões e cultura dos embriões. Processamento pode causar dano ao tecido do explante, o que im5 pacta negativamente as etapas de transformação e regeneração subsequentes. É então importante reduzir dano ao tecido de explante que poderia resultar em esforço de transformação e/ou regeneração sendo aplicado a tecido não-viável.
A excisão de embriões de plante é frequentemente então reali10 zada à mão. Neste processo, sementes esterilizadas na superfície são assepticamente manuseadas uma de cada vez com luvas nas mãos. O explante é então cuidadosamente excisado. No caso de meristemas, as sementes são cuidadosamente orientadas de uma maneira de modo a ejetar o revestimento da semente com força aplicada e então as folhas embriônicas (coti15 lédones) são removidas próximo ao meristema primário para deixar o embrião de semente contendo tecido meristemático. Mesmo o manuseamento cuidadoso de sementes individuais, no entanto, resulta em recuperação menos do que desejável de embriões viáveis, e pode ser menos do que 70% mesmo com sementes de alta qualidade.
Contaminação bacteriana de embriões após excisão é também
uma preocupação significante. O grande manuseamento para preservar viabilidade e recuperação maiores de explantes também aumenta a probabilidade de contaminação destrutiva (que vai manifestar-se em etapas de processamento subsequentes). Tal contaminação pode resultar em perda signi25 ficante, uma vez que um único explante contaminado vai contaminar outras amostras durante a cultura de tecido. Isto causa perda de rendimento e/ou frequência de transformação, e eventualmente eficiência de transformação. Além disso, a excisão manual é de trabalho extremamente intensivo, consome tempo e apresenta-se como uma barreira para expansão do processo 30 de transformação onde muitas plantas devem ser tipicamente tratadas para dar os resultados desejados.
Ainda, os processos atuais são limitados porque o explante coIhido deve ser levado rapidamente para as etapas subsequentes de transformação, ou a viabilidade é perdida. Tipicamente, uma vez colhido o explante (por exemplo, a Publicação do Pedido de Patente U.S. 20050005321 e Publicação PCT correspondente WO 2005/000471), ele é posto em meio e 5 submetido à cocultura com bactérias de transformação dentro de horas de ser removido. Então, quando transformações tiverem que ser realizadas, é necessário primeiro preparar todos os explantes que serão necessários de modo que eles estejam prontos para imediatamente irem para um processo de incubação ou transformação. Este momento pode ser muito complicado e 10 inflexível, particularmente se demandas repentinas surgirem e explantes não puderem ser preparados a tempo. Claramente, a falta de uma habilidade para armazenar tais explantes por mais de algumas horas é uma grande deficiência na técnica.
Permanece uma grande necessidade de processos que possam aumentar a disponibilidade de embriões transformáveis sem aumento inaceitável dos custos totais e/ou cronologias de preparação de explante para transformação. A habilidade em armazenar tecido meristemático excisado (explante) para uso posterior em particular é necessária. Tais métodos aumentariam substancialmente a disponibilidade de embriões transformáveis, e permitiriam planejamento e execução eficientes de estudos de transformação em grande escala. Tais métodos deveriam permitir armazenamento de explante para satisfazer às demandas criadas durante horas operacionais de pico ou durante rompimentos inadvertidos na linha de produção e envio de explantes, por exemplo, para sítios diferentes para manutenção de rodadas de produção. Ainda, o uso de explantes de embrião seco (sementes artificiais) para transformação não é conhecido na técnica devido ao conhecimento comum na técnica de uso de explantes "úmidos" para transformação. Sumário da Invenção
Em um aspecto, a invenção provê um explante de semente tendo um teor de umidade especificado. Em uma modalidade, um explante pode compreender um teor de umidade interna de a partir de cerca de 3% a cerca de 20%. Em modalidades adicionais, um explante provido aqui pode ser definido como um eixo de embrião substancialmente intacto, que pode ser armazenado, contendo pelo menos algum tecido de meristema que é extraído de uma semente com uma umidade interna conforme aqui especificado, por exemplo, de a partir de cerca de 3% a cerca de 20%.
Em outro aspecto, a invenção compreende um método para ob
tenção de uma planta compreendendo as etapas de: (a) obtenção de uma semente de planta seca; e (b) preparação de um explante a partir da semente de planta sob condições onde o explante não germina e permanece viável e competente para germinação e/ou transformação genética. A semente de 10 planta pode ser uma semente de soja, canola, milho, algodão, cebola, pimenta, tomate, abóbora, arroz ou trigo.
Em certas modalidades, o explante compreende uma semente substancialmente intacta modificada para expor pelo menos uma primeira célula transformável da semente. Em outras modalidades, o método para 15 preparação do explante pode compreender perfurar pelo menos uma primeira abertura na semente, ou fazer uma fenda na semente. A semente ou explante compreende tecido meristemático.
Em certas modalidades o método pode compreender ainda a etapa de (c) transformação de pelo menos uma primeira célula do explante 20 com um DNA selecionado e (d) regeneração de uma planta transgênica a partir da dita célula, onde a planta regenerada é estavelmente transformada com o DNA selecionado. Regeneração pode ser realizada em uma temperatura de até cerca de 35° C. O explante pode compreender ainda tecido meristemático, por exemplo, um meristema embriônico. Em uma modalidade, 25 uma planta pode ser regenerada sem o uso de um ou mais reguladores de crescimento de planta de modo a alterar o desenvolvimento do explante.
Em outras modalidades, o método pode compreende armazenamento do explante antes da etapa (c) ou (d) sob condições onde o explante não germina. Em ainda outras modalidades, a semente ou explante pode 30 ser desidratado antes ou após preparação do explante. Um explante transformável e regenerável produzido através do método é também um aspecto da invenção. Em certas modalidades, as condições na etapa (a) ou (b) podem compreender um teor de umidade interna de semente ou explante de a partir de cerca de 3% a cerca de 25%. Em modalidades particulares a condição na etapa (a) ou (b) pode compreender um teor de umidade de semente ou ex5 plante de a partir de cerca de 4% a cerca de 16%. Em certas modalidades, o método pode ser definido como compreendendo redução do teor de umidade da semente de planta e/ou do explante antes da etapa (c). Em outras modalidades, o método pode ser definido ainda como compreendendo aumento do teor de umidade do explante antes da, concomitantemente com 10 e/ou após a etapa (d).
Ainda, os métodos podem ser definidos como uns onde a etapa (a) e/ou etapa (b) é realizada na ausência de um líquido. Alternativamente, os métodos podem ser definidos como uns onde a etapa (a) e/ou etapa (b) é realizada na presença de um líquido. Em ainda outras modalidades, os mé15 todos podem ser definidos como uns onde a etapa (a) e a etapa (b) são realizadas na ausência de um líquido. As condições na etapa (a) ou (b) podem compreender uma temperatura entre cerca de -80° C e cerca de 60° C. Em modalidades particulares, a temperatura pode estar entre cerca de -20° C e cerca de 40° C.
Em outras modalidades, o método pode ser definido como um
onde a etapa (b) é definida mais como compreendendo obtenção de uma pluralidade de explantes de sementes de planta e seleção de um explante de uma pluralidade com base em características associadas com a habilidade em transformar o explante e/ou regenerar uma planta a partir do explante. 25 Em modalidades particulares, a característica é selecionada do grupo consistindo em cor, tamanho, formato, densidade, análise proximal, teor de carboidrato, teor de proteína, teor de gordura, teor de volátil, teor de fibra (cinza), teor de umidade, viabilidade, germoplasma, propriedade de se encontrar intacta, presença de patógeno e característica ópticas.
Em certas modalidades, o método pode ser definido mais como
compreendendo sanitização da semente de planta e/ou explante antes da ou concomitantemente com a etapa (c). O método pode compreender ainda preparação da semente através de contato da semente com uma solução aquosa. A solução aquosa pode compreender um desinfetante tal como alvejante ou álcool. O método pode ser definido ainda como compreendendo desinfecção da semente de planta e/ou do explante antes da etapa (c). Em 5 certas modalidades, o método pode compreender desinfecção do explante, onde a desinfecção compreende aplicação de um desinfetante selecionado do grupo consistindo em alvejante, álcool (por exemplo, etanol), ozônio, gás cloro, Iuz ultravioleta, temperaturas de -20° C ou menores e exposição a uma temperatura maior do que 40° C ou 50° C.
O método para obtenção de um explante a partir de uma semen
te pode ser automático. Em certas modalidades, o método compreende um processo automático onde a semente de planta é orientada conforme ela passa através de um separador mecânico para prover um resultado substancialmente uniforme de tecido de planta meristemático regenerável. O mé15 todo pode ser realizado em semente a granel usando a força gerada com rolos opostos, tal como ilustrado na figura 6, por exemplo, bem como em semente singulada tal como ilustrado nas figuras 2-5, por exemplo.
Em algumas modalidades, o método de transformação pode ser realizado através de transformação bacterialmente mediada ou através de 20 bombardeamento de microprojétil. Transformação de explante pode ser realizada antes da, ou subsequente à, desinfecção do explante. O método pode ser realizado onde a planta transgênica é regenerada sem produção de uma cultura de tecido de calo, através de organogênese ou através de transformação de meristema direta ou subsequente crescimento de galho.
Ainda, o método pode compreender armazenamento do explante
por a partir de cerca de 1 hora a cerca de 2 anos antes da etapa (c) ou etapa (d). Em certas modalidades, o método pode compreender armazenamento do explante por a partir de cerca de 1 hora a cerca de 24 horas. O explante pode ser hidratado ou pré-culturado após armazenamento.
Outro aspecto da invenção compreende um aparelho para pre
paração de tecido de planta embriônico transformável a partir de semente singulada compreendendo: (a) um suporte para uma semente singulada; (b) um meio para aplicação de uma força à semente sendo segura de modo a dividir a semente em cotilédones separados, revestimento de semente e tecido embriônico. O aparelho pode compreender ainda: (c) um meio para separação do tecido embriônico do revestimento da semente e cotilédones e 5 (d) meios para limpeza e/ou esterilização do tecido. As figuras 2-5 ilustram um aparelho para preparação de tecido de planta embriônico transformável a partir de semente singulada. Conforme mostrado na figura 3, o aparelho (1) compreende um suporte (2) para a semente singulada (16). Conforme mostrado na figura 2, o suporte (2) compreende uma posição fixa para a semen10 te superior e inferior (3,4); e dispositivos para aplicação de força à semente (16) em um ponto ou plano de força de cisalhamento (5), para dividir a semente (16) em cotilédones, revestimento de semente e tecido embriônico separados. O suporte pode compreender copos de vácuo (6) que mantêm a posição da semente (16) enquanto aplicando uma força de cisalhamento a 15 ela. A figura 4 ilustra uma modalidade alternativa do suporte (2), onde sentinelas serrilhadas (7) mantêm a posição da semente (16) enquanto aplicando força de cisalhamento. Os copos de vácuo ou sentinelas serrilhados se viram em direções opostas, gerando a força que resulta em divisão da semente (16) no ou próximo ao ponto de força de cisalhamento (5). O aparelho 20 compreende ainda geradores de vácuo (8) ou dispositivos similares para remoção de componentes de uma semente singulada cisalhada da vizinhança do suporte (2) permitindo que a próxima semente seja posta nele.
A figura 6 ilustra um método útil para separação a granel de tecidos de meristema embriônico de tecido de cotilédone e tecidos de revesti25 mento de semente. Cisalhamento é gerado entre os rolos. Neste exemplo, um é metal e ou outro é um elastômero. A semente seca é passada entre esses dois rolos em um ajuste de lacuna apropriado para o tipo de semente e o cisalhamento é aplicado de modo que a semente é dividida e revestimentos de semente e partes de cotilédone podem ser separados mais do 30 eixo do embrião contendo meristema, por exemplo, utilizando fluxo de ar ajustável e peneiras apropriadamente dimensionadas ou similar.
A figura 7 ilustra um aparelho para separação de tecido embriônico de cotilédone, revestimento de semente, ou outros restos, e limpeza do tecido. Conforme mostrado no separador (13) da figura 7, ar estéril flui através de uma mangueira (9) para uma câmara de aplicação e recuperação de explante (10). O fluxo de ar força o material de planta compreendendo tecido 5 embriônico para uma área de voo livre de explante (11), onde materiais são separados. O aparelho compreende ainda uma câmara de exclusão de explante (12) para prevenir perda de explante, mas permitir passagem de pó e fluxo de ar para fora do separador (13) e um meio para remoção estática tal como um gerador de íon (17). A figura 8 ilustra uma modalidade alternativa 10 do separador (13), compreendendo placas carregadas (14) para coletar pó, esporos de mofo ou similar. A figura 9 ilustra ainda outra modalidade de um separador, compreendendo ainda um dispositivo para esterilização do tecido. Conforme mostrado na figura 9, um dispositivo de esterilização tal como lâmpadas de UV germicidas (15) pode ser posto dentro do separador (13), 15 tal como dentro da área de voo livre de explante (11), para esterilizar o tecido de explante.
Ainda outro aspecto da invenção é um método para preparação de material de planta transformável e regenerável compreendendo tecido meristemático de uma semente singulada compreendendo: a) submissão de 20 uma semente singulada que compreende um revestimento de semente, tecido de cotilédone e tecido meristemático a uma força suficiente para quebrar a semente: e b) separação do tecido meristemático do revestimento da semente e opcionalmente do tecido do cotilédone, onde o método é mecanizado. Uma planta transgênica produzida através deste método, onde o método 25 compreende ainda transformação e regeneração do material de explante para produzir uma planta transgênica, é também um aspecto da invenção. Em certas modalidades a planta pode ser uma planta de soja, algodão, cebola, pimenta, arroz, trigo, abóbora, canola e milho.
Breve Descrição dos Desenhos Os desenhos que seguem são parte do presente pedido e estão
incluídos para demonstrar mais certos aspectos da presente invenção. A invenção pode ser melhor compreendida através de referência aos desenhos em combinação com a descrição detalhada das modalidades específicas apresentadas aqui.
Figura 1: Produção de explantes de soja meristemáticos após submissão das sementes à excisão automática.
Figura 2: Vista perspectiva parcial do aparelho (figura 3) para
excisão de explante de alto rendimento de semente única usando copos de vácuo.
Figura 3: Representação simplificada de um aparelho com copos de vácuo para a excisão de material de explante de semente singulada.
Figura 4: Vista perspectiva parcial do aparelho (figura 5) para
excisão de explante de alto rendimento de semente única usando suporte de semente serrilhado.
Figura 5: Representação simplificada de um aparelho com suporte de semente serrilhado para a excisão de material de explante de semente singulada.
Figura 6: Gráfico mostrando etapas principais do Processo de
Excisão.
Figura 7: Modalidade 1 do Sanitizadorde Explante Seco.
Figura 8: Modalidade 2 do Sanitizador de Explante Seco.
Figura 9: Modalidade 3 do Sanitizador de Explante Seco.
Figura 10: Vista próxima de uma modalidade de um aparelho "empilhado" para obtenção de tecido de explante de semente.
Figura 11: Modalidade de um aparelho "empilhado" para obtenção de tecido de explante de semente.
Descrição Detalhada da Invenção
O que se segue é uma descrição detalhada da invenção provida para auxiliar aqueles versados na técnica na prática da presente invenção. Aqueles versados na técnica podem fazer modificações e variações nas modalidades descritas aqui sem se afastar do espírito ou escopo da presente invenção.
A invenção provê métodos e composições para preparação e recuperação e armazenamento de explantes, por exemplo, usando mecanização e automação. Fluido por ser usado para mover explantes e separar explantes desejáveis de restos durante manuseamento mecanizado de sementes e tecido embriônico, incluindo ar comprimido, outros gases e líquidos. Excisão a úmido ou a seco de embriões de planta para dar tecido me5 ristemático transformável pode ser realizada, seguido por uso imediato em métodos de transformação. Alternativamente, embriões úmidos ou secos podem ser subsequentemente secos e armazenados para transformação posterior ou outro uso e embriões excisados secos podem ser armazenados assim ou após secá-los mais dependendo do teor de umidade no momento 10 da excisão.
A flexibilidade de métodos de transformação de planta é aumentada através da redefinição do produto de armazenamento da semente para explante pronto para transformação. Preparação de explante pode acontecer em momentos e dias fora de pico, e explantes armazenados para uso poste15 rior, aumentando bastante a eficiência do processo de transformação geral. Avanços em excisão, processamento, isolamento e armazenamento de explante, e manipulação tornam este processo de trabalho muito mais eficiente e bastante adequado para necessidades de transformação de grande volume, alto rendimento. Métodos para a manipulação do teor de umidade da 20 semente para ajustar características de quebra da semente e subsequente vigor de semente e explante e rendimento de processo são também providos pela invenção. Embriões e meristemas transformáveis produzidos pelos métodos descritos são ainda uma modalidade da invenção.
Em uma modalidade, um explante preparado de acordo com a invenção pode ser definido como tendo uma umidade interna de cerca de 4- 25%, incluindo cerca de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20,
21, 22, 23, 24 e 25% de umidade interna e especificamente incluindo todas as faixas deriváveis entre qualquer dois tais valores. Em modalidades particulares, sementes a partir das quais explantes devem ser preparados podem 30 ser colhidas em uma umidade interna predeterminada adequada para isolamento de material transformável a partir delas. Em certas modalidades nãolimitantes, sementes das quais explantes são obtidos podem ser definidas como tendo uma umidade interna de cerca de 3-25%, incluindo cerca de 3,
4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 e 25% de umidade interna, e especificamente incluindo todas as faixas deriváveis entre qualquer dois tais valores, tal como, por exemplo, de a partir de cerca de 5 4% a 16%. Em certas modalidades, a capacidade de quebra da semente pode ser alterada através da manipulação do teor de umidade, permitindo divisão eficiente de sementes e preparação de explantes. Por exemplo, um teor de umidade interno tal como 3% a 7% pode ser vantajoso. As sementes podem ser mantidas em tais teores de umidade ou qualquer outro teor de 10 umidade dando condições de armazenamento estáveis (e explantes transformáveis) antes do uso. As sementes em certas modalidades podem ser sementes de soja ou algodão, e podem ser também, sem limitação, sementes de milho, canola, cebola, pimenta, tomate, abóbora, arroz, feijão comum, amendoim, milho, trigo ou colza.
Explantes secos podem ser usados que foram excisados de se
mente sob condições de pouca umidade, e podem ser preparados como explantes úmidos secos através de excisão da semente seguindo hidratação/embebimento onde o explante é subsequentemente desidratado e armazenado, incluindo suas combinações. Os explantes podem ser de várias 20 idades. Em uma modalidade, os explantes são relativamente "jovens" pelo fato de que eles foram removidos de sementes em menos de um dia, por exemplo, de a partir de cerca de 1 a 24 horas, tal como cerca de 2, 3, 5, 7, 10, 12, 15, 20 ou 23 horas antes do uso. Em outras modalidades, os explantes podem ser armazenados por períodos mais longos, incluindo dias, se25 manas, meses ou até mesmo anos, dependendo das condições de armazenamento usadas para manter a viabilidade do explante. Aqueles versados na técnica em particular vão compreender que tempos de armazenamento podem ser otimizados de modo que a qualidade e/ou rendimento de transformantes bem como a eficiência do processo de transformação são maximiza30 dos. Isto pode ser realizado para qualquer protocolo de transformação particular, por exemplo, tal como transformação mediada por Agrobacterium, transformação de bombardeamento de microprojétil, bem como outros procedimentos de transformação.
Antes da excisão do embrião, as sementes podem ser submetidas a uma etapa de seleção opcional para remover sementes com um grau alto de contaminação bacteriana ou fúngica e também sementes que podem por qualquer razão ser improváveis de produzir tecido embriônico viável para uso com a presente invenção. Seleção pode ser realizada, por exemplo, com base em parâmetros tal como o tamanho, cor ou densidade da semente ou outras características físicas que em outros contextos seriam não-objetáveis, e podem ser ajustadas empiricamente através de variação dos parâmetros de excisão, esterilização e armazenamento e através da medição de rendimentos finais de tecido viável e de eficiências de regeneração e transformação. Exemplos de métodos de seleção podem incluir o uso de uma escala automática após classificação por tamanho. Um selecionador óptico adequado para este propósito é o Sortex Seed Sorter ou o Satake ScanMaster® Il (Satake USA Inc., Houston, TX). Outras técnicas de seleção podem ser também empregadas incluindo seleção através do teor de umidade.
Em certas modalidades da invenção, explantes secos recuperados podem ser lavados antes do uso em um fluido, que pode ser um gás ou líquido. Um exemplo de uso de um gás inclui fluxo de explantes secos em ar 20 estéril enquanto deionizando os explantes para remover estática. Ainda, placas especificamente carregadas e lâmpadas germicidas UV podem ser usadas para remover partículas indesejáveis tal como contaminantes e pó microscópico. Explantes secos podem ser também submetidos a uma hidratação (pré-cultura) para aumentar o teor de umidade interna antes de serem 25 transformados com um ácido nucleico heterólogo. A transformação é alternativamente realizada antes da preparação ou germinação. Nesta modalidade, esterilização de semente e/ou explante é realizada, por exemplo, usando gás Cl, seguido por quebra em pedaços ou abertura de uma brecha da pele externa de proteção da semente através de outros meios, permitindo infiltra30 ção de uma cultura de Agrobacterium líquida. Este processo pode ser realizado imediatamente seguindo a esterilização e abertura brecha do revestimento da semente ou após armazenamento continuado. A invenção pode em aspectos particulares envolver esterilização de explantes antes da excisão e/ou pós-excisão. Esterilização pode incluir contato do material de semente ou explante com vários fluidos (isto é, líquidos ou gasosos) que servem para reduzir ou eliminar a presença de conta5 minantes bacterianos ou fúngicos viáveis que poderiam de outro modo interferir com viabilidade de semente ou embrião e mais tarde cultura de tecido de planta. Esterilização através da aplicação de líquido pode também hidratar ou parcialmente hidratar os tecidos de planta, e servir para o propósito de preparação de sementes ou embriões. Métodos para esterilização incluem, 10 mas não estão limitados a, uso de gás cloro, ozônio, soluções de alvejamento ou álcool, Iuz ultravioleta, temperaturas de -20° C ou menores e exposição a uma temperatura maior do que 40° C.
Divisão das sementes para isolar o explante pode ser realizada manualmente ou por um indivíduo usando uma variedade de técnicas mecâ15 nicas a fim de isolar o explante. As sementes podem ser divididas na metade ao longo do eixo do cotilédone, usando ferramentas tal como fórceps ou com a mão. Por exemplo, uma semente pode ser dividida ou quebrada ao longo do eixo do cotilédone aplicando pressão direta à semente ao longo do mesmo eixo. Isto pode ser realizado, por exemplo, golpeando a semente com um 20 objeto duro ou usando uma prensa, tal como uma cremalheira (por exemplo, Dayton 4Z328A ou Dayton 4Z329D; Dayton Tool Company, Dayton, OH). Algumas sementes vão dividir-se de modo que o explante pode ser imediatamente separado. Outras sementes podem separar-se ao longo do eixo do cotilédone, mas podem ainda requerer manipulação adicional para isolar o 25 explante. Excisão mecânica automática de tecido de embrião hidratado compreendendo meristemas pode também ser tentada pondo as sementes através de cilindros girando ao contrário e coleta do material de semente resultante, por exemplo, como é descrito na Publicação de Patente U.S. 20050005321.
Em algumas modalidades, uma semente ou explante seco pode
ser primeiro preparado, por exemplo, através de embebimento de um líquido tal como água ou um líquido de esterilização, seco novamente e por fim usado para transformação e regeneração. Em outras modalidades, a semente ou o explante pode ser preparado aumentando o teor de umidade da semente interna para não mais do que 30%, mantendo a semente ou o explante em um ponto de tempo, e então reiniciando o embebimento em um ponto de 5 tempo mais tarde. Em uma modalidade alternativa, a semente ou o explante pode ser preparado aumentando o teor de umidade interna para não mais do que 30%, armazenando a semente ou o explante por um período determinado, secando a semente ou o explante para o teor de umidade interna abaixo de 20% e então reiniciando o embebimento.
Em outra modalidade da invenção, o rendimento de qualidade
do explante pode ser otimizado através de pré-orientação das sementes antes da desmontagem da semente. Desta maneira, o impacto relativamente aleatório das sementes batendo em um rolo em uma máquina automática é controlado, então controlando a divisão das sementes entre as metades do cotilédone.
Qualquer método para separar material de explante desejado de sementes divididas individuais ou do rendimento a granel de sementes separadas pode ser usado (por exemplo, um processo conforme mostrado na figura 6 ou uso de um aparelho conforme mostrados nas figuras 2-5 e figuras 20 10-11), por exemplo, através de processamento automático. Tais métodos podem incluir aspiração onde um vácuo parcial é aplicado a uma primeira câmara contendo rendimento a granel do descascador de arroz ou outra máquina. A primeira câmara consiste em uma série de lados angulados alternados. Conforme o material de semente cai para esses lados e para um 25 recipiente de coleta, fendas ventiladas na câmara permitem que material mais leve seja puxado para uma segunda câmara. Fluxo de ar, e então o peso do material de semente sendo puxado, é controlado por válvulas. A figura 6 descreve um processo automático exemplar para excisão e separação de material de explante de revestimentos de semente e outros tecidos. 30 Seguindo excisão, o explante excisado pode então ser armazenado sob condições de temperatura e umidade apropriadas para uso posterior.
Em outra modalidade da invenção, ao invés de realizar excisão de semente a granel, as sementes são singuladas antes da excisão do explante, e excisão é realizada na semente singulada, por exemplo, através de um método de alto rendimento (por exemplo, figuras 2-5). A semente (por exemplo, uma semente de soja) pode ser manipulada por um sistema de 5 copo a vácuo para alocar a semente, e então posta entre suportes tal como um conjunto de copos a vácuo ou superfícies serrilhadas. Em uma modalidade particular o revestimento da semente é removido através do uso de um sopro de ar de alta pressão ou outro fluido, ou partículas, para pulsar ou soprar o revestimento de semente da semente. O tecido da semente pode ser 10 então manipulado e posto em um recipiente adequado para manipulação adicional tal como excisão de embrião, escolha, processamento, armazenamento e transformação. Em outra modalidade, escolha, seleção ou outras etapas de processamento podem acontecer antes de singular a semente. A semente singulada pode estar em um nível de umidade predeterminado, por 15 exemplo, conforme determinado através de condições de armazenamento seguindo colheita da semente. A semente singulada pode ser automaticamente filmada para análise de qualidade predeterminada, por exemplo, para testar a viabilidade, propriedades química e biológica e adequabilidade no processo de transformação ou regeneração. O explante excisado pode ser 20 armazenado sob condições de temperatura e umidade apropriadas para uso posterior. Um aparelho para excisão de alto rendimento de tecido meristemático transformável de semente singulada é também uma modalidade da invenção (por exemplo, figuras 2-5).
Outro método para separação de material de explante é através 25 de peneiramento manual. Produção a granel do descascador de arroz ou outra máquina é posto através de uma série de peneiras de separação geológicas, de modo que restos grandes e pequenos indesejados sejam separados do explante desejado através de exclusão por tamanho. Isto é realizado eficazmente, por exemplo, com material de soja, usando peneiras-padrão 30 U.S. (listadas de cima para baixo): N0 7 (abertura de 2,8 mm), N0 10 (abertura de 2,0 mm), N0 16 (abertura de 1,18 mm) e então a panela de coleta no fundo. Restos grandes coletados na peneira N0 7 ou N0 10, enquanto material de explante de embrião desejado é retido e coletado na peneira N0 16. Partículas finas indesejadas passaram pela panela de coleta. O rendimento de explante coletado na peneira N0 16 pode ser purificado mais pondo este rendimento em uma coluna de separação de fluxo de ar vertical (por exem5 pio, um OREGON SEED BLOWER; Hoffman Manufacturing, Jefferson, OR) onde ar é passado pelo material, soprando material indesejado mais leve para cima onde ele é aprisionado para remoção. Modificação da coluna com vários meios de redução de estática permitiria remoção de pó das superfícies do embrião e reduz biocontaminação e remove qualquer célula e tecido 10 de planta desnecessários.
Peneiramento mecanizado e separação por fluxo de ar podem ser também utilizados. Por exemplo, rendimento a granel do Descascador de Arroz é alimentado a uma máquina que utiliza vibração e puxamento gravitacional para peneirar e separar o material de semente indesejado dos explan15 tes desejados. Como um exemplo, o CLIPPER OFFICE TESTER (Clipper Separation Technologies: A.T. Ferrell Company, Bluffton, IN) pode ser utilizado. Esta máquina tem duas fendas para peneiras de separação serem inseridas, com o que material de semente é separado de acordo com tamanho. Ainda, esta máquina utiliza um ventilador que duplica o funcionamento 20 do dispositivo de separação de fluxo de ar vertical previamente mencionado, então dando um rendimento purificado final de explantes (figura 1) em uma etapa única.
Em outra modalidade, uma máquina para divisão de sementes é empilhada em um separador mecânico para fluxo contínuo de material e pa25 ra maior automação (figuras 10-11). As sementes são postas na máquina tal como uma Grainman® Laboratory Paddy Rice Sheller (por exemplo, Modelo N0 64-115-60-WDC; Grain Machinery Manufacturing Corp., Miami, FL). Muito do material leve tal como revestimentos de semente é separado através de aspiração durante o processo de excisão/divisão (por exemplo, figura 2, figu30 ra 6) e as frações de semente mais pesadas, isto é, pedaços de cotilédone e os explantes caem diretamente em um separador mecânico que separa do cotilédone dos explantes por meio de exclusão de tamanho usando peneiras vibratórias e gravidade. Fluxo de ar é usado para aspirar pó e outros restos de semente leves durante a separação (por exemplo, figuras 7-9).
Explantes transformáveis regeneráveis podem ser colhidos que não contêm nenhum, um pouco ou uma parte de cada cotilédone remanes5 cente ligado ao tecido embriônico, por exemplo, no máximo 14 do cotilédone. Esses explantes são considerados substancialmente similares, uma vez que eles podem resultar cada um em uma planta transformada estável. O explante deve, no entanto, conter pelo menos um pouco da região meristemática do embrião de modo que tipicamente o explante possa produzir um ga10 Iho dentro de 12 semanas do início das condições de crescimento de cultura de tecido.
O explante pode ser recuperado de uma semente hidratada, de uma semente armazenável a seco, de uma hidratação parcial de explante hidratado seco, onde "hidratação" é definido como qualquer ato para dar um aumento no teor de umidade de uma semente e/ou explante, sem-limitação de se ou não a semente e/ou explante sendo hidratado foi submetido à desidratação. Um explante pode ser de semente que é "preparada"; isto é, uma semente que iniciou a germinação, mas que foi apropriadamente posta em condições favoráveis pendentes para estase para completar o processo de germinação. Aqueles versados na técnica serão capazes de usar vários métodos de hidratação e otimizar a duração do tempo de incubação antes da transformação. O novo explante resultante é armazenável e pode germinar e/ou ser transformado quando condições apropriadas são providas. Então o novo explante de meristema armazenável, seco, pode ser referido como uma semente artificial.
Exemplos de tais condições de hidratação e preparação são apresentados abaixo nas Tabelas 4-8. A Tabela 4 ilustra colocação de explantes seguindo excisão em um tubo cônico de 15 ml_ com 5 ml de água destilada estéril (SDW) por um período de 4 horas. Um protocolo típico para exci30 são de máquina, tal como o tratamento "SOP", pode envolver colocação das sementes por 15 minutos em uma solução de alvejamento de cloro ativo 200 ppm, seguido por um período de 2 horas de exposição a nenhum líquido, seguido por uma hidratação durante a noite ou em meio de germinação de feijão (BGM) ou uma solução de alvejamento de Cl ativo 50 ppm.
Seguindo a excisão, uma pessoa versada na técnica pode armazenar o explante de acordo com os métodos descritos antes do uso sub5 sequente. Métodos e parâmetros para secagem, armazenamento e germinação de sementes são conhecidos na técnica (por exemplo, Senaratna e outros, 1983; Vertucci e Roos, 1990; Chai e outros, 1998). Armazenamento de meristemas excisados de acordo com a presente invenção pode ser realizado usando modificações de tais condições de armazenamento conforme 10 desejado. Quaisquer tais condições podem ser usadas conforme desejado, incluindo em temperaturas, por exemplo, de a partir de cerca de -80° C a cerca de 60° C. Temperaturas de cerca de -20° C até temperatura ambiente em particular foram verificadas funcionar bem, mas a invenção não é de modo algum limitada a essas temperaturas.
Os dados descritos nos Exemplos ilustram, por exemplo, que
explantes de semente armazenados compreendendo tecido meristemático podem permanecer viáveis e úteis para transformação genética e regeneração por semanas ou meses seguindo excisão a partir das sementes (por exemplo, Exemplo 11 e Tabela 14). Manipulação de parâmetros de excisão, 20 esterilização, armazenamento, hidratação, re-hidratação e transformação permite o desenvolvimento de protocolos de transformação de planta de alto rendimento automatizados eficientes.
Vários parâmetros para obtenção e manuseamento de explantes podem ser variados. Em uma modalidade, o método de excisão pode ser 25 manual; em uma modalidade alternativa excisão acontece através de um processo automático. Em outras modalidades esterilização pode ser realizada através de contato de uma semente ou explante com um agente de esterilização líquido. Em uma modalidade alternativa, uma semente ou explante pode ser contatado com um agente de esterilização gasoso. Em uma moda30 Iidade alternativa, a semente ou explante pode ser contatado com um agente de esterilização de irradiação tal como Iuz UV. As figuras 7-9 ilustram aparelhos para tais métodos de esterilização. Em uma modalidade alternativa, uma semente ou explante pode ser esterilizado submetendo a semente ou o explante a um breve período de temperaturas altas de modo a reduzir o vigor de contaminantes biológicos tal como bactérias e fungos imprevistos na superfície da semente ou do explante sem redução do vigor da semente ou 5 do explante. Isto pode ser conseguido em uma temperatura maior do que 40° C; de preferência a temperatura está entre 40° C a 90° C. A temperatura pode ser aumentada, por exemplo, ou através de ar aquecido ou vapor forçado. Tais temperaturas podem ser providas por secadores produzidos pela Bry-Air Inc. (Sunbury, Ohio, USA). Em ainda uma modalidade adicional, o 10 teor de umidade da semente no momento da excisão pode ser variado. Em outra modalidade, a temperatura da semente no momento da excisão pode ser variada. Em outras modalidades, um parâmetro de armazenamento seguindo excisão pode ser variado. Por exemplo, em uma modalidade a umidade relativa sob a qual armazenamento de explante acontece pode ser va15 riada. Em outra modalidade, a temperatura de armazenamento do explante pode ser variada. Em ainda outras modalidades, a duração do tempo de armazenamento do explante pode variar. Em ainda outras modalidades, a composição do meio onde o explante é armazenado pode variar. Parâmetros adicionais que podem ser manipulados incluem composições de meio de 20 hidratação e re-hidratação, temperatura de incubação, período de tempo e métodos de transformação, dentre outros.
Vários métodos foram desenvolvidos para transferência de genes para tecido de planta incluindo microprojeção de alta velocidade, microinjeção, eletroporação, absorção de DNA direta e transformação bacterialmente mediada. Bactérias conhecidas mediar a transformação de célula de planta incluem várias espécies de Rhizobiaceae, incluindo, mas não limitado
a, Agrobacterium sp., Sinorhizobium sp., Mesorhizobium sp. e Bradyrhizobium sp. (por exemplo, Broothaerts e outros, 2005; Publicação de Pedido de Patente U.S. 20070271627). Alvos para tal transformação têm sido frequentemente tecidos de calo não-diferenciados, embora tecido diferenciado tenha sido também usado para transformação de planta transiente e estável.
Aplicação de gene bacterialmente mediada (por exemplo, mediada por Agrobacteriurrr, Patentes U.S. 5.563.055; 5.591.616; 5.693.512; 5.824.877; 5.981.840) pode ser feita em células no meristema vivo de um embrião excisado de uma semente, tal como soja (por exemplo, Patente U.S. 6.384.301). A região meristemática pode ser culturada na presença de 5 um agente de seleção tal como o herbicida glifosato. O resultado desta etapa é o fim ou pelo menos o retardo do crescimento da maioria das células nas quais construção genética estranha não foi aplicada e indução simultânea da formação de galhos, que surgem de um agrupamento pequeno de células incluindo uma célula meristemática transformada. O meristema pode 10 ser também cultivado na presença de outro agente de seleção sozinho ou em combinação, incluindo, mas não limitado a, herbicidas tipo auxina, tal como dicamba ou 2,4-D, MCPA, glufosinato, inibidores de acetolactato sintase, inibidores de protoporfirinogênio oxidase e inibidores de hidroxifenilpiruvato-dioxigenase, neomicina, canamicina, paramomicina, G418, amino15 glicosídeo, espectinomicna, estreptomicina, higromicina B, bleomicina, fleomicina, sulfonamidas, estreptotricina, cloranfenicol, metotrexato, 2- desoxiglicose, aldeído betaína, S-aminoetil L-cisteína, 4-metiltriptofano, Dxilose, D-manose, benziladenina-N-3-glucuronidase. Exemplos de vários marcadores selecionáveis e genes provendo resistência contra eles são des20 critos em Miki e McHugh, 2004. Em uma modalidade da invenção uma região de codificação para o marcador selecionável aminoglicosídeo adeniltransferase (aadA) conferindo resistência à espectinomicina ou estreptomicina é usada (por exemplo, Patente U.S. 5.217.902; ou Sandvang, 1999).
Como é bem-conhecido na técnica, outros métodos para transformação de planta podem ser utilizados, por exemplo, conforme descrito por Miki e outros (1993), incluindo uso de bombardeamento com microprojétil (por exemplo, Patente U.S. 5.914.451; McCabe e outros, 1991; Patentes U.S. Nos 5.015.580; 5.550.318; 5.538.880).
Moléculas de proteína não-modificadas e modificadas e suas moléculas de ácido nucleico correspondentes provendo tolerâncias a herbicida a um ou mais desses herbicidas são bem-conhecidas na técnica. Elas são exemplificadas abaixo e são incorporadas aqui a título de referência: a) seqüências codificando tolerância a glifosato incluem 5- enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS; Patente U.S. 5.627.061, Patente U.S. RE39.247, Patente U.S. 6.040.497; Patente U.S. 5.094.945, WO 04074443 e WO 04009761), glifosato oxidorredutase (GOX; Patente U.S.
5.463.175), glifosato descarboxilase (W005003362 e Pedido de Patente U.S. 20040177399) e glifosato-N-acetil transferase (GAT; Publicação de Patente U.S. 20030083480) conferindo tolerância a glifosato;
b) dicamba mono-oxigenase (DMO, codificada por ddmC) conferindo tolerância a herbicidas tipo auxina tal como dicamba (Pedidos de Pa
tente U.S. 20030115626, 20030135879; Wang e outros, 1996; Herman e outros, 2005);
c) fosfinotricina acetiltransferase (bar) conferindo tolerância à fosfinotricina ou glifosinato (U.S. 5.646.024, U.S. 5.561.236, EP 275.957; U.S. 5.276.268; U.S. 5.637.489; U.S. 5.273.894).
d) ácido 2,2-dicloropropiônico desalogenase conferindo resistên
cia a ácido 2,2-dicloropropiônico (DaIapon) (W09927116);
e) aceto-hidroxiácido sintase ou acetolactato sintase conferindo tolerância a inibidores de acetolactato sintase tal como sulfonilureia, imidazolinona, triazolpirimidina, pirimidiloxibenzoatos e ftalida (U.S. 6.225.105; U.S.
5.767.366; U.S. 4.761.373; U.S. 5.633.437; U.S. 6.613.963; U.S. 5.013.659; U.S. 5.141.870; U.S. 5.378.824; U.S. 5.605.011);
f) haloarilnitrilase (Bxn) para conferir resistência à bromoxinila (W08704181A1; U.S. 4.810.648; W08900193A);
g) acetil-coenzima A carboxilase modificada para conferir tole
rância à cicloexanodiona (setoxidim) e ariloxifenoxipropionato (haloxifope)
(U.S. 6.414.222);
h) di-hidropteroato sintase (sull) para conferir tolerância a herbicidas sulfonamida (U.S. 5.597.717; U.S. 5.633.444; U.S. 5.719.046);
i) polipeptídeo Il de fotossistema de 32 kD (psbA) para conferir
tolerância a herbicidas triazina (Hirschberg e outros, 1983);
j) antranilato sintase para conferir resistência a 5-metiltriptofano (U.S. 4.581.847); k) ácido di-hidrodipicolínico sintase (dapA) para conferir resistência à aminoetil cisteína (W08911789);
I) fitoeno desaturase (drtl) para conferir tolerância a herbicidas piridazinona tal com norflurazon (JP06343473);
5 m) hidroxi-fenil piruvato dioxigenase para conferir tolerância a
herbicidas ciclopropilisoxazol tal como isoxaflutol (WO 9638567; U.S.
6.268.549);
n) protoporfirinogênio oxidase I modificada (protox) para conferir tolerância a inibidores de protoporfirinogênio oxidase (U.S. 5.939.602); e o) ariloxialcanoato dioxigenase (AAD-1) para conferir tolerância
a um herbicida contendo uma porção ariloxialcanoato (W005107437). Exemplos de tais herbicidas incluem fenóxi auxinas (tal como 2,4-D e diclorprop), piridilóxi auxinas (tal como fluroxipir e triclopir), ariloxifenoxipropioatos (AOPP) inibidores de acetil- co-enzima A carboxilase (ACCase) (tal como 15 haloxifope, quizalofope e diclofope) e inibidores de fenoxiacetato protoporfirinogênio oxidase IX 5-substituídos (tal como piraflufen e flumiclorac).
Uma variedade de meios de cultura de tecido é conhecida que, quando suplementados apropriadamente, apoiam crescimento e desenvolvimento de tecido de planta, incluindo formação de plantas maduras de me20 ristemas ou embriões excisados. Esses meios de cultura de tecido podem ou ser comprados como uma preparação comercial ou preparadas pelo comprador e modificadas por aqueles versados na técnica. Exemplos de tais meios incluem, mas não estão limitados a, aqueles descritos por Murashige e Skoog, (1962); Chu e outros (1975); Linsmaier e Skoog, (1965); Uchimia e 25 Murashige, (1962); Gamborg e outros (1968); Duncan e outros (1985); McCown e Lloyd (1981); Nitsch e Nitsch (1969); e Schenk e Hildebrandt (1972) ou derivados desses meios suplementados consequentemente. Aqueles versados na técnica têm consciência que meios e suplementos de meio tal como nutrientes e reguladores de crescimento para uso em transformação e 30 regeneração são geralmente otimizados para a cultura-alvo particular ou variedade de interesse. Reagentes estão comercialmente disponíveis e podem ser comprados de vários fornecedores (vide, por exemplo, Sigma Chemical, Co., St. Louis, Mo. E Phytotechnology Laboratories, Shawnee Mission, KS).
Cocultura e etapas subsequentes podem ser realizadas em condições no escuro, ou em incubadoras Percival iluminadas, por exemplo, por
2 a 5 dias com um fotoperíodo de 16 horas de luz, 8 horas de escuro. Em 5 uma modalidade, a intensidade de Iuz pode ser, por exemplo, pelo menos cerca de 5 μΕ, incluindo pelo menos cerca de 10 μΕ ou 25 μΕ, incluindo entre cerca de 5 eu e cerca de 200uE ou outras condições de iluminação que permitem desenvolvimento de plastídeo normal em uma temperatura de aproximadamente 23 a 25° C, e pode ser realizada até cerca de 35° C.
Exemplos
Aqueles versados na técnica vão compreender as muitas vantagens dos métodos e composições providos pela invenção. Os exemplos que seguem são incluídos para demonstrar as modalidades preferidas da invenção. Deve ser compreendido por aqueles versados na técnica, que técnicas 15 descritas nos exemplos que seguem representam técnicas constatadas pelos inventores funcionar bem na prática da invenção, e então podem ser consideradas constituir modos preferidos para sua prática. No entanto, aqueles versado na técnica devem, à Iuz da presente descrição, compreender que muitas mudanças podem ser feitas nas modalidades específicas que 20 são descritas e ainda obter um resultado igual ou similar sem se afastar do espírito e escopo da invenção. Todas as referências mencionadas aqui são aqui incorporadas a título de referência até o ponto que elas suplementem, expliquem, provejam um fundamento para, ou ensinem metodologia, técnicas ou composições empregadas nelas.
Exemplo 1
Separação de Material de Explante
As sementes são processadas manualmente ou submetidas à excisão automática em um descascador de arroz (por exemplo, Grainman® Laboratory Paddy Rice Sheller (por exemplo, Modelo N0 64-115-60-WDC; 30 Grain Machinery Manufacturing Corp., Miami, FL) ou, por exemplo, conforme descrito na Publicação de Patente U.S. 20050005321. A fim de obter material de explante meristemático, sementes de soja (cv. A3525; Asgrow Seed Company) foram processadas para separar o embrião, compreendendo tecidos meristemáticos, do revestimento da semente e cotilédone(s). O efeito do teor de umidade interna da semente de partida no momento da excisão sobre o rendimento do explante deste processo é mostrado na Tabela 1.
Tabela 1: Efeito do Teor de Umidade Interna sobre Rendimento do Explante
Teor de Umidade de Semente de Soja Estimativa de explante por Kg de semente processada 6,3% 1626 8,2% 939 11,5% 87 A temperatura da semente antes da preparação de material de explante também afetou o rendimento do explante. A Tabela 2 ilustra que explantes podem ser excisados em várias temperaturas, incluindo -20° C até temperatura ambiente.
Tabela 2: Efeito de Temperatura de Armazenamento de Semente sobre Rendimento do Explante__
Temperatura de armazenamento Estimativa de meristema por Kg de semente processada Temperatura ambiente (cerca de 23-26° C) 650,4 4o C 286,2 -20° C 267,3 Exemplo 2
Recuperação de material de explante
A Tabela 3 ilustra o rendimento de tecido de explante útil dado
teor de umidade de semente diferente no início do procedimento de excisão. Umidade de semente menor (cerca de 6,2%) permitiu maior rendimento de material de explante por peso de semente processada. Isto é notável, uma vez que o teor de umidade interna de semente de soja seca quando recémcolhida do campo é aproximadamente 9 a 14% e é idealmente mantida em 20 cerca de 11% por longo prazo (1 a 20 anos) de armazenamento. O teor de umidade maior permite que as sementes sejam manuseadas sem quebra e perda de vigor para o embrião. Os inventores constataram que sementes secas no teor de umidade maior eram muito menos quebradiças do que sementes secas para teores de umidade interna menores (3% a 7%). Esta constatação permite que a semente seja manuseada e armazenada no teor de umidade interna ideal para vigor (aproximadamente 9 a 12%), ainda manipuladas para extração ideal de explantes secos (sementes artificiais) através de secagem das sementes para aproximadamente 3% a 7% para atingir 5 uma estado quebradiço. Este estado quebradiço mantém o vigor do embrião, ainda permitindo uma divisão clara da semente entre os cotilédones, e então permite ambos maior qualidade e alto rendimento.
O teor de umidade ótimo para atingir um estado quebradiço e então permitir rendimento de processo alto e explante de qualidade de transformação alta pode variar com base em genótipo da soja e tipo de cultura. Este exemplo ilustra a metodologia necessária para otimizar condições para uma dada fonte de germoplasma ou tipo de sementes de planta. Tabela 3: Rendimento de tecido de explante útil obtido a partir de sementes com teor de umidade diferente. Teor de Tama¬ Rendi- % de Peso Meris¬ Explan¬ % de Número Estima¬ Estima¬ Estima- % de umida¬ nho da men-to rendi¬ da a- tema tes da¬ explan¬ de ex¬ tiva do tiva de ti-va de recupe¬ de da rodada de em¬ mento mostra conten¬ nifica¬ tes plante meris¬ meris¬ semen¬ ração semen¬ (gra¬ brião bruto total do ex¬ dos OU bons bons tema tema te por com te (%) mas) retor¬ (mg) plante restos em pe¬ por para por kg kg base nado através (mg) so 1000 rodada (conta¬ (conta¬ em mᬠ(gra¬ de ava¬ mg de total gem) gem) ximo mas) liação amos¬ (conta¬ teórico micros¬ tra gem) cópica (mg) 12,5 4203 67,6 1,6 500 170 328 34 68 4597 1094 6050 18,1 12,2 200 3,98 2,0 500 160 340 32 64 255 1274 6050 21,1 12,2 200 3,71 1,9 500 225 275 45 90 334 1670 6050 27,6 14,5 200 3,25 1,6 500 320 180 64 126 410 2048 6050 33,8 14,5 200 3,28 j 1,6 500 250 250 50 102 335 1673 6050 27,6 6,2 200 6,35 3,2 500 200 300 40 80 508 2540 6050 42,0 6,2 200 6,08 3,0 500 230 270 46 96 584 2918 6050 48,2 Exemplo 3
Esterilização de Sementes e/ou Material de Explante
Várias técnicas de esterilização de semente antes da excisão, bem como esterilização de explantes após excisão das sementes foram tes5 tadas. Esterilização pós-excisão de explantes secos usando gás cloro em uma câmara de dissecação a vácuo foi testada em intervalos de tempo variando de 15 minutos a 16 horas. Controle de contaminação aumentou com exposição mais longa a gás Cl, embora contaminação fúngica tenha aumentado em tratamentos onde a exposição a gás Cl tinha ultrapassado o limiar 10 de sobrevivência dos explantes.
Tratamentos com gás ozônio foram também testados. Ambos a semente inteira (antes da excisão) e os explantes secos (após excisão) foram expostos a gás O3 em uma câmara PLEXIGLAS (OSR-8 Ozone Generator; Ozone Solutions, Sioux Center, IA) em vários intervalos de tempo de 15 1 -24 horas. O3 foi usado em uma concentração de 467 ppm. Após a semente ser exposta a ozônio, material embriônico foi excisado e a viabilidade do explante foi medida. Ozonização de semente de soja por 12 horas ou menos não impactou a viabilidade de explantes subsequentemente isolados, mas diminuiu drasticamente a bioqueima encontrada em explantes. Ozonização 20 de explantes excisados secos por no mínimo 1-4 horas diminuiu a saúde do explante (isto é, número de embriões viáveis).
Testes adicionais em esterilização pré-excisão de semente inteira foram realizados usando uma solução de alvejamento de cloro ativo 200 ppm, seguido por um período de hidratação da noite para o dia (~9 horas) 25 em uma solução de cloro ativo 50 ppm. Essas sementes foram então deixadas secar em uma tampa de fluxo laminar (tipicamente por 12-48 horas) antes de serem excisadas mecanicamente. Uma modificação no protocolo de embebimento de alvejamento de 50% foi também testada, onde as sementes foram primeiro enxaguadas com uma solução de etanol a 70%. O etanol 30 foi imediatamente drenado (exposição total a etanol foi menos do que 5 segundos), e então o embebimento de alvejante 50% foi realizado tratando as sementes 3-15 minutos em alvejante 50% seguido por 3 enxágues com água e secagem das sementes da noite para o dia de modo que o teor de umidade fosse menos do que 8%. Luz UV pode ser também empregada para esterilizar o material de planta.
Exemplo 4
5 Hidratação de Sementes e Material de Explante
Estudos empregando novas estratégias de hidratação/germinação de pré-cultura foram testados. Os tipos de meios usados para esta etapa incluem "meio de germinação de feijão" (BGM; Tabela 11 de Meios), meio inócuo de soja (INO, Tabela 11 de Meios) e culturas de cultivo 10 de Agrobacterium de fase Iog preparadas (AGRO). A cultura de cultivo de Agrobacterium foi cultivada da noite para o dia em Caldo Lysogeny (LB, também geralmente referido como Luria-Bertani Broth) para fase log, e então centrifugada e ressuspensa para uma densidade óptica final a 660 nm de 0,25 a 0,6. O meio usado para a diluição é o mesmo que o meio inócuo de 15 soja. Plant Preservative Mixture (PPM®, Produto N°P820; Phytotechnology Laboratories, Shawnee Mission, KS) foi também testado em uma concentração de 2 mg/L (conforme recomendações do fabricante no rótulo). Os explantes foram embebidos nesta solução da noite para o dia a 4° C. Outras variações foram feitas na duração de exposição aos respectivos meios de 20 hidratação, nas várias temperaturas durante esta exposição e o grau de saturação nos respectivos meios. Os tempos de exposição testados variaram de 0 a 24 horas. As temperaturas durante tempos de exposição mais longos (aqueles maiores do que 4 horas) eram ou temperatura ambiente (~26° C), 23° C ou 4° C. Tempos de exposição de 4 horas ou menos foram também 25 todos testados em temperatura ambiente. Como uma alternativa para submergir completamente ou substancialmente saturar explantes com meios líquidos durante o processo de hidratação, alguns tratamentos empregaram o uso de papel filtro umedecido (líquido suficiente para umedecer, mas não saturar). Isto foi feito com papel filtro umedecido ou com BGM ou meio de 30 cultura de Agrobacterium. Hidratação foi realizada em uma variedade de recipientes, incluindo, mas não-limitado a, tubos de centrífuga cônicos, garrafas de vidro graduadas ou um recipiente de cultura de tecido PLANTCON (MP Biomedicals, Irvine1 CA).
Este exemplo também demonstra que hidratação pode ser feita em uma variedade de meios contendo vários tipos de carboidratos tal como glicose (INO) e sacarose (BGM). Outros carboidratos tal como galactose po5 dem ser úteis em meio de hidratação.
Exemplo 5
Transformação e Cultivo de Explantes de Soia
Transformação mediada por Agrobacterium seguido pela etapa de hidratação conforme indicado nas Tabelas 4-9. Explantes de meristema de soja foram transformados com pMON67438 compreendendo um gene CP4 EPSPS conferindo tolerância a glifosato e um gene repórter GUS. Explantes que tinham sido hidratados em alguma outra coisa que não meio de cultura de Agrobacterium, isto é, meio inócuo de soja (INO) ou água destilada estéril (SDW), meio de germinação de feijão (BGM) ou Plant Preservative Mixture, tiveram esse líquido removido, e então os explantes foram enxaguados duas vezes com água destilada estéril. Os explantes foram então postos em uma PLANTCON (se já não em um). Cultura de Agrobaeterium preparada (conforme acima descrito) foi adicionada ao recipiente (suficiente para cobrir todos os explantes dentro do PLANTCON). Os explantes que foram hidratados em cultura de Agrobaeterium para começar permaneceram nesta cultura, e foram também transferidos para um PLANTCON. Os explantes foram então submetidos a ferimento com sonificação por 20 segundo enquanto no PLANTCON de acordo com procedimentos padrão (Patente U.S. N0 7.002.058). Seguindo ferimento com sonificação, os explantes foram transferidos para PLANTCONS novos contendo um pedaço cortado sob medida de papel filtro. 2,5 mL a 5 mL de meio de inócuo de soja foram usados para umedecer o papel filtro. Os explantes foram coculturados a 23° C por 2-
4 dias ou no escuro ou na luz. Seguindo cocultura, os explantes foram postos na superfície de meio sólido de "woody plant medium" (WPM; Tabela 12) e implantados em "woody plant medium" sólido aproximadamente no 17o dia pós-inoculação, para o restante da fase de experimento de cultura de tecido. Galhos foram transferidos para "Bean Rooting Medium" para enraizamento (BRM; Tabela 13). Concentrações de vários hormônios podem ser manipuladas para realizar regeneração. Por exemplo, BAP pode ser usado a 0,04 ppm (0,18 μΜ) em WPM e IAA pode ser usado em cerca de 0,099 ppm (0,565 μΜ) em BRM. Outros reguladores de crescimento de planta e con5 centrações foram rotineiramente utilizados para facilitar transformação e regeneração, por exemplo, conforme descrito na Patente U.S. N° 6.384.301.
Os explantes que tinham sido postos dentro das placas de cavidade de ensaio para hidratação inicial foram deixados lá durante todo o tempo de duração do experimento, incluindo períodos de sonificação e cocultu10 ra. Para esses experimentos, meio líquido foi usado ao invés de meios sólidos, e foi substituído com meio fresco a -17 dias pós-inoculação. Isto demonstra que os explantes são condescendentes à cultura líquida bem como etapas de cultura de tecido sólida (à base de gel).
Exemplo 6
Comparação de Parâmetros de Excisão, Esterilização. Armazenamento e Hidratação de Explantes
Estudos subsequentes testaram uma variedade de parâmetros envolvendo métodos e condições de armazenamento, excisão e esterilização de semente; condições de armazenamento de explante; e condições de 20 transformação uma vez que elas impactam a habilidade de material meristemático excisado em iniciar formação de galho (SF)1 tendo sido ou nãotransformado, bem como frequência de transformação (TF). Esses parâmetros, para um ou ambos a semente e o material de explante, incluem procedimentos de esterilização pré- ou pós-excisão, condições de armazenamen25 to, condições de hidratação e condições de cultura de tecido subsequentes, incluindo a ausência ou presença de seleção.
No estudo SAG_709 (Tabela 4), sementes de soja inteiras foram esterilizadas antes da excisão através de imersão em uma solução de hipoclorito de sódio (alvejante) 50%. Seguindo a esterilização, as sementes fo30 ram enxaguadas e secas para um teor de umidade de <8%. Seguindo essas etapas, os explantes foram preparados e recuperados conforme descrito nos Exemplos 1 e 2. Os parâmetros estudados incluíam: duração do armazenamento antes da transformação de material de explante; temperatura de armazenamento; e meios de hidratação. Os resultados mostraram que os explantes da presente invenção podem ser usados para obter plantas transformadas sob uma faixa ampla de temperatura de armazenamento e uma 5 variedade de meios de hidratação. O resultado de teste de DNA mostrou uma distribuição normal de números de cópia com base no tamanho da amostra.
No estudo SAG_712 (Tabela 5), sementes de soja foram esterilizadas com gás Cl antes da excisão a seco. Seguindo a esterilização e excisão a seco, a duração de armazenamento e condições de hidratação foram variadas. Isto foi comparado com método de excisão a úmido conforme descrito na Publicação U.S. 20050005321 e Patente U.S. N0 7.002.058 (Trt 7).
No Estudo SAG_714 (Tabela 6), as sementes foram esterilizadas antes da excisão através de imersão em uma solução de hipoclorito de 15 sódio (alvejante) 50%. Seguindo esterilização, enxágüe, secagem e excisão a seco, os explantes foram armazenados por um a três dias antes da transformação em várias temperaturas (por exemplo, -20° C, 4° C e temperatura ambiente) e condições de hidratação foram também variadas. A habilidade de explantes tratados desta maneira em formar galhos (frequência de forma20 ção de galho; "SF") ou plantas transformadas (frequência de transformação; "TF") foi comparada com explantes que foram preparados através de um método de excisão a úmido", por exemplo, conforme descrito na Publicação do Pedido de Patente U.S. 20050005321 e então secos e armazenados (Trt 7 e Trt 8).
Transformação foi também demonstrada em explantes que fo
ram recuperados de uma semente hidratada ou embebida (referida como "excisão a úmido" no estudo SAG_714- Tabela 6, tratamentos 7 e 8; e também no estudo SAG_762- Tabela 8, tratamentos 1 e 2) mas onde o explante era apropriadamente desidratado. Métodos de excisão a úmido são descritos 30 na Publicação U.S. 20050005321 e Patente U.S. N0 7.002.058. Um processo típico para preparação de explantes através deste método é como segue:
1) Sementes secas são enxaguadas com água estéril ou uma solução de hipoclorito de sódio (variando de 0 ppm a ~30.000 ppm de cloro ativo, incluindo 50 ppm a 200 ppm de cloro ativo) por 3 a 20 minutos. O líquido é então drenado.
2) Aproximadamente 2 horas mais tarde, meio de re-hidratação é aplicado por 5 a 24 horas. Este meio de re-hidratação pode ser BGM1 água
deionizada estéril, água da torneira estéril ou limpa ou uma solução desinfetante diluída, tal como hipoclorito de sódio com um teor de cloro ativo de 50 a 1000 ppm.
3) Seguindo o meio de re-hidratação, as sementes podem ser imediatamente excisadas para isolar explantes de embrião (ou através de
métodos mecânicos ou manuais) ou podem ser enxaguadas mais com água ou outro desinfetante diluído, tal como hipoclorito de sódio com um teor de cloro ativo de 50 a 1000 ppm por 15 minutos.
4) Seguindo sua excisão e recuperação, o explante é seco e preparado para armazenamento ao ser espalhado em uma bandeja rasa sob
um fluxo de ar. Isto é tipicamente feito em uma tampa de cultura de tecido de ar limpo. Os explantes foram tipicamente deixados secar por ~18 horas a 24 horas.
5) Os explantes secos foram armazenados (tipicamente em tubos cônicos de 50 mL vedados). A duração do armazenamento antes do
início da transformação pode variar de minutos a semanas ou meses. As condições de temperatura durante o armazenamento podem variar da temperatura ambiente até -80° C.
6) Seguindo o armazenamento desejado, os explantes foram hidratados para transformação conforme descrito no Exemplo 4.
O Estudo 716 (Tabela 7) testou o efeito de um período de armazenamento de 7 dias seguindo a excisão a seco sobre a habilidade de explantes em formar galhos.
O Estudo 762 (Tabela 8) testou o efeito de um período de armazenamento de 7 semanas sobre a habilidade de material de explante excisado em formar galhos. Um embrião excisado seco que foi armazenado por até 7 semanas foi capaz de produzir uma planta transgênica. Um sumário geral de formação de galho e frequências de transformação para os estudos listados acima é encontrado na Tabela 9. Os resultados indicam que explantes de soja excisados secos bem como excisados úmidos (e então secos) permanecem viáveis, retêm a habilidade em
formar galhos e plantas e podem ser transformados com sucesso com DNA heterólogo, mesmo após armazenamento a seco de embriões excisados por períodos de tempo de até 8 semanas sob uma variedade de condições de temperatura e tipos de meios de hidratação. Frequência de formação de galho (SF) e frequência de transformação (TF) de explantes excisados secos e 10 armazenados ou explantes excisados úmidos, secos e armazenados comparavam-se favoravelmente com aquelas de explantes que não eram armazenados, de acordo com métodos anteriormente descritos (Publicação U.S. 20050005321). O número de cópia e presença de transgenes introduzidos (por exemplo, CP4), e a presença de seqüências de estrutura principal de 15 vetor (por exemplo, oriV) foram também testadas através de análise Southern ou através do ensaio INVADER (por exemplo, Mein e outros, 2001) na geração RO (Tabelas 5-9). Análise de DNA de plantas R1 deu os mesmos resultados demonstrando transformação estável e herdável. Tabela 4: SAG 709 Trt 1 Trt 2 Trt 3 Trt 4 Trt 5 Trt 6 Trt 7 Trt 8 Trt 9 Trt 10 Trt 11 Condi¬ Esterilização em pré-excisão em 50% de alvejamento ções de esterili¬ zação Condi¬ 2 dias @ 2 dias @ 2 dias @ 2 dias @ 2 dias @ 1 dia @ 1 dia @ 1 dia @ 2 dias @ 2 dias @ 2 dias @ ções de Temp. Temp. Temp. 4°C 4°C 4°C 4°C 4°C -20°C -20°C -20°C armaze¬ Ambiente Ambiente Ambiente namento Condi¬ 4 horas 4 horas 4 horas 4 horas 4 horas 4 horas 4 horas 4 horas 4 horas 4 horas 4 horas ções de em tubos em tubos em tubos em tubos em tubos em tubos em tubos em tubos em tubos em tubos em tubos hidrata¬ cônicos cônicos cônicos cônicos cônicos cônicos cônicos cônicos cônicos cônicos cônicos ção de 15 de 15 de 15 de 15 de 15 de 15 de 15 de 15 de 15 de 15 de 15 mL; 5 mL mL; 5 mL mL; 5 mL mL; 5 mL mL; 5 mL mL; 5 mL mL; 5 mL mL; 5 mL mL; 5 mL mL; 5 mL mL; 5 mL de INO de agro de SDW de INO de agro de SDW de INO de agro de INO de agro de SW Explan¬ 35 34 39 36 56 53 52 96 42 39 30 tes usa¬ do Continuação. Galhos 3 0 7 7 13 5 10 9 9 6 4 obtidos SF 8,57% 0,00% 17,95% 19,44% 23,21% 9,43% 19,23% 9,38% 21,43% 15,38% 13,33% Galhos 1 0 0 3 2 1 1 2 3 2 1 enraiza¬ dos obti¬ dos Ensaio 1 0 0 3 2 1 1 1 3 1 1 de raiz positiva para GUS TF 2,86% n/a n/a 8,33% 3,57% 1,89% 1,92% 2,08% 7,14% 5,13% 3,33% Resultados de teste de DNA para número de cópia (OriV - ou +) Negativo 0 0 0 0 NA 1 Cópia 0 0 0 2 (-) NA 1(-) 1 (-) 2 Cópias 0 0 0 1(-) 1 NA 1 (-) 1(-) 3 Cópias 0 0 0 0 NA 1 2 K-) >/=4 1 (-) 0 0 0 1 (+) 1(-) NA Cópias Continuação ... Médias de Tratamento Tratamento Média Resultados de Teste de DNA (GA MA) SF TF Negativo 1-2 cópias 3-4 cópias > 4 cópias Temperatura Ambiente 8,84% 0,95% 0 0 0 100% 4 graus 16,14% 3,56% 0 69% 13% 18% -20 graus 16,72% 5,20% 0 33% 67% 0 2 dias de armazenamento 14,92% 3,80% 0 56% 44% 0 1 dia de armazenamento 12,68% 1,96% 0 67% 33% 0 hidratação em Agro 11,99% 2,70% 0 40% 20% 40% hidratação em INO 17,17% 5,06% 0 57% 29% 14,0% hidratação em SDW 13,57% 1,74% 0 0 100% 0 Tabela 5: SAG 712 Trt 1 Trt 2 Trt 3 Trt 4 Trt 5 Trt 6 Trt 7 Condições de esteri¬ Esterilização em pré-excisão em gás Cl lização Condições de arma¬ 2 dias @ 2 dias (S) 2 dias @ 4°C 1 dia @ 4°C 1 dia @ 1 dia @ 4°C Convencional (por zenamento 4°C 4°C 4°C exemplo., US 2003/0110532) Condições de hidra¬ 4 horas 4 horas 4 horas em 4 horas em 4 horas em 4 horas em Convencional (por tação em tubos em tubos tubos côni¬ tubos côni¬ tubos cô¬ tubos cônicos exemplo, US cônicos cônicos cos de 15 cos de 15 nicos de de 15 mL; 5 2003/0110532) de 15 mL; de 15 mL; 5 mL de mL; 5 mL de 15 mL; 5 mL de SDW 5 mL de mL; 5 mL SDW INO mL de aINO de agro gro N0 de explan- 54 58 47 92 90 91 100 tes/estudo Número de galhos 3 4 1 16 8 9 8 obtido SF 5,56% 6,90% 2,13% 17,39% 8,89% 9,89% 8,00% Continuação Número de galhos 0 0 0 3 2 3 3 enraizados obtidos Ensaio para raiz po¬ 3 2 2 3 sitive para GUS TF n/a n/a n/a 3,26% 2,22% 3,30% 3.00% Resultados para teste de DNA para número de cópia (OriV - ou +) Negativo 0 0 0 0 0 1 Cópia 0 0 0 K-) 2 (-) 2 (-) K-) 2 Cópias 0 0 0 K-) 0 3 Cópias 0 0 0 0 K-) 1 >/= 4 Cópias 0 0 0 0 0 Médias de Tratamento Tratamentos Média Resultados de teste de DNA (GAMA) SF TF Negativo 1-2 cópias 3-4 cópias >4 cópias 4 graus 8,46% 1,46% 0 83% 17% 0% 2 dias de armaze¬ 4,86% n/a 0 0 0 0 namento Continuação ... 1 dia de armazena¬ 12,06% 2,93% 0 83% 17% 0 mento hidratação em Agro 7,89% 1,11% 0 100% 0 0 hidratação em INO 11,47% 1,63% 0 100% 0 0 hidratação em SDW 6,01% 1,65% 0 67% 33% 0 Tabela 6: SAG 714 Trt 1 Trt 2 Trt 3 Trt 4 Trt 5 Trt 6 Trt 7 Trt 8 Condições de 3 dias @ 3 dias @ 3 dias @ 1 dia @ 1 dia @ 2 dias @ autoex- autoexcisão úmido, então se¬ armazena¬ 4°C 4°C 4°C TA 4°C -20°C cisão co; armazenar por 1 dia @ 4°C mento úmido, então seco; armaze¬ nar por 1 dia @20°C Condições de 4 horas 4 horas 4 horas 4 horas 4 horas 4 horas 4 horas 4 horas em tubo de 50 mL; 5 hidratação em tubos em tubos em tu¬ em tubos em tu¬ em tubo em tubo mL de Agro cônicos cônicos bos cô¬ cônicos bos cônico de de 50 de 15 de 15 mL; nicos de de 15 cônicos 50 mL; 5 mL; 5 mL; 5 mL 5 mL de 15 mL; 5 mL/ 5 mL de 15 mL de mL de de INO agro mL de de Agro mL; 5 Agro Agro SDW mL de SDW Método de Pré-excisão 50% de alvejamento Pós- Protoco- Protocolo-padrão esterilização excisão IoGás Cl padrão N0 de explan- 98 89 72 62 ! 50 86 34 44 tes/estudo Continuação ... Número de 8 13 4 6 6 0 7 9 galhos obtido SF 8,16% 14,61% 5,56% 9,68% 12,00% 0,00% 20,59% 20,45% Número de 2 3 0 1 2 0 2 1 galhos enrai¬ zados obtidos Ensaio de raiz 2 2 1 2 2 1 positiva para GUS TF 2,04% 3,37% n/a 1,61% 4,00% n/a 5,88% 2,27% Resultados de teste de DNA para número de cópia (OriV - ou +) Negativo 1 Cópia 1 2 Cópias 1 2 1 3 Cópias 1 1 >/= 4 Có¬ pias Continuação... Médias de Tratamento Tratamentos Média Resultados de teste de DNA (GAMA) SF TF Negativo 1-2 cópias 3-4 cópias > 4 cópias 4 graus 10,08% 2,35% 0 50% 50% 0 Temp. ambiente 9,68% 1,61% 0 0 0 0 1 dia de armazenamento 10,84% 2,81% 0 100% 0 0 3 dias de armazenamento 9,44% 1,80% 0 33% 67% 0 hidratação em Agro 12,14% 2,49% 0 67% 33% 0 hidratação em INO 8,16% 2,04% 0 50% 50% 0 hidratação em SDW 8,78% 2,00% 0 100% 0 0 Excisado úmido, então seco 20,52% 4,08% 0 100% 0 0 Tabela 7. SAG 716 Trt 1 Trt 2 Trt 3 Condições de armazenamen¬ 7 dias @ 4°C 7 dias @ 4°C 7 dias @ 4°C to: Condições de hidratação 4 horas em tubos cônicos 4 horas em tubos cônicos de 4 horas em tubos cônicos de 50 de 50 mL; 5 mL de Agro 50 mL; 5 mL de INO mL; 5 mL de SDW Método de esterilização Pré-excisão 50% de alvejamento N0 de explantes/estudo 104 122 96 Número de galhos 3 1 2 SF 2,88% 0,82% 2,08% Número de galhos enraizados 0 0 0 Médias de Tratamento: SF Hidratação em Agro 2,88% Hidratação em INO 0,82% Continuação ... Hidratação em SDW 2,08% Média de todos os testes em 7 1,93% dias de armazenamento Tabela 8. SAG 762 Trt 1 Trt 2 Trt 3 Trt 4 Condições de armazena¬ Autoexcisão úmido, Autoexcisão úmido, Excisado seco, ar¬ Excisado seco, armaze¬ mento: então seco; armaze¬ então seco; armaze¬ mazenado ~8 sema¬ nado ~7 semanas @ 4o C nado ~7 semanas @ nado ~7 semanas @ nas @ 4o C 4o C 20° C Condições de hidratação: 4 horas em refratário 4 horas em refratário 4 horas em tubos 4 horas em tubos cônicos béquerde 150 mL; 50 béquerde 150 mL; 50 cônicos de 50 mL; 25 de 50 mL; 25 mL de INO mL de INO mL de INO mL de INO Método de esterilização: Pré-germinação como para SOP Pré-excisão 50% de alvejamento N0 de explantes/estudo 425 650 275 321 Número de galhos 2 12 6 5 SF 0,47% 1,85% 2,18% 1,56% Número de galhos enrai¬ 0 0 0 1 zados Ensaio de raiz para GUS 1 TF n/a n/a n/a 0,31% Tabela 9: Sumário de formação de galho e frequências de transformação obtidas Médias de Trata¬ mento Tratamentos Média Resultados de teste de DNA (GAMA) SF TF Negativo 1-2 cópias 3-4 cópias > 4 cópias Temperatura am¬ 9,26% 1,28% 0,00% 0,00% 0,00% 100,00% biente 4 graus 11,56% 2,46% 0,00% 67,33% 26,67% 6,00% -20 graus 16,72% 5,20% 0,00% 57,00% 42,00% 0,00% SF TF Negativo 1-2 cópias 3-4 cópias >4 cópias 1 dia de armaze¬ 11,86% 2,57% 0,00% 83,33% 16,67% 0,00% namento 2 dias de armaze¬ 9,89% 1,90% 0,00% 56,00% 44,00% 0,00% namento 3 dias de armaze¬ 9,44% 1,80% 0,00% 33,00% 67,00% 0,00% namento Mais de 7 sema¬ 1,51% 0,08% 0,00% 100,00 0,00% 0,00% nas de armazena¬ mento Continuação... SF TF Negativo 1 -2 cópia 3-4 cópias > 4 cópias hidratação em INO 9,41% 2,18% 0,00% 78,50% 14,50% 7,00% hidratação em A- 8,73% 1,57% 0,00% 69,00% 15,67% 4,67% gro hidratação em 7,61% 1,35% 0,00% 55,67% 44,33% 0,00% SDW SF TF Negativo 1 -2 cópia 3-4 cópias > 4 cópias Excisado úmido & 10,84% 2,04% 0,00% 100,00% 0,00% 0,00% seco Excisado seco 9,64% 2,03% 0,00% 59,69% 25,58% 14,71% Outro parâmetro que foi variado em transformação mediada por Agrobacterium foi uma mudança no momento de início da cultura de Agrobacterium, e início de ferimento por sonificação. Ao invés de esperar por 1 hora ou mais para os explantes secos hidratarem, procedimentos de feri5 mento com sonificação em alguns estudos foram iniciados imediatamente quando da submersão no meio de hidratação. Alternativamente, alguns tratamentos receberam um atraso de 1 a 2 dias no início da inoculação da cultura de Agrobacterium. Ao invés de serem inoculados imediatamente após a etapa de hidratação, esses explantes foram postos em papel filtro umedeci10 do durante o período de atraso e então inoculados e procedimentos de sonificação foram completados. Em um tratamento diferente, a etapa de ferimento com sonificação foi retirada do procedimento completamente, enquanto explantes estavam sendo hidratados em papel filtro umedecido com cultura de Agrobacterium.
Foi também testado o início retardado de pressão de seleção
(por exemplo, exposição a glifosato). Ao invés de transferir explantes para meios sólidos com composto de seleção em 2-4 dias pós-inoculação os estudos receberam WPM líquido sem-glifosato por mais 48 horas ou 1 semana antes de serem transferidos para o WPM sólido com composto de seleção 20 para terminar ou pelo menos retardar o crescimento de células nãotransformadas.
Uma alternativa para transformação mediada por Agrobaeterium foi também testada. Explantes excisados secos foram inoculados com linhagens RL 2370LBA & RL 204G de Rhizobium leguminosarum, pMON96033. 25 O protocolo para transformação mediada por Rhizobium era similar à transformação mediada por Agrobacterium, exceto pela substituição da linhagem bacteriana com Rhizobium.
Uma citocina, 6-Benzilamino purina (BAP), foi também testada como um aditivo para o meio inócuo de cultura de Agrobacterium (também referido como meio inócuo de soja, INO) (por exemplo, McCabe e Martinelli, 1993).
Exemplo 7 Preparação e Transformação de Explantes de Algodão
Explantes de meristema de algodão excisados (cv STN 474) secos após excisão e armazenados secos por 30 dias ou mais são viáveis após reidratação e transformação de cocultura com Agrobacterium. O proto5 colo para transformação de meristema de algodão seguiu essencialmente o método de McCabe e Martinelli (1993). As sementes foram excisadas e preparadas como por McCabe & Martinelli (1993), com a exceção que embriões excisados foram espalhados e deixados em um recipiente aberto até secarem. Condições de armazenamento, e procedimentos de pré-esterilização de 10 semente, re-hidratação, inoculação com Agrobacterium, cocultura e cultura de tecido eram essencialmente idênticos àqueles descritos para soja. De acordo com os resultados de soja, galhos e folhas jovens foram observados em explantes de algodão culturados seguindo transformação de tecido meristemático com DNA exógeno.
Exemplo 8 Meios Usados
Composto: Quantidade Estoque BT N0 1 10 mL Estoque BT N0 2 10 mL Estoque BT N0 3 3 mL Estoque BT N0 4 3 mL Estoque BT N0 5 1 mL Sacarose 25 g Ajustar para pH 5,8. Adições antes do uso: Por 1 L Cefotaxima (50 Mg/Ml) 2,5 mL Estoque de Fungicida 3 mL Estoaue BT Dara Meio de Germinação de Feiião Estoque BT 1 (1 litro) KNO3 50,5 g NH4 NO3 24,0 g MgS04*7H20 KH2PO4
Estoque BT 2 (1 litro)
CaCI2*2H20 Estoque BT 3 (1 litro)
H3BO3 MnSO4H2O ZnS047H20 Kl
NaMo04*2H20 CuS04*5H20 CoCI4*6H20 Estoque BT 4 (1 litro)
Na2EDTA FeS04*7H20
Estoque BT 5 (500 ml)
Tiamina-HCI Ácido de Nicotina Piridoxina-HCI Estoque de Fungicida (IOOmL)
Clorotalonila (Bravo)
Captano 50% WP
Adicionar água destilada estéril para 100 mL Tabela 11 Meio Inócuo de Soia (INO)
25
Estoque N0 1 (Ingredientes em quantidades maiores) Estoque B5 N0 2 (Cloreto de Cálcio)
Estoque B5 N0 3 (Ingredientes em quantidades menores) Estoque B5 N0 5 (Ferro)
Nitrato de Potássio (KNO3)
Glicose
MES
49,3 g 2,7 g
17,6 g
0,62 g 1,69 g 0,86 g 0,083 g 0,072 g
0,25 mL de estoque 1,0 mg/mL 0,25 mL de estoque 1,0 mg/mL
1,116 g 0,834 g
0,67 g 0,25 g 0,41 g
75% WP
1.0 g
1.0 g
quantidade por litro 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 9 30 g 3,9 g Adicionar água até 1L
pH inicial: Ajustado para 5,4 com KOH
Autoclave
Estoque B5 N0 4 (Vitaminas) (F.S.)
Armazenar em temperatura ambiente Estoque B5 N01 Água TC
Sulfato de magnésio Sulfato de amônio 10 Fosfato de Sódio Anidro Monobásico Anidro Agitar até completamente dissolvido Trazer para 1 L com água TC Estoque B5 N0 2 Água TC 15 Cloreto de Cálcio
Agitar até completamente dissolvido Trazer para 1L com Água TC Estoque B5 N0 3 Água TC Ácido Bórico
Sulfato de Manganês Heptaidrato de Sulfato de Zinco Iodeto de potássio Di-hidrato de Molibdato de Sódio Sulfato Cúprico (1 mg/mL)
Cloreto de Cobalto (1 mg/mL)
Agitar até completamente dissolvido Trazer para 1L com Água TC Estoque B5 N0 4 30 Água TC Mio-Inositol Ácido Nicotínico
1 mL
Quantidade por litro
750 mL
100 g
53,6 g
60 g
Quantidade por litro 750 mL 60 g
Quantidade por litro
750 mL
0,3 g
1 9
0,2 g
0,075 g
0,025 g
2.5 mL
2.5 mL
Quantidade por litro 750 mL 10 g 0,1 g 10
15
20
25
30
HCI Piridoxina HCI Tiamina
Agitar até completamente dissolvido Trazer para 1L com Água TC Estoque B5 N0 5 Água TC Sequestrene
Agitar até completamente dissolvido
Trazer para 1L com Água TC
Tabela 12 Woodv Plant Medium (WPM)
com glifosato 75 uM como um agente de seleção
Composto
Sal de WPM (Phytochem)
Sacarose
Gluconato de Sódio (Sigma)
Fungicida Clearys (CarIin)
PH
AgarGeI (Sigma)
Autoclave
Carbenicilina (40 mg/ml)
Ticarcilina (100 mg/ml)
Cefotaxima (50 mg/ml)
Glifosato (Estoque FS 0,5M)
0,1 g 1 9
Quantidade por litro
750 mL
2,8g
Quantidade por litro 2,41 g
20.0 g 1,29 g 0,03 g 5,6
4,Og
5.0 ml
1.0 ml
4.0 ml 0,15 ml
Tabela 13 BRM (Meios de Enraizamento de Feijão) (para 4L)
Sais MS 8,6 g
Mio-Inositol 0,40 g
Estoque de Vitamina Meio de Enraizamento de Feijão 8 mL
L-Cisteina (10 mg/mL) 40 mL
Sacarose(UItraPura) 120 g pH 5,8
Ágar Lavado 32 g Adições após Autoclave: Estoque de hormônio BRM Ticarcilina/ácido clavulânico
20.0 mL
4.0 mL
(100 mg/mL Ticarcilina)
Estoque de Vitamina de Meio de Enraizamento de Feijão (1 Litro)
Glicina
1,0 g 0,25 g 0,25 g 0,05 g
Ácido Nicotínico HCI Piridoxina HCI Tiamina
Estoque de Hormônio BRM (Quantidade por 1 litro) IAA 6,0 mL (0,033 mg/mL)
SDW 4,0 mL Exemplo 9
Excisão de Semente Única de Alto Rendimento
vés do uso de um sistema de singulação para prover sementes individuais (singuladas) para processamento. Após singulação, a semente (por exemplo, uma semente de soja) é manipulada através de um sistema de copo de vácuo para alocar a semente. A semente é então posta entre um conjunto de copos de vácuo e a semente é presa entre os copos, permitindo remoção do 20 revestimento da semente através do uso de um sopro de ar de alta pressão alternativamente uma disposição similar para pulsar, jato de areia, ou sopro de ar o revestimento da semente. Conforme mostrado nas figuras 2-3, a semente (16) é posta no copo de vácuo inferior (6) e a semente é presa abaixando um copo de vácuo superior (6). A semente e os dois copos de vácuo 25 são então girados em direções opostas para produzir um ponto ou plano de força de cisalhamento (5) ao longo do centro do eixo elíptico da semente para facilitar a divisão da semente no plano do eixo elíptico. Quando da separação o copo de vácuo superior é levantado e/ou um dos geradores de vácuo (8) é ligado, permitindo manipulação do explante e sua separação de 30 outras porções da semente. O explante pode então ser movido para um local desejado tal como um tubo ou uma placa com cavidade. Nas figuras 4-5 um conceito similar é executado, com a inclusão de uma superfície serrilhada de
O processo de excisão a seco pode ser também realizado atrametal para ajudar a girar a semente sem se dividir. O sistema inclui localização de vácuo e unidades para pegar. Embora o explante possa compreender algum tecido cotiledonário em adição ao seu tecido embriônico, ele contém pelo menos um pouco da região meristemática do embrião de modo que 5 tipicamente o explante pode produzir um galho com 12 semanas do início das condições de cultivo de cultura de tecido.
O objetivo deste processo é remover o tecido meristemático da semente sob condições secas em uma base de velocidade alta de semente única e então pôr o explante em um recipiente adequado para etapas de 10 transformação adicionais. Processamento de explante adicional (por exemplo, esterilização, escolha ou hidratação) pode ser também realizado entre a remoção do explante da semente e sua liberação para o recipiente. Processamento adicional poderia também incluir imagem de avanço do explante para traços e características desejáveis, tratamentos de esterilização e 15 transformação. Alternativamente, a semente poderia ser filmada e classificada quanto à viabilidade e adequabilidade antes de ir para o processo de singulação e remoção de explante. Tais métodos permitem que excisão de explante de alto rendimento possa ser feita mais eficientemente através de sistemas paralelos.
As figuras 2-5 e 7-9 ilustram modalidades e separadores mecâ
nicos e limpadores/esterilizadores para uso na excisão de tecido embriônico transformável a partir de semente. As figuras 2-5 ilustram mecanismos para manter uma única semente conforme uma força de cisalhamento é aplicada. As figuras 7-9 ilustram modalidades para limpar e sanitizar mecanicamente 25 material de explante usando, por exemplo, um gerador de íon, placas carregadas para coletar mofo, pó, etc; ou lâmpadas germicidas UV.
Com referência agora às figuras 2-5, que geralmente ilustram exemplos de um aparelho mecanizado para excisão de tecido embriônico a partir de uma semente singulada (16), a semente singulada é mantida de modo a aplicar uma força de cisalhamento conforme descrito. Nas figuras 2-
5, os primeiro e segundo copos de vácuo (6) e primeiro e segundo sentinelas serrilhados (7) se viram em direções opostas, enquanto uma única semente está parada ou é apertada entre eles, resultando em quebra da semente singulada. Outros meios para segurar a semente singulada, tal como rolos ou redes que permitam a aplicação de uma força de cisalhamento apropriada, podem ser também usados.
Quando da quebra da semente e excisão de tecido embriônico
transformável, o explante compreendendo tecidos embriônicos (por exemplo, figura 1) pode ser movido para uma localização ou recipiente desejado para uso imediato ou armazenamento sob condições apropriadas, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 6 acima. Este método para excisão de mate10 rial de explante a partir de semente singulada permite preparação de alto rendimento automática de quantidades convenientes de tecidos embriônicos transformáveis.
Procedimentos de limpeza, escolha, esterilização e seleção podem ser aplicados à semente não-excisada a granel, ou seguindo singulação, ou eles podem ser aplicados a material de explante seguindo excisão. As figuras 7-9 ilustram limpador/sanitizadores exemplares para realização de tais operações em material de explante.
Exemplo 10
Equipamento Empilhado para Preparação de Explante com Alto Rendimento Conforme mostrado na figura 10, as sementes são postas no
aparelho mecanizado no alto (por exemplo, um descascador Grainman®; vide Exemplo 1) para serem divididas conforme também descrito, por exemplo, no Exemplo 9 e na figura 6. Muito do material leve, tal como revestimentos de semente, é separado através de aspiração durante o processo de ex25 cisão, e as frações de semente mais pesadas, tal como pedaços de cotilédone e explantes, caem para separação adicional de cotilédones de outro material de explante. Nesta configuração "empilhada" (figuras 10-11), a fração mais pesada agora cai diretamente em um separador automático que separa os cotilédones dos explantes, por exemplo, através de exclusão por 30 tamanho com peneiras de malha vibratórias e gravidade (por exemplo, conforme conseguido pelo CLIPPER OFFICE TESTER ou componente similar). Fluxo de ar pode ser também usado para aspirar pó e outros restos de semente leves para fora do material desejado, para limpar e/ou esterilizar o material (por exemplo, figuras 7-9; figura 11). Essas máquinas e processos são também descritos individualmente (por exemplo, Exemplo 9), no entanto, sua combinação através de empilhamento para fluxo contínuo representa 5 um aperfeiçoamento adicional no processo e aparelho.
Exemplo 11
Transformação de explantes de soia excisados secos armazenados por períodos de tempo longos
Explantes excisados secos foram armazenados por até 20 me10 ses a -20° C a 4o C e então testados quanto à sobrevivência, transformabilidade e vigor. Sobrevivência de explante e vigor geral pareciam ser similares em todos os grupos de tratamento, sem importar as condições de armazenamento ou temperatura comparado com tratamento de controle (Tratamento 1). Isto demonstra a habilidade para armazenar explantes excisados se15 cos por quase dois anos sem dano. Explantes de cada tratamento foram testados quanto à expressão GUS transiente 4 dias após inoculação. A Tabela
14 mostra uma comparação de expressão gus específica de meristema entre tratamentos, classificada em uma escala de 0-9, com 0 sendo nenhuma expressão visível e 9 sendo expressão extensiva em todos os 3 meristemas 20 do embrião. Isto demonstra que explantes excisados secos podem não apenas sobreviver a armazenamento a longo prazo em várias condições sem perda significante de vigor, mas eles também retêm tendência à transformação. Então é agora possível excisar grandes quantidades de explantes durante momentos fora de pico para uso posterior, o que representa economi25 as de custo potenciais significantes e flexibilidade no planejamento e execução de estudos de transformação. Tabela 14: Efeito da duração de armazenamento e temperatura sobre transformação de explante _
Tratamento Técnica de Técnica de Duração Temperatura Expres Esterilização Excisão do arma¬ de armaze¬ são de de Semente zena¬ namento gus mento transiente (escala de 0-9) 1 & 2 enxágüe com Excisão a Nenhuma NA 0,90, alvejante seco auto¬ 1,60 50% mática com descascador de arroz Grainman 3 enxágüe com Excisão a 17 meses 4o C 0,20 alvejante seco auto¬ 50% mática com descascador de arroz Grainman 4 enxágüe com Excisão a 17 meses -20° C 0,10 alvejante seco auto¬ 50% mática com descascador de arroz Grainman 5 enxágüe com Excisão a 20 meses 4o C 0,70 alvejante seco manual 50% 6 enxágüe com Excisão a 20 meses -20° C 1,50 alvejante seco manual 50% Exemplo 12
Identificação de Composições e Condições de Cultura de Pré-inoculacão
(Pré-cultura) Adequadas
É provável que explantes excisados secos estejam ainda em um estado de semidormência quando eles são inoculados com Agrobacterium para transformação. Então foi desenvolvido um método para estimular a atividade metabólica dos explantes excisados secos antes de inoculação com Agrobacterium, para aumento de sua competência de transformação. Isto é, através de manipulação da biologia do explante seco, é possível aumentar a % de eventos positivos da linha germinativa por explante em 2 a 10 vezes.
Várias composições de meio: BGM (Tabela 10), INO (Tabela 11) ou OR (Tabela 15) foram testadas em temperaturas de 23° C e/ou 28° C, e sob condições de luz/escuro diferentes de 1 a 5 dias, quanto à sua habilidade em aumentar a competência de transformação. Após etapa de pré10 cultura, os explantes foram agrupados e inoculados com a cultura de Agrobacterium de acordo com o método descrito no Exemplo 5. Ensaios de expressão GUS transiente realizados em explantes mostraram atividade GUS alta nos tratamentos de pré-cultura após 2 dias e 4 dias de cocultura.
Perdas de planta aconteceram devido à infecção fúngica em al15 guns dos experimentos de pré-cultura, mas TF geral dos explantes excisados secos que foram pré-culturados em papéis filtro umedecidos com BGM a 23° C no escuro por 5 dias parecia ser maior quando comparado com explantes excisados secos que não foram pré-culturados. As perdas devido à contaminação fúngica poderiam ser mitigadas usando um agente antifúngico 20 tal como BRAVO 75 e Captan 50 em cerca de 1% cada um durante a etapa de pré-cultura e/ou cocultura. Análises Southern blot e INVADER das plantas produzidas neste exemplo com uma sonda CP4 confirmaram a natureza transgênica dessas plantas.
Tabela 15: Meio Orqanoqênico de Soia (OR)
Composto Por 4 Litros
SaisdeMS 17,2 g
Sais de MS 3X Menor 40 ml
Ácido Nicotínico (1 mg/ml) 4 ml
HCI Piridoxina (1 mg/ml) 4 ml
HCI Tiamina (1 mg/ml) 46,8 ml
Sacarose (Ultra Pura) 120 g
Mio-Inositol (Grau de Cultura Celular) 0,40 g pH 5,8
Ágar Lavado 32 g
Adições após Autoclave:
Prolina (Estoque 2,5 m) 19,2 ml
Estoque de Hormônio TSG/OR 40,0 ml
Tabela 16: Efeito de pré-cultura sobre explante seco; frequência de transformação usando pMON1Q343.____
Tipo de Composição Explantes Galhos Enrai¬ TF % de Per¬ Explante de Meios e zados da Fúngi¬ Condições de ca (PlantPré-cultura cons) Úmido 300 15 5,00% 0% Seco Nenhum 650 6 0,92% 13% Seco BGM, 5 d 23° 972 29 2,98% 0% escuro Seco BGM, 5 d 365 1 0,27% 44% 23°C 16/8 Iuz Seco BGM, 5 d 315 3 0,95% 7% 28°C escuro Seco BGM, 5 d 188 1 0,53% 62% 28°C16/8 Iuz Os estudos foram repetidos comparando dois construtos, pMON101343, compreendendo um T-DNA que compreende um gene CP4 10 especificando resistência a glifosato e uma origem de replicação oriV, e pMON 107350, compreendendo um T-DNA que compreende um gene CP4 especificando resistência a glifosato e uma origem de replicação OriR (por exemplo, vide US20070074314), na estrutura principal do vetor. Novamente, pré-cultura de explantes secos reforçou TF conforme comparado com a TF 15 de explantes secos de não-pré-cultura, conforme mostrado na Tabela 17. Tabela 17: Estudos adicionais sobre pré-cultura de explantes excisados secos __
Tipo de explante e vetor N0 de Explantes N0 de Galhos Enrai¬ TF zados PMON101343 Úmido 535 16 2,99% Seco 1331 8 0,60% Continuação ...
Pré-Cultura Seca 2437 43 1,76% pMON107350 Úmido 671 11 1,64% Seco 190 0 0,00% Pré-Cultura Seca 500 9 1,80% Conforme mostrado na Tabela 18, explantes excisados secos
pré-culturados também deram TFs maiores quando explantes foram culturados em meio de regeneração líquido (meios da Tabela 12 exceto AgarGeI) 5 que foi removido e adicionado automaticamente usando um sistema robótico. TF parecia ser ainda maior com o meio de regeneração líquido com uma etapa de pré-cultura. Explantes excisados úmidos em meio líquido pareciam ter tido TF baixa devido à contaminação.
Pré-cultura surpreendentemente melhora a competência para transformação e melhora a uniformidade de transformação. Tais aperfeiçoamentos reduzem a variabilidade durante as rodadas de produção em escala industrial para produção de plantas de soja transgênicas e são prováveis de melhorar TF onde agentes de seleção em geral dão TFs menores.
Tabela 18: Pré-cultura de explantes excisados secos: comparação de meios sólidos e líquidos._
Tipo de ex¬ Composi¬ Meio de re¬ Explan¬ Galhos TF plante ções de Mei¬ generação tes Enraiza¬ pMON101343 os e Condi¬ dos ções de Précultura Úmido Nenhum WPM sólido 460 17 3,70% Úmido Nenhum WPM líquido 31 0 0.00% Seco Nenhum WPM sólido 1286 8 0.62% Seco Nenhum WPM líquido 128 0 0.00% Seco BGM, 5 d WPM sólido 1257 33 2.63% 23°C escuro Seco BGM, 5 d WPM líquido 111 3 2,70% 23°C escuro Exemplo 13
Produção de plantas de soia transgênicas usando explantes de soia secos e seleção de espectinomicina
Sementes secas, viáveis (semente de soja de qualidade apropriadamente armazenada compreende aproximadamente 10 a 12% de teor de umidade interna), foram enxaguadas com água estéril, ou uma solução de 5 Hipoclorito de sódio (variando de O ppm a ~30.000 ppm de cloro ativo, incluindo 50 ppm e 200 ppm de cloro ativo), por 3 a 20 minutos. Líquido foi então drenado. Este processo aumenta o teor de umidade interna para aproximadamente 16%. Seguindo esta breve etapa de sanitização da superfície, o teor de umidade interna da semente foi diminuído em um secador de semen10 te comercial com um fluxo de ar desumidificado (temperatura controlada para aproximadamente 15,56 a 32,22 graus centígrados (60 a 90 graus F)) para menos do que 8%.
Seguindo armazenamento desejado, os explantes foram hidratados para transformação. Os tipos de meios usados para esta etapa podem ser variados e incluem "meio de germinação de feijão" (BGM; Tabela 10), meio inóculo de soja (INO; Tabela 11) e culturas de cultivo de Agrobacterium de fase Iog preparadas (AGRO). A cultura de cultivo de Agrobacterium foi cultivada da noite para o dia em Lysogeny Broth (LB, também geralmente referido como Luria-Bertani Broth) para fase log, e então centrifugada e ressuspensa para uma densidade óptica final a 660 nm de 0,25 a 0,6. O meio usado para a diluição é o mesmo que o meio inóculo de soja. Temperaturas e durações de hidratação podem ser também variadas, com alguns experimentos tendo explantes que foram embebidos em uma dessas soluções da noite para o dia a 4o C. Outras variações foram feitas na duração de exposição a respectivo meio de hidratação, nas várias temperaturas durante esta exposição e na extensão de saturação no respectivo meio. Os tempos de exposição testados variaram de 0 a 24 horas. Hidratações durante tempos de exposição mais longos (aqueles maiores do que 4 horas) foram feitas ou em temperatura ambiente (-26° C), 23° C ou 4o C. Tempos de exposição de 4 horas ou menos foram todos testados em temperatura ambiente. Como uma alternativa para submergir completamente ou substancialmente saturar explantes com meios líquidos durante o processo de hidratação, alguns tratamentos empregaram o uso de papel filtro umedecido (líquido suficiente para umedecer, mas não saturar). Isto foi feito com papel filtro umedecido ou com BGM ou meio de cultura de Agrobacterium. Hidratação foi realizada em uma variedade de recipientes, incluindo, mas não limitado a, tubos centrífu5 gos cônicos, garrafas de vidro graduadas ou um recipiente de cultura de tecido PLANTCON (MP Biomedicals, Irvine, CA).
Após hidratação, os explantes foram rapidamente sonificados na presença das culturas de Agrobacterium apropriadas. Cocultura e etapas subsequentes foram realizadas em incubadoras Percival iluminadas por 2 a 10 5 dias (16 horas de luz, 8 horas de escuro, com intensidade de Iuz de pelo menos 5 μΕ a 200 μΕ) em uma temperatura de aproximadamente 23 a 25° C e podem ser realizadas até 35° C. A Iuz é conhecida promover transferência de gene de Agrobacterium para células de planta. Espectinomicina foi aplicada como um agente de seleção ou durante hidratação, em etapas de co15 cultura e/ou seguindo cocultura a 15 mg/L a 1000 mg/L.
Galhos positivos para fenótipo (plantas) foram rotineiramente recuperados, conforme mostrado na Tabela 19, usando o construto, pMON96999, compreendendo um T-DNA compreendendo um gene aadA e uma origem de replicação OriV ou o construto, ou pMON101343 compreen20 dendo um T-DNA compreendendo um gene CP4 e uma origem de replicação OriV. Por "positivo para fenótipo" na presença de espectinomicina, quer dizer que os galhos são verdes e robustos, enquanto galhos negativos para fenótipo são fracos e alvejados (brancos), se eles se alongarem de alguma maneira. Espectinomicina ou glifosato foi usado no meio de regeneração 25 (ambos sólido e líquido) em uma concentração mostrada na Tabela 19.
Tabela 19. Frequência de transformação de explantes de soja secos usando glifosato ou espectinomicina como agente seletivo. _
Espectinomicina (%TF) Glifosato (% TF) ppm 50 ppm 100 ppm 200 ppm 50 uM 4,66 4,24 6,34 5,99 2,00 Espectinomicina foi também usada como um agente seletivo pa
ra transformação de embriões de soja excisados secos utilizando as condições que seguem: 1 hora de hidratação em meio INO1 4 dias de cocultura em INO, espectinomicina 150 ppm, com cultura em WPM sólido ou líquido (Tabela 12, com ou sem ágar adicionado). Temperaturas de 23-25° C ou 28°C, até cerca de 35° C, podem ser utilizadas. Galhos positivos para fenóti5 po foram colhidos em 8 e 10 semanas pós-inoculação com Agrobacterium, e enraizamento foi induzido em BRM sólido (Tabela 13) com Espectinomicina 150 ppm. Frequências de transformação muito altas de 25,05% e 19,27% foram obtidas em dois estudos diferentes. Os explantes usados neste estudo não foram tratados com reguladores de crescimento de planta do tipo citoci10 na (tal como TDZ ou BAP), então demonstrando que frequência de transformação alta poderia ser conseguida na ausência de tais reguladores de crescimento de planta.
Exemplo 14
Produção de plantas de soia transgênicas usando embriões de soia secos, espectinomicina e meio de cultura líquido
Nesses estudos, os explantes foram inicialmente hidratados e eventualmente regenerados em meios sólidos WPM com cobertura líquida ou meio líquido WPM como acima. Todos os explantes foram transferidos em 6 semanas pós-inoculação para bandejas contendo Oasis® Wedge Sys20 tem (Smithers-Oasis USA; Kent, OH) e um meio líquido simplificado (0,5 g / L WPM com IBA 0,25 mg/L). Plantas R0 enraizadas e com galhos foram obtidas duas a 4 semanas mais tarde. Em todos os estudos e tratamentos, hidratação inicial de explantes foi feita por 1 hora nos respectivos meios conforme mostrado na Tabela 20. Meio de cultura líquido era o mesmo que na 25 Tabela 12 exceto que glifosato foi substituído por espectinomicina a 150 ppm. Em tratamento com cobertura líquida ambos os meios de cultura sólido e líquido foram usados; meio líquido foi aplicado em cima dos explantes, enquanto eles estavam sobre o meio sólido em um momento especificado durante a cultura do tecido conforme identificado na Tabela 21. Isto foi feito 30 como um tipo de revigoramento de meios e evita a necessidade de transferência de explantes de meios velhos para meios novos. Nos tratamentos controle, os explantes foram revestidos na superfície em um meio WPM sólido (Tabela 12). Galhos foram colhidos e enraizados em BRM sólido conforme acima descrito, exceto que glifosato foi substituído com espectinomicina a 150 ppm.
Tabela 20. Frequência de transformação com condições de hidratação dadas.
Tratamento Meio de hidratação Incubação com TF% Agrobacteria (média de 3 repetições) 1- Controle INO 0 minuto 3,10% 2 BGM a/o cefotaxima 0 minuto 14,67% 3 BGM a/o cefotaxima 15 minutos 15,45% 4 BGM a/o cefotaxima 30 minutos 18,50% 5 INO 0 minuto 13,98% 6 INO 15 minutos 9,64% 7 INO 30 minutos 13,79% Tabela 21. Momento de sobreposição de líquido
T ratamento Tempo de adi¬ Volume de Transferência % TF amento do Lí¬ adiamento de de Oasis® (média de quido meio líquido Wedge para repetições) em WPM só¬ regeneração lido Controle-1 NA Nenhum Não 8,00% 2 Nenhum Nenhum Sim 14,67% 3 3 semanas 5 mL Sim 15,45% pós-inoculação 4 3 semanas 10 mL Sim 18,50% pós-inoculação 5 4 semanas 5 mL Sim 13,98% pós-inoculação 6 4 semanas 10 mL Sim 9,64% pós-inoculação EXEMPLO 15
Produção de plantas de soia transgênicas usando embriões de soia secos, espectinomicina e transferência de explante de regeneração inteiro com uma etapa de pré-cultura
Nesses estudos, como com o Exemplo 12, uma etapa de précultura (5 dias 23° C em BGM) foi usada. Hidratação de uma hora do explante excisado seco em meio INO foi também feita antes da etapa de précultura. Cerca de 12 ml de WPM líquido contendo 150 ppm de espectinomicina foram despejados diretamente no PLANTCON de cocultura após o período de cocultura, e os explantes foram revestidos na superfície em WPM 5 sólido contendo 150 ppm de espectinomicina 4 dias mais tarde. Neste exemplo, galhos verdes positivos para fenótipo foram identificados mais ou menos na semana 4 de regeneração e transferidos de meio de regeneração WPM para bandejas contendo Oasis® Wedge System (Smithers-Oasis USA; Kent, OH) e um meio líquido simplificado (0,5 g / L de WPM com 0,25 mg/L 10 de IBA). Plantas Ro enraizadas e com galhos foram obtidas duas a 4 semanas mais tarde. No geral, pré-cultura nesses estudos também melhorou a % de TF (Tabela 22). A porcentagem de eventos de qualidade mostrada abaixo (Tabela 22) refere-se à proporção de eventos transgênicos demonstrando a presença de 1-2 cópias de ambos o gene de interesse (GUS) e um gene 15 marcador (aadA) através do ensaio Invader®. TF livre de marcador estimada (mTF) refere-se a % de eventos sem o gene marcador. Os explantes usados neste estudo foram tratados com TDZ 1,0 ppm durante cocultura, então demonstrando que frequência de transformação alta com explantes secos poderia ser conseguida na presença de um regulador de crescimento de planta 20 tipo citocina, o que poderia ser usado na promoção de proliferação de galho. Tabela 22 Frequência e qualidade de transformação observadas a partir de explantes regenerados inteiros._____
Protocolo & N0 de N0 de E- % N0 de % de % mTF Tipo de Vetor Ex¬ ventos TF Eventos eventos qTF estima¬ plantes Produzi¬ Ensaia¬ de qua¬ da % dos dos lidade Excisado se¬ 260 34 13,1+/- 32 21,9 2,7+1- 0,62 co - 2T/OriV 0,17 0,23 Excisado se¬ 161 15 9,32+/- 14 28,6 2,5 0,45 co - 2T/OriRi 7,38 Pré-culturado 1641 319 19,4+/- 311 24,4 4,6+/- 1,1 Seco - 5,42 1,35 2T/OriV Pré-culturado 336 66 19,64+/ 64 20,3 3,9+/- 0,7 seco - -1,97 1,22 2T/OriRi Exemplo 16
Produção de plantas de soia transgênicas usando embriões de soia secos armazenados, espectinomicina e transferência de explante regenerado inteiro com uma etapa de pré-cultura 5 Neste exemplo, explantes secos armazenados por 3 meses fo
ram usados, e uma etapa de 1 hora de hidratação realizada em INO foi utilizada, em explantes excisados secos. Pré-cultura foi realizada por 5 dias a 23° C em condições no escuro em BGM com fungicidas nistatina 50 ppm e TBZ 10 ppm (tiabendazol) (Estoque de nistatina e TZB é feito dissolvendo 50.000 ppm de Nistatina e 10.000 ppm de TBZ em DMSO puro, diluído 1000 vezes (1 ml de estoque em 1L de INO)). TDZ (1,0 ppm) e ácido lipóico foram ambos adicionados ao inócuo e aos meios de cocultura (INO). O construto, pMON107379, era um vetor 2T convencional compreendendo gene oriRi e aadA e cocultura foi feita por 5 dias. Após cocultura os explantes foram revestidos na superfície em WPM sólido e então transferidos para o Oasis® Wedge System (Smithers-Oasis USA; Kent, OH) com um meio líquido simplificado (0,5 g/L de WPM com 0,25 mg/L de IBA). Conforme mostrado na Tabela 23, pré-cultura de explantes secos reforçou TF. Então, explantes secos armazenados por 3 meses poderiam ter desempenho similar a explantes secos recém-excisados. A adição a meios de cocultura INO de nistatina (50 ppm) e tiabendazol (10 ppm) dissolvidos em DMSO (1,0 ml de DMSO por litro de INO) melhorou a saúde dos explantes, provavelmente através do controle de leveduras e fungos geralmente encontrados nas e sobre as sementes e então podem ser benéficos quando realizando cultura de tecido grande e/ou automática.
Tabela 23 Efeito de pré-cultura sobre TF (%) de explantes secos armazenados _
Tipo de explante Etapa de N0 de Ex¬ Plantas TF pré-cultura plantes RO Excisado úmido Não 263 75 28,52% Explantes Secos Ar¬ Não 678 71 10,47% mazenados Explantes Secos Não 375 24 6,40% Frescos Tipo de explante Etapa de N0 de Ex¬ Plantas TF pré-cultura plantes RO Explantes Secos Ar¬ Sim 901 129 14,32% mazenados Explantes Secos Sim 1008 112 11,11% Frescos Todas as composições e métodos revelados e reivindicados aqui
podem ser feitos e executados sem experimentação indevida à Iuz da presente revelação. Embora as composições e métodos da presente invenção tenham sido descritos em termos das modalidades ilustrativas acima, ficará 5 aparente àqueles versado na técnica que variações, mudanças, modificações e alterações podem ser aplicadas à composição, métodos e nas etapas ou na seqüência de etapas dos métodos descritos aqui, sem se afastar dos verdadeiros conceito, espírito e escopo da invenção. Mais especificamente, ficará aparente que certos agentes que são ambos quimicamente e fisiologi10 camente relacionados podem substituir os agentes descritos aqui, enquanto os mesmos resultados ou similares sendo atingidos. Todos tais substitutos similares e modificações aparentes àqueles versados na técnica são considerados estar dentro do espírito, escopo e conceito da invenção conforme definido pelas reivindicações apensas.
Referências
As referências que seguem, até o ponto que elas proverem detalhes de procedimento exemplares ou outros suplementares àqueles mostrados aqui, são aqui especificamente incorporadas a título de referência.
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Claims (45)

1. Método para obtenção de um tecido de planta transformável compreendendo: (a) obtenção de uma semente de planta; e (b) preparação do explante a partir da semente de planta sob condições onde o explante não germina e permanece viável e competente para transformação genética.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, onde o explante compreende uma semente substancialmente intacta modificada para expôr pelo menos uma primeira célula transformável da semente.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, onde a preparação do explante compreende perfuração de pelo menos uma primeira abertura na semente.
4. Método de acordo com a reivindicação 2, onde preparação do explante compreende fazer uma fenda na semente.
5. Método de acordo com a reivindicação 2, onde a semente substancialmente intacta compreende um meristema da semente.
6. Método de acordo com a reivindicação 1 compreendendo ainda a etapa de: (c) transformação de pelo menos uma primeira célula do explante com um DNA selecionado.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, compreendendo ainda a etapa de: (d) regeneração de uma planta transgênica a partir da dita célula, onde a planta é estavelmente transformada com o DNA selecionado.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, definido ainda como compreendendo armazenamento do explante antes da etapa (d) sob condições onde o explante não germina.
9. Método de acordo com a reivindicação 1, definido ainda como compreendendo desidratação da dita semente e/ou explante antes ou após preparação do explante.
10. Método de acordo com a reivindicação 7, definido ainda como compreendendo aumento do teor de umidade do explante antes da ou concomitantemente com a etapa (d).
11. Método de acordo com a reivindicação 1, onde a preparação do explante é realizada na ausência de um líquido.
12. Método de acordo com a reivindicação 1, onde a semente ou explante compreende um teor de umidade interna de a partir de cerca de 3% a cerca de 25%.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, onde a semente ou explante compreende um teor de umidade interna de a partir de cerca de 4% a cerca de 16%.
14. Método de acordo com a reivindicação 8, onde o explante é armazenado em uma temperatura entre cerca de -80° C e cerca de 60° C.
15. Método de acordo com a reivindicação 8, onde o explante é desidratado antes do armazenamento.
16. Método de acordo com a reivindicação 1, definido ainda como compreendendo preparação de uma pluralidade de explantes a partir de uma pluralidade de sementes e seleção de um ou mais explantes exibindo pelo menos uma primeira característica indicativa da habilidade em transformar o explante e/ou regenerar uma planta a partir do explante.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, onde a característica é selecionada do grupo consistindo em cor, tamanho, formato, densidade, análise proximal, teor de carboidrato, teor de proteína, teor de gordura, teor de fibra (cinza), teor de umidade, viabilidade, germoplasma, capacidade de permanecer intacto, presença de patógeno e características ópticas.
18. Método de acordo com a reivindicação 6 definido ainda como compreendendo preparação da semente de planta e/ou do explante antes da ou concomitantemente com a etapa (c).
19. Método de acordo com a reivindicação 18, onde a preparação da semente compreende contato da semente com uma solução aquosa.
20. Método de acordo com a reivindicação 19, onde a solução aquosa compreende um desinfetante.
21. Método de acordo com a reivindicação 20, onde a solução aquosa compreende alvejante ou álcool.
22. Método de acordo com a reivindicação 1, onde a semente de planta é uma semente de soja, canola, milho, algodão, cebola, pimenta, tomate, abóbora, arroz ou trigo.
23. Método de acordo com a reivindicação 1, onde preparação do explante é automática.
24. Método de acordo com a reivindicação 23, onde preparação do explante compreende um processo automático onde a semente de planta é orientada conforme ela passa por um separador mecânico para prover um resultado substancialmente uniforme de tecido de planta meristemático regenerável.
25. Método de acordo com a reivindicação 6, onde a etapa (c) é realizada através de transformação bacterialmente mediada ou bombardeamento de microprojétil.
26. Método de acordo com a reivindicação 7, onde a planta transgênica é regenerada sem produção de uma cultura de tecido de calo.
27. Método de acordo com a reivindicação 7 definido ainda como compreendendo desinfecção da semente de planta e/ou do explante antes da etapa (d).
28. Método de acordo com a reivindicação 27 compreendendo desinfecção do explante.
29. Método de acordo com a reivindicação 27, onde desinfecção compreende aplicação de um desinfetante selecionado do grupo consistindo em alvejante, álcool, ozônio, gás cloro, Iuz ultravioleta, temperaturas de -20° C ou menos e exposição a uma temperatura maior do que 50° C.
30. Método de acordo com a reivindicação 29, onde desinfecção compreende aplicação de uma nistatina e/ou diabendazol.
31. Método de acordo com a reivindicação 8, onde armazenamento do explante é realizado por cerca de 1 hora a cerca de 2 anos antes da etapa (c).
32. Método de acordo com a reivindicação 8, onde armazenamento do explante é realizado por de a partir de cerca de 1 hora a cerca de24 horas.
33. Método de acordo com a reivindicação 7, onde o método é realizado sem manipulação do desenvolvimento do explante com um regulador de crescimento de planta.
34. Método de acordo com a reivindicação 7, onde a etapa (d) compreende cultura do explante na presença de um agente seletivo em cerca de 35° C.
35. Método de acordo com a reivindicação 7, onde a etapa (d) compreende cultura do explante sob condições de iluminação que permitem desenvolvimento de plastídeo normal.
36. Método para produção de um tecido de planta transformável compreendendo: (a) obtenção de um explante a partir de uma semente de planta; e (b) desidratação da semente de planta e/ou explantes antes da, concomitantemente com ou após a dita etapa (a) para obter um explante que não germina e permanece viável e competente para transformação genética.
37. Método de acordo com a reivindicação 36 compreendendo ainda a etapa de: (c) hidratação do dito explante; e (d) regeneração de uma planta a partir do explante.
38. Método de acordo com a reivindicação 37, compreendendo ainda a etapa de: (e) transformação de pelo menos uma primeira célula do explante com um DNA selecionado antes da etapa de regeneração da planta a partir do explante, onde a planta é estavelmente transformada com o DNA selecionado.
39. Método de acordo com a reivindicação 38, onde hidratação do dito explante é realizada sob condições no escuro.
40. Método de acordo com a reivindicação 7, onde pelo menos uma porção da regeneração é realizada em uma temperatura de até cerca de 40° C.
41. Explante regenerável competente para transformação genética produzido através do método como definido na reivindicação 1.
42. Explante regenerável competente para transformação genética produzido através do método como definido na reivindicação 37.
43. Aparelho para preparação de tecido de planta embriônico transformável a partir de semente singulada compreendendo: (a) um suporte para uma semente singulada; e (b) dispositivos para aplicação de uma força à semente sendo apoiada de modo a dividir a semente em cotilédones, revestimento de semente e tecido embriônico separados.
44. Aparelho de acordo com a reivindicação 43, compreendendo ainda (c) um ou mais dispositivos para separação do tecido embriônico do revestimento da semente e cotilédones; e opcionalmente (d) dispositivos para limpeza e/ou esterilização do tecido.
45. Método para preparação de material de explante transformável e regenerável compreendendo tecido meristemático a partir de uma semente singulada compreendendo: a) submissão de uma semente singulada que compreende um revestimento de semente, tecido de cotilédone e tecido meristemático a uma força suficiente para quebrar a semente; e b) separação do tecido meristemático a partir do revestimento da semente e opcionalmente o tecido do cotilédone, onde o método é mecanizado.
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