JP6215388B2 - 植物細胞の適格性を改善する方法 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年１２月１７日出願の米国仮出願第６１／４２４，１３６号の優先権の利益を主張する。上記の出願の開示は全て参照として本明細書に組み込まれる。

本発明は植物バイオテクノロジーの分野である。より詳細には、植物細胞の細胞仲介形質転換の適格性を改善する方法が提供される。

胚のような植物組織は、米国特許第７，４２７，６９５号に開示されているような、組織培養に使用される機械的手段により大量に得ることができる。典型的には、そのような植物細胞が得られると、形質転換ステップを用いる、または用いない組織培養プロセスに直ぐにまたは数時間以内に使用される。後の使用のために保存される場合、形質転換の適格性は低減されうる。例えば米国特許出願公開第２００８／０２８０３６１号に開示されている、乾燥種から誘導される胚軸は、保存しても比較的安定しているが、形質転換前の水和ステップは、これらの形質転換の適格性を低減しうる。

本発明は、植物細胞を形質転換の前に有効量のポリエチレングリコールと接触させることを含む、植物細胞の細菌仲介形質転換の適格性を改善する方法を提供する。

特定の実施形態において、有効量のポリエチレングリコールは約１容量％〜約２５容量％でありうる。より特定の実施形態において、有効量のポリエチレングリコールは約２０容量％である。

ポリエチレングリコールの分子量は、約２００〜約１００００の範囲でありうるが、より特定の実施形態において、ポリエチレングリコールの分子量は４０００〜８０００である。

特定の態様において、組成物は、有効量の少なくとも１つの成長調整剤を更に含み、ここで成長調整剤は、有効量のオーキシン、サイトカイニン、またはこれらの組み合わせを含む。オーキシンは、ＩＡＡ、２，４−Ｄ、ＮＡＡ、ＩＢＡ、ジカンバ、またはこれらの組み合わせを含むことができ、オーキシンの量は、好ましくは約０．００１ｍｇ／Ｌ〜約３０ｍｇ／Ｌである。

サイトカイニンは、ＢＡＰ、ゼアチン、カイネチン、ＴＤＺ、またはこれらの組み合わせを含むことができ、約０．００１ｍｇ／Ｌ〜約３０ｍｇ／Ｌの量で存在することができる。

本発明の実施において、植物細胞をＰＥＧと接触させる時間は、１日間から約３０日間でありうる。他のより特定の実施形態において、有効な時間は約３日間から７日間である。更に別の実施形態では、植物細胞をＰＥＧと約３０分間から３００分間接触させる。

本発明の方法は、すすぎステップを更に含むことができ、ここで、ＰＥＧと接触させた植物細胞を形質転換の前に非ＰＥＧ含有組成物ですすぐ。

本発明の別の態様は、植物細胞を再生させることを更に含む。植物細胞は、単子葉または双子葉植物種の種、葉、茎、根、未熟胚、成熟胚、カルス、小胞子、分裂組織、子葉、胚軸、上胚軸、中胚軸、子葉鞘、根生、幼芽、または生殖組織の細胞を含むことができる。

本発明の方法の実施において、細菌仲介形質転換は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）仲介またはリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）仲介形質転換でありうる。

本明細書に開示されている本発明の方法により作り出される遺伝子導入植物および本開示の他の部分で定義されているその任意の植物部分も、本発明の態様である。

明細書に組み込まれ、その一部を形成する添付の図面は、本発明の実施形態を例示し、記載と共に本発明の原理の説明に役立つ。図中：
ＰＥＧなしのＬｙｎｘ２３０４に保存した胚（右側パネル）と比較した、ＰＥＧを補充したＬｙｎｘ２３０４培地に保存した胚（左側パネル）からのカルス生産を例示する。 ＢＡＰなしで保存した胚（左側パネル）と比較した、ＰＥＧおよびＢＡＰを補充したＬｙｎｘ２３０４培地に保存した胚（右側パネル）からの子葉鞘節の増強された毛状突起形成および膨潤を例示する。 ＢＡＰなしのＬｙｎｘ２３０４培地で保存した胚（左側パネル）と比較した、ＰＥＧおよびＢＡＰを補充したＬｙｎｘ２３０４培地に保存した胚（右側パネル）からの改善された苗条形成を例示する。

以下は、本発明を実施する当業者を助けるために提供される詳細な説明である。当業者は、本発明の精神または範囲を逸脱することなく本明細書に記載されている実施形態に修正および変更を行うことができる。特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、発明が属する当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。一般に、本明細書に記載されている基本的な製造または実験室手順の命名法および記載は、当該技術において既知であり、一般的に用いられている。特に示されない限り、従来の方法がこれらの手順において使用され、様々な一般的な技術用語辞書または教科書により例示されている。用語が単数形で提供される場合、本発明者たちは、その用語の複数形により記載される発明の態様も考慮する。本発明者たちは、特定の作用機構または様式に限定することを意図しない。それらへの参照は、例示目的のためだけに提供される。本明細書に記述される全ての公報、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照として明確に組み込まれる。

本発明は、植物細胞を形質転換の前に有効量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）により、処理される組織の形質転換を増強するのに十分な時間にわたって接触させる（適用させる、処理させる、保存させる、触れさせる、接合させる、混合させる、そうでなければ相互作用をひきおこす）ことを含む、植物細胞の細菌仲介形質転換の適格性を改善する方法を提供する。

本発明の方法は、トウモロコシの未熟胚における植物細胞の生存力を様々な保存条件下で保存し、したがって、有効量のＰＥＧと接触させない組織と比較して、形質転換および組織培養の適格性を改善するのに有用である。このように、組成物の「有効量」は、植物細胞の適格性に効果がないかまたは有害である少なすぎるまたは多すぎる組成物と接触させたまたは接触させていない植物と比較して、組成物と接触させた植物細胞の細菌仲介形質転換の適格性を改善するのに効果的な量と定義される。

形質転換および組織培養に適格性のある植物細胞を保存および維持する能力は、最高の生産時間または生産プロセスの予期せぬ中断の際に柔軟性をもたらすことによって、大規模実験のより効率的な計画および実施を可能にする。このことは、異なる立地に組織を輸送するために大きな柔軟性を持つことも可能にする。また、そのような方法は、例えばダイズの乾燥種の胚軸における植物細胞の形質転換の適格性を改善するのに有用である。

そのような用語に与えられる範囲を含む、本明細書および請求項への明快で一貫した理解を提供するために、以下の定義を提供する。

用語「適格性」は、組織培養または形質転換に対する植物細胞の応答と定義される。「応答」は、典型的には、外部または内部の刺激によりもたらされる生物における任意の挙動または変化として生体系において典型的に定義される。したがって、用語「改善された適格性」は、組織培養または形質転換に対する基礎または否定応答への増強として定義される。幾つかの態様において、組織培養に対して改善された適格性は、植物細胞の高い生存率により測定することができる。別の態様では、形質転換に対して改善された適格性は、形質転換頻度の増加として測定される。

用語「植物細胞」は、とりわけ種、葉、茎、根、未熟胚、成熟胚、カルス、小胞子、分裂組織、子葉、胚軸、上胚軸、中胚軸、子葉鞘、根生、幼芽、またはがく片、花弁、おしべ、花粉、花粉管、めしべ、花托、および胚珠を含む花の細胞が含まれるが、これらに限定されない植物の任意の部分からの任意の細胞を一般に意味する。植物細胞は、オオムギ、トウモロコシ、エンバク、コメ、ライムギ、モロコシ、芝生、サトウキビ、コムギ、アルファルファ、バナナ、ブロッコリー、インゲンマメ、キャベツ、カノーラ、ニンジン、キャッサバ、カリフラワー、ハクサイ、セロリ、柑橘類、クローバー、ココナッツ、コーヒー、ワタ、ウリ科、アメリカトガサワラ、乾燥マメナス、ユーカリノキ、ウイキョウ、アマ、ソラマメ、ニンニク、ヒョウタン、ブドウ、オリーブ、オクラ、タマネギ、リーキ、デーダマツ、メロン、ヤシ、レタス、エンドウマメ、ピーナッツ、コショウ、ジャガイモ、ポプラ、マツ、カボチャ、ラディッシュ、ヒマワリ、ベニバナ、モロコシ、ダイズ、ホウレンソウ、スクアッシュ（ｓｑｕａｓｈ）、イチゴ、サトウダイコン、モミジバフウ、サツマイモ、スイッチグラス、チャ、タバコ、トマト、ライコムギ、芝生、スイカ、観賞植物、灌木、堅果、ヒヨコマメ、キマメ、キビ、ホップ、および牧草が含まれるが、これらに限定されない実質的に任意の植物から誘導されうる。

「胚」は、葉、茎、および根の前駆組織（分裂組織）を含む種の一部である。胚が成長（発芽）し始めると、実生植物になる。

「分裂組織（ｍｅｒｉｓｔｅｍ）」または「分裂組織（ｍｅｒｉｓｔｅｍａｔｉｃ ｔｉｓｓｕｅ）」は、分化して、茎、根、葉、生殖組織、および種を含む複数の植物構造を生み出す分裂組織細胞である未分化細胞を含む。「外植片」は、植物細胞を含む形質転換の標的材料を意味するために使用される用語である。植物細胞は上記に定義されたとおりである。

本発明の方法は、植物細胞を形質転換の前に有効量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と所定の時間接触させることを含む。本明細書に記載されるＰＥＧの量の率は、容量に基づいて提示される。特定の非限定実施形態では、ＰＥＧを、滅菌蒸留水（ＳＤＷ）、接種培地（ＩＮＯ、表７を参照すること）、またはマメ発芽培地（ＢＧＭ、表８を参照すること）に溶解することができる。本発明のＰＥＧの有効量は作物によって変わることができ、一般に、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、および５０％を含み、特にそのような任意の２つの値の間に派生する全ての範囲を含む約１％〜約５０％の範囲である。特定の非限定実施形態において、ＰＥＧの平均分子量は、約２００、３００、４００、５５０、６００、１０００、１５００、２０００、３０００、３３５０、４０００、６０００、８０００、１００００、２００００、および３５０００を含み、特にそのような任意の２つの値の間に派生する全ての範囲を含む約２００〜約３５０００でありうる。幾つかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、４０００、５０００、６０００、７０００、または８０００である。

本発明の幾つかの形態では、植物細胞を、有効量のＰＥＧおよび１つ以上の植物成長調整剤（ＰＧＲ）を含む組成物と接触させることができる。胚形成培養応答は、遺伝子型、外植片の発育段階、培養条件、および培養培地の成長調整剤組成物の間の相互作用の生成物である。培養開始のプロセスの際に、外植片は、外植片の最初の発育段階が成長調整剤の助けにより適切に修飾されるステップである、「脱分化」として知られているプロセスを受ける。成長調整剤の効果に応じて、このプロセスは数時間または数日間かかり、ここでは、最適量の生長調整剤の組み合わせを送達することが主要なステップである。この「成長調整剤」を送達する主要なステップにおける１つの大きな問題は、非常に高い用量の成長調整剤が外植片に対して有害な作用を引き起こしうることである。本発明の１つの態様は、ＰＲＧをＰＥＧ組成物と組み合わせることにより、有害作用のない適切な培養培地で培養する前に外植片を高濃度のＰＧＲと接触させる方法を提供する。この手法は、高濃度の成長調節剤の有害作用を緩和するのみならず、植物細胞の脱分化プロセスも増強する。

多くのＰＧＲが当該技術において知られており、本発明の方法に使用することができ、例えば、４−ＣＰＡ、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、ジクロルプロプ、フェノプロプ、インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）、インドール−３−酪酸（ＩＢＡ）、ナフタレンアセトアミド、α−ナフタレン酢酸、１−ナフトールナフトキシ酢酸（ＮＡＡ）、ナフテン酸カリウム、ナフテン酸ナトリウム、および２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸、３，６−ジクロロ−２−メトキシ安息香酸（ジカンバ）、および４−アミノ−３，５，６−トリクロロピコリン酸（ピクロラム）が含まれるが、これらに限定されないオーキシン；クロフィブリン酸および２，３，５−トリ−ヨード安息香酸が含まれるが、これらに限定されない抗オーキシン；２ｉＰ、ベンジルアデニン、チジアズロン（ＴＤＺ）、６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、カイネチン、およびゼアチンが含まれるが、これらに限定されないサイトカイニン；カルシウムシアナミド、ジメチピン、エンドタール、エテホン、メルホス、メトクスロン、ペンタクロロフェノール、およびトリブホスが含まれるが、これらに限定されない落葉剤；アビグリシンおよび１−メチルシクロプロペンが含まれるが、これらに限定されないエチレンインヒビター；１−アミノシクロプロパンカルボン酸、エタセラシル、エテホン、およびグリオキシムが含まれるが、これらに限定されないエチレンリリーサー；ジベレリン酸（ＧＡ３）が含まれるが、これに限定されないジベレリン；グリホセート、グリホシネート、ＤＬ−ホスフィノトリシン、３，６−ジクロロ−２−メトキシ安息香酸、および２，４−ジクロロフェノキシ酢酸が含まれるが、これらに限定されない除草剤；アブシジン酸、アンシミドール、ブトラリン、カルバリル、クロルホニウム、クロルプロファム、ジケグラック、フルメトラリン、フルオリダミド、ホサミン、グリホシン、イソピリモール、ジャスモン酸、マレイン酸ヒドラジド、メピコート、ピプロクタニル、プロヒドロジャスモン、プロファム、２，３，５−トリ−ヨード安息香酸、クロルメコート、ダミノジッド、フルルプリミドール、メフルイジド、パクロブトラゾール、テトシクラシス、およびウニコナゾールが含まれるが、これらに限定されない成長抑制剤および矮化剤；クロルフルレン、クロルフルレノール、ジクロルフルレノール、およびフルレノールが含まれるが、これらに限定されないモルファクチン；ブラシノライド、ホルクロルフェヌロン、およびヒメキサゾールが含まれるが、これらに限定されない成長刺激剤；ならびに／またはベンゾフルオル（ｂｅｎｚｏｆｌｕｏｒ）、ブミナホス、カルボン、シオブチド（ｃｉｏｂｕｔｉｄｅ）、クロフェンセット、クロキシホナック、シアナミド、シクラニリド、シクロヘキシミド、シプロスルファミド（ｃｙｐｒｏｓｕｌｆａｍｉｄｅ）、エポコレオン（ｅｐｏｃｈｏｌｅｏｎｅ）、エチクロゼート、エチレン、フェンリダゾン（ｆｅｎｒｉｄａｚｏｎ）、ヘプトパルギル（ｈｅｐｔｏｐａｒｇｉｌ）、ホロスルフ、イナベンフィド、カレタザン（ｋａｒｅｔａｚａｎ）、ヒ酸鉛、メタスルホカルブ、プロヘキサジオン、ピダノン、シントフェン（ｓｉｎｔｏｆｅｎ）、トリアペンテノール（ｔｒｉａｐｅｎｔｈｅｎｏｌ）、およびトリネキサパックが含まれるが、これらに限定されない他の未分類の植物成長調整剤である。

本発明の特定の実施形態において、オーキシンは２，４−Ｄであり、他の実施形態では、オーキシンはピクロラムである。他の実施形態において、サイトカイニンはＴＤＺであり、なお他の実施形態では、サイトカイニンはＢＡＰである。

植物細胞培養および形質転換の当業者は、本発明の特定の植物種に使用するのに適した植物成長調整剤の適切なレベルおよび／または比率を決定することができる。例えば、トウモロコシまたは他の植物種における例えばＢＡＰおよび／または２，４−Ｄの活性と機能的に同等のこれらまたは他のＰＧＲのレベルは、植物が接触させられる培地に存在するそのような成長調整剤のレベルを変え、外植片およびそれから誘導される組織の成長をモニタリングして決定することができる。したがって、他のＰＧＲが使用される場合でも、上記に提示されたＰＧＲの考慮された量および比率と同等な植物成長調整効果を含む。

様々な非限定実施形態において、ＰＥＧ含有組成物に使用されるＰＧＲの量は、約０．０１、０．１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、および３０ｍｇ／Ｌを含み、特にそのような任意の２つの値の間に派生する全ての範囲を含む０．００１ｍｇ／Ｌ〜約３０ｍｇ／Ｌの範囲でありうる。

特定の非限定実施形態では、未熟トウモロコシ胚外植片を、ＰＥＧ含有組成物と、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０日間を含み、特にそのような任意の２つの値の間に派生する全ての範囲を含む約１〜１０日間にわたって接触させる。特定の実施形態では、外植片を組成物と約３日間接触させる。

他の実施形態では、細胞を含む成熟ダイズ胚外植片を、ＰＥＧ含有組成物と、３０、４０、５０、６０、７０、９０、１００、１２０、１８０、２４０、および３００分間を含み、特にそのような任意の２つの値の間に派生する全ての範囲を含む約３０〜３００分間にわたって接触させる。特定の実施形態では、外植片を組成物と約６０分間接触させる。

なお他の非限定実施形態では、外植片を、ＰＥＧ含有組成物と、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、および３０℃を含み、特にそのような任意の２つの値の間に派生する全ての範囲を含む約２〜３０℃の温度で接触させる。

本明細書に開示される量、持続時間、温度、および分子量の範囲は、非限定的である。当業者は、特定の植物種の特定の要件に応じて、本発明の精神および範囲を逸脱することなく特定的に提示されたものよりも低い、高い、またはその中間の量、持続時間、温度、または分子量を使用して本発明を実施することができる。

本発明の方法は、すすぎステップを更に含むことができ、ここで、ポリエチレングリコール組成物と接触させた植物細胞を形質転換の前に非ＰＥＧ含有組成物ですすぐ。様々な非限定態様において、非ＰＥＧ含有組成物は、本開示の他の部分に記載されている、水、または１／２ＭＳ ＰＬ（表１）、１／２ＭＳ ＶＩ（表２）、ＩＮＯ（表６）、ＢＧＭ（表８）のような培地、またはアグロバクテリウム培養再懸濁液でありうる。特定の非限定実施形態において、すすぎステップは、所望のリンス媒質による１回以上の急速な反復すすぎを含むことができる、または代替的に１〜５分間にわたる長時間の単回のすすぎを含むことができる。

本発明の特定の非限定態様において、植物細胞は未熟胚でありうる。未熟胚がトウモロコシのような単子葉植物のものである場合、実質的に単離される組織は、任意の適切な様式で、例えば種の成熟する雌穂または頭花に結合して提供される。単子葉植物の種は、標的組織を実質的に精製する前に、雌穂または頭花から取り出すことができる。雌穂は、典型的には受粉の１０〜１２日後に収集され、表面滅菌される。表面滅菌の方法は、当該技術において良く知られており、有効濃度のエタノールまたは亜塩素酸ナトリウムを含有する溶液に有効時間、例えば１〜１５分間にわたって浸漬することが含まれるが、これに限定されない。未熟胚は、手作業、または機械化もしくは自動化された方法を含む任意の適切な技術により得ることができる。

単子葉植物の種の果皮または種皮を開くことは、所望の外植片の単離の実現をもたらすために提供される。このことは、例えば針、錐、刃、または他の適切な器具で穴を開ける、刺す、または切り込むことであるが、これらに限定されない任意の適切な技術により達成することができる。方法の幾つかの適用では、果皮組織を取り出す必要はなく、他の適用では、果皮組織を開くことは、果皮の少なくとも一部、可能であれば幾つかの非胚組織（例えば、内乳）の取り出しを含むことができる。好ましくは、開くことは種から胚を実質的に分離するのに十分であり、これは、手作業により、またはスパチュラのような滅菌道具を使用して内乳および胚をかき出すことにより、または仁の側面を押して、胚を出現させ、仁から部分的または完全に露出させることにより実施することができる。種への力の適用が胚のような標的組織の実質的な単離をもたらすように、果皮を十分に弱めること（例えば、摩耗により、または他の物理的、化学的、もしくは酵素的な処理により）のみが必要なこともある。

自動化または機械化された手段により未熟胚を得る方法は、米国特許第７，５６０，６１１号に開示されている。方法は、種から未熟胚のような標的組織を実質的に単離するのに十分な力を種に適用するステップを含み、実質的に単離された標的組織は、遺伝子形質転換および組織培養に適している。力を複数の種に続けてまたは同時に適用することができる。適用される力は、連続的または非連続的（例えば、脈動または波状力）であることができ、一般に機械的に適用され、すなわち、力は人の手ではなく装置または機械を使用して得られる。適用される力の量は、好ましくは、標的組織（例えば、胚）と非標的（例えば、内乳のような非胚組織）が互いに接着することを克服するのに十分であり、したがって標的と非標的組織の分離を可能にする。任意の適切な力を種からの標的組織の取り出しに用いることができ、複数の力を組み合わせて、順次、または同時に使用することができる。適切な力には、流体ジェット正圧、液体ジェット正圧、機械式正圧、負圧、吸引、遠心力、線形加速、線形減速、流体剪断、流体乱流、および流体層流が含まれるが、これらに限定されない。流体力は、任意の流体、気体、もしくは液体、または両方の組み合わせにより発揮されうる。

方法は、未熟胚のような実質的に単離された標的組織を内乳、ほう頴、および種皮または果皮組織のような関連する非胚組織から分離するステップを更に含むことができる。未熟胚を他の組織から分離する方法は、米国特許出願公開第２００９／０１４２８３７号に記載されている。分離は、サイズ排除（例えば、１つ以上の濾過ステップによる濾過）による分離、疎水性、親水性、親油性、または他の引力に基づいた分離、および質量または密度の差による分離（例えば、遠心分離、沈降、および傾瀉による分離）が含まれるが、これらに限定されない１つ以上の適切な技術によって達成することができる。分離ステップは任意であり、無傷または部分胚の追加の分離は、組織培養における使用では必要ない。

遺伝子形質転換または組織培養に適したトウモロコシ胚のような実質的に単離された標的組織を提供するこれらの方法を自動化することができ、例えば、トウモロコシの雌穂または種にロボットまたは機械による取扱いを用いて、果皮を開き、種に力を適用する、または任意の分離ステップを適用する。そのような自動化は、光学または機械式センサーを使用して、適用される力に対して、または分離ステップにおいてトウモロコシの雌穂または種を位置決めすることを助ける。トウモロコシ胚を実質的に単離する機器は米国特許第７，５６０，６１１号に開示されているように提供され、これは、流体流を導く少なくとも１つの開口部を含み、ここで流体流はトウモロコシ雌穂の仁と接触し、仁から胚を実質的に単離する。一般に、流体流は、胚をより急速に単離するように、所定時間内に都合よいほど多くの仁と接触することが好ましい。少なくとも１つの開口部は、単一の開口部または複数の開口部（例えば、平坦、丸形、楕円、扇型、または他のパターン化ノズル、および可調、移動、または静止ノズルを含むことができる単一または複数のノズル）を含むことができ、任意の適切な種類および媒体の流体流を発生することができる。流体は、気体（例えば、空気、窒素、もしくは気体混合物）、液体（例えば、水、生理食塩水、もしくは様々な培養培地）、またはこれらの組み合わせでありうる。適切な流体流には、流体ジェット（例えば、単または複数カラムジェット；平坦、円錐形、または扇型のジェットまたはスプレー；およびシート状ジェット）、流体層流、ならびに流体乱流が含まれるが、これらに限定されない。適切な流体流は、正圧もしくは負圧、またはその両方を含む１つ以上の力をもたらして、胚を仁から取り出すことができる。１つ以上の力を、連続的または非連続的に複数の種に続けてまたは同時に適用することができ、一般に機械的に適用され、手作業では適用されない。他の適切な力は、遠心力、線形加速、線形減速、および流体剪断でありうる。そのような力は、均一もしくは非均一、連続的もしくは非連続的（例えば、脈動もしくは波状力）、またはこれらの任意の組み合わせでありうる。

機器は、実質的に精製される標的組織および流体流を互いに移動させる手段を更に含むことができる。例えば、種を含有するトウモロコシの雌穂もしくは流体流、またはその両方を移動させることができる。様々な実施形態の機器を、トウモロコシの単一または複数の無傷または部分雌穂と使用することができる。例えば、トウモロコシの雌穂を、流体流に対して移動するホルダまたは捕捉器具に固定することができる。しかし他の実施形態では、トウモロコシの雌穂をホルダに個別に固定する必要がなく、仁から胚を取り出すのに使用される力によって複数の仁が接触するのを可能にするように、自由に移動することができる。流体流に対して少なくとも１つのトウモロコシ雌穂を移動させる手段は、少なくとも１つのトウモロコシ雌穂および少なくとも１つの開口部を互いに回転することができる、または流体流を少なくとも１つのトウモロコシ雌穂の縦軸に沿って移動させることができる、または少なくとも１つのトウモロコシ雌穂および少なくとも１つの開口部の互いの回転および縦運動の組み合わせのような任意の適切な三次元移動を提供することができる。

機器は、標的組織を非標的組織から分離する少なくとも１つの分離機を更に含むことができる。例えば、胚を非胚組織から分離することができ、ここで分離された胚は、遺伝子形質転換または組織培養に適した少なくとも幾つかのトウモロコシ胚を含む。分離機は、サイズ排除による（例えば、メッシュ、スクリーン、有孔表面、または特定のサイズの物体を排除することができる他の装置を使用する）分離、疎水性または他の引力に基づいた（例えば、胚を誘引または跳ね返す固体または液体である材料を使用する）分離、および質量または密度の差による（例えば、遠心力を使用する、または異なる沈降の溶液を使用する）分離が含まれるが、これらに限定されない任意の適切な機構により作用することができる。分離機は任意であり、無傷または部分胚の追加の分離は、遺伝子形質転換または組織培養における使用では必要ない。

実質的に単離された（および場合により分離された）未熟胚には、上記に記載された、組織培養用途、形質転換、カルス形成、直接の胚形成、分化植物組織の形成、少なくとも１つの成熟した植物の形成、少なくとも１つの稔性植物の形成、およびこれらのプロセスの組み合わせに適した、少なくとも幾つかの未熟無傷または部分胚のような胚が含まれる。実質的に単離された未熟胚および非胚組織を、遺伝子または生化学分析が含まれるが、これらに限定されない他の目的に使用することもできる。

組み合わせ機器は、場合により、少なくとも１つのトウモロコシ雌穂を力の供給源に対して移動させる手段（すなわち、機械的な正圧力を適用する固体表面、流体流を導く開口部、または負流体圧を適用する開口部）を含むことができる。好ましくは、雌穂は、力が胚をより急速に単離するために所定時間内に都合よいほど多くの仁と接触するように、力の起源に対して移動される。

組み合わせ機器は、遺伝子形質転換または組織培養に適した実質的に単離された未熟胚を更に分離する少なくとも１つの手段を更に含むことができ、ここで分離された胚は、遺伝子形質転換または組織培養に適した少なくとも幾つかのトウモロコシ胚を含む。分離機は、サイズ排除による分離、引力に基づいた分離、および質量または密度の差による分離が含まれるが、これらに限定されない任意の適切な機構により作用することができる。

本発明の別の態様において、植物細胞は成熟胚である。成熟胚外植片は、例えば米国特許出願公開第２００８／０２８０３６１号に開示されているように、乾燥種から得ることができる。これらの外植片は、乾燥切除外植片（ＤＥＥ）と呼ばれる。乾燥湿潤外植片を使用することもでき、これは水和／吸水の後に種から切除された外植片であり、続いて脱水され、保存される。両方の種類の外植片は、保存時に適度な安定性を示したが、形質転換の前の急速な水和ステップは、これらの細菌仲介形質転換の適格性を低減しうる。特定の作用機構に束縛されることを意図していないが、本発明の方法は、乾燥種から、または水和もしくは吸水種の切除後に脱水される外植片から誘導される胚外植片の水和率を調節するのに有用であり、それによって植物細胞の細菌仲介形質転換の適格性を改善する。

様々な実施形態において、植物細胞を含む外植片は、手作業または機械的な方法により得ることができる。胚切除の前に、種を滅菌ステップ、ならびに選別ステップに付して、微生物汚染を避けること、高度の細菌または真菌汚染を有する種を除去すること、また、本発明に使用される生存可能な外植片組織を何らかの理由で生産する可能性がない種を除去することができる。選別は、例えば、種のサイズ、色、もしくは密度、または化学組成の特徴を含む他の特徴のようなパラメーターに基づいて実施することができる。選別方法の例には、サイズ分別の後での自動秤の使用を含めることができる。この目的に適した光学分別機は、Ｓｏｒｔｅｘ ３０００ Ｓｅｒｉｅｓ Ｃｏｌｏｒ Ｓｏｒｔｅｒ（Ｂｕｈｌｅｒ−Ｓｏｒｔｅｘ ＫＫ，Ｙｏｋｏｈａｍａ，Ｊａｐａｎ）である。水分量による選別を含む他の選別技術を用いることもできる。

特定の実施形態において、切除は、表面に適用された種を破砕する、反対方向の回転することができるローラーを使用して機械的に実施される。ローラー間の隙間は、適用される種のサイズに基づいて調整することができる。ローラー材料は、例えば、エラストマーまたは金属でありうる。特定の実施形態では、ステンレス鋼ローラーが、反復および持続使用の後でも有益な作業品質を保持することが見出された。１つの実施形態において、外植片は、約３、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、および２５％の内部水分を含み、特にそのような任意の２つの値の間に派生する全ての範囲を含む約３〜２５％の内部水分を有することができる。外植片が調製される種は、形質転換可能植物細胞を単離するのに適した所定の内部水分で採取することができる。種の脆性は、水分量を操作することにより変えることができ、効率的な種の分割および外植片の調製を可能にする。例えば、３％〜７％のような内部水分量が有利でありうる。種を、使用前にそのような水分量または安定した保存条件（および形質転換可能な外植片）を生じる任意の他の水分量で保持することができる。種の脆性は、種を低温、例えば−２０℃もしくは−８０℃、またはより寒冷に曝露して、例えば液体窒素（約−１９６℃）と接触させて、変えることもできる。

様々な齢の乾燥外植片を使用することができ、外植片が比較的「若い」場合、これらには使用の１日未満、例えば約２、３、５、７、１０、１２、１５、２０、または２３時間のように約１〜２４時間前に種から取り出されるものが含まれる。外植片は長期間保存することもでき、これには、外植片の生存力を維持するために使用される保存条件に応じて数日間、数週間、数か月、または数年間さえも含まれる。特に当業者は、保存時間を、形質転換体の品質および／または収率、ならびに形質転換プロセスの効率が最大化されるように最適化できることを理解する。

乾燥種または外植片を、再乾燥する前、ならびに後の形質転換および再生に使用する前に、例えば水または滅菌液のような液体の吸水により最初に予備刺激することができる。種または外植片を、種内部水分量を３０％超に上昇させ、その時点で種または外植片を保持し、次に後の時点で吸水を再開することによって、予備刺激することもできる。あるいは、種または外植片を、内部水分量を３０％超に上昇させ、種または外植片を所定の時間保存し、種または外植片を２０％未満の内部水分量まで乾燥し、次に吸水を再開することによって、予備刺激することができる。

例えば子葉の１／４まで胚組織に結合したままでいる各子葉を含有しない、いくらか含有する、または一部分含有する再生可能な形質転換可能外植片を、採取することができる。これらの外植片は、それぞれ安定した形質転換植物をもたらしうるので、実質的に類似すると考慮される。しかし外植片は、典型的には外植片が組織培養増殖条件を開始した１２週間以内に苗条を生産できるように、胚の少なくとも幾つかの分裂組織の領域を含有するべきである。

外植片を得るため、および取り扱うための多数のパラメーターは、変わることができる。滅菌は、種または外植片を液体滅菌剤と接触させることによって実施することができる。種または外植片を、気体滅菌剤またはＵＶ光線のような照射滅菌剤と接触させることもできる。あるいは、種または外植片は、種または外植片の活力を低減することなく種または外植片の表面の外来性細菌および真菌のような生物学的汚染物の活力を低減するように、種または外植片を高温に短時間付すことによって滅菌することができる。このことは、４０℃を超える温度、例えば約４０〜約９０℃で達成することができる。温度を、例えば強制加熱空気または流により上昇させることができる。そのような温度は、Ｂｒｙ−Ａｉｒ Ｉｎｃ．（Ｓｕｎｂｕｒｙ，Ｏｈｉｏ，ＵＳＡ）により製造されるドライヤーにより提供することができる。同時培養培地（例えば、ＩＮＯ）へのＤＭＳＯ（１リットルのＩＮＯあたり１．０ｍｌのＤＭＳＯ）に溶解したナイスタチン（５０ｐｐｍ）およびチアベンダゾール（１０ｐｐｍ）の添加は、おそらく、種の中および外に一般的に見出される酵母菌および真菌を制御することにより外植片の健康を改善することができ、大規模および／または自動化組織培養を実施する場合に有用な道具となりうる。

切除時の種の水分量、ならびに切除時の種の温度は、変わりうる。加えて、切除後の保存パラメーターも変わりうる。例えば、外植片が保存される相対湿度は、変わりうる。外植片の保存温度、ならびに外植片保存の持続時間および外植片が保存される培地の組成も、変わりうる。更に、操作されうるパラメーターには、とりわけ、水和および再水和培地の組成、インキュベーション温度、時間の長さ、および形質転換の方法が含まれる。

切除の後、非形質転換可能損傷外植片、子葉、種皮、および他の破片から形質転換可能外植片材料をスクリーニングする方法および機器は、米国特許出願公開第２００８／０２８０３６１号に記載されているように用いることができる。方法は、手作業で実施することができる、または部分的もしくは完全に機械化することができる。例えば、１つ以上の篩い分けのステップは、破砕される種および単離される外植片のサイズに基づいた適切なサイズの篩を使用して、実施することができる。ローラーを通過する破砕種のバルク収量を、不要な大型および小型破片がサイズ排除により所望の外植片から分離されるように、一連の分離篩に通すことができる。このことは、例えば、＃８（開口２．３６ｍｍ）、＃１０（開口２．０ｍｍ）、＃１６（開口１．１８ｍｍ）のような米国標準篩、および適切であれば他のもの（例えば、１／１６″×３／４″、１／１８″×３／４″、１／１９″×１／２″、または１／２０″×１／２″のような細長窓篩）を使用して、ダイズ材料で効果的に達成することができる。他の開口サイズの篩を、所定の種のサイズに必要であれば、適用される材料のサイズに基づいて作製することができる。スクリーニングプロセスの時間の長さ、および篩い分けの激しさを調整して、プロセスの処理量および／または収率を増強することもできる。

破片に対する外植片材料の溶液中における異なる浮力を測定することのような、他のスクリーニング方法を利用することもできる。水溶液に浮遊する材料の画分は、無傷の形質転換可能外植片が豊富であることが見出された。

外植片を、水和種から、乾燥保存可能種から、乾燥水和外側片の部分再水和から（ここで、「水和」および「再水和」は、種内部水分率の測定可能な変化として定義される）、または「予備刺激」された種から、すなわち、発芽を開始しているが、発芽プロセスと競合する均衡未決定好条件に適切に置かれている種から回収することができる。当業者は、様々な水和方法を使用すること、および形質転換の前のインキュベーション時間を最適化することができる。得られる外植片は、保存可能であり、発芽することができる、および／または適切な条件が提供される場合に形質転換されうる。したがって、新たな乾燥保存可能な分裂組織外植片を、人工種と呼ぶことができる。

切除に続いて、当業者は、開示されている方法に従って外植片を後の使用の前に保存することができる。種を乾燥する、保存する、発芽させる方法およびパラメーターは、当該技術において知られている。植物細胞を含む切除外植片の保存は、望ましい場合は、例えば約−８０℃〜約６０℃の温度を含む、そのような保存条件の変更を使用して実施することができる。約−２０℃から室温の温度は、特に良好に機能することが見出されている。

細胞を含む単離された胚外植片を、本発明の組成物と接触させた後、外植片を、選択された異種ＤＮＡ配列により形質転換することができ、遺伝子導入植物をそれらから再生することができる。遺伝子導入植物を遺伝導入事象と呼ぶこともできる。高速マイクロプロジェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、直接ＤＮＡ取り込み、および細菌仲介形質転換を含む様々な方法が、遺伝子を植物組織に移入するために開発されてきた。リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）の種の様々な細菌を植物および／または植物細胞の遺伝子形質転換のベクターとして使用する方法、ならびに遺伝子導入植物をそれらから再生する方法は、当該技術において知られている。宿主細菌株は、多くの場合、発現単位の移入機能を有するプラスミドを持つアグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＡＢＩ、Ｃ５８、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１、またはＥＨＡ１０５である。本発明の特定の非限定態様において、アグロバクテリウム仲介形質転換および遺伝子導入植物の再生は、米国特許第５，８２４，８７７号、同第５，５９１，６１６号、同第５，９８１，８４０号、および同第６，３８４，３０１号に記載されているように実施することができる。植物形質転換の当業者に知られている他の細菌株も、本発明における使用のために考慮され、例えば米国特許出願公開第２００７／０２７１６２７号に記載されているリゾビウム仲介形質転換、シノリゾビウム種、メソリゾビウム種、およびブラディリゾビウム種（例えば、Ｂｒｏｏｔｈａｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，２００５）である。

所望の遺伝子成分を含有するプラスミドまたはベクターを調製する手段は、当該技術において良く知られている。一般に、異種ＤＮＡ配列を１つ以上の遺伝子成分と組み合わせて、発現単位を調製する。多くの場合に、これらの発現単位は、植物細胞への配列の移入のために少なくとも１つのＴ−ＤＮＡ境界を備える。次に１つ以上の発現単位をプラスミドまたはベクターに挿入し、次にこれを細菌の中に移動させ、次にこれを細胞と接触させる。細菌は、発現単位を細胞に移入し、発現単位は、細胞のゲノムに組み込まれ、次に世代毎に遺伝される。

遺伝子成分は、以下の遺伝子成分：（ａ）植物細胞で機能してＲＮＡ配列の産生を引き起こすプロモーター、（ｂ）商業的に有用性のある産物をコードするＲＮＡ配列の産生を引き起こす構造ＤＮＡ配列、および／または遺伝子の発現を阻害するＲＮＡｉ分子の産生を引き起こすＤＮＡ配列、ならびに（ｃ）植物細胞で機能してＲＮＡ配列の３′末端へのポリアデニル化ヌクレオチドの付加を引き起こす３′非翻訳ＤＮＡ配列の少なくとも１つ以上を含むプラスミドまたはベクター分子に組み込まれる。

ｍＲＮＡへのＤＮＡの転写は、通常「プロモーター」と呼ばれるＤＮＡの領域により調節される。プロモーター領域は、ＤＮＡと関連すること、およびＤＮＡ鎖のうちの１つをテンプレートとして使用してｍＲＮＡへの転写を開始し、ＲＮＡの対応する相補鎖を作製することを、ＲＮＡポリメラーゼにシグナル伝達する塩基の配列を含有する。植物細胞において活性な多数のプロモーターが文献に記載されている。そのようなプロモーターには、アグロバクテリウムツメファシエンスのＴｉプラスミドに運ばれるノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）およびオクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）１９Ｓおよび３５Ｓプロモーター、およびＦｉｇｗｏｒｔモザイクウイルス（ＦＭＶ）３５Ｓプロモーターのようなカリモウイルスプロモーター、ならびに強化ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（ｅ３５Ｓ）が含まれるが、これらに限定されない。環境、ホルモン、化学、および／または発生のシグナルに応答して調節される様々な他の植物遺伝子プロモーターを、植物細胞における異種遺伝子の発現に使用することもでき、例えば、（１）熱（Ｃａｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８８）、（２）光（例えば、エンドウマメＲｂｃＳ−３Ａプロモーター、Ｋｕｈｌｅｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）；トウモロコシＲｂｃＳプロモーター、Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９１））、（３）アブシジン酸のようなホルモン（Ｍａｒｃｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９８９）、（４）創傷（例えば、Ｗｕｎｉ，Ｓｉｅｂｅｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８９）、または他のシグナルもしくは化学薬品により調節されるプロモーターが含まれる。組織特異的発現も知られている。下記に記載されているように、選択される特定のプロモーターは、有効量の目的遺伝子産物の産生をもたらすのに十分な発現を引き起こすことができるべきである。そのようなプロモーターを記載する例には、限定されることなく、米国特許第６，４３７，２１７号（トウモロコシＲＳ８１プロモーター）、米国特許第５，６４１，８７６号（コメアクチンプロモーター）、米国特許第６，４２６，４４６号（トウモロコシＲＳ３２４プロモーター）、米国特許第６，４２９，３６２号（トウモロコシＰＲ−１プロモーター）、米国特許第６，２３２，５２６号（トウモロコシＡ３プロモーター）、米国特許第６，１７７，６１１号（構成的トウモロコシプロモーター）、米国特許第５，３２２，９３８号、同第５，３５２，６０５号、同第５，３５９，１４２号、および同第５，５３０，１９６号（３５Ｓプロモーター）、米国特許第６，４３３，２５２号（トウモロコシＬ３オレオシンプロモーター）、米国特許第６，４２９，３５７号（コメアクチン２プロモーター、ならびにコメアクチン２イントロン）、米国特許第５，８３７，８４８号（根特異的プロモーター）、米国特許第６，２９４，７１４号（光誘導性プロモーター）、米国特許第６，１４０，０７８号（塩誘導性プロモーター）、米国特許第６，２５２，１３８号（病原体誘導性プロモーター）、米国特許第６，１７５，０６０号（リン欠乏誘導性プロモーター）、米国特許第６，６３５，８０６号（ガンマ−コイキシン（ｃｏｉｘｉｎ）プロモーター）、ならびに米国特許出願第０９／７５７，０８９号（トウモロコシクロロプラストアルドラーゼプロモーター）が含まれる。使用を見出すことができる追加のプロモーターは、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモーター（Ｅｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７）、オクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）プロモーター（アグロバクテリウムツメファシエンスの腫瘍誘導性プラスミドにより運ばれる）、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）１９Ｓプロモーター（Ｌａｗｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７）、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９８５）、ｆｉｇｗｏｒｔモザイクウイルス３５Ｓ−プロモーター（Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７；米国特許第６，０５１，７５３号、同第５，３７８，６１９号）のようなカリモウイルスプロモーター、スクロースシンターゼプロモーター（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９０）、Ｒ遺伝子複合体プロモーター（Ｃｈａｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９）、クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子プロモーター、ＰＣ１ＳＶ（米国特許第５，８５０，０１９号）、およびＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ（ジェンバンク受入番号Ｖ０００８７；Ｄｅｐｉｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ，１９８２；Ｂｅｖａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３）プロモーターである。

またプロモーターハイブリッドを構築して、転写活性を増強すること（米国特許第５，１０６，７３９号）、または所望の転写活性、誘導性、および組織特異性もしくは発生特異性を組み合わせることができる。植物において機能するプロモーターには、記載されているように誘導性である、ウイルス性である、合成である、構成的である、ならびに時間的に調節される、空間的に調節される、および時間空間的に調節されるプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。組織増強される、組織特異的である、または発生調節される他のプロモーターも当該技術において知られており、本発明の実施に有用性を有すると考慮される。

本発明のＤＮＡ作成物（すなわち、キメラ／組み換え植物遺伝子）に使用されるプロモーターを、望ましい場合は修飾して、これらの制御特性に影響を与えることができる。プロモーターを、オペレーター領域との連結により、ランダムまたは制御突然変異誘発などにより誘導することができる。更に、プロモーターを、複数の「エンハンサー配列」を含有するように変更して、遺伝子発現を高めるのを助けることができる。

本発明のＤＮＡ作成物により産生されるｍＲＮＡは、５′非翻訳リーダー配列を含むこともできる。この配列は、遺伝子を発現するように選択されたプロモーターから誘導することができ、ｍＲＮＡの翻訳を増加または減少するように特異的に修飾することができる。５′非翻訳領域は、ウイルスＲＮＡから、適切な真核生物遺伝子から、または合成遺伝子配列から得ることもできる。そのような「エンハンサー」配列は、得られるｍＲＮＡの翻訳効率を増加または変更するために望ましいことがある。本発明は、非翻訳領域がプロモーター配列を伴う両方の５′非翻訳配列から誘導される作成物に限定されない。むしろ、非翻訳リーダー配列を、無関係のプロモーターまたは遺伝子から誘導することができる（例えば、米国特許第５，３６２，８６５号を参照すること）。非翻訳リーダー配列の例には、トウモロコシおよびペチュニアヒートショックタンパク質リーダー（米国特許第５，３６２，８６５号）、植物ウイルス外殻タンパク質リーダー、植物ルビスコリーダー、ＧｍＨｓｐ（米国特許第５，６５９，１２２号）、ＰｈＤｎａＫ（米国特許第５，３６２，８６５号）、ＡｔＡｎｔ１、ＴＥＶ（Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｆｒｅｅｄ，１９９０）、ならびにＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ（ジェンバンク受入番号Ｖ０００８７；Ｂｅｖａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３）が含まれる。遺伝子の発現を増強する、または転写もしくは翻訳に影響を与えるのに役立つ他の遺伝子成分も、遺伝子成分として考慮される。

キメラ作成物の３′非翻訳領域は、転写ターミネーターまたは同等の機能を有するエレメント、および植物において機能して、ＲＮＡの３′末端にポリアデニル化ヌクレオチドを付加させるポリアデニル化シグナルを含有することができる。ＤＮＡ配列は、本明細書において転写終結領域と呼ばれる。領域は、転写されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の効率的なポリアデニル化にとって必要である。ＲＮＡポリメラーゼは、ポリアデニル化が生じる部位を介してコードＤＮＡ配列を転写する。適切な３′領域の例は、（１）ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ； Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８３）遺伝子のようなアグロバクテリウム腫瘍誘導性（Ｔｉ）プラスミド遺伝子のポリアデニル化シグナルを含有する３′転写、非翻訳領域、ならびに（２）ダイズ貯蔵タンパク質遺伝子のような植物遺伝子およびリブロース−１，５−ビスホスフェートカルボキシレート（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ）遺伝子の小型サブユニットである。好ましい３′領域の例は、エンドウマメのｓｓＲＵＢＩＳＣＯ Ｅ９遺伝子からのものである（欧州特許出願第０３８５，９６２号）。

本発明は、評価可能、選択可能、またはスクリーン可能なマーカー、および記載された関連調節エレメントを、特定の望ましい形質を付与するのに十分な方法で発現された１つ以上の核酸を伴って含有する任意の適切な植物形質転換プラスミドまたはベクターと共に使用することができる。例示的なマーカーは知られており、とりわけ、ＧＵＳ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、およびルシフェラーゼ（ＬＵＸ）が含まれるが、これらに限定されない。選択可能またはスクリーン可能なマーカーは、再生可能植物組織において機能して、そうでなければ毒性化合物に対する抵抗性を植物組織に対して付与する化合物を生成する。特定の実施形態において、ベクターは、植物細胞にスペクチノマイシンに対する抵抗性をコードする関連調節エレメントを有するａａｄＡ遺伝子を含む。特定の実施形態において、ａａｄＡ遺伝子は、形質転換植物細胞の葉緑体へのａａｄＡ遺伝子産物の輸送を指示する葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）配列を含む。他の実施形態において、ベクターは、アグロバクテリウム細胞のような細菌細胞における発現が設計されている適切な調節エレメントを有するスペクチノマイシン抵抗性遺伝子を含み、それによって、選択的試薬を同時培養培地に加えることができ、例えば同時培養の時間の後で選択的作用物質を更に使用しないで、遺伝子導入植物を得ることを可能にする。本発明において考慮される農学的な目的の形質を付与する適切な遺伝子の例には、病気、昆虫、または病害虫に耐性、除草剤に耐性の遺伝子、収率、栄養強化、環境もしくはストレス耐性、またはデンプン産生（米国特許第６，５３８，１８１号、同第６，５３８，１７９号、同第６，５３８，１７８号、同第５，７５０，８７６号、同第６，４７６，２９５号）、変更された油生成（米国特許第６，４４４，８７６号、同第６，４２６，４４７号、同第６，３８０，４６２号）、高い油生成（米国特許第６，４９５，７３９号、同第５，６０８，１４９号、同第６，４８３，００８号、同第６，４７６，２９５号），変更された脂肪酸含有量（米国特許第６，８２８，４７５号、同第６，８２２，１４１号、同第６，７７０，４６５号、同第６，７０６，９５０号、同第６，６６０，８４９号、同第６，５９６，５３８号、同第６，５８９，７６７号、同第６，５３７，７５０号、同第６，４８９，４６１号、同第６，４５９，０１８号）、高いタンパク質産生（米国特許第６，３８０，４６６号）、果実の成熟（米国特許第５，５１２，４６６号）、強化された動物およびヒトの栄養（米国特許第６，７２３，８３７号、同第６，６５３，５３０号、同第６，５４１２，５９号、同第５，９８５，６０５号、同第６，１７１，６４０号）、バイオポリマー（米国特許第ＲＥ３７，５４３号、同第６，２２８，６２３号、同第５，９５８，７４５号、および米国特許公開第２００３／００２８９１７号）を含む、植物生理学、成長、発生、形態学、もしくは植物生成物における任意の所望の変化のような品質の改善のための遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。また、環境ストレス抵抗性（米国特許第６，０７２，１０３号）、医薬ペプチドおよび分泌性ペプチド（米国特許第６，８１２，３７９号、同第６，７７４，２８３号、同第６，１４０，０７５号、同第６，０８０，５６０号）、改善されたプロセッシング形質（米国特許第６，４７６，２９５号）、改善された消化性（米国特許第６，５３１，６４８号）、低いラフィノース（米国特許第６，１６６，２９２号）、工業用酵素生産（米国特許第５，５４３，５７６号）、改善された風味（米国特許第６，０１１，１９９号）、窒素固定（米国特許第５，２２９，１１４号）、ハイブリッド種の生産（米国特許第５，６８９，０４１号）、繊維生産（米国特許第６，５７６，８１８号、同第６、２７１、４４３号、同第５，９８１，８３４号、同第５，８６９，７２０号）、及びバイオ燃料生産（米国特許第５，９９８，７００号）である。これらのまたは他の遺伝子エレメント、方法、および導入遺伝子のいずれかを、本開示を考慮して当業者によって適切であると理解されたら、本発明と共に使用することができる。

あるいは、目的のＤＮＡ配列は、アンチセンス仲介機構、相互抑制仲介機構のような遺伝子サイレンシング技術、ｍｉＲＮＡを含むＲＮＡｉ技術を介して、内在性遺伝子の発現に標的阻害を引き起こすＲＮＡ分子をコードすることによりこれらの表現型の影響を与えることができる（例えば、米国特許出願公開第２００６／０２００８７８号）。

本発明に包含される方法により導入されうる例示的な核酸には、例えば、別の種のＤＮＡ配列もしくは遺伝子、または同じ種に由来する、もしくは存在するが、伝統的な生殖もしくは繁殖技術ではなく遺伝子操作方法によりレシピエント細胞に組み込まれる遺伝子もしくは配列も含まれる。しかし、用語「外来性」は、形質転換された細胞に通常存在しない、または単に、通常存在するが、例えば過剰発現することが望ましい形質転換ＤＮＡセグメントもしくは遺伝子に見出されるような形態、構造などで存在しない遺伝子を意味することが意図される。したがって、用語「外来性」遺伝子またはＤＮＡは、同様の遺伝子が細胞に既に存在しうるかにかかわらず、レシピエント細胞に導入される任意の遺伝子またはＤＮＡセグメントを意味することが意図される。外来性ＤＮＡに含まれるＤＮＡの種類には、植物細胞に既に存在しているＤＮＡ、別の植物のＤＮＡ、異なる生物のＤＮＡ、または遺伝子のアンチセンスメッセージを含有するＤＮＡ配列、もしくは遺伝子の合成型もしくは修飾型をコードするＤＮＡ配列のような外部で生成されたＤＮＡが含まれうる。

Ｔ−ＤＮＡは、ＲＢおよび／もしくはＬＢ配列により結合されうる、または境界配列を有さないことがある。植物細胞に移入されうる配列は、１つの形質転換ベクターにおいて、形質転換に利用される細菌株の中に存在しうる。別の実施形態において、配列は別々の形質転換ベクターで細菌株の中に存在しうる。なお別の実施形態において、配列は、形質転換に一緒に使用される別々の細菌細胞または株に見出される。

本発明の方法で形質転換に使用されるＤＮＡ作成物は、細菌細胞に複製機能および抗生物質選択を提供する、例えば、ｏｒｉ３２２のような大腸菌由来の複製、ｏｒｉＶまたはｏｒｉＲｉのような広範囲の宿主由来の複製、およびスペクチノマイシンまたはストレプトマイシンに対して抵抗性を付与するアミノグリコシドアデニルトランスフェラーゼ（ａａｄＡ）をコードするＳｐｅｃ／Ｓｔｒｐのような選択性マーカーのコード領域を提供するプラスミド主鎖ＤＮＡセグメントを含有することもできる（例えば、米国特許第５，２１７，９０２号）。本開示を考慮すると、他の多数の可能な調節エレメントおよび他の興味深い配列が当業者に理解される。したがって、前述の考察は、網羅的ではなく例示的であることが意図される。

当業者は、植物のアグロバクテリウム仲介形質転換プロセスにおける典型的なステップを認識している。アグロバクテリウムは、グリセロール貯蔵液からＬｕｒｉａ Ｂｕｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地のような液体を直接接種すること、またはグリセロール貯蔵液からアグロバクテリウムを固体培地にストリークすることにより、細菌を適切な選択条件下、一般に約２６℃〜３０℃または約２８℃で増殖させ、プレートからアグロバクテリウムの単一のコロニーまたは小型のループを取り出し、選択性作用物質を含有する液体培養培地に接種することによって調製することができる。当業者は、アグロバクテリウムの増殖手順および適切な培養条件、ならびに続く接種の手順について良く知っている。接種に使用されるアグロバクテリウム培養物の密度およびアグロバクテリウム細胞と外植片の比率は、系毎に変わることがあり、したがって、任意の形質転換方法におけるこれらのパラメーターの最適化が予測される。

典型的には、アグロバクテリウム培養物を、ストリークされたプレートまたはグリセロール貯蔵液により接種し、一晩増殖させ、細菌細胞を、外植片の接種に適した培養培地により洗浄および再懸濁する。本発明に適した接種培地には、未熟胚外植片では１／２ＭＳ ＰＬまたは１／２ＭＳ ＶＩ（それぞれ表１および２を参照すること）、ならびに成熟胚外植片ではＩＮＯ（表６を参照すること）が含まれるが、これらに限定されない。

アグロバクテリウム仲介形質転換プロセスの次の段階は、接種である。この段階では、外植片およびアグロバクテリウム細胞懸濁液が一緒に混合される。胚外植片が未熟トウモロコシ胚である本発明の実施形態において、胚外植片は、アグロバクテリウムを含有する接種培地に直接置かれる。胚を接種培地で３０分未満培養する。接種は、一般に、約１５℃〜３０℃または約２３℃〜２８℃の温度で実施される。接種は、また、未熟胚を同時培養培地（下記に記載される）で直接単離し、次に１μＬのアグロバクテリウム溶液を胚にスポットする、あるいはアグロバクテリウム溶液で飽和した１片の濾紙を胚の上に覆うように約５〜６０分間配置することによって実施することができる。次に濾紙および過剰溶液を、同時培養の前に除去する。

特定の実施形態において、異種ＤＮＡが外植片と接触したとき、またはその後、外植片を１つ以上の植物成長調整剤（ＰＧＲ）と接触させることができる。多くのＰＧＲが当該技術において知られており、そのような実施形態において考慮され、例えば、オーキシン、抗オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、除草剤、成長抑制剤および矮化剤、モルファクチン、成長刺激剤、ならびに／または他の未分類植物成長調整剤であり、本開示の他の部分に提示されている。

接種の後、過剰アグロバクテリウム溶液を除去することができ、アグロバクテリウムおよび標的植物材料が同時培養される。同時培養は、接種後であり、遅延または選択培地への移動の前の時点を意味する。任意の数の植物組織培養培地を、同時培養ステップに使用することができる。特定の実施態様では、アグロバクテリウムで接種した後、植物組織を、アガロースまたは低ＥＥＯアガロースのようなゲル化剤を有する半固体ＭＳに基づいた、または還元塩１／２ＭＳに基づいた半固体同時培養培地で培養する（表３）。

同時培養は、典型的には、約１８℃〜３０℃または約２０℃〜２５℃の温度で約１〜３日間または２４時間未満にわたって実施される。同時培養は、光または光制限条件下で実施することができる。通常、同時培養は、光制限条件下で実施される。「光制限条件」は、本明細書で使用されるとき、植物とアグロバクテリウムの混合物を含有する培養皿を布、ホイルで覆うこと、または培養皿をブラックバッグに入れること、または培養細胞を暗室に入れることが含まれるが、これらに限定されない、同時培養期間に光を制限する任意の条件と定義される。点灯条件は、それぞれの植物系に最適化することができ、当業者には知られている。

胚外植片が成熟ダイズ胚のものである本発明の実施形態では、胚外植片を、調製した接種物に曝露し、Ｌ＆Ｒ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ ＱＳ１４０（Ｌ＆Ｒ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｃｏ．，Ｋｅａｒｎｙ，Ｎ．Ｊ．）またはＨｏｎｄａ Ｗ１１３超音波処理器（Ｈｏｎｄａ，Ｄｅｎｓｈｉ Ｊａｐａｎ）のような標準的な実験室水浴洗浄超音波処理機からの超音波エネルギーに２０秒間、短時間曝露する。短時間の超音波処理ステップの後、外植片を発生接種物から排出し、通常は形質移入の開始の数時間以内に、ＩＮＯ培地に浸した濾紙をそれぞれ含有する新たなＰＬＡＮＴＣＯＮに移す。次に外植片を、点灯チャンバー（一般に≧５ｕＥの光で１６時間）によりおよそ２３〜２８℃で１〜５日間インキュベートする。同時培養および後のステップは、暗黒条件または光の中で、例えば点灯Ｐｅｒｃｉｖａｌインキュベーターにより、例えば、およそ２３〜２５℃の温度で２〜５日間（例えば、約５〜２００μＥのような≧５μＥの光強度または正常な色素体発生を可能にする他の点灯条件で１６時間の光期間／８時間の暗黒を）実施することができ、約３５℃または４０℃まで実施することができる。

アグロバクテリウムとの同時培養の後または微小発射体の衝撃の後、外植片を、典型的には選択性作用物質を含有する再生培地に直接置くことができる。外植片は（形質転換方法にかかわりなく）、選択培地に、約７〜約４２日間、または約７〜約３０日間、または約７〜約２１日間、または約７〜約１４日間置かれる。様々な組織培養培地および移入要件が知られており、これらを実施および最適化して、植物組織の成長、植物の形質転換の発生、および遺伝子導入植物の回収を支持することができる。これらの組織培養培地を、市販の調製物として購入することができる、または当業者により特別仕様に調製すること、および修飾することができる。そのような培地の例には、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ（１９６２）；Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，（１９７５）；Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ（１９６５）；Ｕｃｈｉｍｉｙａ ａｎｄ Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ（１９６２）；Ｇａｍｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．，（１９６８）；Ｄｕｎｃａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）；ＭｃＣｏｗｎ ａｎｄ Ｌｌｏｙｄ（１９８１）；Ｎｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｎｉｔｓｃｈ（１９６９）；およびＳｃｈｅｎｋ ａｎｄ Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ（１９７２）、または適宜補充されたこれらの培地の誘導体が含まれるが、これらに限定されない。当業者は、培地、ならびに形質転換および再生に使用される栄養素および成長調整剤のような培地補充物が、通常、特定の標的作物または様々な目的のために最適化されることを認識する。組織培養培地を、グルコース、スクロース、マルトース、マンノース、フルクトース、ラクトース、ガラクトース、および／もしくはデキストロースのような炭水化物、または炭水化物の割合で補充することができる。試薬は市販されており、多数の供給者から購入することができる（例えば、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．；およびＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｈａｗｎｅｅ Ｍｉｓｓｉｏｎ，Ｋａｎｓ．を参照すること）。追加的に適切な培地成分を、選択または遅延培地に添加してアグロバクテリウムの成長を抑制することができる。そのような培地成分には、カルベニシリンまたはセフォタキシムのような抗生物質が含まれるが、これらに限定されない。続いて培養物を、形質転換小植物の回収に適した培地に移す。当業者は、植物系および選択性作用物質に応じて変わりうる選択的な措置、培地、および成長条件における多数の変更も認識している。典型的な選択性作用物質には、ジェナテシン（Ｇ４１８）、カナマイシン、パロモマイシン、スペクチノマイシンのような抗生物質、またはグリホセートもしくは他の除草剤のような他の化学薬品が含まれるが、これらに限定されない。本発明の特定の実施形態において、選択性作用物質はスペクチノマイシンである。緑芽または葉を有するスペクチノマイシン抵抗性苗条は、スペクチノマイシン抵抗性があるのでスクリーン可能または評価可能である。これらを選択性作用物質の存在下または不在下で土壌または発根培地のような土壌代用物に置くことができる。そのような外植片から伸びる苗条は、遺伝子導入性であることを日常的に示しており、遺伝子導入性であるＲ_１および続く後代を生じ、一方、そのような外植片から発生する根は、遺伝子導入性または非遺伝子導入性でありうる。したがって、遺伝子導入苗条および部分的または完全に非遺伝子導入根系を含む植物も、考慮される。あるいは、選択性作用物質を欠いている培地で形質転換組織を培養することによって、形質転換分裂組織から、根は非遺伝子導入性であるが、遺伝子導入苗条を再生する方法も考慮され、例えば、米国特許出願公開第２００８／００５７５１２号に開示されている。

これらの方法を１つ以上の容器で実施することもでき、プロセスは、手作業でありうる、または最新の自動制御機械を使用して自動化することができる。本発明に開示されている培地および培養条件を、栄養的に同等の成分または遺伝子導入事象の同様の選択および回収プロセスに変更または代え、それでも、本発明の範囲内に入ることができる。アグロバクテリウム形質転換方法を使用して形成される遺伝子導入植物は、１つの染色体に挿入された単一の簡単な組み換えＤＮＡ配列（単一コピー）を典型的に含有し（しかし、必ずしもそうであるとは限らず）、遺伝子導入事象と呼ばれる。そのような遺伝子導入植物は、挿入された外来性配列によってヘテロ接合体であると呼ぶことができる。導入遺伝子の観点から遺伝子導入植物ホモ接合体は、単一の外来性遺伝子配列を含有する個別の分離個体植物をそれ自体と、例えばＲ_０植物と有性交配（自配）して、Ｒ_１種を生産することによって得られる。生産されたＲ_１種の四分の一は、導入遺伝子の観点からホモ接合体である。Ｒ_１種の発芽は、典型的には、ヘテロ接合体とホモ接合体の区別を可能にするＳＮＰアッセイまたは熱増幅アッセイ（すなわち、接合生殖性アッセイ）を使用して、接合生殖性について試験することができる植物においてもたらされる。

遺伝子導入植物において外来性ＤＮＡまたは「導入遺伝子」の存在を確認するために、様々なアッセイを実施することができる。そのようなアッセイには、例えば、サザンおよびノーザンブロッティング、ＰＣＲ（商標）、ＩＮＶＡＤＥＲアッセイ、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）法（例えば、米国特許第７，４８５，４２８号を参照すること）のような「分子生物学」アッセイ；例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット）による、または酵素機能によるタンパク質産物の存在の検出のような「生化学」アッセイ；葉または根のアッセイのような植物部分のアッセイ；また、全再生植物の表現型を分析することが含まれる。

導入遺伝子が植物に導入されると、この遺伝子を、第２植物を直接形質転換することなく、交配により、第１植物と生殖的に同等の任意の植物に導入することができる。したがって、本明細書で使用されるとき、用語「後代」は、本発明により調製される任意の世代の親植物の子孫を意味し、ここで後代は選択されたＤＮＡ作成物を含む。したがって「遺伝子導入植物」は、任意の世代でありうる。植物を「交配」して、出発植物系と比べて１つ以上の付加導入遺伝子または対立遺伝子を有する植物系を提供することは、出発系を、導入遺伝子または対立遺伝子を含むドナー植物系と交配させることによって、特定の配列が植物系に導入されることをもたらす技術と定義される。これを達成するために、例えば、以下の４つのステップ：（ａ）第１（出発系）および第２（所望の導入遺伝子または対立遺伝子を含むドナー植物系）の親植物の種を植えるステップ；（ｂ）第１および第２親植物の種を、花を咲かせる植物に成長させるステップ；（ｃ）第１親植物の花を第２親植物の花粉で受粉させるステップ；ならびに（ｄ）受精花を持つ親植物で生産される種を採取するステップを実施することができる。

本発明の別の態様は、本明細書に開示されている本発明に方法を使用して作り出される、本開示の他の部分において定義されている遺伝子導入植物およびその任意の植物部分である。

当業者は、本発明により提供される方法および組成物の多くの利点を理解する。以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を示すために含まれている。当業者は、本開示を考慮して、多くの変更を、開示されている特定の実施形態において実施することができ、依然として、本発明の精神および範囲を逸脱することなく同様または類似の結果が得られることを理解するべきである。本明細書に引用される全ての参考文献は、本明細書に用いられている方法論、技術、または組成物を補足する、説明する、背景を提供する、または教示する程度で参照として本明細書に組み込まれる。
実施例１

水中のＰＥＧと接触させたダイズ細胞の増強された形質転換
この実施例は、滅菌蒸留水（ＳＤＷ）にＰＥＧを含有する組成物と接触させた乾燥ダイズ胚の増強された形質転換を示す。ダイズｃｖ．Ａ３５２５乾燥胚を、米国特許出願公開第２００８／０２８０３６１号に記載された方法に従って切除し、ＳＤＷに溶解した５、１０、２０、または５０％ＰＥＧ−４０００の様々な量と１時間接触させた。胚をＳＤＷで５〜６回すすぎ、米国特許出願公開第２００９／０１３８９８５号に記載された方法に従って形質転換した。胚を、元のＯｒｉＲｉまたはＯｒｉＶ複製を有し、アグロバクテリウムのＡＢＩまたはＡＢ３０株に含まれた２Ｔ形質転換ベクターで形質転換した。胚を、スペクチノマイシン選択培地で再生させた。表４に示されているように、５、１０、および２０％ＰＥＧ組成物と接触させた胚は、ＩＮＯ培地またはＳＤＷ単独と接触させた胚と比較して、一般に、増強された形質転換頻度および単一コピー事象の増強された頻度を示した。５０％ＰＥＧと接触させた胚も、ＳＤＷと接触させた胚（ＴＦ＝２．３％）と比較して改善されたＴＦ（７％）を示した。５０％ＰＥＧでの実験は、ＡＢ３０／ＯｒｉＲｉ作成物により実施した。ダイズのスペクチノマイシン選択培地の組成については表５を参照すること。

実施例２

ＩＮＯ培地中のＰＥＧと接触させたダイズ細胞の増強された形質転換
この実施例は、ＩＮＯまたはＩＮＯ培地中にＰＥＧを含有する組成物と接触させた乾燥ダイズ胚の増強された形質転換を示す。ダイズｃｖ．Ａ３５２５乾燥胚を、米国特許出願公開第２００８／０２８０３６１号に記載された方法に従って切除し、ＩＮＯに溶解した２０％ＰＥＧ−４０００と１時間接触させた。胚を無添加ＩＮＯで５〜６回すすぎ、米国特許出願公開第２００９／０１３８９８５号に記載された方法に従って形質転換した。胚を、元のＯｒｉＲｉ複製を有し、アグロバクテリウムのＡＢ３０株に含まれた２Ｔ形質転換ベクターで形質転換した。胚を、スペクチノマイシン選択培地で再生させた。表６に示されているように、２０％ＰＥＧ組成物と接触させた胚は、一般に、ＩＮＯ培地単独と接触させた胚と比較して、２つの異なる実験において増強された形質転換頻度を示した。ＩＮＯ培地の組成については表７を参照すること。

実施例３

ＢＧＭ中のＰＥＧと接触させたダイズ細胞の増強された形質転換
この実施例は、ＢＧＭ単独と比較した、マメ発芽培地（ＢＧＭ−表８）にＰＥＧを含有する組成物と接触させた乾燥ダイズ胚の増強された形質転換を示す。ダイズｃｖ．Ａ３５２５乾燥胚を、米国特許出願公開第２００８／０２８０３６１号に記載された方法に従って切除し、ＢＧＭに溶解した１０％または２０％ＰＥＧ−４０００と１時間接触させた。胚をＢＧＭで５〜６回すすぎ、米国特許出願公開第２００９／０１３８９８５号に記載された方法に従って形質転換した。胚を、元のＯｒｉＶ複製を有し、アグロバクテリウムのＡＢ３０株に含まれた２Ｔ形質転換ベクターで形質転換した。胚を、スペクチノマイシン選択培地で再生させた。表９に示されているように、１０％および２０％ＰＥＧ組成物と接触させた胚は、ＢＧＭ単独と接触させた胚と比較して増強された形質転換頻度を示した。

実施例４

他の浸透性化合物と比較したＴＦに対するＰＥＧの効果
この実施例は、ＰＥＧと比較したＴＦに対する他の浸透性化合物の効果を示す。様々なＰＥＧ種による処理のＴＦ増強も比較する。ダイズｃｖ．Ａ３５５５乾燥胚を、米国特許出願公開第２００８／０２８０３６１号に記載された方法に従って切除し、ＳＤＷに溶解したＰＥＧ−４０００、ＰＥＧ−６０００、ＰＥＧ−８０００、マンニトール、ソルビトール、またはグリセロールの様々な量と１時間接触させた。次に胚をＳＤＷで５〜６回すすぎ、米国特許出願公開第２００９／０１３８９８５号に記載された方法に従って形質転換した。胚を、元のＯｒｉＲｉ複製を有し、アグロバクテリウムのＡＢ３０株に含まれた２Ｔ形質転換ベクターで形質転換した。胚を、スペクチノマイシン選択培地で再生させた。表１０に示されているように、１０％および２０％ＰＥＧ組成物と接触させた胚は、他の浸透性化合物または水単独で処理した胚と比較して、増強された形質転換頻度を示した。

実施例５

ＰＥＧは乾燥胚外植片の水和率を調節する
この実施例は、ＰＥＧが乾燥胚外植片の水和率の調節に有用であることを示す。ダイズｃｖ．Ａ３５２５乾燥胚を、米国特許出願公開第２００８／０２８０３６１号に記載された方法に従って切除した。次に外植片を、ＩＮＯに溶解した２０％ＰＥＧ４０００またはＩＮＯ単独のいずれかと接触させた。水分取り込み率は、処理の際に定期的な間隔で外植片の試料を取り、それらを重量測定に基づいた破壊オーブン試験に付し、そこで外植片を約１００℃のオーブンでおよそ２日間乾燥した。水分率は、これらの重量損失により決定した。表１１および１２にそれぞれ示されているように、第１の研究は、１、４、および２４時間の水和率を検査し、一方、第２の研究は、０、１５、３０、４５、および６０分間の水和率の率を検査した。両方の研究は、２０％ＰＥＧ４０００と接触させた乾燥ダイズ胚外植片による水分取り込み率が低減されていることを示す。により水和を調節する

実施例６

ＰＥＧ処理は胚外植片の出液水放出を低減する
この実施例は、水中のＰＥＧと接触させた乾燥切除胚外植片が、水単独と接触させたものと比較して少ない出液水を放出することを示す。ダイズｃｖ．Ａ３５５５乾燥胚を、米国特許出願公開第２００８／０２８０３６１号に記載された方法に従って切除し、ＳＤＷ中２０％ＰＥＧ−４０００またはＳＤＷ単独と１時間接触させた。それぞれの培地中の外植片を、オービタルシェイカーに７５ＲＰＭで入れ、室温でインキュベートした。各群の培地の試料をインキュベーションの０、１５、３０、４５、および６０分後に取り出し、光学密度（３００ｎｍでの吸光度、適切な培地による空試験）および伝導率（マイクロジーメンス）を測定して出液水を分析した。表１３に示されているように、出液水の光学密度は、２０％ＰＥＧ処理の試料と比較して水対照試料においてはるかに高かった。伝導率についても同じことが当てはまった。注：星印（^＊）で示された読み取り値は、使用した分光光度計が最大範囲の３．２９５を有したので、試料の１／１０希釈で実施し、次に１０を掛けた。

実施例７

水和ダイズ胚の形質転換頻度に対するＰＥＧ処理の効果
この実施例は、アグロバクテリウム仲介形質転換の前に接触させたときの、水和ダイズ胚の形質転換頻度に対するＰＥＧ処理の効果を示す。ダイズｃｖ．Ａ３５２５ダイズ胚を、米国特許出願公開第２００８／０２８０３６１号に記載された方法に従って切除し、ＳＤＷ中のＰＥＧ−４０００の多様な量と１時間接触させた。胚をＳＤＷで５〜６回すすぎ、米国特許第７，４０２，７３４号に記載された方法に従って形質転換した。胚を、元のＯｒｉＲｉ複製を有し、アグロバクテリウムのＡＢ３０株に含まれた２Ｔ形質転換ベクターで形質転換した。胚を、スペクチノマイシン選択培地で再生させた。表１４に示されているように、ＰＥＧ処理は、既に水和されたダイズ成熟胚のＴＦの増強に有用であるとは思われなかった。ＰＥＧ処理は乾燥胚および下記のトウモロコシ未熟胚で例示されているように未熟胚に有用でありうる。

実施例８

形質転換頻度に対する、同時培養の際のＰＥＧの使用の効果
この実施例は、形質転換頻度に対する、同時培養の際のＰＥＧ組成物の効果を示す。ダイズｃｖ．Ａ３５５５乾燥胚を、米国特許出願公開第２００８／０２８０３６１号に記載された方法に従って切除し、ＳＤＷに溶解した２０％ＰＥＧ−４０００と１時間接触させた。胚をＳＤＷで５〜６回すすぎ、米国特許出願公開第２００９／０１３８９８５号に記載された方法に従って形質転換した。胚を、元のＯｒｉＲｉ複製を有し、アグロバクテリウムのＡＢ３０株に含まれた２Ｔ形質転換ベクターで形質転換した。次に形質転換された細胞を、１、５、１０、または２０％ＰＥＧ４０００を含有するＩＮＯ培地で同時培養した。同時培養培地は１ｐｐｍのＴＤＺも含有した。胚を、スペクチノマイシン選択培地で再生させた。表１５に示されているように、ＰＥＧが同時培養培地に含まれている処理は、ＰＥＧが同時培養の前に使用された処理と比較して低いＴＦを生じた。このことは、形質転換の前のＰＥＧ処理が細胞の細菌仲介形質転換の適格性を改善するが、同時培養の際のＰＥＧはＴＦを低減すると思われることを示唆している。

実施例９

ＰＥＧと接触させたトウモロコシ胚の増強されたカルス生産
この実施例は、ＰＥＧおよび異なる量（％）のＰＥＧをカルス生産の改善のために使用できることを示す。トウモロコシの雌穂からトウモロコシ胚を、本開示の他の部分に記載されているように手作業で単離し、集めた。胚を、１ｍＬのＬｙｎｘ２３０４または異なる量のＰＥＧ８０００（Ｓｉｇｍａ Ｐ−２１３９）を含有する１ｍＬのＬｙｎｘ２３０４培地のいずれかに、６℃で４日間暗黒に保存した。それぞれの処理では４回の反復を実施した。続いて胚をカルス誘導培地Ｌｙｎｘ１０７４で約２週間培養した。Ｌｙｎｘ１０７４および２３０４培地の組成については表１７を参照すること。表１６に示されているように、対照処理（保存なし）では、単離の後にＬｙｎｘ２３０４培地で直接培養したとき、１００％の胚がカルスを生産した。１％または５％のＰＥＧ８０００に保存されたとき、僅かな率の胚がカルスを生産した。ＰＥＧなしの培地に保存されたとき、カルスを生産した胚はなかった（処理２）。１０または２０％のＰＥＧ８０００に保存された胚の１００％がカルスを生産した（処理５および６）。

実施例１０

この実施例は、植物細胞の適格性を改善するための、異なる分子量のＰＥＧの使用を示す。トウモロコシの雌穂からトウモロコシ胚を、本開示の他の部分に記載されているように手作業で単離し、集め、次に１ｍｌのＬｙｎｘ２３０４または異なる分子量の２０％ＰＥＧを含有する１ｍｌのＬｙｎｘ２３０４培地のいずれかに、６℃で４日間暗黒に保存した。続いてこれらをＬｙｎｘ１０７４で２週間培養して、カルス応答を観察した。表１８に示されているように、対照処理（保存なし）では、単離の後にＬｙｎｘ２３０４培地で直接培養したとき、１００％の胚がカルスを生産した。ＰＥＧ不在下で保存されなかった胚により形成されたカルスはなかったが、一般に全ての胚は、ＰＥＧと接触させたときカルスを生産した。更に、ＰＥＧの分子量が２００から８０００に増加すると、カルスの形成は増加した。

実施例１１

この実施例は、形質転換の前にＰＥＧと接触させたトウモロコシ胚の形質転換頻度における改善を例示する。トウモロコシ未熟胚を同系繁殖系ＬＨ２４４から本開示の他の部分に記載されているように手作業で単離し、処理に分けた。１つの処理の胚を、２０％Ｗ／Ｖ ＰＥＧ８０００を含有するＬｙｎｘ２３０４培地と１０分間接触させ、次に滅菌ｄｄＨ_２Ｏで３回洗浄した。別の処理は、胚単離の後にＰＥＧ処理を受けなかった。両方の処理にアグロバクテリウム（６６０ｎｍでＯＤ０．１）を５分間接種し、続いて米国特許第７、６８２，８２９号に記載されているように、選択および再生のために培養した。

表１９に示されているように、ＰＥＧと接触させた胚は、より多くの遺伝子導入部分、最終的にはより多くの遺伝子導入植物を生産し、トウモロコシ胚をＰＥＧと接触させることは、これらの形質転換適格性を改善することを示している。

実施例１２

この実施例は、植物細胞の適格性が、植物細胞をＰＥＧおよびオーキシンのような成長調整剤を含有する培地と接触させることによって改善されうることを示す。トウモロコシ未熟胚を同系繁殖系ＬＨ２４４から本開示の他の部分に記載されているように手作業で単離し、２．２ｍｇ／Ｌのピクロラム、２０％ＰＥＧ８０００（ｖ／ｖ）を含有する１ｍＬのＬｙｎｘ１８５４（表２０）またはＰＥＧ８０００なしのＬｙｎｘ１８５４のいずれかに４℃で６日間暗黒に保存した。続いて胚をカルス誘導培地Ｌｙｎｘ１０７４で約２週間培養した。図１は、Ｌｙｎｘ１８５４のみに保存した胚（右側パネル）と比較した、ＰＥＧおよびピクロラムを補充したＬｙｎｘ１８５４培地に保存した胚（左側パネル）のみからのカルス生産を例示する。

実施例１３

この実施例は、ＰＥＧおよび１つ以上の成長調整剤を含有する培地に保存したトウモロコシ胚の改善された形質転換を示す。トウモロコシ未熟胚を同系繁殖系ＬＨ２４４から本開示の他の部分に記載されているように手作業で単離し、処理に分けた。処理２を、２０％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ８０００、０．５ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ、０．０１ｍｇ／ＬのＢＡＰ（Ｓｉｇｍａ Ｂ−３４０８）を補充したＬｙｎｘ１４５２培地（表２１）に保存し、一方、処理３を、２０％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ、０．５ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ、２．２ｍｇ／ｌのピクロラムを補充したＬｙｎｘ１４５２に保存した。処理２および３を６℃で４日間暗黒に保存した。対照（処理１）では、胚を形質転換の前に保存せず、ＰＥＧまたは任意の成長調整剤と接触もさせなかった。保存した後、胚に１ｍＬのアグロバクテリウム培養懸濁液を５分間接種し、アグロバクテリウムを除去し、次に１ｍＬのアグロバクテリウム培養懸濁液を更に５分間再び接種した。続く培養および植物再生を、米国特許第７，６８２，８２９号に記載された方法に従って実施した。

表２２に示されているように、トウモロコシ胚を、ＰＥＧおよび１つ以上の成長調整剤を含有する培地と接触させることは、高い形質転換頻度をもたらした。

実施例１４

この実施例は、異なる温度で植物細胞の形質転換の適格性を改善するための、ＰＥＧ単独または成長調整剤と組み合わせたＰＥＧの使用を示す。トウモロコシ未熟胚を同系繁殖系ＬＨ２４４から本開示の他の部分に記載されているように手作業で単離し、２０％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ８０００を含有するＬｙｎｘ２３０４または２０％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ８０００および０．５ｍｇ／ｍｌの２，４−Ｄ＋０．０１ｍｇ／ｌのＢＡＰを含有するＬｙｎｘ２３０４のいずれかに保存した。これらを、米国特許第７，６８２，８２９号に記載された方法に従って形質転換する前に、４℃または２３℃で３日間暗黒に保存した。表２３に示されているように、Ｌｙｎｘ２３０４＋ＰＥＧまたはＬｙｎｘ２３０４＋ＰＥＧおよび成長調整剤の培地に４℃または２３℃で保存したトウモロコシ胚は、遺伝子導入植物を生産した。ＰＥＧおよび成長調整剤を含有する培地で保存したトウモロコシ胚は、ＢＡＰを含有しない培地で保存したものより多くの遺伝子導入植物を生産した。４℃で保存したトウモロコシ胚は、２３℃で保存したものより多くの遺伝子導入植物を生産した。

実施例１５

この実施例は、胚が異なる時間にわたって保存された場合における、植物細胞の形質転換の適格性を改善するための、成長調整剤と組み合わせたＰＥＧの使用を示す。トウモロコシ未熟胚を同系繁殖系ＬＨ２４４から本開示の他の部分に記載されているように手作業で単離し、２０％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ８０００、０．５ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ、０．０１ｍｇ／ｌのＢＡＰを含有するＬｙｎｘ２３０４に４℃で３、５、または７日間暗黒に保存した。次に胚を、米国特許第７，６８２，８２９号に記載された方法に従って形質転換した。表２４に示されているように、３、５、または７日間のいずれかで保存されたトウモロコシ胚は、遺伝子導入植物を生産した。３日間保存されたトウモロコシ胚は、ＰＥＧ８０００および成長調整剤を含有する培地で保存しなかったものより多くの遺伝子導入植物を生産した。

実施例１６

この実施例は、機械的に単離された植物細胞の適合性を改善するためのＰＥＧの使用を示す。トウモロコシ胚を米国特許第７，５６０，６１１号に記載されたように切除し、２０％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ８０００を含有するＬｙｎｘ２３０４に４℃で２日間暗黒に保存した。次に胚を、米国特許第７，６８２，８２９号に記載された方法に従って形質転換した。表２５に示されているように、機械的に切除したトウモロコシ胚は、２つの異なる実験において、保存の２日後に遺伝子導入植物を生産することができた。

実施例１７

この実施例は、植物細胞／組織への成長調整剤の効果的な送達が、植物細胞／組織を培養する前に、植物細胞／組織を、ＰＥＧおよびサイトカイニンのような成長調整剤を含有する培地と接触させることによって達成できることを示す。トウモロコシ未熟胚を同系繁殖系ＬＨ２４４から本開示の他の部分に記載されているように手作業で単離し、１ｍＬのＬｙｎｘ２３０４または２０％ＰＥＧ８０００（ｖ／ｖ）、５ｍｇのＢＡＰ（ｖ／ｖ）を含有する１ｍｌのＬｙｎｘ２３０４のいずれかに４℃で１４日間暗黒に保存した。次に胚外植片を、ＰＥＧを除去した後、発芽培地で平板培養した。Ｌｙｎｘ２３０４のみに保存した胚を平板培養する直前に、５ｍｇ／ｌのＢＡＰ（ｖ／ｖ）を保存管に加えた。続いて胚を、サイトカイニンを有さない発芽培地Ｌｙｎｘ１６０７（表２６）で約１週間培養した。図２は、ＢＡＰなしで保存した胚（左側パネル）と比較した、ＰＥＧおよびＢＡＰを補充したＬｙｎｘ２３０４培地に保存した胚（右側パネル）からの子葉鞘節の増強された毛状突起形成および膨潤を例示する。

実施例１８

この実施例は、植物細胞／組織を、ＰＥＧおよびサイトカイニンのような成長調整剤を含有する培地と接触させることによる植物細胞／組織の適格性の増強を更に示す。トウモロコシ未熟胚を同系繁殖系ＬＨ２４４から本開示の他の部分に記載されているように手作業で単離し、１ｍＬのＬｙｎｘ２３０４または２０％ＰＥＧ８０００（ｖ／ｖ）および２０ｍｇのＢＡＰ（ｖ／ｖ）を含有する１ｍｌのＬｙｎｘ２３０４のいずれかに４℃で３日間暗黒に保存した。続いて胚をカルス誘導培地Ｌｙｎｘ１０７４で約２週間培養した。図３は、ＰＥＧまたはＢＡＰなしで保存した胚（左上、左下のパネル）と比較した、ＰＥＧおよびＢＡＰを補充したＬｙｎｘ２３０４培地に保存した胚（右上、右下のパネル）からの改善された苗条形成を例示する。したがって、この実施例は、オーキシン含有カルス誘導培地（Ｌｙｎｘ１０７４）で培養する前、ＰＥＧおよびサイトカイニンと有効時間にわたって接触させた外植片ら生産された胚形成カルスからの、苗条および苗条様構造の増強された急速な再生も示す。

実施例１９

この実施例は、胚の保存における、ＰＥＧと比較した別の一般的に使用される凍害防御物質の浸透圧調節物質であるグリセロールの効果を示す。トウモロコシ未熟胚を同系繁殖系ＬＨ２４４から本開示の他の部分に記載されているように手作業で単離した。胚を、１ｍｌのＬｙｎｘ１８５４、２０％グリセロールを有し、ＰＥＧを有さないＬｙｎｘ１８５４、または２０％グリセロールおよび２０％ＰＥＧの両方を有するＬｙｎｘ１８５４を含有するエッペンドルフ管に移した。それぞれの培地に１本のエッペンドルフ管があった。３本の管を全て４℃で６日間保存した。このインキュベーション期間の後、管をインキュベーションから取り出し、それぞれの管の内容物を全て１０７４半固体培地に移し、続いて未熟胚を散布した（２０〜２５／プレート）。胚を１０７４で暗黒にインキュベートした７日後、培養応答を評価した。表２７に示されているように、培養反応は、ＰＥＧ単独を有する処理番号１においてのみ達成された。単独またはＰＥＧの組み合わせで存在するグリセロールは、いずれも、胚盤組織から培養応答がなかったので保存の際に負の効果を有した。

実施例２０

ＰＥＧと接触させたワタ細胞の増強された形質転換
この実施例は、滅菌水にＰＥＧを含有する組成物と接触させた乾燥ワタ胚の増強された形質転換を示す。ワタｃｖ．ＤＰ３９３−００５３種を、１０％クロロックス漂白剤で１０分間無菌化した。次にこれらを種乾燥機で一晩乾燥して、平均内部水分量の３．４％を達成した。最初にディスク型粉砕機のＧＰ１４０型（Ｍｏｄｅｒｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｐ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＩ）で種を加工し、次にＣｌｉｐｐｅｒ Ｅｃｌｉｐｓｅ ３２４（Ｃｌｉｐｐｅｒ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ａ．Ｔ．Ｆｅｒｒｅｌｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｂｌｕｆｆｔｏｎ，Ｉｎｄ）のような自動化篩い分け空気流分離装置で加工して、種皮、微粉および他の破片のような種の不要な部分の大部分を除去することにより、乾燥胚を乾燥種から切除した。保持した種材料を沸騰が止まるまで（約３０秒間）液体窒素に浸け、次に、米国特許出願公開第２００８／０２８０３６１号に記載されているように、追加的にスクリーンして、子葉、種皮および他の破片のような不要な材料から望ましい胚外植片材料を単離する前に、ディスク型粉砕機で再び加工した。乾燥胚を、滅菌水に溶解した２０％ＰＥＧ−４０００と１時間接触させた。胚をＲＯ水で４分間すすぎ、次に、米国特許第８，０４４，２６０号に記載された方法に従ってアグロバクテリウム仲介形質転換に付した。胚を、スペクチノマイシン選択培地で再生させた。表２８に示されているように、２０％ＰＥＧ組成物と接触させた胚は、一般に、ＩＮＯ培地（ＰＥＧなし）と接触させた胚と比較して増強された形質転換頻度を示した。ワタのスペクチノマイシン選択培地の組成については表２９を参照すること。

Claims (32)

1. 植物細胞を形質転換の前に有効量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）含有組成物と接触させることを含む、前記植物細胞の細菌仲介形質転換の適格性を改善する方法であって、前記植物細胞が成熟胚細胞または未成熟胚細胞であり、前記ポリエチレングリコールの有効量が１〜２５容量％である方法。
2. 前記ポリエチレングリコールの前記有効量が５〜２５容量％である、請求項１に記載の方法。
3. 前記ポリエチレングリコールの前記有効量が２０容量％である、請求項２に記載の方法。
4. 前記ポリエチレングリコールの分子量が２００〜１００００である、請求項１に記載の方法。
5. 前記ポリエチレングリコールの分子量が４０００〜８０００である、請求項４に記載の方法。
6. 有効量の少なくとも１つの植物成長調整剤が前記ポリエチレングリコール含有組成物と共に提供される、請求項１に記載の方法。
7. 前記植物成長調整剤が、オーキシン、サイトカイニン、またはこれらの組み合わせを含む、請求項６に記載の方法。
8. 前記オーキシンが、ＩＡＡ、２，４−Ｄ、ＮＡＡ、ＩＢＡ、ジカンバ、またはこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
9. 前記オーキシンの量が０．００１ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌである、請求項７に記載の方法。
10. 前記サイトカイニンが、ＢＡＰ、ゼアチン、カイネチン、ＴＤＺ、またはこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
11. 前記サイトカイニンの量が０．００１ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌである、請求項７に記載の方法。
12. 前記ポリエチレン含有組成物が前記植物細胞と３０分〜１０日間接触させられる、請求項１に記載の方法。
13. 前記ポリエチレン含有組成物が前記植物細胞と３日〜１０日間接触させられる、請求項１２に記載の方法。
14. 前記ポリエチレン含有組成物が前記植物細胞と３０分〜３００分間接触させられる、請求項１２に記載の方法。
15. 前記植物細胞を全植物に再生させることを更に含む、請求項１に記載の方法。
16. 前記植物細胞が、トウモロコシ、ダイズ、ワタ、カノーラ、サトウギビ、タマネギ、メロン、サトウダイコン、またはコムギの細胞を含む、請求項１に記載の方法。
17. 前記細菌仲介形質転換が、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）仲介、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）仲介、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）仲介、メソリゾビウム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）仲介、またはブラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）仲介形質転換である、請求項１に記載の方法。
18. 前記ポリエチレングリコールと接触させた前記植物細胞を、形質転換の前に非ＰＥＧ含有組成物においてすすぐステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
19. 前記ポリエチレングリコール含有組成物中のポリエチレングリコールの有効量が１０容量％〜２５容量％である、請求項２に記載の方法。
20. 前記ポリエチレングリコール含有組成物中のポリエチレングリコールの有効量が１０容量％〜２０容量％である、請求項１に記載の方法。
21. 前記植物細胞がトウモロコシ、ダイズまたはワタの種子からのものである、請求項１に記載の方法。
22. 植物胚細胞の細菌仲介形質転換の適格性を改善する方法であって、
    （ａ）植物の胚外植片を５容量％〜２５容量％のポリエチレングリコールを有する有効量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）含有組成物と接触させ；ついで
    （ｂ）前記植物の胚外植片の少なくとも１個の細胞を細菌仲介形質転換を介して異種ＤＮＡで形質転換することを含み、
    ここに前記形質転換するステップ（ｂ）を前記接触させるステップ（ａ）の後に行い、前記ＰＥＧ含有組成物を前記形質転換するステップ（ｂ）の前に除去し、および改善された適格性を形質転換頻度における増強として測定する方法。
23. 前記植物の胚外植片の少なくとも１個の形質転換した細胞が分裂組織細胞である、請求項２２に記載の方法。
24. 前記植物の胚外植片が乾燥種から切除される、請求項２２に記載の方法。
25. 前記植物の胚外植片がダイズ、トウモロコシまたはワタの種子からのものである、請求項２２に記載の方法。
26. 前記植物の胚細胞が成熟植物胚からのものである、請求項２２に記載の方法。
27. 前記植物の胚細胞が未成熟植物胚からのものである、請求項２２に記載の方法。
28. 前記ＰＥＧ含有組成物を、形質転換するステップ（ｂ）の前に非ＰＥＧ含有組成物で植物の胚外植片をすすぐことによって除去する、請求項２２に記載の方法。
29. 前記接触させるステップ（ａ）におけるＰＥＧ含有組成物が１０容量％〜２５容量％のポリエチレングリコールを有する、請求項２２に記載の方法。
30. 前記細菌仲介形質転換が、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）仲介、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）仲介、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）仲介、メソリゾビウム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）仲介、またはブラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）仲介の形質転換である、請求項２２に記載の方法。
31. 前記細菌仲介形質転換がアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）仲介の形質転換である、請求項３０に記載の方法。
32. 前記形質転換するステップ（ｂ）を、植物の胚外植片の事前のカルス誘導なしで行う、請求項２２に記載の方法。

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