BR112013015247A2 - métodos para aperfeiçoar competência de células de planta - Google Patents

Abstract

MÉTODOS PARA APERFEIÇOAR COMPETÊNCIA DE CÉLULAS DE PLANTA A presente invenção refere-se a métodos para aperfeiçoar competência de células de planta para transformação mediada por bactéria compreendendo contatar as células de planta com uma quantidade eficaz de polietileno glicol (PEG) por um período de tempo antes da transformação. A capacidade de armazenar e manter células de planta competentes para transformação e cultura de tecidos permite planejamento e execução mais eficientes de experimentos em grande escala, fornecendo flexibilidade de horas de produção de pico, ou durante interrupções não planejadas no processo de produção. Estes métodos são úteis na preservação da viabilidade de células de planta em várias condições de armazenamento, desse modo melhorando sua competência para transformação e cultura de tecido.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS PARA APERFEIÇOAR COMPETÊNCIA DE CÉLULAS DE PLANTA". Referência Cruzada Para Pedidos Relacionados O presente pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido 5 Provisório Norte-americano 61/424.136, depositado em 17 de dezembro de

2010. A revelação completa do pedido acima referido está aqui incorporada como referência. Campo da Invenção A presente invenção refere-se ao campo da biotecnologia de plantas. Mais especificamente, um método de melhorar a capacidade de cé- lulas de plantas para a transformação mediada por bactéria é fornecido. Antecedentes da Invenção Tecidos de plantas como os embriões podem ser obtidos em grandes quantidades, por meios mecânicos, como revelado na Patente Nor- te-americana 7.427.695, para utilização em cultura de tecidos. Tipicamente, uma vez que ditos tecidos de plantas são obtidos, são utilizados imediata- mente ou dentro de horas em processos de cultura de tecidos com ou sem uma etapa de transformação. Quando armazenado para uso posterior, a sua competência para transformação pode ser reduzida. Eixos embrionários de- rivados de sementes secas, por exemplo, como revelado na Publicação do Pedido de Patente Norte-americano2008/0280361, são relativamente está- veis durante o armazenamento, mas uma etapa de hidratação antes da transformação pode reduzir a sua competência para transformação. Sumário da Invenção A presente invenção fornece métodos para melhorar a compe- tência de células de plantas para a transformação mediada por bactéria compreendendo contatar as células de plantas com uma quantidade eficaz de polietileno glicol antes da transformação. Em certas modalidades, a quantidade eficaz de polietileno glicol pode estar entre cerca de 1% a cerca de 25% em volume. Em modalidades mais particulares, a quantidade eficaz de polietileno glicol é de cerca de 20% em volume.

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O peso molecular do polietileno glicol pode variar entre cerca de 200 e cerca de 10000, enquanto que em modalidades mais particulares o peso molecular do polietileno glicol é de 4000 a 8000. Em certos aspectos, a composição compreende ainda uma 5 quantidade eficaz de pelo menos um regulador de crescimento, onde o regu- lador de crescimento compreende uma quantidade de auxina, citoquinina, ou uma combinação dos mesmos.

As auxinas podem incluir IAA, 2,4-D, NAA, IBA, dicamba, ou uma combinação dos mesmos, e a quantidade de auxina é de preferência de cerca de 0,001 mg/L a cerca de 30 mg/L.

As citocininas podem compreender BAP, zeatina, cinetina, TDZ, ou uma combinação dos mesmos, e podem estar presentes em uma quanti- dade de cerca de 0,001 mg/L a cerca de 30 mg/L.

Na prática da presente invenção, o período de tempo para con- tatar as células de plantas com PEG pode ser de 1 dia a cerca de 30 dias.

Em outras modalidades mais específicas, o período de tempo eficaz é de cerca de 3 dias a 7 dias.

Ainda em outras modalidades, as células de plantas são contatadas com o PEG durante um período de cerca de 30 minutos a 300 minutos.

Os métodos da presente invenção podem ainda compreender uma etapa de enxague, onde as células da planta que foram contatadas com o PEG são enxaguadas com uma composição não contendo PEG antes da transformação.

Outro aspecto da presente invenção compreende adicionalmen- te a regeneração de células de planta.

As células de plantas podem compre- ender células de semente, folha, caule, raiz, embrião imaturo, embrião ma- duro, calo, microsporo, meristema, cotilédones, hipocótilo, epicótilo, mesocó- tilo, coleóptilos, radical, plúmula ou tecido reprodutivo de uma espécie de planta ou monocotildôneas ou dicotiledôneas.

Na prática os métodos da presente invenção, a transformação mediada por bactéria pode ser mediada por Agrobacterium, ou transforma- ção mediada por Rhizobium.

Uma planta transgênica, e partes de plantas da mesma, como

18893486v1 definidas em outros lugares na presente revelação, foram criadas utilizando os métodos da presente invenção aqui descritos, é também um aspecto da presente invenção.

Breve Descrição dos Desenhos 5 Os desenhos anexos, que são incorporados e constituem uma parte da especificação, ilustram as modalidades da presente invenção e jun- tos com a descrição, servem para explicar os princípios da invenção.

Nos desenhos: Figura 1 ilustra a produção de calos a partir de embriões que fo- ram armazenados em meio Lynx 2304 suplementado com PEG (painel es- querdo), em comparação com embriões que foram armazenados em Lynx 2304 sem PEG (painel direito). Figura 2 ilustra a formação de tricomas aumentada e o inchaço do nó coleoptilar dos embriões que foram armazenados em meio Lynx 2304 suplementado com PEG e BAP (painel direito) em comparação com os em- briões que foram armazenados sem BAP (painel esquerdo). Figura 3 ilustra a formação de brotos melhorada a partir dos em- briões que foram armazenados em meio Lynx 2304 suplementado com PEG e BAP (painel direito) em comparação com os embriões que foram armaze- nados em meio de cultura Lynx 2304 sem BAP (painel esquerdo). Descrição Detalhada da Invenção O que se segue é uma descrição detalhada da invenção forneci- da para auxiliar os especialistas na técnica na prática da presente invenção.

Os especialistas na técnica podem fazer modificações e variações nas mo- dalidades aqui descritas sem sair do espírito ou do escopo da presente in- venção.

A menos que definido em contrário, todos os termos técnicos e cien- tíficos aqui utilizados têm o mesmo significado como comumente entendido por especialista na técnica à qual pertence esta invenção.

Geralmente, a nomenclatura e descrições de procedimentos básicos de fabricação base ou de laboratório aqui descritos são conhecidos e comumente utilizados na téc- nica.

Salvo indicação em contrário, os métodos convencionais são utilizados para estes procedimentos, e são exemplificados por uma variedade de di-

18893486v1 cionários técnicos gerais ou textos.

Quando é fornecido um termo no singu- lar, os inventores contemplam também aspectos da invenção descritos pelo plural desse termo.

Os inventores não pretendem estar limitados a um parti- cular mecanismo ou modo de ação.

Referência aos mesmos é fornecida a- 5 penas para fins ilustrativos.

Todas as publicações, pedidos de patentes, pa- tentes, e outras referências aqui mencionadas são expressamente incorpo- radas como referência em sua totalidade.

A presente invenção fornece métodos para melhorar a compe- tência de células de plantas para a transformação mediada por bactéria compreendendo contatar (aplicando, tratando, armazenando, tocando, jun- tando, misturando ou, de outro modo causando interação) nas células da planta com uma quantidade eficaz de polietileno glicol (PEG) durante um período de tempo antes da transformação suficiente para aumentar a trans- formação do tecido assim tratado.

Os métodos da presente invenção são úteis para preservar a vi- abilidade das células da planta em embriões imaturos de milho durante vá- rias condições de armazenamento, melhorando assim a sua capacidade de transformação e de cultura de tecidos em comparação com os tecidos que não contataram uma quantidade eficaz de PEG.

Assim, uma "quantidade eficaz" da composição, é definida como uma quantidade que é eficaz para melhorar a competência para transformação mediada por bactéria de células de planta que são contatadas pela composição, em comparação com as cé- lulas de plantas que são contatados por nenhuma, muito pouco, ou muito da composição, de modo a ser ou ineficaz ou prejudicial para a competência das células da planta.

A capacidade de armazenar e manter as células competentes para a transformação de plantas e cultura de tecidos permite o planejamento e execução mais eficientes de experiências em grande escala, fornecendo a flexibilidade de horas de produção de pico, ou durante as interrupções im- previstas no processo de produção.

Isto também permite uma maior flexibili- dade para o transporte de tecidos de diferentes locais.

Além disso, ditos mé- todos são úteis para melhorar a competência das células de planta em eixos

18893486v1 embrionários de sementes secas, por exemplo, de soja para a transforma- ção. A fim de fornecer uma compreensão clara e consistente da es- pecificação e das reivindicações, incluindo o escopo dado a esses termos, 5 as seguintes definições são fornecidas. O termo "competência" é definido como uma resposta de uma célula vegetal para a cultura de tecidos ou transformação. Uma "resposta" é tipicamente definida em sistemas biológicos como qualquer mudança de comportamento ou de um organismo vivo, que resulta de um estímulo exter- no ou interno. Assim, o termo "melhoria da competência" é definido como uma melhoria em relação à resposta basal ou negativa à cultura de tecidos ou transformação. Em alguns aspectos, a melhoria da competência para a cultura de tecidos pode ser medida por um aumento da taxa de sobrevivên- cia das células da planta. Em outros aspectos, a melhoria da competência para transformação é medida como um aumento na frequência de transfor- mação. O termo "células de planta" geralmente se refere a quaisquer cé- lulas de qualquer parte de uma planta, incluindo, entre outras a semente, folha, caule, raiz, embrião imaturo, embrião maduro, calo, microsporo, meris- tema, cotilédones, hipocótilo, epicótilo, mesocótilo, coleóptilos, radical, plú- mula ou flor incluindo sépala, pétala, estame, pólen, tubo polínico, pistilo, receptáculo, e óvulo, entre outras. As células de planta podem ser derivadas essencialmente de qualquer planta, incluindo, entre outras, cevada, milho, aveia, arroz, centeio, sorgo, relva turfa, cana de açúcar, trigo, alfafa, banana, brócolos, feijão, repolho, canola, cenoura, mandioca, couve-flor, repolho chi- nês, aipo, citrinos, trevo, coco, café, algodão, abóbora, Douglas fir, berinjela feijão, eucalipto, erva-doce, linho, feijão jardim, alho, abóbora, uva, azeitona, quiabo, cebola, alho-poró, pinus taeda, melão, palma, alface, ervilha, amen- doim, pimenta, batata, choupo, pinho, abóbora, nabo, girassol, cártamo, sor- go, soja, espinafre, abobrinha, morango, beterraba, goma-doce, batata doce, gramínea, chá, tabaco, tomate, triticale, relvado, melancia, ornamental, ar- busto, porca, grão de bico, feijão-guandu, milheto, lúpulo e plantas de pasto.

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"Embrião" é parte de uma semente, compreendendo tecidos precursores (tecidos meristemáticos) para as folhas, caule e raiz.

Uma vez que o embrião começa a crescer (germinar), torna-se uma muda. "Meristema" ou "tecido meristemático" compreende células indi- 5 ferenciadas, as células meristemáticas, que se diferenciam para produzir várias estruturas de plantas, incluindo caule, raízes, folhas, tecidos e semen- tes de linha germinal. "Explante" é um termo utilizado para se referir ao ma- terial alvo para a transformação compreendendo células de plantas.

As célu- las de planta são definidas como acima.

O método da presente invenção compreende contatar as células de planta com uma quantidade eficaz de polietileno glicol (PEG), por um pe- ríodo de tempo antes da transformação.

Quantidades percentuais de PEG aqui descritas são dadas em volume.

Em certas modalidades não limitantes, o PEG pode ser dissolvido em água destilada estéril (SDW), meio de inocu- lação (INO, ver Tabela 7), ou meio de germinação do feijão (BGM, ver Tabe- la 8). A quantidade eficaz de PEG da presente invenção pode variar depen- dendo do cultivo e está geralmente na faixa de cerca de 1% a cerca de 50%, incluindo cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 e 50% e, especificamente, incluindo todas as faixas deriváveis entre quaisquer dois desses valores.

Em certas modalidades não limitantes, o peso molecular médio do PEG pode variar entre cerca de 200 e cerca de 35000, incluindo cerca de 200, 300, 400, 550, 600, 1000, 1500, 2000, 3000, 3350, 4000, 6000, 8000, 10000, 20000 e 35000 e especificamente incluindo todas as faixas deriváveis entre quais- quer dois de ditos valores.

Em algumas modalidades, o peso molecular do PEG é de 4000, 5000, 6000, 7000 ou 8000. Em alguns aspectos da presente invenção, as células de planta podem ser contatadas com uma composição compreendendo uma quanti- dade eficaz de PEG e um ou mais reguladores de crescimento de plantas (PGRs). Resposta à cultura de embriogênicos é o produto da interação entre o genótipo, o estágio de desenvolvimento do explante, condições de cultura

18893486v1 e da composição do meio de cultura do regulador de crescimento.

Durante o processo de iniciação da cultura, um explante é submetido a um processo conhecido como "desdiferenciação" - uma etapa em que a fase de desenvol- vimento inicial do explante é adequadamente modificada com a ajuda de 5 reguladores de crescimento.

Dependendo da eficácia dos reguladores de crescimento, este processo pode demorar horas ou dias, onde a liberação da quantidade ótima da(s) combinação(ões) do regulador de crescimento é uma etapa fundamental.

Um obstáculo significativo nesta etapa chave de liberação dos "reguladores de crescimento" é que uma dose muito elevada de reguladores de crescimento pode causar efeitos deletérios ao explante.

Um aspecto da presente invenção fornece um método de contatar explantes com uma elevada concentração de PGRs antes da cultura em um meio de cultura adequado, sem efeitos deletérios, combinando os PGRs em uma composição de PEG.

Essa abordagem não só reduz efeito deletério de altas concentrações de reguladores de crescimento, mas também melhora o pro- cesso de desdiferenciação de células de planta.

Muitos PGRs são conhecidos na técnica e podem ser utilizados de acordo com os métodos da presente invenção, como auxinas, incluindo, entre outros a 4-CPA, ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2, 4-D), diclorprope, fenoprope, ácido indole-3-acético (IAA), ácido indole-3-butírico (IBA), nafta- lenoacetamida, ácido -naftalenoacético, ácido 1-naftol naftoxiacético (NAA), naftenato de potássio, naftenato de sódio, e 2,4,5-triclorofenoxi ácido acéti- co, ácido 3,6-dicloro-2-metoxibenzoico (dicamba) e ácido 4-amino-3,5,6- tricloropicolinico (picloram); antiauxinas, incluindo, entre outros, ácido clofí- brico e ácido 2,3,5-tri-iodobenzoico; citocininas, incluindo, entre outros 2iP, benziladenina, tidiazuron (TDZ), 6-benzilaminopurina (BAP), cinetina, zeatina e, desfolhantes, incluindo, entre outros, cianamida de cálcio, dimetipina, en- dotal, etefon, merfos, metoxuron, pentaclorofenol e, tribufos; inibidores de etileno, incluindo, entre outros, aviglicina, e 1-metilciclopropeno; liberadores de etileno, incluindo, entre outros, ácido 1-aminociclopropanocarboxílico, etacelasila, etefon, e glioxime; giberelinas, incluindo entre outros, ácido gibe- rélico (GA3); herbicidas, incluindo entre outros, glifosato, glufosinato, a DL-

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Fosfinotricina, ácido 3,6-dicloro-2-metoxibenzoico e ácido 2,4-diclorofe- noxiacético; inibidores e retardadores de crescimento incluindo, entre outros, ácido abscísico, ancimidol, butralina, carbarila, clorfonium, clorprofam, dike- gulac, flumetralina, fluoridamida, fosamina, glifosina, isopirimol, ácido jasmô- 5 nico, maleico hidrazida, mepiquat, piproctanila, proidrojasmon, profame, áci- do 2,3,5-tri-iodobenzoico, clormequat, daminozida, flurprimidol, mefluidida, paclobutrazol, tetciclacis e uniconazole; morfactinas, incluindo, entre outros, clorflureno, clorflurenol, diclorflurenol e flurenol; estimuladores de crescimen- to, incluindo entre outros brassinolida, forclorfenuron e himexazol, e/ou ou- tros reguladores de crescimento de plantas não classificados incluindo entre outros, benzofluor, buminafos, carvona, ciobutide, clofencet, cloxifonac, cia- namida, ciclanilida, cicloheximida, ciprosulfamida, epocoleona, eticlozato, etileno, fenridazona, heptopargila, holosulf, inabenfide, karetazano, arseniato de chumbo, metasulfocarbo, proexadiona, pidanona, sintofeno, triapentenol e trinexapac.

Em certas modalidades da presente invenção, a auxina é 2,4-D, e em outras modalidades a auxina é picloram.

Em outras modalidades a citocinina é TDZ, e ainda em outras modalidades, a citocinina é BAP.

Um especialista na técnica da cultura de células de planta e transformação seria capaz de determinar os níveis e/ou proporções de regu- ladores de crescimento de plantas que são apropriados para o uso de uma dada espécie de plantas específicas com a presente invenção.

Por exemplo, os níveis destes ou de outros PGRs com um nível de atividade, funcional- mente equivalente, como, por exemplo, BAP e/ou 2,4-D no milho ou em ou- tras espécies de plantas, podem ser determinados através da variação dos níveis de ditos reguladores de crescimento de apresentar em meios a que explantes são contatados, e a monitorização do crescimento dos explantes e tecidos derivados.

Assim, se outros PGRs são usados, no entanto, compre- endem um efeito de regulação de crescimento de planta equivalente a essas quantidades e taxas contempladas dos PGRs listados acima.

Em várias modalidades não limitantes, a quantidade de PGRs utilizada na composição contendo PEG pode variar de 0,001 mg/L a cerca

18893486v1 de 30 mg/L, incluindo cerca de 0,01, 0,1, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, e 30 mg/L, e, especificamente, incluindo todas as faixas deriváveis entre quaisquer dois de ditos valores. 5 Em certas modalidades não limitantes, explantes de embriões imaturos de milho são contatados com a composição contendo PEG por um período de cerca de 1 a 10 dias, incluindo cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, e 10 dias e, especificamente, incluindo todas as faixas deriváveis entre quaisquer dois de ditos valores.

Em uma modalidade específica, os explantes são con- tatados com a composição por cerca de 3 dias.

Em outras modalidades, os explantes de embriões de soja ma- duros compreendendo células são contatados com uma composição con- tendo PEG por um período de cerca de 30 a 300 minutos, incluindo cerca de 30, 40, 50, 60, 70, 90, 100, 120, 180, 240, e 300 minutos, e, especificamente incluindo todas as faixas deriváveis entre quaisquer dois de ditos valores.

Em uma modalidade específica, os explantes são contatados com a compo- sição por cerca de 60 minutos.

Ainda em outras modalidades não limitantes, os explantes são contatados com a composição contendo PEG a uma temperatura entre cer- ca de 2 a 30 graus Celsius, incluindo cerca de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 e 30 graus Celsius, e especificamente incluindo todas as faixas deriváveis entre quais- quer dois desses valores.

As faixas de quantidade, duração, temperatura e de peso molecu- lar, aqui descritas, são não limitantes.

Os especialistas na técnica podem exe- cutar a presente invenção, usando uma quantidade, duração, temperatura ou peso molecular abaixo ou acima, ou entre aqueles especificamente dados, sem nos afastarmos do âmbito e espírito da presente invenção, dependendo das exigências específicas de uma determinada espécie de planta.

Os métodos da presente invenção podem ainda compreender uma etapa de enxague, onde as células de planta que tenham sido contata- das com a composição de polietileno glicol são enxaguadas com composi-

18893486v1 ção não contendo PEG antes da transformação. Em vários aspectos, não limitantes, a composição não contendo PEG pode ser água, ou um meio, como ½MS PL (Tabela 1), ½MS VI (Tabela 2), INO (Tabela 6), BGM (Tabela 8), ou cultura de ressuspensão de Agrobacterium, já descrita na presente 5 revelação. Em certas modalidades, não limitantes, a etapa de enxague pode compreender um ou mais enxagues rápidos repetitivos com o meio de enxa- gue desejado, ou pode alternativamente compreender um único enxague por um período mais longo de 1 a 5 minutos. Tabela 1. Composição do Meio ½MS PL.

Componentes Fonte Quantidade por Litro MS Sais basais Phytotech M524 2,165 g MS Vitaminas Phytotech M533 103,1 mg Glicose Phytotech G386 36 g Sacarose Phytotech S391 68,5 g Prolina Fisher BP392-100 0,115 g pH a 5,4 Tabela 2. Composição do Meio ½MS VI. Componentes Fonte Quantidade por Litro MS Sais basais Phytotech M524 2,165 g MS Vitaminas Phytotech M533 103,1 mg Glicose Phytotech G386 10 g Sacarose Phytotech S391 20 g Prolina Sigma P-5607 0,115 g pH a 5,4 Em determinados aspectos, não limitantes da presente inven- ção, as células de planta podem ser embriões imaturos. Quando os em- briões imaturos são de uma monocotiledônea como o milho, os tecidos a serem substancialmente isolados são fornecidos em qualquer maneira ade- quada, por exemplo, unida à espiga ou à cabeça onde as sementes amadu- recem. Sementes de monocotiledônea podem ser removidas a partir da es- 18893486v1 piga ou da cabeça antes de substancialmente purificar o tecido alvo.

Espigas são normalmente coletadas 10-12 dias após a polinização e a superfície é esterilizada.

Métodos para a esterilização da superfície são bem conhecidos na técnica, e incluem, entre outros a imersão em uma solução contendo uma 5 concentração eficaz de etanol, ou de hipoclorito de sódio por um período de tempo eficaz, por exemplo, de 1 a 15 minutos.

Os embriões imaturos podem ser obtidos por qualquer técnica adequada, incluindo manualmente, ou por meio de métodos mecanizados ou automatizados.

Uma abertura no pericarpo ou tegumento das sementes de mo- nocotiledônea é fornecido para efetuar o isolamento do explante desejado.

Isto pode ser conseguido por qualquer técnica adequada, como, entre ou- tras, fazer um furo, uma punção ou incisão com uma agulha, sovela, lâmina, ou outro utensílio adequado.

Em algumas aplicações do método, não há te- cido de pericarpo que necessite ser removido, em outras aplicações, a aber- tura do pericarpo pode incluir a remoção de pelo menos uma parte do peri- carpo, e possivelmente de algum tecido não embrionário (por exemplo, en- dosperma). De preferência, a abertura é suficiente para separar substanci- almente o embrião da semente, que pode ser feito manualmente, usando um instrumento estéril, como uma espátula para colher o endosperma e embri- ão, ou empurrando no lado do núcleo, fazendo o embrião surgir e ser parcial ou totalmente exposto do núcleo.

Pode ser necessário somente enfraquecer o pericarpo o suficiente (por exemplo, por abrasão, ou por outros tratamen- tos físicos, químicos ou enzimáticos), de modo que a aplicação de força na semente resulta no isolamento substancial do tecido-alvo, como o embrião.

Métodos de obtenção de embriões imaturos por meios automati- zados ou mecanizados são revelados na Patente US 7.560.611. O método inclui a etapa de aplicação de força nas sementes o suficiente para isolar substancialmente o tecido-alvo, como um embrião imaturo a partir das se- mentes, onde o tecido alvo substancialmente isolado é adequado para a transformação genética e cultura de tecidos.

A força pode ser aplicada em várias sementes consecutivamente ou simultaneamente.

A força aplicada pode ser contínua ou não contínua (por exemplo, força pulsada ou força on-

18893486v1 da similar), e é geralmente aplicada mecanicamente, isto é, a força é obtida através da utilização de um dispositivo ou máquina, em vez da mão humana.

A quantidade de força aplicada é de preferência suficiente para ultrapassar a aderência do alvo (por exemplo, embrião) e não alvo (por exemplo, o tecido 5 de não embrião, como endosperma), um do outro, permitindo assim a sepa- ração dos tecidos alvo e não alvo.

Qualquer força ou forças adequadas po- dem ser empregadas para a remoção do tecido alvo de sua semente, e vá- rias forças podem ser usadas em combinação, sequencialmente ou simulta- neamente.

Forças adequadas incluem, entre outras, jato de fluido a uma pressão positiva, a pressão mecânica positiva, a pressão negativa, aspira- ção, força centrífuga, aceleração linear, desaceleração linear, cisalhamento de fluidos, o fluxo turbulento do fluido, e um fluxo laminar do fluido.

Forças de fluido podem ser exercidas por qualquer dos fluidos, gases ou líquidos, ou combinações de ambos.

O método pode incluir ainda a etapa de separar o tecido alvo substancialmente isolado, como embriões imaturos, de tecido associados não embriões, como a endosperma, glumas, e no tegumento ou tecidos do pericarpo.

Métodos para a separação de embriões imaturos de outros teci- dos estão descritos na Publicação do Pedido de Patente US 2009/0142837. A separação pode ser conseguida por uma ou mais técnicas adequadas, incluindo, entre outras, separação por exclusão de tamanho (por exemplo, por meio de filtração em uma ou mais etapas de filtração), a separação ba- seada em hidrofobicidade, hidrofilicidade, a lipofilicidade, ou outras forças atrativas, e separação por diferenciais de massa ou densidade (por exemplo, a separação por centrifugação e decantação). A etapa ou etapas de separa- ção podem ser opcionais, por exemplo, onde não é necessário isolamento adicional de embriões intactos ou parciais para o seu uso em cultura de teci- dos.

Estes métodos para fornecer aos tecidos alvos substancialmente isolados, como embriões de milho, que são adequados para a transformação genética de cultura de tecido podem ser automatizados, por exemplo, atra- vés do emprego de robótica ou manuseio mecânico das espigas de milho ou

18893486v1 sementes, a abertura do pericarpo, a aplicação de força na semente, ou as etapas de separação opcionais. Tal automatização pode usar sensores óti- cos ou mecânicos para ajudar no posicionamento das espigas ou sementes de milho relativamente à força ou forças aplicadas, ou nas etapas de sepa- 5 ração. Um aparelho para substancialmente isolar embriões de milho é forne- cido como revelado na Patente US 7.560.611, que compreende, pelo menos, uma abertura para orientar o fluxo de um fluido, onde o fluxo de fluido conta- ta os núcleos nas espigas de milho e isola substancialmente os embriões dos núcleos. Geralmente, é preferencial que o fluxo de fluido contate o má- ximo de núcleos possível em um determinado período de tempo, como é conveniente, de modo a isolar os embriões mais rapidamente. A pelo menos uma abertura pode incluir uma única abertura ou várias aberturas (por exemplo, bicos únicos ou múltiplos, que podem incluir bicos planos, redon- dos, ovais, em forma de leque ou outros formas, e ajustável, que se deslo- cam, ou bicos estacionários), e pode gerar um fluxo de fluido de qualquer tipo e meio adequados. Os fluidos podem ser gases (como o ar, nitrogênio ou misturas de gases), líquidos (por exemplo, água, soro fisiológico ou vários meios de cultura) ou combinações. Fluxos de fluidos adequados incluem, entre outros, os jatos de fluidos (como jatos colunares únicas ou múltiplas; planas, em forma de cone, ou jatos em forma de leque ou sprays, e jatos do tipo folha), o fluxo de fluido laminar e fluxo de fluido turbulento. Fluxos de fluidos apropriados podem resultar em uma ou mais forças para retirar o embrião do seu núcleo, incluindo a pressão positiva ou uma pressão negati- va ou ambas. A uma ou mais forças podem ser aplicadas a várias sementes de forma consecutiva ou simultaneamente, de forma contínua ou não contí- nua, e é geralmente aplicada mecanicamente e não manualmente. Outros fatores apropriados podem ser a força centrífuga, aceleração linear, desace- leração linear e de cisalhamento do fluido. Estas forças podem ser uniformes ou não uniformes, contínua ou não contínua (como uma força pulsada ou de onda similares) ou em qualquer combinação dos mesmos. O aparelho pode incluir ainda um meio para mover o tecido alvo a ser substancialmente purificado e a corrente de fluido, relativo um ao outro.

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Por exemplo, quer a espiga de milho contendo sementes ou o fluxo de fluido, ou ambos, podem ser movidos. Várias modalidades do aparelho podem ser usadas com as espigas individuais ou múltiplas, intactas ou parciais de mi- lho. Por exemplo, a espiga de milho ou espigas pode ser fixada em um su- 5 porte ou pinça, que é movido em relação ao fluxo de fluido. Em outras moda- lidades, no entanto, a espiga ou espigas de milho não precisam ser fixadas individualmente em um suporte, mas podem ser livremente móveis, de modo a permitir que vários núcleos sejam contatados pela força usada para remo- ver os embriões a partir do núcleo. Os meios para mover pelo menos uma espiga de milho em relação ao fluxo de fluido podem rodar a pelo menos uma espiga de milho e a pelo menos uma abertura em relação ao outro, ou pode mover o fluxo de fluido ao longo do eixo longitudinal da pelo menos uma espiga de milho, ou pode fornecer qualquer movimento tridimensional apropriado a pelo menos uma espiga de milho e a pelo menos uma abertura em relação uma a outra, como uma combinação de rotação e o movimento longitudinal. O aparelho pode ainda incluir, pelo menos, um separador para separar os tecidos alvos dos tecidos não alvos. Por exemplo, os embriões podem ser separados de tecidos de não embriões, onde os embriões sepa- rados compreendem, pelo menos, alguns embriões de milho adequados pa- ra a transformação genética ou para cultura de tecidos. Os separadores po- dem funcionar por qualquer mecanismo adequado, incluindo, entre outros a, separação por exclusão de tamanho (por exemplo, utilizando uma malha, tela, a superfície perfurada, ou outro dispositivo capaz de excluir objetos de certo tamanhos), a separação com base na hidrofobicidade ou outras forças atrativas (por exemplo, utilizando um material, sólido ou fluido, que pode a- trair ou repelir os embriões), e de separação por diferenciais de massa ou densidade (por exemplo, utilizando uma centrífuga, ou utilizando soluções de sedimentação diferencial). O separador pode ser opcional, como por exem- plo, onde não é necessário isolamento adicional de embriões intactos ou parciais para a sua utilização na transformação genética ou cultura de teci- dos.

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Os embriões imaturos substancialmente isolados (e opcional- mente separados) incluem, pelo menos, alguns embriões como embriões imaturos intactos ou parciais, adequados para aplicações em cultura de teci- dos, transformação, formação de calos, embriogênese direta, formação de 5 tecido de planta diferenciado, a formação de pelo menos uma planta madu- ra, a formação de pelo menos uma planta fértil madura, e combinações des- tes processos, como descrito acima.

Os embriões imaturos substancialmen- te isolados e tecidos de não embriões podem também ser usados para ou- tros fins, como, entre outros, análise genética ou bioquímica.

Aparelhos de combinação podem incluir, opcionalmente, um meio para mover a pelo menos uma espiga de milho em relação à fonte ou fontes de força (isto é, a superfície sólida para aplicação de pressão mecâni- ca positiva, a abertura para guiar o fluxo de fluido, ou a abertura para a apli- cação de pressão negativa de fluido). De preferência, a espiga, ou espigas, se move em relação à fonte de força de modo que a força ou as forças con- tata o máximo de núcleos durante um determinado período de tempo, como é conveniente, de modo a isolar os embriões mais rapidamente.

Aparelhos de combinação podem ainda incluir pelo menos um meio para posterior separação dos embriões imaturos substancialmente iso- lados adequados para a transformação genética ou de cultura de tecidos, onde os embriões separados compreendem, pelo menos, alguns embriões de milho adequados para a transformação genética ou cultura de tecidos.

Os separadores podem funcionar por qualquer mecanismo adequado, incluindo, entre outros, a separação por exclusão por tamanho, a separação baseada em forças de atração, e separação por diferenciais de massa ou densidade.

Em outro aspecto da presente invenção, as células de planta são embriões maduros.

Explantes de embriões maduros podem ser obtidos a partir de sementes secas, por exemplo, como revelado na Publicação do Pedido de Patente US 2008/0280361. Estes explantes são referidos como explantes secos cortados (DEEs). Explantes secos úmidos também podem ser utilizados, que são explantes que foram excisados de sementes após hidratação/embebição, e são subsequentemente desidratados e armazena-

18893486v1 dos.

Ambos os tipos de explantes mostraram ser bastante estáveis após ar- mazenamento, mas uma etapa de hidratação rápida antes da transformação pode reduzir a sua capacidade para a transformação mediada por bactéria.

Embora não pretendendo estar limitado por um mecanismo de ação particu- 5 lar, os métodos da presente invenção são úteis na regulação da velocidade de hidratação de explantes derivados de embriões de sementes secas, ou de explantes que são desidratados após a excisão de sementes hidratadas, ou embebidas, assim melhorando a competência de células de planta para a transformação mediada por bactéria.

Em várias modalidades, os explantes compreendendo células de planta podem ser obtidos por métodos manuais ou mecânicos.

Antes da exci- são de embriões, as sementes podem ser submetidas a uma etapa de esteri- lização, como também a uma etapa de descarte, para evitar a contaminação microbiana, para remover as sementes com um grau elevado de contamina- ção bacteriana ou fúngica, e também para remover as sementes que por qualquer razão podem ser improváveis de produzir tecido de explante viável para utilização com a presente invenção.

O descarte pode ser realizado, por exemplo, com base em parâmetros como a dimensão, a cor ou densidade das sementes ou outras características, incluindo as características de composi- ção química.

Exemplos de métodos de descarte pode incluir a utilização de uma escala de automática, depois da classificação por tamanho.

Um classifi- cador óptico adequado para esta finalidade é o Sortex 3000 Series Color Sor- ter (Buhler-Sortex KK, Yokohama, Japão). Outras técnicas de descarte tam- bém podem ser empregadas incluindo o descarte por teor de umidade.

Em modalidades específicas, a excisão é executada mecanica- mente utilizando-se rolos que trituram as sementes aplicadas às suas faces, que pode ser contra rotação.

A distância entre os rolos pode ser ajustada com base no tamanho das sementes aplicadas.

O material do rolo pode, por exemplo, ser metálico ou elastomérico.

Em certas modalidades, demonstrou- se que os rolos de aço inoxidável retêm qualidades benéficas de trabalho mesmo após o uso repetido e sustentado.

Em uma modalidade, um explante pode ter uma umidade interna de cerca de 3-25%, incluindo cerca de 3, 5, 6,

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7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, e 25% de umi- dade interna e, especificamente incluindo todas as faixas deriváveis entre quaisquer dois de ditos valores.

Sementes a partir das quais os explantes devem ser preparados podem ser colhidas a uma umidade interna prede- 5 terminada adequada para isolar as células de plantas transformáveis das mesmas.

A fragilidade das sementes pode ser alterada por meio da manipu- lação do teor de umidade, o que permite obter uma separação eficaz de se- mentes e preparação dos explantes.

Por exemplo, um teor de umidade in- terna, como de 3% a 7% pode ser vantajoso.

As sementes podem ser man- tidas com tais teores de umidade ou qualquer outro teor de umidade produ- zindo condições de armazenamento estáveis (e explantes transformáveis) antes do uso.

A fragilidade das sementes pode também ser alterada por ex- posição das sementes a baixas temperaturas, por exemplo -20°C ou -80°C, ou ainda mais frio, por exemplo, quando em contatadas com nitrogênio líqui- do (aproximadamente -196°C). Explantes secos de várias idades podem ser utilizados, incluindo quando os explantes estão relativamente "jovens", em que foram removidos de sementes de menos de um dia, por exemplo, desde cerca de 1 a 24 ho- ras, como cerca de 2, 3, 5, 7, 10, 12, 15, 20, ou 23 horas antes da utilização.

Explantes também podem ser armazenados por longos períodos, incluindo dias, semanas, meses ou mesmo anos, dependendo das condições de ar- mazenamento usadas para manter a viabilidade do explante.

Aqueles espe- cialistas na técnica, em particular, compreenderão que os tempos de arma- zenagem podem ser aprimorados de modo que a qualidade e/ou rendimento dos transformantes, bem como a eficiência do processo de transformação, seja maximizada.

Uma semente seca ou um explante pode ser preparado em pri- meiro lugar, por exemplo, por embebição em um líquido como água ou um líquido de esterilização, antes de ser seco novamente, e depois usado para transformação e regeneração.

A semente ou o explante pode também ser preparado através do aumento do teor de umidade interno da semente supe- rior a 30%, mantendo a semente ou o explante em um ponto de tempo e, em

18893486v1 seguida, reiniciar a embebição em um ponto de tempo posterior.

Alternati- vamente, a semente ou o explante pode ser preparado pelo aumento do teor de umidade interna acima de 30%, armazenando as sementes ou o explante durante um período predeterminado, a secagem das sementes ou o explante 5 ao teor de umidade interno abaixo de 20%, e em seguida, reiniciar a embe- bição.

Explantes transformáveis regeneráveis podem ser colhidos que não contêm nenhum ou alguns ou uma parte de cada cotilédone permane- cente ligado ao tecido embrionário ou nenhum, por exemplo, no máximo ¼ do cotilédone.

Estes explantes são considerados substancialmente similares, uma vez que cada um pode resultar em uma planta transformada estável.

O explante deverá, contudo, conter, pelo menos, parte da região meristemá- tica do embrião de tal modo que normalmente o explante pode produzir um broto dentro de 12 semanas após o inicio de condições de crescimento de cultura de tecidos.

Um número de parâmetros para a obtenção e manipulação de explantes pode ser variado.

A esterilização pode ser realizada por contato de uma semente ou de explante com um agente de esterilização líquido.

Uma semente ou um explante pode também ser contatado com um agente esteri- lizante gasoso, ou com um agente de esterilização por irradiação, como luz UV.

Alternativamente, uma semente ou um explante pode ser esterilizado submetendo a semente ou o explante a um breve período de altas tempera- turas, de modo a reduzir vigor de contaminantes biológicos como bactérias adventícias e fungos sobre a superfície das sementes ou explante sem re- duzir o vigor das sementes ou explante.

Isto pode ser conseguido a uma temperatura superior a 40°C, por exemplo, desde cer ca de 40°C até cerca de 90°C.

A temperatura pode ser aumentada, por exem plo, por meio de ar aquecido forçado ou vapor.

Tais temperaturas podem ser fornecidas por se- cadores produzidos por Bry-Air Inc. (Sunbury, Ohio, EUA). A adição de nista- tina (50 ppm) e tiabendazol (10 ppm) dissolvidos em DMSO (1,0 mL de DM- SO por litro de INO) para um meio de co-cultura (como INO) podem melho- rar a saúde dos explantes, provavelmente por controlar as leveduras e fun-

18893486v1 gos encontrados geralmente nas e sobre as sementes e pode ser uma fer- ramenta útil na realização de cultura de tecido grande e/ou automatizada. O teor de umidade da semente no momento da excisão pode ser variado, assim como a temperatura da semente no momento da excisão. 5 Além disso, o parâmetro de armazenamento após a excisão pode ser varia- do. Por exemplo, a umidade relativa sob as quais ocorre o armazenamento do explante pode ser variada. A temperatura de armazenamento do explante pode também ser variada, assim como a duração do armazenamento dos explantes, e a composição do meio onde o explante é armazenada. Outros parâmetros que podem ser manipulados incluem composições de meios de hidratação e reidratação, temperatura de incubação, duração do período, e métodos de transformação, entre outros. Após a excisão métodos e aparelhos para a seleção de material de explante a transformável de explantes não transformáveis danificados, cotilé- dones, tegumentos, e outros debris são empregues, como descrito em Publica- ção de Pedido de Patente US 2008/0280361. Os métodos podem ser executa- dos manualmente, ou podem ser parcialmente ou totalmente mecanizados. Por exemplo, um ou mais passos de peneiragem podem ser realizados, usando peneiras de tamanho apropriado com base no tamanho das sementes a serem trituradas e os explantes a serem isolados. O rendimento em massa das se- mentes trituradas que passaram através dos rolos pode ser colocado em uma série de peneiras de separação, de tal modo que debris indesejáveis grandes e pequenos são separados do explante desejado por exclusão de tamanho. Isto pode ser eficazmente realizado, por exemplo, com o material de soja, utilizando peneiras padrão US, como: #8 (2,36 mm de abertura), #10 (abertura de 2,0 mi- límetros), #16 (abertura de 1,18 mm), e outras conforme adequado (por exem- plo, penieras de janela alongada com abertura, como 1/16 "× ¾", 1/18 "× ¾", 1/19 "× ½", ou 1/20 "× ½"). Peneiras com outros tamanhos de abertura podem ser fabricadas, se necessário, levando em conta os tamanhos de sementes com base no tamanho do material a ser aplicado. O período de tempo durante o processo de seleção e o vigor da peneiração podem também ser ajustados para melhorar a produtividade e/ou do rendimento do processo.

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Outros métodos de seleção também podem ser utilizados, como medir a flutuabilidade diferencial em soluções de material de explante versus debris.

Uma fração do material que flutua em uma solução aquosa foi encon- trada ser enriquecida por explantes transformáveis intactos. 5 O explante pode ser recuperado a partir de uma semente hidra- tada, a partir de sementes secas armazenáveis, a partir de uma de reidrata- ção parcial de um explante seco hidratado, onde "Hidratação" e "reidratação" são definidas como uma alteração mensurável na percentagem de umidade interna das sementes, ou a partir de uma semente que é "preparada", isto é, uma semente, que iniciou a germinação, mas foi apropriadamente colocada na estase pendente das condições favoráveis para completar o processo de germinação.

Aqueles especialistas na técnica serão capazes de utilizar vá- rios métodos de hidratação e aprimorar o período de incubação antes da transformação.

O explante resultante é armazenável e pode germinar e ou ser transformado, quando as condições adequadas são fornecidas.

Assim, o novo explante do meristema, seco, armazenável pode ser referido como uma semente artificial.

Após a excisão, um especialista na técnica pode armazenar o explante de acordo com os métodos descritos anteriormente para uso sub- sequente.

Métodos e parâmetros de secagem, armazenamento e germina- ção de sementes são conhecidos na técnica.

Armazenamento de explantes excisados compreendendo células de planta pode ser realizado usando mo- dificações de tais condições de armazenamento, como desejado, incluindo as temperaturas, por exemplo, de desde cerca de -80°C a cerca de 60°C.

Temperaturas de cerca de -20°C a temperatura ambien te em particular, de- monstraram funcionar bem.

Depois que os explantes de embriões isolados compreendendo células são contatados com as composições da presente invenção, os ex- plantes podem ser transformados por uma sequência de DNA heterólogo selecionado, e as plantas transgênicas podem ser regeneradas dos mes- mos.

As plantas transgênicas podem também ser referidas como aconte- cimentos transgênicos.

Vários métodos têm sido desenvolvidos para trans-

18893486v1 ferir genes para tecido de planta incluindo a microprojeção de alta veloci- dade, microinjeção, eletroporação, absorção direta de DNA e a transforma- ção mediada por bactéria.

Os métodos de utilização de várias espécies de bactérias Rhizobiaceae como um vetor para a transformação genética de 5 plantas e/ou de células de planta e regeneração de plantas transgênicas das mesmas são conhecidos na técnica.

A linhagem bacteriana hospedeira é geralmente de Agrobacterium tumefaciens ABI, C58, LBA4404, EHA101, ou EHA105 transportando um plasmídeo tendo uma função de transferên- cia para a unidade de expressão.

Em determinados aspectos, não limitan- tes da presente invenção, a transformação mediada por Agrobacterium e regeneração de uma planta transgênica podem ser conduzidas como des- crito nas Patentes US 5.824.877, 5.591.616, 5.981.840, 6.384.301. Outras linhagens bacterianas também conhecidas dos especialistas na técnica de transformação de plantas são contempladas para utilização na presente invenção, por exemplo, transformação mediada por Rhizobium como des- crito na Publicação do Pedido de Patente US 2007/0271627, Sinorhizobium sp., Mesorhizobium sp. e Bradyrhizobium sp. (por exemplo, Broothaerts et al., 2005). Meios para preparar os plasmídeos ou os vetores que contêm os componentes genéticos desejados são bem conhecidos na técnica.

Geral- mente, a sequência de DNA heteróloga é combinada com um ou mais com- ponentes genéticos para preparar uma unidade de expressão.

Frequente- mente estas unidades de expressão são fornecidas com menos uma frontei- ra de T-DNA para transferência da sequência para as células da planta.

Uma ou mais unidades de expressão estão inseridas em um plasmídeo ou vetor, que é então mobilizado nas bactérias, que são então contatadas com as cé- lulas.

As bactérias transferem a unidade de expressão para a célula e a uni- dade de expressão é incorporada no genoma da célula e, em seguida, her- dada de uma geração para outra.

Os componentes genéticos são incorporados em um plasmídeo ou molécula de vetor compreendendo pelo menos um ou mais dos seguintes componentes genéticos:

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(a) um promotor que funcione em células de planta para causar a produção de uma sequência do RNA, (b) uma sequência estrutural do DNA que cause a produção de uma sequência de RNA que codifique um produto da utilidade comercial 5 e/ou de uma sequência de DNA que cause a produção de uma molécula de RNAi para inibir a expressão de um gene; e (c) uma sequência de DNA 3' não traduzida que funciona em cé- lulas de planta para causar a adição de nucleotídeos poliadenilados a extre- midade 3' da sequência do RNA.

A transcrição do DNA em mRNA é regulada por uma região do DNA normalmente referida como o "promotor". A região do promotor contem uma sequência de bases que sinaliza à RNA polimerase se associar ao DNA e iniciar a transcrição de mRNA que usa uma das fitas do DNA como um molde para fazer uma fita complementar correspondente do RNA.

Um núme- ro de promotores que estão ativos em células de planta tem sido descrito na literatura.

Tais promotores incluiriam, entre outros, os promotores da nopali- na sintase (NOS) e otopina sintase (OCS) que são transportados em plas- mídeos Ti de Agrobacterium tumefaciens, os promotores de caulimovirus, tal como os promotores de vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) 19S e 35S e o promotor 35S do vírus do mosaico Figwort (FMV) e o promotor melhorado de CaMV35S (e35S). Uma variedade de outros promotores de genes de planta é regulada em resposta ambiental, hormonal, química e/ou sinais de desenvolvimento, também pode ser usada para a expressão de genes hete- rólogos em células de planta, incluindo, por exemplo, promotores regulados por (1) calor (Callis et al., 1988, (2) luz (por exemplo, promotor RbcS-3A de ervilha, Kuhlemeier et al., (1989); promotor RbcS de milho, Schaffner et al., (1991); (3) hormônios, como o ácido abscísico (Marcotte et al., 1989, (4) fe- rimento (por exemplo, Wuni, Siebertz et al., 1989); ou outros sinais ou produ- tos químicos.

Expressão específica de tecido também é conhecida.

Como descrito abaixo, é preferencial que o promotor particular selecionado seja capaz de causar expressão suficiente para resultar na produção de uma quantidade eficaz do produto do gene de interesse.

Os exemplos que des-

18893486v1 crevem tais promotores incluem entre outros Patente US 6.437.217 (promo- tor do milho RS81),. Patente US 5.641.876 (promotor da actina do arroz), Patente US 6.426.446 (promotor do milho RS324),. Patente US 6.429.362 (promotor do milho PR-1), Patente US 6.232.526 (promotor do milho A3),. 5 Patente US 6.177.611 (promotores constitutivos do milho), Patente US

5.322.938, 5.352.605, 5.359.142 e 5.530.196 (promotor 35S), Patente US

6.433.252 (promotor da oleosina do milho L3), Patente US 6.429.357 (pro- motor 2 da actina do arroz bem como intron 2 da actina do arroz), Patente US 5.837.848 (promotor específico da raiz), Patente US 6.294.714 (promoto- res induzíveis por luz), Patente US 6.140.078 ((promotores induzíveis por sal), Patente US 6.252.138 (promotores induzíveis de patógenos), Patente US 6.175.060 (promotores induzíveis por deficiência de fósforo ), Patente US

6.635.806 (promotor gama-coixina), e Pedido de Patente US 09/757.089 (promotor aldolase do cloroplasto de milho). Promotores adicionais que po- dem encontrar utilização são promotor de nopalina sintase (NOS), (Ebert et al., 1987), promotor de sintase de otopina (OCS) (que é realizada em plas- mídeos indutores de tumores de Agrobacterium tumefaciens), os promotores de caulimovirus vírus como o promotor 19S do mosaico da couve-flor (CaMV) (Lawton et al., 1987.), o promotor 35S de CaMV (Odell et al., 1985.), o promotor 35S do vírus mosaico figwort (Walker et al., 1987,. Patente US

6.051.753, 5.378.619), o promotor da sacarose sintase (Yang et al., 1990), o promotor do gene complexo R (Chandler et al., 1989), e o promotor do gene de ligação da proteína a/b da clorofila, e promotores PC1SV (Patente US.

5.850.019), e AGRtu.nos (GenBank Acessão V00087; Depicker et al., 1982;. Bevan et al., 1983). Promotores híbridos também podem ser construídos de modo a melhorar a atividade de transcrição (Patente US 5.106.739), ou para combinar a atividade de transcrição desejada, a indutibilidade e especificida- de de tecido ou da especificidade de desenvolvimento. Promotores que fun- cionam em plantas incluem, entre outros, promotores que são induzíveis, virais, sintéticos, constitutivos como descrito, e temporalmente regulado, es- pacialmente regulado e espaço-temporalmente regulado. Outros promotores que são melhoradores de tecidos, tecido específico, ou desenvolvente regu- 18893486v1 lada também são conhecidos na técnica e visionados como tendo utilidade na prática desta invenção. Os promotores utilizados nos constructos de DNA (isto é, genes de plantas quiméricos/recombinantes da presente invenção podem ser modi- 5 ficados, se desejado, para afetar as suas características de controle. Os promotores podem ser derivados por meio de ligação a regiões de operado- res, mutagênese ao acaso ou controlada, etc. Além disso, os promotores podem ser alterados para conter múltiplas "sequências melhoradoras" para ajudar a elevação da expressão do gene. O mRNA produzido por um constructo de DNA da presente in- venção pode também conter uma sequência líder 5' não traduzida. Esta se- quência pode ser derivada do promotor selecionado para expressar o gene e pode ser especificamente modificado de modo a aumentar ou diminuir a tra- dução do mRNA. As regiões 5' não traduzidas podem também ser obtidas a partir de RNAs virais, a partir de genes eucariotas apropriados, ou de uma sequência de gene sintética. Tais sequências "melhoradoras" podem ser desejáveis para aumentar ou alterar a eficiência da tradução do mRNA resul- tante. A presente invenção não está limitada a construções onde a região não traduzida é derivada de ambas as sequências 5' não traduzidas que a- companham a sequência do promotor. Em vez disso, a sequência líder não traduzida pode ser derivada de promotores ou genes não relacionados (ver, por exemplo, Patente US 5.362.865). Exemplos de sequências líder não tra- duzidas incluem proteínas líderes de choque por calor de milho e petúnia (Patente US 5.362.865), proteína de vírus líderes de tegumento, líderes de plantas rubisco, GmHsp (Patente US 5.659.122), PhDnaK (Patente US

5.362.865), AtAnt1, TEV (Carrington and Freed, 1990), e AGRtu.nos (Gen- Bank Acessão V00087; Bevan et al., 1983). Outros componentes genéticos que servem para estimular a expressão ou afetar a transcrição ou tradução de um gene são também previstos como componentes genéticos. A região 3' não traduzida das construções quiméricas podem conter um terminador da transcrição, ou um elemento que tem uma função equivalente, e um sinal de poliadenilação que funciona em plantas para cau- 18893486v1 sar a adição de nucleotídeos poliadenilados à extremidade 3' do RNA.

As sequências de DNA são aqui referidas como regiões de transcrição- terminação.

As regiões são necessárias para a poliadenilação eficiente do RNA mensageiro transcrito (mRNA). RNA polimerase transcreve uma se- 5 quência de DNA que codifica através de um local onde ocorre poliadenila- ção.

Exemplos adequados de regiões 3' são: (1) as regiões 3' transcritas, não traduzidas contendo o sinal de poliadenilação dos genes de plasmídeo de indução de tumor (Ti) de Agro- bacterium, como o gene da nopalina sintase (NOS,. Fraley et al., 1983), e (2) genes de plantas como os genes da proteína de armazena- mento da soja e a pequena subunidade do gene da carboxilase de ribulose- 1,5-bifosfato (ssRUBISCO). Um exemplo de uma região 3' preferida é a par- tir do gene E9 ssRUBISCO de ervilha (Pedido de Patente Europeia 0385962). A presente invenção pode ser usada com qualquer plasmídeo adequado para transformação de plantas ou um vetor contendo um marca- dor contável, selecionável, ou triável e elementos reguladores associados, como descrito, junto com um ou mais ácidos nucleicos expressos de uma maneira suficiente para conferir uma característica particular desejável.

E- xemplos de marcadores são conhecidos, e incluem, entre outros, GUS, a proteína fluorescente verde (GFP), e luciferase (LUX), entre outros.

Os mar- cadores selecionáveis ou triáveis funcionam em tecido de planta regenerável para produzir um composto que confere ao tecido vegetal resistência a um composto de outro modo tóxico.

Em certas modalidades, o vetor compreen- de um gene aadA com os elementos reguladores associados que codificam para a resistência à espectinomicina, em células vegetais.

Em uma modali- dade particular, o gene aadA compreende uma sequência de peptídeo de trânsito de cloroplasto (CTP) que direciona o transporte do produto do gene aadA para o cloroplasto de uma célula de planta transformada.

Em outras modalidades, o vetor compreende um gene de resistência à espectinomicina com elementos reguladores adequados concebidos para expressão em uma célula bacteriana, como uma célula de Agrobacterium, de modo que o rea-

18893486v1 gente de seleção pode ser adicionado a um meio de cocultura, e permitindo a obtenção de plantas transgênicas, por exemplo, sem utilização posterior do agente seletivo, após o período de cocultura. Exemplos de genes ade- quados que conferem características de interesse agronômico como previsto 5 pela presente invenção que incluem, entre outros, genes de tolerância à do- ença, insetos ou pragas, tolerância a herbicidas, genes para melhorias de qualidade como rendimento, melhorias nutricionais, tolerâncias a ambiente ou stress, ou quaisquer alterações desejáveis em fisiologia, crescimento, desenvolvimento, morfologia produtos de planta (s), incluindo a produção de amido (Patentes US 6.538.181; 6.538.179, 6.538.178, 5.750.876,

6.476.295), produção de óleos modificada (Patentes US 6.444.876.;

6.426.447, 6.380.462), alta produção de óleo (Patentes US 6.495.739;

5.608.149, 6.483.008, 6.476.295), teor de ácidos graxos modificado (Paten- tes US 6.828.475;. 6.822.141, 6.770.465, 6.706.950, 6.660.849, 6.596.538,

6.589.767, 6.5377.50, 6.489.461, 6.459.018), alta produção de proteína (Pa- tente US. 6.380.466), a maturação do fruto (Patente US 5.512.466), melhoria da alimentação animal e humana (Patentes US 6.723.837; 6.653.530;

6.5412.59; 5.985.605; 6.171.640), biopolímeros (Patentes US RE37, 543;

6.228.623, 5.958.745 e Publicação de Patente US US20030028917). Tam- bém resistência ao estresse ambiental (Patente US 6.072.103), peptídeos farmacêuticos e peptídeos secretáveis (Patentes US 6.812.379, 6.774.283,

6.140.075, 6.080.560), características de processamento melhoradas (Pa- tente US 6.476.295), melhor digestibilidade (Patente US 6.531.648) baixa rafinose (Patente US 6.166.292), produção industrial de enzimas (Patente US 5.543.576), melhor sabor (Patente US 6.011.199), fixação de nitrogênio (Patente US 5229114) produção de sementes híbridas (Patente US

5.689.041), produção de fibras (Patente US. 6.576.818; 6.271.443,

5.981.834, 5.869.720), e produção de biocombustíveis (Patente US

5.998.700). Qualquer um destes ou outros elementos genéticos, métodos, e transgenes podem ser utilizados com a invenção, como será apreciado pelos especialistas na técnica tendo em vista a revelação instantânea. Alternativamente, as sequências de DNA de interesse podem 18893486v1 afetar estes fenótipos através da codificação de uma molécula de RNA que causa a inibição específica da expressão de um gene endógeno através de tecnologias de silenciamento do gene, como os mecanismos anti-senso, de co-supressão mediada, tecnologias de RNAi incluindo miRNA (por exemplo, 5 Publicação de Pedido de Patente US 2006/0200878). Exemplos de ácidos nucleicos que podem ser introduzidos atra- vés dos métodos abrangidos pelo presente invenção incluem, por exemplo, sequências de DNA ou genes de outras espécies ou mesmo genes ou se- quências que se originam ou estão presentes nas mesmas espécies, mas são incorporados em células receptoras por métodos de engenharia genéti- ca, em vez da reprodução clássica ou técnicas de reprodução. No entanto, o termo "exógeno" também pretende referir-se a genes que não estão nor- malmente presentes na célula que está sendo transformada, ou talvez sim- plesmente não presentes na forma, estrutura, etc, como encontrados no ge- ne ou segmento de DNA de transformação, ou os genes que estão normal- mente presentes ainda que se deseje, por exemplo, ter sido sobre- expressados. Assim, o termo gene ou DNA "exógeno" destina-se a referir a qualquer gene ou segmento de DNA que é introduzido em uma célula recep- tora, independentemente se um gene similar possa já estar presente em tal célula. O tipo de DNA incluído no DNA exógeno pode incluir DNA que já está presente na célula da planta, DNA de outra planta, DNA de um organismo diferente ou um DNA gerado externamente, como uma sequência de DNA contendo uma mensagem antissenso de um gene, ou uma sequência de DNA que codifica uma versão sintética ou modificada de um gene. O T-DNAs devem estar ligado a sequências RB e/ou LB ou pode não ter sequências de fronteira. As sequências que podem ser transferidas para uma célula de planta podem estar presentes em um vetor de transfor- mação de uma linhagem bacteriana a ser utilizada para a transformação. Em outra modalidade, as sequências podem estar presentes em vetores de transformação separados na linhagem bacteriana. Ainda em outra modalida- de, as sequências podem ser encontradas em células bacterianas separa- das ou linhagens utilizadas em conjunto para a transformação.

18893486v1

Os constructos de DNA utilizadas para a transformação nos mé- todos da presente invenção podem também conter os segmentos de DNA que proporcionam plasmídeos esqueleto que fornecem função de replicação e seleção por antibióticos em células bacterianas, por exemplo, uma origem 5 de replicação de Escherichia coli como ori322, uma ampla gama de origem de replicação de hospedeiros como oriV ou oriRi, e uma região de codifica- ção para um marcador selecionável, como Spec/Strp que codifica para ami- noglicosídeo adeniltransferase (aadA) conferindo resistência à estreptomici- na ou espectinomicina (por exemplo, Patente US 5.217.902. À luz desta re- velação, numerosos outros possíveis elementos reguladores e outras se- quências de interesse serão aparentes para aqueles especialistas na técni- ca.

Portanto, a discussão que se segue destina-se a ser mais exemplificado- ra do que exaustiva.

Os especialistas na técnica estão cientes dos passos típicos do processo de transformação de plantas mediada por Agrobacterium.

A Agro- bacterium pode ser preparada através da inoculação de um líquido, como meio de Luria Burtani (LB) diretamente a partir de um estoque de glicerol ou estriando a Agrobacterium em um meio solidificado a partir de um estoque de glicerol, permitindo que as bactérias cresçam sob as condições seletivas adequadas, geralmente cerca de 26°C - 30°C, ou cerc a de 28°C, e reco- lhendo uma colônia isolada ou o conteúdo de uma pequena alça de Agro- bacterium da placa e inoculando de um meio de cultura líquido contendo os agentes seletivos.

Aqueles especialistas na técnica estão familiarizados com os procedimentos para crescimento e as condições de cultura adequadas para Agrobacterium bem como os procedimentos de inoculação subsequen- tes.

A densidade da cultura de Agrobacterium utilizada para a inoculação e a proporção de células de Agrobacterium para explante podem variar de um sistema para o próximo, e por isso o aprimoramento destes parâmetros para qualquer método de transformação é esperado.

Tipicamente, uma cultura de Agrobacterium é inoculada a partir de uma placa estriada ou estoque de glicerol e é cultivada durante a noite e as células bacterianas são lavadas e ressuspensas em um meio de cultura

18893486v1 adequado para inoculação do explante.

Meios de inoculação adequados pa- ra a presente invenção incluem, entre outros, ½MS PL ou ½MS VI para os explantes de embriões imaturos (ver Tabelas 1 e 2, respectivamente, e INO ver Tabela 6) para explantes de embriões maduros. 5 A fase seguinte do processo de transformação mediada por Agrobacterium é a inoculação.

Nesta etapa, os explantes e suspensões celu- lares de Agrobacterium são misturados em conjunto.

Em modalidades da presente invenção onde os explantes de embriões são de embriões imaturos de milho, os explantes de embriões são colocados diretamente no meio de inoculação contendo a Agrobacterium.

Os embriões são cultivados em meio de inoculação por menos de 30 min.

A inoculação é geralmente realizada a uma temperatura de cerca de 15°C a 30°C, ou cerca d e 23°C a 28°C.

A ino- culação pode também ser realizada através do isolamento dos embriões imaturos diretamente para o meio de co-cultura (descrito abaixo) e, em se- guida, colocar 1 L de solução de Agrobacterium sobre o embrião ou, alter- nativamente, colocando um pedaço de papel de filtro saturado em solução de Agrobacterium sobre a parte superior dos embriões durante cerca de 5 a 60 minutos.

O papel de filtro e qualquer excesso de solução são em seguida, removidos antes da cocultura.

Em certas modalidades, no momento, ou depois do momento em que um DNA heterólogo está em contato com o explante, o explante po- de ser contatado com um ou mais reguladores de crescimento de plantas (PGRs). Muitos PGRs são conhecidos na técnica e estão contemplados em tais modalidades, como auxinas, citocininas, antiauxinas, giberelinas, herbi- cidas, inibidores e retardadores do crescimento, morfactinas, estimuladores de crescimento e/ou de outros reguladores de crescimento de plantas não classificados, conforme listado no resto da presente revelação.

Após a inoculação, qualquer excesso da suspensão de Agrobac- terium pode ser removido e a Agrobacterium e o material de plantas alvo são cocultivados.

A cocultura refere-se ao tempo pós-inoculação e antes da transferência para um meio de atraso ou seleção.

Qualquer número de mei- os de cultura de tecidos de plantas pode ser utilizado para a etapa de cocul-

18893486v1 tura.

Em certas modalidades, após a inoculação com Agrobacterium os teci- dos das plantas foram cultivados em um meio de cocultura semissólido ba- seado em MS, ou baseado em ½ MS sal reduzido com um agente de gelifi- cação, como agarose, ou EEO com baixa agarose (Tabela 3). 5 Tabela 3. Meio de cocultura semisólido baseado em MS. 1/2 MS Baseado MS Baseado em meio de co- em meio de cultura cocultura

Componentes Fonte Quantidade por Litro MS Sais basais Phytotech M524 2,165 g 4,33 g MS Vitaminas Phytotech M533 103,1 mg 103,1 mg Tiamina HCL Sigma T-3902 0,5 mg 0,5 mg 2,4-D Phytotech D295 3 mg 0,5 mg Glicose Phytotech G386 10 g 0 Sacarose Phytotech S391 20 g 30 g Prolina Sigma P-5607 0,115 g 1,38 g Casamin ácidos Difco DF0288-17 0 0,5 g Agarose, Baixo EEO Sigma A-6013 5,5 g 5,5 g Acetosiringona Aldrich, D134406 40 mg 40 mg Nitrato de prata Sigma S-6506 3,4 mg 3,4 mg Carbenicilina Phytotech C346 0 50 mg pH 5,2 5,8 A co-cultura é tipicamente realizada durante cerca de um a três dias, ou por menos de 24 horas a uma temperatura de cerca de 18°C a 30°C, ou cerca de 20°C a 25°C.

A cocultura pode ser realizada com luz ou em condições limitantes de luz.

Normalmente, a cocultura é realizada em condições limitantes de luz. "Condições limitantes de luz", como aqui utiliza- dos são definidas como quaisquer condições que limitam a luz durante o período de cocultura, incluindo entre outros a cobrir uma placa de cultura contendo a planta e a mistura de Agrobacterium com um pano, folha, ou a colocar as placas de cultura em um saco preto, ou colocar as células cultiva-

18893486v1 das em um quarto escuro.

As condições de iluminação podem ser aprimora- das para cada sistema de planta, como é conhecido pelos especialistas na técnica.

Em modalidades da presente invenção, onde os explantes de 5 embriões são de embriões de soja maduros, os explantes de embriões são expostos ao inóculo preparado, e brevemente exposto a energia de sonica- ção de um laboratório de um banho de limpeza sonicador padrão, como L e R Ultrasonics QS140 (L & R Manufacturing Co., Kearny, NJ), ou um sonica- dor W113 Honda (Honda, Denshi Japan) por 20 segundos.

Após a breve etapa de sonificação, os explantes são drenados do inóculo de origem e transferidos para PLANTCONs frescos cada um contendo papel de filtro u- medecido com o meio contendo INO, geralmente dentro de algumas horas após o início da transfecção.

Os explantes são então incubados em uma câmara iluminada (geralmente 16 horas de luz em 䵑 5 uE) a cerca de 23 a 28°C por 1 a 5 dias.

Co-cultura e as etapas subsequ entes podem ser reali- zadas sob condições de escuridão, ou sob condições de luz, por exemplo, em incubadoras Percival com iluminação, por exemplo, de 2 a 5 dias (por exemplo, fotoperíodo de 16 horas de luz/8 horas de escuro, com intensidade de 䵑 5 E, como cerca de 5-200 E ou outras condições de iluminação que permitem o desenvolvimento normal dos plastídeos), a uma temperatura de cerca de 23° a 25°C, e pode ser realizada até cerca de 35°C ou 40°C.

Após a cocultura com Agrobacterium ou após o bombardea- mento com microprojéteis, os explantes podem ser colocados diretamente em meio de regeneração, tipicamente contendo um agente seletivo.

Os explantes (independentemente do método de transformação) são coloca- dos em meios seletivos, por cerca de 7 a cerca de 42 dias, ou entre cerca de 7 a cerca de 30 dias, ou entre cerca de 7 a cerca de 21 dias, ou cerca de 7 a cerca de 14 dias.

Uma variedade de meios de cultura de tecidos e os requisitos de transferência são conhecidos por poderem ser implemen- tados e aprimorados para suportar o crescimento do tecido da planta e o desenvolvimento de transformação e de recuperação de plantas transgêni- cas.

Estes meios de cultura de tecidos podem ser adquiridos como uma

18893486v1 preparação comercial ou preparados de forma personalizada e modificados por aqueles especialistas na técnica.

Exemplos de tais meios incluem, mas entre outros aos descritos por Murashige e Skoog, (1962); Chu et al., (1975),. Linsmaier e Skoog, (1965); Uchimiya e Murashige, (1962); Gam- 5 borg et al., (1968), Duncan et al., (1985),. McCown e Lloyd, (1981); Nitsch e Nitsch (1969) e de Schenk e Hildebrandt (1972), ou derivações destes meios suplementados de acordo.

Os especialistas na técnica estão cientes de que os meios e suplementos de meios como nutrientes e reguladores do crescimento para utilização em transformação e regeneração são normal- mente aprimoráveis para uma colheita alvo em particular ou variedade de interesses.

Meios de cultura de tecidos podem ser complementados com carboidratos, como, entre outros, glicose, sacarose, maltose, manose, fru- tose, lactose, galactose e/ou dextrose, ou proporções de carboidratos.

Os reagentes estão comercialmente disponíveis e podem ser comprados de um número de fornecedores (ver, por exemplo, Sigma Chemical Co., St.

Louis, Mo., e Phyto Technology Laboratories, Shawnee Mission, Kans.). Componentes adicionais de meios adequados podem ser adicionados ao meio de seleção ou atraso para inibir o crescimento de Agrobacterium.

Tais componentes dos meios podem incluir, entre outros, antibióticos como car- benicilina ou Cefotaxima.

As culturas são subsequentemente transferidas para um meio adequado para a recuperação de plântulas transformadas.

Os especialistas na técnica também estão conscientes das numerosas mo- dificações nos regimes seletivos, meios e condições de crescimento, que podem ser variados, dependendo do sistema da planta e do agente seleti- vo.

Agentes seletivos típicos incluem, entre outros, antibióticos como gene- ticina (G418), a canamicina, a paramomicina, a espectinomicina, ou outros produtos químicos como glifosato ou outros herbicidas.

Em uma modalida- de específica da presente invenção, o agente seletivo é espectinomicina.

Brotos resistentes à espectinomicina que têm botões ou folhas verdes são contáveis ou selecionáveis como resistentes à espectinomicina.

Eles po- dem ser colocados no solo ou sobre um substituto do solo, como em meio de enraizamento, na presença ou na ausência do agente seletivo.

Alonga-

18893486v1 mento de brotos de tal explante são rotineiramente demonstrados como sendo transgênico, dando origem a R1 e progênie posterior que é transgê- nica, enquanto que as raízes em desenvolvimento a partir de tais explantes podem ser transgênicas ou não transgênicas. Assim, uma planta transgêni- 5 ca que compreende um broto e um sistema radicular, parcialmente ou to- talmente não transgênico é também contemplada. Alternativamente, um método para a regeneração de uma planta completa a partir de brotos transgênicos de tecido meristemático transformado enquanto as raízes são não transgênicas, por cultura de tecido transformado em meio sem um a- gente seletivo, é também contemplada, como revelado na Publicação do Pedido de Patente US 2008/0057512. Estes métodos também podem ser feitos em um ou mais recipi- entes e o processo pode ser manual ou automatizado usando o estado da arte de automação. Meios e condições de cultura revelados na presente in- venção podem ser modificados ou substituídos por componentes nutricio- nalmente equivalentes, ou processos similares para seleção e recuperação de eventos transgênicos, e ainda permanecer dentro do escopo da presente invenção. Uma planta transgênica formada utilizando métodos de transfor- mação tipicamente por Agrobacterium (embora nem sempre) contém uma única sequência de DNA recombinante simples (cópia simples) inserida em um cromossomo e é referido como um acontecimento transgênico. Tais plantas transgênicas podem ser referidas como sendo heterozigóticas para a sequência exógena inserida. Uma planta transgênica homozigótica no que diz respeito a um transgene pode ser obtida por acasalamento sexual (sel- fing) de uma planta transgênica segregante independente que contenha uma única sequência do gene exógeno para si mesmo, por exemplo, uma planta R0, para produzir sementes R1. Um quarto da semente R1 produzida será homozigótica no que se refere ao transgene. Resultados da germinação de sementes R1 em plantas que podem ser testadas para a zigosidade, tipica- mente, utilizando um ensaio do SNP ou um ensaio de amplificação térmica que permite a distinção entre os heterozigotos e homozigotos (ou seja, um ensaio de zigosidade).

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Para confirmar a presença do DNA exógeno ou "transgene(s)", nas plantas transgênicas uma variedade de ensaios pode ser realizada. Tais ensaios incluem, por exemplo, ensaios de "biologia molecular", como Sou- thern e Northern blotting e PCR™, ensaios INVADER, o método de Amplifi- 5 cação de Recombinase Polimerase (RPA) (ver, por exemplo, a Patente US

7.485.428); ensaios "bioquímicos", como detectar a presença de um produto de proteína, por exemplo, por meios imunológicos (ELISA e Western blots) ou por função enzimática; ensaios de partes da planta, como folhas ou en- saios de raiz, e, também, por meio da análise do fenótipo da planta inteira regenerada. Uma vez que o transgene foi introduzido em uma planta, o gene pode ser introduzido em qualquer planta sexualmente compatível com a pri- meira planta através do cruzamento, sem a necessidade de transformar dire- tamente a segunda planta. Portanto, como é aqui utilizado, o termo "progê- nie" indica a progênie de qualquer geração de uma planta progenitora prepa- rada em conformidade com a presente invenção, onde a progênie compre- ende construir um DNA selecionado. Uma "planta transgênica" pode, portan- to, ser de qualquer geração. "Cruzamento" de uma planta para fornecer uma linhagem de plantas com um ou mais transgenes ou alelos adicionados em relação a uma linhagem de plantas de partida é definida como as técnicas que resultam em uma sequência particular a ser introduzida em uma linha- gem de plantas por cruzamento de uma linhagem de partida, com uma plan- ta doadora A linhagem que compreende um transgene ou alelo. Para alcan- çar este objetivo pode-se, por exemplo, realizar as seguintes etapas: (a) se- mentes de plantas da primeira (linhagem de partida) e segunda (linhagem da planta doadora que compreende um transgene desejado ou alelo) plantas mãe, (b) crescer as sementes das primeira e segunda plantas progenitoras em plantas que florescem, (c) polinizar a flor da primeira planta progenitora com o pólen a partir da segunda planta progenitora e (d) colheita das semen- tes produzidas na planta progenitora tendo a flor fertilizada. Outro aspecto da presente invenção é uma planta transgênica, e quaisquer partes das mesmas como definido em outros lugares na presente 18893486v1 revelação, criada utilizando os métodos da presente invenção aqui revela- dos.

Exemplos Os especialistas na técnica apreciarão as muitas vantagens dos 5 métodos e composições fornecidos pela presente invenção.

Os exemplos a seguir são incluídos para demonstrar certas modalidades da invenção.

Os especialistas na técnica deverão, à luz da presente revelação, apreciar que muitas alterações podem ser feitas nas modalidades específicas que são descritas e ainda assim obter um resultado parecido ou similar sem se afas- tar do espírito e escopo da invenção.

Todas as referências aqui citadas es- tão aqui incorporadas como referência na medida em que complementam, explicam, fornecem um fundamento para, ou ensinam a metodologia, as téc- nicas, ou as composições aqui empregadas.

Exemplo 1 Transformação Melhorada de Células de Soja Contatadas com PEG em Água Este exemplo demonstra a transformação melhorada de em- briões de soja secos que foram contatados com uma composição contendo o PEG em água destilada estéril (SDW). Embriões secos de soja cv.

A3525 foram excisados de acordo com o método descrito na Publicação do Pedi- do de Patente US 2008/0280361 e contatados por uma hora com várias quantidades de PEG-4000 5, 10, 20, ou 50% dissolvido em SDW.

Os em- briões foram enxaguados 5-6X com SDW e transformados de acordo com os métodos descritos na Publicação do Pedido de Patente US 2009/0138985. Os embriões foram transformados com um vetor 2T de transformação possuindo uma origem de replicação OriRi ou oriV e conti- dos na linhagem ABI ou AB30 de Agrobacterium.

Os embriões foram rege- nerados em meio de seleção espectinomicina.

Como mostrado na Tabela 4, os embriões contatados com composição de PEG 5, 10, e 20% mostra- ram geralmente frequência melhorada de transformação, e frequência de eventos de cópia única melhorada, em comparação com os embriões con- tatados com meio INO ou SDW sozinha.

Os embriões que foram contata-

18893486v1 dos com 50% PEG também demonstraram uma melhoria de TF (7%) quando comparado com embriões que foram contatadas com SDW (TF = 2,3%). O experimento com PEG 50% foi feito com uma construção AB30/OriRi. Vide Tabela 5 para composição do meio de seleção especti- nomicina para a soja. Tabela 4. Frequência de transformação de células de soja contatadas com PEG em água comparada com água ou meio INO.

Tratamento TF% TF% (ABI/OriRi) (AB30/OriV) Meio INO 5,9 6,2 H2O 2,3 1,7 PEG 1% em H2O 1,9 3,7 PEG 5% em H2O 8,1 5,2 PEG 10% em H2O 14,3 12,3 PEG 20%em H2O 19,6 12,2 Tabela 5. Composição de meio de seleção espectinomicina para a soja.

Componentes Fonte Quantidade por litro Meio LM Woody Plant c/ Vitaminas Phytotech L449 2,41g Sacarose Phytotech S391 20g Gluconato de cálcio Sigma G-4625 1,29g Agargel Sigma A-3301 4g Carbenicillina (40mg/mL estoque) Phytotech C346 5mL Timentina (100mg/mL estoque) Duchefa T0190 1mL Cefotaxima (50mg/mL estoque) Midwest NDC0039-0019-10 4mL Espectinomicina (50mg/mL estoque) Sigma S-4014 3mL 18893486v1

Exemplo 2 Transformação melhorada de células de soja contatadas com PEG em meio

INO Este exemplo demonstra a transformação melhorada de 5 embriões de soja secos que foram contatados com uma composição con- tendo PEG em INO ou com meio INO. Embriões secos de soja cv. A3525 foram excisados de acordo com o método descrito na Publicação do Pedi- do de Patente US 2008/0280361 e contatados por uma hora com PEG- 4000 20% dissolvido em INO. Os embriões foram então enxaguados 5-6X com INO sozinho e transformados de acordo com os métodos descritos na Publicação do Pedido de Patente US 2009/0138985. Os embriões foram transformados com um vetor 2T de transformação possuindo uma origem de replicação OriRi e contido em uma linhagem AB30 de Agrobacterium. Os embriões foram regenerados em meio de seleção espectinomicina. Como mostrado na Tabela 6, os embriões contatados com composições de 20% de PEG geralmente mostraram frequência de transformação melhora- da em comparação com embriões contatados com meio INO sozinho em dois experimentos diferentes. Vide a Tabela 7 para composição do meio de INO. Tabela 6. Frequência de transformação de células de soja contatadas com PEG em INO comparadas com INO.

Tratamento # Explantes # Eventos para o Solo %TF

INO 4135 210 5,1 PEG 20% em INO 4049 317 7,8

INO 4149 163 3,9 PEG 20% em INO 4110 341 8,3 18893486v1

Tabela 7. Composição do meio de inoculação (INO) Componentes Quantidade por Litro

Sulfato de magnésio (Fisher M63) 0,1 g

Sulfato de magnésio (Fisher A702) 53,6 mg

Fosfato de sódio mono-hidratado (Fisher S369-500) 60 mg

Cloreto de cálcio (Sigma C-3881) 60 mg

Ácido bórico (Fisher A73-3) 0,3 mg

Sulfato de manganês (Sigma I-2550) 1 mg

Sulfato de zinco hepta-hidratado (Sigma Z-1001) 0,2 mg

Iodeto de potássio (Sigma P-8166) 0,075 mg

Molibdato de sódio di-hidratado (Sigma S-6646) 0,025mg

Sulfato cúprico (Fisher C493-500) 2,5 g

Cloreto de cobalto hexa-hidratado (Sigma C-2911) 2,5 g

Sequestrene (Ciba 964603) 2,8 mg

Nitrato de potássio (Sigma P-8291) 1g

Glicose (Phytotech G386) 30 g

MES (Sigma M8250) 3,9 g

Levar o volume a 1 litro com água destilada desionizada pH com KOH a 5,4 Autoclave

Adicionar estoque de vitamina estéril contendo o seguinte

Mio-inositol (Sigma I-3011) 10 mg

Ácido nicotínico (Sigma N-0765) 0,1 mg

Piridoxina HCl (Sigma P-8666) 0,1 mg

Tiamina HCl (Sigma T-3902) 1 mg

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Exemplo 3 Transformação Melhorada de Células de Soja Contatadas com PEG em BGM.

Este exemplo demonstra a melhoria da transformação de em- 5 briões secos de soja que foram contatados com uma composição contendo o PEG em meio de germinação do feijão (BGM - Tabela 8) em relação ao BGM sozinho.

Embriões secos de soja cv.

A3525 foram excisados de acordo com o método descrito na Publicação do Pedido de Patente US 2008/0280361 e contatados por uma hora com PEG-4000 10% ou 20% dis- solvido em BGM.

Os embriões foram então enxaguados 5-6X com BGM e transformados de acordo com os métodos descritos na Publicação do Pedi- do de Patente US 2009/0138985. Os embriões foram transformados com um vetor 2T de transformação possuindo uma origem de replicação OriV e con- tido em uma linhagem AB30 de Agrobacterium.

Os embriões foram regene- rados em meio de seleção espectinomicina.

Como mostrado na Tabela 9, os embriões contatados com composições de PEG 10% e 20% mostraram fre- quência de transformação melhorada em comparação com embriões conta- tados com BGM sozinho.

Tabela 8. Composição do Meio de Germinação de Feijão (BGM). Componentes Fonte Quantidade por Litro NH4NO3 (Sigma A-3795) 240mg KNO3 (Sigma P-8291) 505mg CaCl2•2H2O (Sigma C3881) 176mg MgSO4•7H2O (Fisher M63) 493mg KH2PO4 (Fisher BP362-500) 27mg H3BO3 (Fisher BP168-1) 1,86mg Na2MoO4•2H2O (Sigma S-6646) 0,216mg MnSO4•H2O (Sigma I-2550) 5,07mg

ZnSO4•7H2O (Sigma Z1001) 2,58mg FeSO4•7H2O (Sigma F8263) 2,502mg

KI (Sigma P-8256) 0,249mg

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Componentes Fonte Quantidade por Litro Na2EDTA •2H2O (Fisher BP120) 3,348mg CuSO4•5H2O (Sigma C-3036) 0,0008mg CoCl2•6H2O Sigma C-2911) 0,0008mg Tiamina HCl Sigma C-2911) 1,34mg Ácido nicotínico (Sigma N-0765) 0,5mg Piridoxina HCl (Sigma P-8666) 0,82mg Bravo (75% WP) (Carlin) 30mg Captan (50% WP) (Carlin 10-0250) 30mg

Sacarose (Phytotech S391) 25000mg pH 5,8

Tabela 9. Frequência de transformação de células de soja contatadas com PEG em BGM comparado ao meio BGM Tratamento Explantes Plantas # R0 TF BGM 1635 12 0,73% BGM PEG 10% 1562 39 2,50% BGM PEG 20% 1487 38 2,56% Exemplo 4 Efeito do PEG em TF em comparação com outros compostos osmóticos 5 Este exemplo demonstra o efeito de outros compostos osmóti- cos em TF em comparação com PEG.

Compara também a melhora de TF de tratamentos com várias espécies de PEG.

Embriões secos de soja cv.

A3555 foram excisados de acordo com o método descrito na Publicação do Pedido de Patente US 2008/0280361 e contatado por uma hora com várias quantidades de PEG-4000, PEG-6000, PEG-8000, manitol, sorbitol ou glice- rol, dissolvidos em SDW.

Os embriões foram então enxaguados 5-6X com SDW e transformados de acordo com os métodos descritos na Publicação do Pedido de Patente US 2009/0138985. Os embriões foram transformados com um vetor 2T de transformação possuindo uma origem de replicação OriRi e contido em uma linhagem AB30 de Agrobacterium.

Os embriões fo-

18893486v1 ram regenerados em meio de seleção espectinomicina. Como mostrado na Tabela 10, os embriões contatados com composições de PEG 10% e 20% mostraram frequência de transformação melhorada em comparação com embriões tratados com outros compostos osmóticos, ou apenas com água. 5 Tabela 10. Frequência de transformação de células de soja contatadas com PEG, em comparação com outros compostos osmóticos.

Tratamento Explantes iniciais Plantas # R0 TF H2O 1562 76 4,90% PEG4000 20% 1165 177 15,20% PEG6000 10% 1088 99 9,10% PEG6000 20% 1280 220 17,20% PEG8000 10% 1485 113 7,60% PEG8000 20% 1478 215 14,50% Manitol 10% 1008 5 0,50% Sorbitol 10% 1034 4 0,40% Sorbitol 20% 906 3 0,30% Glicerol 10% 174 4 2,30% Glicerol 20% 205 0 0,00% Exemplo 5 PEG Regula a Taxa de Hidratação em Explantes de Embriões Secos Este exemplo demonstra que o PEG é útil para a regulação da taxa de hidratação de explantes de embriões secos. Embriões secos de soja cv. A3525 foram excisados de acordo com o método descrito na Publicação do Pedido de Patente US 2008/0280361. Os explantes foram então contata- dos com PEG4000 20% dissolvido em INO, ou INO sozinho. A taxa de con- sumo de umidade foi medida tomando-se amostras dos explantes em inter- valos regulares durante o tratamento e, em seguida, submetendo-os a um ensaio em forno de base gravimétrica destrutivo no qual os explantes foram secados em um forno a ~100°C por aproximadamente do is dias. A umidade percentual foi determinada a partir de sua perda de peso. Um primeiro estu- do examinou as taxas de hidratação em 1, 4, e 24 horas, enquanto um se- 18893486v1 gundo estudo examinou a taxa de hidratação, a 0, 15, 30, 45 e 60 minutos, como mostrado nas tabelas 11 e 12, respectivamente.

Ambos os estudos indicam que a taxa de consumo de umidade por explantes de embriões de soja secas que são contatados com PEG4000 20% é reduzida.

Regulando a 5 hidratação com Tabela 11. Hidratação de explantes de embriões secos contatados com PEG em comparação com meio INO registrada em intervalos de hora em hora.

Teor de umidade Tempo (horas) INO PEG4000 20% em INO 0 5,8% +/- 0,1% 5,8% +/- 0,1% 1 64,4% +/- 0,3% 55,2% +/- 0,2% 4 63,6% +/- 0,4% 58,7% +/- 0,3% 24 64,6% 57,7%

Tabela 12. Hidratação de explantes de embriões secos contatados com PEG em comparação com meio INO registrada em intervalos de 15 minutos.

Teor de umidade Tempo (minutos) INO PEG4000 20% em INO 0 5,8% +/- 0,1% 5,8% +/- 0,1% 15 51,2% +/- 0,5% 44,6% +/- 0,5% 30 59,6% +/- 0,6% 52,1% +/- 0,4% 45 60,7% +/- 2,0% 54,5% +/- 0,9% 60 63,20% 58,10% Exemplo 6 Tratamento com PEG reduz a liberação de exsudatos de explantes de em- briões Este exemplo demonstra que os explantes de embriões secos excisados contatados com PEG na liberação de menos água em relação aos exsudatos comparados com os que contataram somente água.

Embriões secos de soja cv.

A3555 foram excisados de acordo com o método descrito na Publicação do Pedido de Patente US 2008/0280361 e contatados por uma hora, com PEG-4000 20% em SDW ou SDW sozinho.

Os explantes,

18893486v1 nos seus respectivos meios foram colocados em um agitador orbital, a 75 RPM e incubados a temperatura ambiente.

Amostras dos meios de cada grupo foram retiradas depois de 0, 15, 30, 45 e 60 minutos de incubação e analisadas por exsudatos como medido pela densidade óptica (absorbância 5 a 300 nm, calibrados com meio apropriado o branco) e condutividade (em microsiemens). Como mostrado na Tabela 13, a densidade óptica de exsu- datos foi muito mais elevada nas amostras de controle de água em compa- ração com as amostras do tratamento de PEG 20%. O mesmo foi verdade para a condutividade.

Nota: As leituras assinaladas com um asterisco (*) fo- ram feitas com diluições de 1/10 das amostras e depois multiplicado por 10, porque o espectrofotômetro utilizado tinha um alcance máximo de 3.295. Tabela 13 Densidade óptica e condutividade de explantes tratados com água em comparação com o tratamento com PEG.

Densidade óptica (A300nm) Condutividade (µS)

Tempo (minutos) H2O PEG-4000 20% H2O PEG-4000 20% Meio Branco 0 0 2,6 124 0 0,512 0,203 68,5 148,5 15 3,74* 1,132 748,6 336,2 30 6,25* 1,756 1011 447,8 45 7,06* 2,411 1152 519,8 60 7,46* 2,849 1320 557,4 Exemplo 7 Efeito do Tratamento com PEG na Frequência de Transformação de Em- briões de Soja Hidratados Este exemplo demonstra o efeito do tratamento com PEG na frequência de transformação de embriões de soja hidratados quando conta- tados antes da transformação mediada por Agrobacterium.

Embriões de soja cv.

A3525 foram excisados de acordo com o método descrito na Publicação do Pedido de Patente US 2008/0280361 e contatado por uma hora com vá- rias quantidades de PEG-4000, em SDW.

Os embriões foram enxaguados 5- 6X com SDW e transformados de acordo com os métodos descritos na Pa- tente US 7.402.734. Os embriões foram transformados com um vetor de

18893486v1 transformação 2T possuindo uma origem de replicação OriRi e contido na linhagem AB30 de Agrobacterium.

Os embriões foram regenerados em meio de seleção espectinomicina.

Como mostrado na Tabela 14, o tratamento com PEG não parece ser útil na melhoria do TF de embriões maduros de 5 soja já hidratados.

Pode ser que o tratamento com PEG seja benéfico para embriões secos e embriões imaturos como exemplificado com os embriões imaturos de milho abaixo.

Tabela 14. Frequência de transformação de células de soja hidratadas con- tatadas com o PEG em água em comparação com água.

Tratamento Explantes # Enraizados TF H2O 394 66 16,75% PEG1% 436 43 9,86% PEG5% 393 45 11,45% PEG10% 374 42 11,23% PEG20% 387 25 6,46% Exemplo 8 Efeito do Uso de PEG Durante a Cocultura na Frequência de Transformação Este exemplo demonstra o efeito da composição de PEG duran- te a cocultura na frequência de transformação.

Embriões secos de soja cv.

A3555 foram excisados de acordo com o método descrito na Publicação do Pedido de Patente US 2008/0280361 e contatado por uma hora, com 20% de PEG-4000 dissolvido em SDW.

Os embriões foram enxaguados 5-6 X com SDW e transformados de acordo com os métodos descritos na Publica- ção do Pedido de Patente US 2009/0138985. Os embriões foram transfor- mados com um vetor de transformação 2T possuindo uma origem de repli- cação OriRi e contido na linhagem AB30 de Agrobacterium.

As células trans- formadas foram depois cocultivadas em meio INO contendo 1, 5, 10, ou 20% de PEG 4000. O meio de cocultura também continha 1 ppm de TDZ.

Os em- briões foram regenerados em meio de seleção espectinomicina.

Como mos- trado na Tabela 15, os tratamentos em que o PEG foi incluído no meio de cocultura originou um TF inferior em comparação com os tratamentos em que o PEG foi usado antes da cocultura.

Isto sugere que, embora o trata-

18893486v1 mento de PEG antes da transformação melhora a competência das células para transformação mediada por bactérias, o PEG durante a cocultura pare- ce reduzir TF. Tabela 15. Frequência de transformação de células de soja em contato com 5 o PEG durante a cocultura. Explantes # R0 Tratamento Meio de Co- cultura Iniciais Plantas TF H2O INO 1562 76 4,90% 20% PEG4000 INO 1165 177 15,20% 20% PEG 4000 1% PEG 4000 em INO 922 84 9,10% 20% PEG 4000 5% PEG 4000 em INO 782 52 6,60% 20% PEG 4000 10% PEG 4000 em INO 922 17 1,80% 20% PEG 4000 20% PEG 4000 em INO 762 0 0,00% Exemplo 9 Produção Melhorada de Calo de Embriões de Milho Contatados com PEG Este exemplo demonstra que o PEG e diferentes quantidades (%) de PEG podem ser usados para melhorar a produção de calo. Embri- ões de milho de espigas de milho foram isolados manualmente, conforme descrito em outras partes da presente revelação e reunidos. Os embriões foram armazenados em 1 ml de Lynx 2304, ou 1 ml de meio de Lynx 2304 contendo diferentes quantidades de PEG 8000 (Sigma P-2139) a 6°C du- rante 4 dias no escuro. Quatro réplicas de cada tratamento foram executa- das. Os embriões foram posteriormente cultivados em meio de indução de calos Lynx 1074 por cerca de duas semanas. Vide Tabela 17 para compo- sições de meio Lynx 1074 e 2304. Como mostrado na Tabela 16, no trata- mento controle (sem armazenamento), 100% dos embriões produziram ca- lo quando foram cultivados diretamente em meio Lynx 2304 depois do iso- lamento. Uma pequena percentagem de embriões produziu calo quando foram armazenados em 1% ou 5% de PEG 8000. Nenhum dos embriões produziu calo quando foram armazenados em meio sem PEG (trt 2). 100% dos embriões armazenados em 10 ou 20% de PEG 8000 produziram calos (trts 5 & 6).

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Tabela 16. Efeito do PEG sobre a resposta do calo em embriões imaturos de milho.

Tratamento % PEG (V/V) Resposta à Cultura e comentários Controle (sem ar- mazenamento, 100% dos embriões produziram resposta do calo 1 cultivados imedia- embriogênico tamente após o isolamento) Embriões não produziram resposta à cultura em- 2 0 briogênica, morreram durante a cultura 10% embriões produziram resposta à cultura embri- 3 1 ogênica 20% embriões produziram resposta à cultura embri- 4 5 ogênica 5 10 100% embriões produziram resposta à cultura em- briogênica 6 20

Tabela 17. Composições dos meios usados na invenção. * O volume foi ajusta- do para 800 mL e o meio é armazenado após o filtração esterilizante (FS) sem ajuste de pH.

Antes de usar, o PEG e todos os outros aditivos descritos nos Exemplos foram adicionados e o volume/pH foi ajustado antes de FS.

Componentes do Meio /L (Fornecedores) Lynx1074 Lynx2304* MS Sais Basais (Phytotech M524) 4,33 g 4,33 g MS Vitaminas (100X) (Phytotech M533) 10 mL 10 mL Tiamina HCL (Sigma T-3902) 0,5 mg 0,5 mg 2,4-D (Phytotech D295) 0,5 mg 0 Sacarose (Phytotech S391) 30 g 30 g Prolina (Sigma P-5607) 1,38 g 1,38 g Casaminoácidos (Difco DF0288-17) 0,5 g 0,5 g pH 5,8 Agarose Baixa EEO (Sigma A-6013) 0 0 Phytagel (Sigma P-8169) 3,0g 0 Picloram (Sigma P-5575) 2,2mg 0 Carbenicillina (Phytotech C346) 0 0 Acetosiringona (Aldrich, D134406) 0 0 BAP (Sigma B-3408) 0 0 Nitrato de Prata e (Sigma S-6506) 3,4 mg 0

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Exemplo 10 Este exemplo demonstra o uso de PEG de diferentes pesos mo- leculares para melhorar a competência das células de planta.

Embriões de milho a partir de espigas de milho foram isoladas manualmente como descri- 5 to em outro lugar da presente descrição e reunidas, e depois armazenados em 1 ml de Lynx 2304, ou 1 ml de meio Lynx 2304 contendo 20% de PEG de diferente peso molecular, durante 4 dias a 6°C no e scuro.

Eles foram subse- quentemente cultivados em Lynx 1074 durante duas semanas para se ob- servar a resposta do calo.

Como mostrado na Tabela 18, no tratamento con- trole (sem armazenamento), 100% dos embriões produziram calo quando foram cultivados diretamente em meio Lynx 2304 depois do isolamento.

Ne- nhum calo foi formado por embriões que não foram armazenados na ausên- cia de PEG, enquanto geralmente todos os embriões produziram calos quando contatados com PEG.

Além disso, a formação dos calos aumentou com o peso molecular de PEG aumentado de 200 para 8000. Tabela 18. Efeito de diversas espécies de PEG na resposta do calo em em- briões imaturos de milho.

Trata- Sigma Peso mole- m osm/L Resposta à cultura e comentários mento Cat# cular médio Controle (Sem armaze- 100% embriões produziram calos A0 N/D namento) embriogênicos Embriões não produziram resposta à A1 Sem PEG 171 cultura, morreram durante a cultura 30% embriões produziram resposta à A2 P-3015 200 1608 cultura embriogênica

50% embriões produziram resposta à A3 P-3265 400 1116 cultura embriogênica

80% embriões produziram resposta à A4 P-3515 950-1050 742 cultura; bons calos embriogênicos A5 P-5402 1450 626 Excelente formação de calos embrio-

A6 P-4338 3350 586 gênicos.

Os tratamentos foram indistinguíveis A7 P-2139 8000 532 uns dos outros

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Exemplo 11 Este exemplo ilustra a melhoria da frequência de transformação de embriões de milho contactados com PEG antes da transformação.

Em- briões imaturos de milho foram isolados manualmente, conforme descrito em 5 outras partes da presente revelação de linhagem LH 244 e divididos em tra- tamentos.

Os embriões de um tratamento foram contatados com o meio Lynx 2304 contendo 20% PEG8000 P/V durante 10 min., depois lavados três vezes com ddH20 estéril.

Outros tratamentos não receberam nenhum trata- mento com PEG após isolamento do embrião.

Ambos os tratamentos foram inoculados com Agrobacterium (0,1 DO a 660 nm), por 5 minutos e subse- quentemente cultivadas para a seleção e regeneração, como descrito na Patente US 7682829. Como mostrado na Tabela 19, os embriões que foram contata- dos com PEG, produziram maior número de setores transgênicos e eventu- almente maior número de plantas transgênicas, indicando que contatar os embriões de milho com o PEG melhora a sua competência de transforma- ção.

Tabela 19. Frequência de transformação de embriões de milho tratados com PEG. # embriões GFP Se- # plantas

Tratamento para meio tores transgênicas % TF de seleção positivos produzidas

Sem Tratamento com PEG; Agro DO 80 24 8 10 =0,1; 5 min inoculação

Tratamento com PEG; Agro DO =0,1; 5 80 33 14 17,5 min inoculação

Exemplo 12 Este exemplo demonstra que a capacidade das células de planta pode ser melhorada fazendo contatar as células vegetais com um meio con- tendo PEG e reguladores de crescimento, como as auxinas.

Embriões imatu- ros de milho foram isolados manualmente, como descrito em outro lugar da presente revelação, da linha consanguínea LH 244 e armazenado em 1 ml

18893486v1 de Lynx 1854 (Tabela 20), contendo 2,2 mg/L de picloram 20% PEG 8000 (v/v) ou Lynx 1854 sem PEG 8000 a 4°C durante 6 dia s no escuro.

Os em- briões foram posteriormente cultivados em meio de indução de calos Lynx 1074 por cerca de duas semanas.

Figura 1 ilustra a formação de calos só a 5 partir dos embriões que foram armazenados em meio Lynx 1854 suplemen- tado com PEG e picloram (painel esquerdo), em comparação com embriões que foram armazenados em apenas Lynx 1854 (painel direito). Tabela 20. Composição do meio Lynx 1854

Componentes Fonte Quantidade por L MS Sais basais Phytotech M524 4,33 g MS Vitaminas Phytotech M533 103,1 mg Tiamina HCL Sigma T-3902 0,5 mg 2,4-D Phytotech D295 0,5 mg Sacarose Phytotech S391 30 g Prolina Sigma P-5607 1,38 g Casaminoácidos Difco DF0288-17 0,5 g Polietileno glicol - MW 8000 Sigma P-2139 200 g Picloram Sigma P-5575 2,2 mg pH a 5,8 Exemplo 13 Este exemplo demonstra a transformação melhorada de em- briões de milho, quando estavam armazenados em um meio contendo PEG e um ou mais reguladores de crescimento.

Embriões imaturos de milho fo- ram isolados manualmente, conforme descrito em outras partes da presente revelação, da linhagem LH 244 e divididos em tratamentos.

Tratamento 2 foi armazenado em meio Lynx 1452 (Quadro 21) suplementado com PEG 8000 a 20% (v/v), 0,5 mg/L de 2,4-D, 0,01 mg/L de BAP (Sigma B-3408), enquan- to que o tratamento 3 foi armazenado em Lynx 1452 suplementado com 20% de PEG (v/v), 0,5 mg/l de 2,4-D, 2,2 mg/L de picloram.

Os tratamentos 2 e 3 foram armazenados durante 4 dias a 6°C no escuro.

P ara o controle (trata- mento 1), os embriões não foram armazenados, contatados com o PEG ou

18893486v1 quaisquer reguladores de crescimento antes da transformação. Após o ar- mazenamento, os embriões foram inoculados em suspensão de cultura agro 1 mL por 5 minutos, a agro foi removida, e, em seguida, eles foram nova- mente inoculados com uma suspensão de cultura agro 1 mL por mais 5 mi- 5 nutos. Subsequente cultura e regeneração de plantas foram realizadas de acordo com o método descrito na Patente US 7682829. Como mostrado na Tabela 22, contatar os embriões de milho com um meio contendo PEG e um ou mais reguladores de crescimento, re- sultou em maior frequência de transformação. Tabela 21. Composição do meio Lynx 1452 Componentes Fonte Quantidade por L MS Sais basais (Phytotech) Phytotech M524 4,33 g MS Vitaminas (100X) (Phytotech) Phytotech M533 103,1 mg Tiamina HCL (Sigma) Sigma T-3902 0,5 mg Sacarose (Phytotech) Phytotech S391 30 g Prolina (Sigma) Sigma P-5607 1,38 g Casaminoácidos (Difco) Difco DF0288-17 0,5 g pH 5,8 Tabela 22. Frequência de transformação de embriões de milho contatados com o PEG e vários PGRs.

# Embriões para # Eventos Tratamento Meio de armazenamento % TF meio de seleção produzidos 1 (Controle) N/D 188 68 36,2 Lynx 1452 c/ 20% PEG 8000; 0,5 2 269 155 57,6 mg/l 2,4-D; 0,01 mg/L BAP Lynx 1452 c/ 20% PEG 8000; 0,5 3 278 144 51,8 mg/l 2,4-D; 2,2 mg/L Picloram 18893486v1

Exemplo 14 Este exemplo demonstra o uso de PEG isoladamente ou em combinação de PEG com reguladores de crescimento para melhorar a capa- cidade das células de planta para a transformação em temperaturas diferen- 5 tes. Embriões imaturos de milho foram isolados manualmente, como descrito em outro lugar da presente revelação, da linhagem LH 244 e armazenada tanto em Lynx 2304 contendo 20% de PEG 8000 (v/v), quanto armazenada em Lynx 2304 contendo 20% de PEG 8000 (v/v) e 0,5 mg/l de 2,4-D + 0,01 mg/l de BAP. As amostras foram armazenadas durante 3 dias a 4°C ou 23°C no escuro, antes de serem transformadas de acordo com o método descrito na Patente US 7682829. Como mostrado na Tabela 23, os embriões de mi- lho que foram armazenados em meio Lynx 2304 acrescido de PEG, ou Lynx 2304 acrescido de PEG e reguladores de crescimento, a 4°C ou 23°C, pro- duziram plantas transgênicas. Embriões de milho que foram armazenados em meio contendo PEG e reguladores de crescimento de plantas produziram mais transgênicos que aqueles armazenados no meio não contendo BAP. Embriões de milho, que foram armazenados a 4°C prod uziram mais plantas transgênicas que os embriões que foram armazenados a 23°C. Tabela 23. Frequência de transformação de embriões de milho contatados com o PEG e PGRs a várias temperaturas.

# Embriões para # Eventos % Condição de armazenamento meio de seleção produzidos TF Lynx 2304 + PEG @ 4C (Total de 4 réplicas) 203 45 22,2 Lynx 2304 + PEG+2,4-D + BAP @ 4C (Total 218 59 27,1 de 4 réplicas) Lynx 2304 + PEG @ 23C (Total de 4 réplicas) 218 33 15,1 Lynx 2304 + PEG+ 2,4-D + BAP @ 23C (Total 228 47 20,6 de 4 réplicas) Exemplo 15 Este exemplo demonstra o uso de PEG em combinação com re- guladores de crescimento para melhorar a capacidade das células de planta para a transformação quando os embriões foram armazenados por períodos 18893486v1 de tempo diferentes.

Embriões imaturos de milho foram isolados manual- mente, como descrito em outro lugar da presente revelação da linhagem LH 244 e armazenados em Lynx 2304 contendo 20% de PEG 8000 (v/v), 0,5 mg/L de 2,4-D, 0,01 mg/L BAP em 3, 5 ou 7 dias a 4°C no escuro.

Os embri- 5 ões foram então transformados de acordo com o método descrito na Patente US 7682829. Como mostrado na Tabela 24, os embriões de milho que foram armazenados quer em 3, 5 ou 7 produziram plantas transgênicas.

Embriões de milho que foram armazenados durante 3 dias, produziram mais plantas transgênicas que aqueles que não foram armazenados em um meio conten- do PEG 8000 e reguladores de crescimento.

Tabela 24. Frequência de transformação de embriões de milho contatados com o PEG e PGRs, armazenados para vários períodos de tempo.

Período de ar- Meio de arma- Embriões para Plantas transgê- mazenamento zenamento meio de seleção nicas produzidas % TF Sem armaze- namento N/A 393 173 44 20% PEG 8000; 0,5mg/l 2,4-D; 3d 0,01 mg/l BAP 421 203 48,2 20% PEG 8000; 0,5mg/l 2,4-D; 5d 0,01 mg/l BAP 384 137 35,7 20% PEG 8000; 0,5mg/l 2,4-D; 7d 0,01 mg/l BAP 357 58 16,2 Exemplo 16 Este exemplo demonstra o uso de PEG para melhorar a compe- tência de células de planta que foram isoladas mecanicamente.

Embriões de milho foram excisados mecanicamente, como descrito na Patente US 7560611 e armazenados em Lynx 2304 contendo 20% de PEG 8000 (v/v) por 2 dias a 4°C no escuro.

Os embriões foram então transformados de a- cordo com o método descrito na de Patente US. 7682829. Como mostrado na Tabela 25, os embriões de milho que foram excisados mecanicamente foram capazes de produzir plantas transgênicas, após dois dias de armaze-

18893486v1 namento, em dois experimentos diferentes. Tabela 25. Frequência de transformação de embriões de milho isolados me- canicamente tratados com PEG.

Expt # Embriões para seleção # Eventos produzido % TF 10194 133 36 27,1 10195 120 23 19,2 Exemplo 17 5 Este exemplo mostra que a liberação eficaz dos reguladores de crescimento para células/tecidos de planta pode ser conseguida contatando células/tecidos de planta com um meio contendo PEG e reguladores de crescimento, como citocinina antes da cultura das células/tecidos de planta. Embriões imaturos de milho foram isolados manualmente, como descrito em outro lugar da presente revelação da linhagem LH 244 e armazenado em 1 ml de Lynx 2304 e 1 ml de Lynx 2304 contendo 20% de PEG 8000 (v/v), 5 mg/L de BAP (v/v) a 4°C durante 14 dias no escuro. Os explantes de em- briões foram então semeados em meio de germinação, após remoção do PEG. Pouco antes de plaqueamento dos embriões armazenados em Lynx 2304 sozinho, 5 mg/L de BAP (v/v) foram adicionados ao tubo de armaze- namento. Os embriões foram posteriormente cultivados em meio de germi- nação Lynx 1607 (Tabela 26), sem qualquer citocinina durante cerca de uma semana. Figura 2 ilustra a formação de tricomas e o inchaço do nó coleopti- lar aumentados dos embriões que foram armazenados em meio Lynx 2304 suplementado com PEG e BAP (painel direito) em comparação com os em- briões que foram armazenados sem BAP (painel esquerdo). Tabela 26. Composição do meio Lynx 1607 Componentes Fonte Quantidade por Litro MS Sais basais Phytotech M524 4,33 g MS Vitaminas Phytotech M533 103,1 mg Sacarose Phytotech S391 60 g Phytagar Gibco 10695-047 6g Carbenicillina Phytotech C346 100 mg pH 5,8 18893486v1

Exemplo 18 Este exemplo demonstra ainda mais a melhoria da competência de células/tecidos de plantas por contatar células/tecidos de plantas com um meio contendo PEG e reguladores de crescimento, como citocinina.

Em- 5 briões imaturos de milho foram isolados manualmente, como descrito em outro lugar da presente revelação, da linhagem LH 244 e armazenado em 1 mL de Lynx 2304 e 1 mL de Lynx 2304 contendo 20% de PEG 8000 (v/v) e 20 mg/L de BAP (v/v) a 4°C durante 3 dias no escuro . Os embriões foram posteriormente cultivados em meio de indução de calos Lynx 1074 por cerca de duas semanas.

Figura 3 mostra melhora da formação de brotos a partir dos embriões que foram armazenados em Lynx 2304 suplementado com PEG e BAP (canto superior direito, painel inferior direito) em comparação com os embriões que estavam armazenados sem PEG ou BAP (canto supe- rior esquerdo, painel inferior esquerdo). Assim, este exemplo demonstra também rápida regeneração de estruturas de broto e similares a broto de calos embriogênicos produzidos a partir de explantes que foram contatados com PEG e uma citocinina por um período de tempo efetivo antes de cultivo em um meio de indução de calos contendo auxina (Lynx 1074). Exemplo 19 Este exemplo demonstra o efeito de outro crioprotetor osmótico comumente usado, glicerol, em comparação com PEG, no armazenamento de embriões.

Embriões imaturos de milho foram isolados manualmente, con- forme descrito em outras partes da presente revelação, da linhagem LH 244. Os embriões foram transferidos para tubos de Eppendorff contendo 1 mL de Lynx 1854, Lynx 1854 com 20% de glicerol e sem PEG, ou Lynx 1854 com ambos glicerol 20% e PEG 20% . Houve um tubo Eppendorff para cada mei- o.

Todos os três tubos foram armazenados a 4°C por 6 dias.

Após este perí- odo de incubação, os tubos foram removidos da incubação e a totalidade do conteúdo de cada tubo foi transferida para meio semissólido 1074 seguido por espalhamento dos embriões imaturos (20-25/placa). Resposta à Cultura foi marcada 7 dias após a incubação dos embriões em 1074 no escuro.

Co- mo mostrado na Tabela 27, a resposta à cultura foi somente alcançada a

18893486v1 partir do Tratamento #1 com PEG sozinho.

Mesmo o glicerol quando presen- te sozinho ou em combinação com PEG teve um efeito negativo durante o armazenamento, não houve resposta à cultura de tecidos a partir do escute- lo. 5 Tabela 27. Efeito do glicerol em reposta à cultura em comparação com PEG Tratamento Resposta á cultura Lynx 1854 (20% v/v PEG 8000) Sim

Lynx 1854 + 20% glicerol v/v, SEM PEG Não

Lynx 1854 + 20% glicerol v/v e 20% PEG v/v Não Exemplo 20 Transformação Melhorada de Células de Algodão Contatadas com PEG Este exemplo demonstra transformação melhorada de embriões secos de algodão, que foram contatados com uma composição contendo o PEG em água estéril.

Sementes de algodão cv.

DP393-0053 foram higieni- zadas com 10% de água sanitária Clorox por 10 minutos.

Elas foram, em seguida, secas em um secador de sementes durante a noite, atingindo um teor interno de umidade média de 3,4%. Embriões secos foram excisados a partir de sementes secas primeiramente processando a semente através de um triturador em forma de disco, modelo GP-140 (Modern Process Equip- ment Corp, Chicago, IL), e, em seguida, processado em um peneiramento automatizado e dispositivo de separação por fluxo de ar, como o Clipper E- clipse 324 (Clipper Separation Technologies; A.T.

Ferrell Company, Bluffton, Ind) para remover uma porção substancial de partes de sementes indesejá- veis, como tegumentos, poeira e outros debris.

O material de semente retido foi imerso em nitrogênio líquido até parar a ebulição (cerca de 30 segundos) e, em seguida, processado uma vez mais através do triturador em forma de disco, antes de serem adicionalmente selecionados para isolar o material de explante de embrião do material indesejado, como cotilédones, tegumentos e outros debris, como descrito na Publicação do Pedido de Patente US 2008/0280361. Embriões secos foram contatados durante uma hora com PEG-4000 20% dissolvido em água estéril.

Os embriões foram enxaguados

18893486v1 durante 4 minutos em água RO e em seguida, submetidos à transformação mediada por Agrobacterium de acordo com os métodos descritos na Patente US 8044260. Os embriões foram regenerados em um meio de seleção de espectinomicina.

Como mostrado na Tabela 28, os embriões contatados 5 com a composição de PEG20% mostraram em geral frequência de transfor- mação melhorada, em comparação com os embriões contatados com meio INO (sem PEG). Consultar a Tabela 29 para composição do meio de seleção de espectinomicina para o algodão.

Tabela 28. Frequência de transformação de células de algodão em contato com o PEG em água, em comparação com o meio INO Tratamento Explantes Iniciais Plantas #R0 TF% (desvio padrão) INO 10000 140 1,4% (0,26) PEG 4000 20% 5000 120 2,4% (0,38) em água

Tabela 29. Composição do meio de seleção espectinomicina para algodão.

Componentes Fonte Quantidade por L

Meio B5 de Gamborg Phytotech G398 3,21g

Dextrose Fisher D16-3 20g

Gluconato de Cálcio Sigma G-4625 1,29g

Clearys 3336 WP Carlin 10-032 0,03g

Agar gel Sigma A-3301 4g

Carbenicillina (40mg/mL estoque) Phytotech C346 5mL

Timentina (100mg/mL estoque) Duchefa T0190 1mL

Cefotaxima (50mg/mL estoque) Midwest NDC0039-0019-10 4mL

Espectinomicina (50mg/mL estoque) Sigma S-4014 5mL

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Claims (19)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para melhorar competência de células de planta para transformação mediada por bactéria, caracterizado pelo fato de que com- preende contatar as células de planta com uma quantidade eficaz de uma 5 composição contendo polietileno glicol antes da transformação.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a quantidade eficaz do polietileno glicol é de cerca de 1 a cerca de 25% em volume.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a quantidade eficaz do polietileno glicol é de 20% em volume.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o peso molecular do polietileno glicol é de cerca de 200 a cerca de 10000.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o peso molecular do polietileno glicol é de 4000 a 8000.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma quantidade eficaz de pelo menos um regulador de cresci- mento de planta é fornecida com a dita composição contendo polietileno gli- col.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o regulador de crescimento de planta compreende uma auxina, citocinina ou combinação das mesmas.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a auxina é selecionada do grupo consistindo em IAA, 2,4-D, NAA, IBA, dicamba ou uma combinação dos mesmos.

9. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a quantidade de auxina é de cerca de 0,001 mg/L a cerca de 30 mg/L.

10. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a citocinina é selecionada do grupo consistindo em BAP, zeatina, quinetina, TDZ ou uma combinação dos mesmos.

11. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a quantidade de citocinina é de cerca de 0,001 mg/L a cerca de 30 mg/L.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo 5 fato de que a composição contendo polietileno é contatada com as células de planta por cerca de 30 minutos a cerca de 10 dias.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pe- lo fato de que a composição contendo polietileno é contatada com as células de planta por cerca de 3 dias a 7 dias.

14. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pe- lo fato de que a composição contendo polietileno é contatada com as células de planta por cerca de 30 minutos a 300 minutos.

15. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ainda compreende regenerar as células de planta em plantas inteiras.

16. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células de planta compreendem células de semente, folha, caule, raiz, embrião imaturo, embrião maduro, calo, micrósporo, meristema, cotilédone, hipocótilo, epicótilo, mesocótilo, coleóptilo, radical, plúmula ou tecido reprodutivo.

17. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células de planta compreendem células de milho, soja, algo- dão, canola, cana-de-açúcar, cebola, melão, beterraba ou trigo.

18. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a transformação mediada por bactéria é transformação mediada por Agrobacterium, mediada por Rhizobium, mediada por Sinorhizobium, mediada por Mesorhizobium e mediada por Bradyrhizobium.

19. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ainda compreende uma etapa de enxaguar as células de planta contatadas com o polietileno glicol em uma composição não contendo PEG antes da transformação.

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