CN103421889A

CN103421889A - 一种改良水稻粒型和粒重的方法

Info

Publication number: CN103421889A
Application number: CN2012103798688A
Authority: CN
Inventors: 何予卿; 孙亮
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2012-10-09
Filing date: 2012-10-09
Publication date: 2013-12-04
Anticipated expiration: 2032-10-09
Also published as: CN103421889B

Abstract

本发明属于水稻分子辅助育种技术领域，具体涉及一种利用聚合粒型QTL从而获得不同籽粒大小不同粒重材料的方法。本发明采用一次杂交、三次回交和一次自交的育种程序，将目标粒型QTL导入到待改良的水稻品种中，建立多个在改良品种遗传背景下的近等基因系；再根据近等基因系之间的两两杂交，将目标QTL聚合到待改良的材料中，并对遗传背景进行筛选，获得使除开目标基因区段之外，改良型品种的基因组与原品种相同的单株；同时借助分子标记辅助选择，根据与目标粒型QTL紧密连锁的分子标记，判断目标QTL的基因型。根据上述方案获得呈现不同籽粒大小不同粒重的水稻品系。

Description

一种改良水稻粒型和粒重的方法

技术领域

本发明属于水稻分子辅助育种技术领域，具体涉及一种利用聚合粒型QTL从而获得不同籽粒大小不同粒重材料的方法，并为改良水稻的外观品质和粒重提供当前优质品种改良育种的适合材料。

背景技术

产量和品质是水稻育种的两个主要目标。千粒重和谷粒粒型都是籽粒的固有生物学属性，其中千粒重是重要的产量构成因子，谷粒粒型是重要的外观品质性状，均具有重要的经济学性状。粒型包括粒长、粒宽和粒厚性状，粒重常用千粒重衡量。水稻谷粒大小是一个重要的农艺性状。谷粒大小还是一个重要的稻米外观品质性状，稻米外观品质的好坏直接关系稻米商品性的好坏。中国在1999年颁布的优质稻谷标准中对稻米粒长与粒宽的比值作了具体规定，认为优质的籼稻品种的稻米长宽比必须大于等于2.8。粒重和粒长、粒宽、粒厚等性状呈极显著正相关(邢永忠等，2001，植物学报43:840-845)，而粒重又是水稻产量的三个主要构成因子之一，粒型是该性状的重要决定因素。粒型的遗传基础比较复杂，是典型的数量性状。利用分子标记技术可以对控制数量性状的QTL（Quantitative Trait Loci）进行定位和分解，将复杂的数量性状分解为简单的孟德尔因子来进行研究。但是目前千粒重常与其它产量构成因子一起研究，而粒型往往作为外观品质性状被单独加以研究，尚缺乏对千粒重与粒型关系的研究。另外，在众多研究中发现，许多相关性状的QTL往往也是相关的，它们经常定位于同一区域。因此，在育种中导入某一片段以改良某一性状时，会出现因连锁累赘或一因多效的缘故损失优良性状。所以，在育种中达成外观品质与产量的协调，显然是需要对粒型与千粒重这种相关性状之间的关系有一个全面的了解。本发明正是基于这一相关性进行的研究。

本发明的遗传学背景的重要方面在于：1）水稻粒型、千粒重可以分解为粒长、粒宽和粒厚等多个QTL；2）水稻粒型QTL具有多效性，同时影响不同性状，如本发明中的粒型QTL可影响粒型及粒重；3）通过分子标记辅助选择可以将不同粒型QTL聚合，获得不同籽粒大小（含粒长、粒宽和粒厚等），不同籽粒重量的材料，为改良水稻的外观品质和粒重产量性状奠定重要的遗传基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过聚合粒型QTL有效改良水稻粒型和粒重的方法，以达到利用聚合粒型QTL从而获得不同籽粒大小不同粒重材料，为改良水稻的外观品质和粒重提供当前优质品种改良育种的适应材料的目的。

本发明的总体技术方案包括通过常规杂交、回交和分子标记辅助选择的方法。即采用一次杂交和三次回交的育种程序。先建立多个在待改良品种A遗传背景下的不同粒型QTL的近等基因系；再将上述的粒型近等基因系之间进行相互杂交的方式，将目标粒型QTL聚合到待改良品种A中。同时对聚合材料的遗传背景进行背景筛选，获得使除开目标QTL区段之外，改良型品种的基因组与原品种相同的单株。借助分子标记辅助选择，根据与目标粒型QTL紧密连锁的分子标记，判断目标QTL的基因型。根据上述方案获得呈现不同籽粒大小不同粒重的水稻品种，从而实现本发明的目的（总体技术思路见图1）。

根据本发明的技术思路，我们将三个粒型QTL聚合到了珍汕97B遗传背景中，获得了一个聚合了三个粒型QTL并且遗传背景主要是珍汕97B的材料：即水稻（Oryza sativa）NIL(SLG/H94)，申请人于2012年9月27日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏编号为CCTCC

P201209。根据这个材料的自交，获得了一个分离群体，在分离群体中，通过上述三个粒型QTL连锁的分子标记的基因型筛选目的单株。

上述珍汕97B背景下聚合三个粒型QTL的材料，水稻（Oryza sativa）NIL(SLG/H94)的获得通过以下三个步骤（如图2）：

（1）以两个不同的粒型QTL：以水稻材料SLG（上海市农业生物基因中心罗利军研究员惠赠）为供体亲本，以水稻材料珍汕97B（江西省农业科学院颜龙安院士选育和惠赠）为轮回亲本，通过三次回交将两个粒型QTL（qGW2a和qGL3）导入水稻珍汕97B中，构建两个珍汕97B遗传背景下的粒型QTL的近等基因系NIL；同时借助NIL(H94)作为第三个粒形QTL的供体亲本NIL(qGS5)来源于水稻品种珍汕97B和H94（上海市农业生物基因中心罗利军研究员惠赠）组合衍生的重组自交系，其中NIL(H94)为qGS5的近等基因系,申请人于2010年5月27日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏编号为CCTCC NO：P201007；

（2）以上述三个珍汕97B背景下三个粒型QTL的近等基因系NILs(qGL3)、NIL(qGW2a)和NIL(qGS5)为杂交亲本，将含有qGL3的近等基因系NILs(qGL3)和含有qGW2a的近等基因系NIL(qGW2a)杂交得到聚合qGL3和qGW2a的材料NIL(qGL3/qGW2a)，同时将将含有qGW2a的近等基因系NIL(qGW2a)和含有qGS5的近等基因系NIL(qGS5)进行杂交得到聚合qGW2a和qGS5的材料NIL(qGW2a/qGS5)，再将获得的两个聚合两个粒型的近等基因系NIL(qGL3/qGW2a)和NIL(qGW2a/qGS5)作为杂交亲本，将这三个QTLs同时聚合在珍汕97B内，获得最终的品系水稻（Oryza sativa）NIL(SLG/H94)，其保藏号为CCTCC P201209；

（3）以上述（1）步和（2）步中所获得的杂交后代为材料，根据与目标QTL紧密连锁的分子标记，对（1）步和（2）的每一次杂交后代进行PCR选择，严格控制杂交的精准度；

（4）以上述（2）步获得的杂交后代NIL(SLG/H94)为材料，以珍汕97B作对照进行遗传背景检测；

（5）步骤（3）中所述的与目标QTL紧密连锁的分子标记的核苷酸序列分别如序列表SEQ IDNO:1,SEQID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ IDNO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12所示；

本发明中所涉及到的PCR技术中水稻基因组DNA提取采用CTAB法（邢永忠,1999），具体如下：选取0.5g鲜嫩叶片，装于1.5ml离心管，于-20°C储存备用。将本发明中所涉及到的水稻材料叶片倒于研钵中，加入800μl 1.5%的CTAB缓冲液（1.5%CTAB配方：CTAB粉末15g/L；EDTA20mmol/L；pH=8.0Tris-HCl100mmol/L；NaCl1.4mol/L），磨成匀浆。65°C水浴30分钟，每隔5min轻摇一次。加入等体积的氯仿:异戊醇（体积比为24:1）轻摇，混匀30分钟。8,000r/min离心10min，轻轻取出，吸取上清至新的1.5ml的离心管中，加入两倍体积的冰冻无水乙醇，上下翻转数次混匀，冰浴30min。10,000r/min离心10min，小心的倒去上清，加750μ1漂洗液（75%乙醇），漂洗一次。倒掉漂洗液，于室温下晾干至透明无色。视DNA量，酌情加入去离子水溶解DNA，-20°C保存备用。

上述步骤（3）所述的PCR选择步骤为：

1）PCR扩增反应体系：反应总体积为20ul，提取各待测水稻单株的总DNA，依据与目标基因共分离或紧密连锁的分子标记设计正向引物，其核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ IDNO:5,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:11所示，其反向引物的核苷酸序列分别如序列表SEQ IDNO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:12所示，各0.25um，Taq DNA 聚合酶1U，dATP，dTTP，dCTP，dGTP各0.1mM，Tris-HCl（pH8.0）和KCl各10mM，以及MgCl2各2mM；

2）PCR反应程序：94℃变性4分钟后进入PCR循环扩增，循环扩增包括94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共三步，共循环运行30~34次，最后在72℃延伸10分钟后，25℃保温4分钟

3）PCR产物检测：采用如下步骤对PCR产物进行检测：a）用2％的琼脂糖凝胶电泳检测，点样后，在250V直流电压电泳23~34分钟，溴化乙啶染色约1个小时左右后置于紫外灯下，读取各样品的PCR带型；或b）4%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，上样后，在90W的恒定功率下电泳2~4个小时，揭下凝胶，通过银染的方法：用AgNO3溶液染色10分钟后在含有1%的甲醛的NaOH溶液中显色8~10分钟，读取各样品的PCR带型，根据这两种方法确定各样品的分子标记基因型，从而判断出目标QTL的基因型。

本发明的优点在于：

1、运用PCR技术，通过分子辅助选择对回交后代的单株进行基因型的正向的目标选择和反向的遗传背景选择，从而达到固定目的性状且不改变待改良品种A的遗传背景的目的，为基础研究提供了一定的研究思路和研究方法，为其它作物育种提供了技术借鉴。

2、本发明在将三个粒型QTL（qGL3、qGW2a和qGS5）聚合到珍汕97B的实施中，中获得了珍汕97B遗传背景下但具有不同外观品质和粒重的材料。它们可以直接用于育种，并可准确的改良水稻的外观品质和粒重，适应当前优质水稻品种育种的需要。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是扩增分子标记C62正向引物的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：2是扩增分子标记C62反向引物的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：3是扩增分子标记C88正向引物的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：4是扩增分子标记C88反向引物的核苷酸序列。

序列表SEQ IDNO：5是扩增分子标记YP2正向引物的核苷酸序列。

序列表SEQ IDNO：6是扩增分子标记YP2反向引物的核苷酸序列。

序列表SEQ IDNO：7是扩增分子标记SW1正向引物的核苷酸序列。

序列表SEQ IDNO：8是扩增分子标记SW1反向引物的核苷酸序列。

序列表SEQ IDNO：9是扩增分子标记SR37正向引物的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：10是扩增分子标记SR37反向引物的核苷酸序列。

序列表SEQ IDNO：11是扩增分子标记SR49正向引物的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：12是扩增分子标记SR49反向引物的核苷酸序列。

图1.是本发明的描述总体技术思路流程图。

图2.是本发明的具体实施过程中的技术流程。其中RIL(珍汕97×SLG)是是珍汕97B（江西省农业科学院颜龙安院士选育和惠赠）和SLG（上海市农业生物基因中心罗利军研究员惠赠）组合衍生的重组自交系群体；RIL(珍汕97×H94)是珍汕97B（江西省农业科学院颜龙安院士选育和惠赠）和H94（上海市农业生物基因中心罗利军研究员惠赠）组合衍生的重组自交系群；NIL(qGL3)是粒型QTL(qGL3)的在珍汕97B遗传背景下的近等基因系，NIL(qGW2a)是粒型QTL(qGW2a)的在珍汕97B遗传背景下的近等基因系，NIL(qGS5)即NIL(H94)是粒型QTL(qGS5)的在珍汕97B遗传背景下的近等基因系；

图3.是本发明实例中所用到的三个粒型QTL在水稻染色体上的位置。其中qGWa2位于第二染色体的段臂端，qGL3位于第三染色体的长臂端，而qGS5位于第五染色体的段臂端；

图4.是本发明实例中得到珍汕97B背景下不同粒型大小的品种，其中a为粒长的表型对照，b为粒宽的表型对照，（Line1为珍汕97B对照，Line2为ZS(qGL3)，Line3为ZS(qGW2a)，Line4为ZS(qGS5)，Line5为ZS(qGL3/qGW2a)，Line6为ZS(qGL3/qGS5)，Line7为ZS(qGS5/qGW2a)，Line8为ZS(qGL3/qGW2a/qGS5)）。

图5.是本发明实例中所用到的分子标记具体PCR产物检测的胶图。其中，C62，C88，YP2，SW1和SR49是使用上述PCR产物检测中（2）4%聚丙烯酰胺凝胶（PAGE胶）电泳检测的方法；而SR37则是使用上述PCR产物检测中（1）2％的琼脂糖凝胶检测的方法；

具体实施方式

以下实施例进一步定义本发明，并描述了在珍汕97B背景下聚合三个粒型QTL:qGL3，qGW2a和qGS5的近等基因系材料的构建，与QTL位点紧密连锁的分子标记的制备、对聚合材料的遗传背景检测和最后分获得的各种粒型QTL纯和位点组合的材料。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明本质和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1：近等基因系的构建

1.1：目标三个粒型QTL的遗传效应分析

在本发明的实施过程中利用了三个华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室发现的粒型QTL：第二染色体上控制粒宽的qGW2a，第三染色体上控制粒长的qGL3和第五染色体上控制粒宽的qGS5，具体在水稻基因组上的位置大致如图3所示（见马大鹏，2005；Li et al.2011）。其中qGW2a是控制粒宽的主效位点，它能解释群体粒宽变异的66.7%；qGL3是控制粒长的主效QTL，它能解释群体粒长变异的59.8%,；qGS5它能解释群体粒宽变异的36.2%（表1）。在对这三个粒型QTL之间的互作的研究中发现，位点之间不存在任何上位性效应，但存在巨大的加性效应，它们之间的加性效应可解释粒长变异的67.7%，粒宽的80.7%，粒厚的70.6%和粒重的74.1%。

表1：3个RILs群体检测到的各自的粒型QTLs位点

1.2：将三个粒型QTL聚合到珍汕97B中

根据图2的技术路线，从水稻品种珍汕97B（江西省农业科学院颜龙安院士选育和惠赠）和SLG（上海市农业生物基因中心罗利军研究员惠赠）组合衍生的重组自交系群体里选择含有主效粒型QTL位点qGL3和qGW2a，且63%遗传背景与珍汕97B一致的家系，与珍汕97B杂交并连续与珍汕97回交3代，自交1代，构建了两个水稻粒型QTL的近等基因系NIL(qGL3)和NIL(qGW2a)。另外，先前华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室发现的水稻第五染色体粒宽数量性状位点qGS5的近等基因系NIL(H94)，来源于珍汕97B（江西省农业科学院颜龙安院士选育和惠赠）和H94（上海市农业生物基因中心罗利军研究员惠赠）组合衍生的重组自交系群该近等基因系，水稻水稻（Oryza sativa）NIL(H94)已于2010年5月27日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为CCTCC NO.P201007。将这三个粒型近等基因系作为杂交亲本，聚合这三个粒型QTL，得到三个位点全部为杂合，且遗传背景基本上是珍汕97B的杂种材料F1。该材料即水稻（Oryza sativa）NIL(SLG/H94)，于2012年9月27日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏号为CCTCC P201209。

具体实施步骤如下：

（1）以两个不同的粒型QTL：SLG为供体亲本，以珍汕97B为轮回亲本，通过三次回交将两个粒型QTL导入水稻珍汕97B中，构建两个珍汕97B遗传背景下的粒型QTL的近等基因系NIL；同时借助NIL(H94)作为第三个粒形QTL的供体亲本NIL(qGS5)；

（2）以上述三个珍汕97B背景下三个粒型QTL的近等基因系（如图2中的NILs(qGL3)、NIL(qGW2a)和NIL(qGS5)）为杂交亲本，将含有qGL3的近等基因系NILs(qGL3)和含有qGW2a的近等基因系NIL(qGW2a)杂交得到聚合qGL3和qGW2a的材料NIL(qGL3/qGW2a)；同时将含有qGW2a的近等基因系NIL(qGW2a)和含有qGS5的近等基因系NIL(qGS5)杂交得到聚合qGW2a和qGS5的材料NIL(qGW2a/qGS5)；

（3）以上述获得的两个聚合两个粒型的近等基因系NIL(qGL3/qGW2a)和NIL(qGW2a/qGS5)作为杂交亲本，将这三个个QTLs同时聚合在珍汕97B内，获得NIL(SLG/H94)。

实施例2：与QTL紧密连锁的分子标记的制备及标记基因型鉴定方法

2.1与QTL紧密连锁的分子标记的制备

本发明中所用到的SSR标记的序列及位置等信息全部来自于Gramene网站数据库

(http://www.gramene.org/)。还根据网上公布的粳稻品种Nipponbare的基因组序列(http://rgp.dna.affrc.go.jp)以及籼稻品种93-11（籼稻品种93-11为公共数据库资源）的基因组序列（参见：http://rise.genomics.org.cn/)作为比对，来寻找和设计和多态性标记。标记设计的原则是：在上述粳稻品种Nipponbare的基因组序列与籼稻品种93-11的基因组序列两者间存在5-10bp缺失或插入的、PCR片段大约有200-400bp。根据华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室的发现的QTL定位结果（见：马大鹏，2005）的基础上，针对qGL3和qGW2a寻找了两对新的SSR(Simple Sequence Repeat)标记，其中YP2和SW1是和qGW2a紧密连锁的SSR标记（YP2的PCR扩增引物正向序列如序列表SEQ ID NO：5所示，反向序列如SEQ ID NO：6所示;SW1的PCR扩增引物正向序列如序列表SEQ ID NO：7所示，反向序列如SEQ ID NO：8所示），SR37和SR49是与qGL3紧密连锁的SSR标记（SR37的PCR扩增引物正向序列如序列表SEQ ID NO：9所示，反向序列如SEQ IDNO：10所示；SR49的PCR扩增引物正向序列如序列表SEQ ID NO：11所示，反向序列如SEQ ID NO：12所示）。同时根据华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室关于水稻粒宽基因GS5的克隆（见：Li etal.2011）的结果，挑选了两对STS(简单序列标签)引物，即：C62和C88（C62的PCR扩增引物正向序列如序列表SEQ ID NO：1所示，反向序列如SEQ ID NO：2所示；C88的PCR扩增引物正向序列如序列表SEQID NO：3所示，反向序列如SEQ ID NO：4所示）。这三个粒型QTL连锁的分子标记在PCR检测中具体部分胶图见图5

2.2标记基因型鉴定方法

PCR程序参见萨姆布鲁克等，2002，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社介绍的方法，并按照华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室的条件和要求，做了修改：

PCR扩增反应：反应总体积为20ul，各待测单株的DNA各10~50ng，依据与目标基因共分离或紧密连锁的分子标记设计的特异正向引物（序列如序列表SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ IDNO:7,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:11所示）和反向引物（序列如序列表SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:12所示）各0.25um，Taq DNA聚合酶1U，四种脱氧核糖核苷酸dATP，dTTP，dCTP，dGTP各0.1mM，Tris-HCl（pH8.0）和KCl各10mM，以及MgCl₂各2mM。

PCR反应程序：首先在94℃变性4分钟后进入PCR循环扩增，循环扩增包括94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共三步，共循环运行30~34次，最后在72℃延伸10分钟后，25℃保温4分钟。

PCR产物检测：本发明使用到的PCR产物检测：a）2％的琼脂糖凝胶电泳检测：点样后，在250V直流电压电泳23~34分钟，溴化乙啶染色约1个小时左右后置于紫外灯下，读取各样品的PCR带型；或b）4%聚丙烯酰胺凝胶（PAGE胶）电泳检测：上样后，在90W的恒定功率下电泳2~4个小时，揭下凝胶，通过银染的方法（AgNO₃溶液染色10分钟后在含有1%的甲醛的NaOH溶液中显色8~10分钟）读取各样品的PCR带型。根据这两种方法确定各样品的分子标记基因型，从而判断出目标QTL的基因型。

实施例3本发明在水稻育种中应用

3.1本发明制备分子标记在正向和反向选择中的应用

本发明中涉及到多个杂交后代，根据分子辅助选择方法，以本发明中所涉及到的所有获得的杂交后代为材料，根据与目标QTL紧密连锁的分子标记，进行PCR选择，严格控制杂交的精准度。其中，与目标QTL紧密连锁的分子标记的核苷酸序列的如实施例2.1中所描述的。具体为：C62和C88是qGS5的紧密连锁标记，用于正向选择该粒型QTL。YP2和SW1是qGW2a的紧密连锁标记，用于正向选择该粒型QTL。SR37和SR49是qGL3的紧密连锁标记，用于正向选择该粒型QTL。

本发明还基于PCR技术鉴定最终获得的聚合材料的遗传背景用于反向选选择，在反向选择中，以珍汕97B为对照，所有SSR标记作为筛选工具，所有用于筛选背景的SSR标记分为RM系列和MRG系列（标记设计基于美国孟三都公司所公布的水稻基因组序列信息，其中RM标记的参考文献为Temnykh et al.(2000,2001)而MRG标记的参考文献为McCouch et al.2002），进行遗传背景检测。

3.2通过本发明获得在珍汕97B遗传背景下不同粒型不同粒重的遗传材料

根据实施例2中本发明上述步骤，获得的在珍汕97B遗传背景下聚合三个粒型QTL的杂种F1，使其进行自交繁种得到一个分离群体。在该分离群体内，根据三个粒型位点紧密连锁的分子标记，寻找表现为不同粒型和粒重的材料。并对这些种子套袋收取自交种，自然干燥后置于室温下至少放置3个月以上以保证谷粒的干燥相对一致。后对这些材料考察粒型和粒重数据，粒型数据通过粒长、粒宽和粒厚表示，粒重数据用水稻谷粒千粒重来描述（具体的表型数据见表2，具体的表型示例见图4）。在表2中，Line1表示珍汕97B对照，Line2表示单独聚合了qGL3的材料，Line3表示单独聚合了qGW2a的材料，Line4表示单独聚合了qGS5的材料，Line5表示同时聚合了qGL3和qGW2a的材料，Line6表示同时聚合了qGL3和qGS5的材料，Line6表示同时聚合了qGS5和qGW2a的材料，Line8表示将三个粒型QTL同时聚合在珍汕97B中。上述所有的材料（Line1~Line8）均为从聚合杂种F1中分离出来且各QTL的标记基因型为纯和。这些材料可直接用于生产为传统育种提供具有不同谷粒粒型，不同谷粒粒重的育种材料。

表2：8种纯合基因型的粒型和粒重

表2的说明：A表示QTL为珍汕97提供；B表示为SLG；C表示H94

附录1：有关本发明所涉及的分子标记的来源资料说明：

（1）序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2是分子标记C62的核苷酸序列的引物对的序列

C62是qGS5紧密连锁的一侧标记，位于第五染色体3083310~3443935，

正向引物：GATTGACTGATAAATTGACAGC，22bp，序列见SEQ ID NO：1；

反向引物：CTAACTCCCATGGAATTAC，19bp，序列见SEQ ID NO：2。

所在的水稻BAC号为GenBank:AC087425.2；

下载地址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/AC087425.2。

（2）序列表SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4是分子标记C88的核苷酸序列的引物对的序列。

C88是qGS5紧密连锁的一侧标记，位于第五染色体3083310~3443935，

分为正向引物：GTGGAGCGAGAGAGGTCACTG，21bp，序列见SEQ IDNO：3；

反向引物：CTAACGGATGTGGATTATCTG，21bp，序列见SEQIDNO：4。

所在的水稻BAC号为GenBank:AC093492.3；

下载地址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/AC093492.3

（3）序列表SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：6是分子标记YP2的核苷酸序列的引物对的序列。

YP2是qGW2a紧密连锁的一侧标记，位于第二染色体7981449~9881541；

正向引物：CGAGAGCGAAACATTTCTAC，20bp，序列见SEQ IDNO：5；

反向引物：CTCACAGGCTAGCCAGAATC，20bp，序列见SEQ IDNO：6。

所在的水稻BAC号为GenBank:AP005613.2,

下载地址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/AP005613.2

（4）序列表SEQ ID NO：7和SEQ IDNO：8是分子标记SW1的核苷酸序列的引物对的序列。

SW12是qGW2a紧密连锁的一侧标记，位于第二染色体7981449~9881541；

正向引物：TTATGCCATGTGGTCCAATCAGC，23bp，序列见SEQ ID NO：7；

反向引物：ATTTGAACCATTTGGGCCTTGG，21bp，序列见SEQIDNO：8。

所在的水稻BAC号为GenBank:AP005007.3，

下载地址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/AP005007.3

（5）序列表SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10是分子标记SR37的核苷酸序列的引物对的序列。

SR37是qGL3紧密连锁的一侧标记，位于第三染色体21429267~25112696；

正向引物：CCAAACATGGCCTTGTAGTAGACG，24bp，序列见SEQ IDNO：9；

反向引物：CTGTGGCTATGCCTTTGGTTGG，22bp，序列见SEQ ID NO：10。

所在的水稻BAC号为GenBank:AL731878.4；

下载地址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/AL731878.4。

（6）序列表SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12是分子标记SR49的核苷酸序列的引物对的序列。

SR49是qGL3紧密连锁的一侧标记，位于第三染色体21429267~25112696；

正向引物：GTAGGAAATTCTTCGCCAGATGC，23bp，序列见SEQ ID NO：11；

反向引物：CCGAGACTTGGAACAATCTTAGGC，24bp，序列见SEQ ID NO：12。

所在的水稻BAC号为GenBank:AC133333.5，

下载地址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/AC133333.5。

参考文献：

1、马大鹏，2005，硕士学位论文，华中农业大学图书馆，和中国知网：http://www.cnki.net/KCMS/detail/detail.aspx?dbcode=CMFD&QueryID=9&CurRec=1&dbname=CMFD9908&filename=2005153480.nh&urlid=&yx=&uid=WEEvREcwSlJHSldTTGJhYlRGMlJzR005N05iWUozenNwZmtoSE1jYWplT0lVYXhDWlcwdTkwcHR4eVY3c3RNbw==

2、Li YB,Fan CC,Xing YZ,Jiang YH,Luo LJ,Sun L,Shao D,Xu CJ,Li XH,Xiao JH,He YQ,Zhang QF(2011)Natural variation in GS5plays an important role in regulating grain size and yield in rice.Nat Genet 43:1266–1269.

3、邢永忠，1999，博士学位论文，华中农业大学图书馆，和中国知网：http://ww.cnki.net/KCMS/detail/detail.aspx?dbcode=CDFD&QueryID=9&CurRec=1&dbname=CDFD9908&filename=2004050762.nh&urlid=&yx=&uid=WEEvREcwSlJHSldTTGJhYkdWKzNWVW1tMnc 1bGdTUjlqRjkzMWpUZk1sQnBIenNjV0ZoM0lQbE91RVlJeHByKw==

4、萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，北京，2002年版

5、Temnykh S,Park WD,Ayres N,Cartihour S,Hauck N,Lipovich L,Cho YG,IshiiT,McCouch SR(2000)Mapping and genome organization of microsatellite sequences in rice(Oryza sativa L.).Theor Appl Genet 100:697–712.

6、Temnykh S,Declerck G,LuashovaA,Lipovich L,Cartinhour S,McCouch SR(2001)Computational andexperimental analysis of microsatellites in rice(OryzasativaL.),frequency,length variation,transposonassociations,and genetic marker potential.Genome Res11:1441-1452.

7、McCouch SR,Teytelman L,Xu Y，Lobos KB,Clare K,Walton M,Fu B,Mahirang R,Li Z,Xing Y，Zhang Q,Kono I,Yano M,Fjellstrom R,DeClerck G,Schneider D,Cartinhour S,Ware D,Stein L(2002)Developmentand mapping of 2240new SSR markers forrice(Oryza sativaL.).DNA Res 9:199-207。

Claims

1.一种改良水稻粒型和粒重的方法，其特征在于；通过聚合粒型QTL方法，采用一次杂交、三次回交和一次自交的育种程序，将不同的粒型QTL导入到待改良品种A中，通过改良待改良品种A的粒型同时改良其粒型和粒重性状：首先建立该待改良品种A的遗传背景下不同的粒型QTL的多个近等基因系，再以这些粒型QTL的近等基因系为杂交亲本，通过这些近等基因系之间相互杂交，将目标QTL聚合到待改良品种A中，同时对上述的杂交后代进行遗传背景筛选，获得除目标QTL区段之外，待改良品种A的基因组与原品种相同的单株；根据与目标粒型QTL紧密连锁的分子标记，判断目标QTL的基因型，获得不同籽粒大小和不同粒重的水稻品系；

其中：

所述的通过聚合三个粒型QTL改良珍汕97B的粒型和粒重步骤如下：

（1）以两个不同的粒型QTL：水稻SLG为供体亲本，以水稻珍汕97B为轮回亲本，通过三次回交将两个粒型QTL即qGW2a和qGL3导入水稻珍汕97B中，构建两个珍汕97B遗传背景下的粒型QTL的近等基因系NIL；同时借助NIL(H94)作为第三个粒形QTL的供体亲本NIL(qGS5)来源于水稻品种珍汕97B）和H94组合衍生的重组自交系，其中NIL(H94)为qGS5的近等基因系保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏编号为CCTCC P201007；

（2）以上述三个珍汕97B背景下三个粒型QTL的近等基因系NILs(qGL3)、NIL(qGW2a)和NIL(qGS5)为杂交亲本，将含有qGL3的近等基因系NILs(qGL3)和含有qGW2a的近等基因系NIL(qGW2a)杂交得到聚合qGL3和qGW2a的材料NIL(qGL3/qGW2a)，同时将将含有qGW2a的近等基因系NIL(qGW2a)和含有qGS5的近等基因系NIL(qGS5)进行杂交得到聚合qGW2a和qGS5的材料NIL(qGW2a/qGS5)，再将获得的两个聚合两个粒型的近等基因系NIL(qGL3/qGW2a)和NIL(qGW2a/qGS5)作为杂交亲本，将这三个QTLs同时聚合在珍汕97B内，获得最终的品系水稻（Oryza sativa）NIL(SLG/H94)，其保藏号为CCTCCP201209；

（3）以上述（1）步和（2）步中所获得的杂交后代为材料，根据与目标QTL紧密连锁的分子标记，对（1）步和（2）步的每一次杂交后代进行PCR选择，严格控制杂交的精准度；

（5）步骤（3）中所述的与目标QTL紧密连锁的分子标记的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO:1,SEQ IDNO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12所示；

上述步骤（3）中所述的PCR选择步骤为：

1）PCR扩增反应体系：反应总体积为20ul，提取各待测水稻单株的总DNA，依据与目标基因共分离或紧密连锁的分子标记设计正向引物，其核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ IDNO:5,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:11所示，其反向引物的核苷酸序列分别如序列表SEQ IDNO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:12所示，各0.25um，Taq DNA聚合酶1U，dATP，dTTP，dCTP，dGTP各0.1mM，Tris-HCl（pH8.0）和KCl各10mM，以及MgCl2各2mM；

3）PCR产物检测：采用如下步骤对PCR产物进行检测：a）用2％的琼脂糖凝胶电泳检测，点样后，在250V直流电压电泳23~34分钟，溴化乙啶染色约1个小时左右后置于紫外灯下，读取各样品的PCR带型；或b）4%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，上样后，在90W的恒定功率下电泳2~4个小时，揭下凝胶，通过银染的方法：用AgNO3溶液染色10分钟后在含有1%的甲醛的NaOH溶液中显色8~10分钟，读取各样品的PCR带型，根据上述方法确定各样品的分子标记基因型，从而判断出目标QTL的基因型。

2.一种与水稻粒型、粒重QTL紧密连锁的分子标记，其特征在于，其核苷酸序列分别如序列表SEQID NO:1和SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10以及SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示。

3.权利要求1所述的方法在聚合粒型QTL改良水稻粒型和粒重中的应用。

4.权利要求2所述的分子标记在聚合粒型QTL改良水稻粒型和粒重中的应用。