ES2290155T3 - Regulacion de las tasas lipidicas por mediacion del gen zmax1 y del gen hbm. - Google Patents

Abstract

Un método para identificar una molécula implicada en la regulación de lípidos de comprende: (A) construir un primer anfitrión que contiene un gen que tiene la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 1 o un polipéptido codificado de ese modo; (B) construir un segundo anfitrión que contiene un gen que tiene la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 2 o un polipéptido codificado de ese modo; (C) analizar la diferencia entre el primer anfitrión y el segundo anfitrión; y (D) identificar una molécula que, cuando se añade al primer anfitrión, hace que el primer anfitrión muestre niveles de lípidos característicos del segundo anfitrión.

Description

Regulación de las tasas lipídicas por mediación del gen Zmax1 y del gen HBM.

Campo de la invención

La presente invención se refiere generalmente al campo de la genética, la genómica y la biología molecular. La presente descripción hace referencia a los métodos y materiales utilizados para aislar, detectar y secuenciar un gen de masa ósea elevada y el correspondiente gen de tipo salvaje, y los mutantes del mismo que pueden estar implicados en la modulación de los niveles de lípidos. La presente descripción también hace referencia al gen de masa ósea elevada, al correspondiente gen de tipo salvaje, y a los mutantes del mismo. Los genes identificados en la presente descripción están implicados en la ontología y fisiología de la aterosclerosis, la arteriosclerosis y las enfermedades y afecciones asociadas con ellas. Asimismo se describen ácidos nucleicos, proteínas, vectores de clonación, vectores de expresión, anfitriones transformados, métodos de desarrollo de composiciones farmacéuticas, métodos de identificación de moléculas implicadas en la arteriosclerosis y afecciones asociadas, y métodos de tratamiento o prevención de enfermedades asociadas con niveles anómalos de lípidos. La presente descripción está dirigida a los métodos para tratar, diagnosticar, evitar y escrutar afecciones normales y anormales asociadas con lípidos, incluyendo arteriosclerosis, enfermedades cardiovasculares y apoplejía.

Antecedentes de la invención

La enfermedad cardiovascular es la primera causa de muerte en los Estados Unidos, y la aterosclerosis es la causa principal de enfermedad cardíaca y apoplejía. Es ampliamente comprendido que el colesterol juega un importante papel en la aterogénesis. Normalmente, la mayor parte del colesterol sirve como elemento estructural en las paredes de las células, mientras la mayor parte del resto se encuentra en tránsito por la sangre o funciona como material de partida para la síntesis de ácidos biliares en el hígado, hormonas esteroides en las células endocrinas y vitamina D en la piel. El transporte de colesterol y otros lípidos a través del sistema circulatorio es facilitado por su empaquetamiento en portadores de lipoproteínas. Estas partículas esféricas comprenden proteína y cubiertas de fosfolípidos que circundan un núcleo de lípido neutro, incluyendo colesterol no esterificado ("libre") o esterificado y triglicéridos. El riesgo de aterosclerosis aumenta con concentraciones crecientes de colesterol de la lipoproteína de baja densidad (LDL), mientras el riesgo es inversamente proporcional a los niveles de colesterol de la lipoproteína de elevada densidad (HDL). El control mediado por el receptor de los niveles de LDL en plasma ha sido bien definido, y estudios recientes han proporcionado ahora nuevas percepciones en el metabolismo de HDL.

La elucidación del metabolismo de LDL comenzó en 1.974 por Michael Brown y Joseph Goldstein. En resumen, el hígado sintetiza una lipoproteína precursora (lipoproteína de muy baja densidad, VLDL) que se convierte durante la circulación en lipoproteína de densidad intermedia (IDL) y después en LDL. La mayoría de los receptores de LDL expresados en el organismo están sobre las superficies de las células del hígado, aunque virtualmente todos los demás tejidos ("tejidos periféricos") expresan algunos receptores de LDL. Después de la unión, el complejo receptor-lipoproteína es internalizado por las células vía depresiones recubiertas y vesículas, y la partícula de LDL completa es liberada en los lisosomas, donde es desmontada mediante hidrólisis enzimática, liberando el colesterol para su posterior metabolismo celular. Esta ruta de absorción de partículas completas es denominada "endocitosis mediada por receptores". La regulación de la retroalimentación mediada por colesterol de los niveles de receptores de LDL y de la biosíntesis de colesterol celular ayuda a asegurar la homeostasis del colesterol celular. Los defectos genéticos en el receptor de LDL en humanos da como resultado la hipercolesterolemia familiar, una enfermedad caracterizada por colesterol de LDL en plasma elevado y aterosclerosis prematura y ataques cardíacos. Una hipótesis para los efectos deletéreos del exceso de colesterol de LDL en plasma es que la LDL entra en la pared arterial, es modificada químicamente, y después es reconocida por una clase especial de receptores denominados receptores captadores de macrófagos, que median la acumulación celular del colesterol de LDL en la arteria, conduciendo eventualmente a la formación de una lesión aterosclerótica.

Las clases principales de lipoproteínas incluyen quilomicrones derivados intestinalmente que transportan grasas y colesterol de la dieta, VLDL, IDL y LDL derivadas del hígado que pueden ser aterogénicas, y HDL derivadas de hígado e intestino que son anti-aterogénicas. La apoproteína B (ApoB) es necesaria para la secreción de quilomicrones (Apo B48) y VLDL, IDL y LDL (Apo B100). Los niveles en plasma de triglicéridos VLDL se determinan principalmente mediante las tasas de secreción en la actividad lipolítica de LPL. Los niveles en plasma de colesterol de LDL se determinan principalmente mediante la secreción de Apo B100 en plasma, la eficacia con la cual las VLDL se convierten en LDL y mediante aclaramiento mediado por receptores de LDL. La regulación de los niveles de colesterol de HDL es compleja y está afectada por las tasas de síntesis de sus proteínas Apo, las tasas de esterificación del colesterol libre a éster de colesterol mediante LCAT, los niveles de lipoproteínas ricas en triglicéridos y la transferencia mediada por CETP de ésteres de colesterol a partir de HDL, y el aclaramiento del plasma de lípidos de HDL y proteínas
Apo.

El transporte de lipoproteínas normal está asociado con bajos niveles de triglicéridos y colesterol de LDL y elevados niveles de colesterol de HDL. Cuando un transporte de lipoproteínas es anormal, los niveles de lipoproteínas pueden cambiar de manera que predisponen a los individuos a la aterosclerosis y la arteriosclerosis (véase Ginsberg, Endocrinol. Metab. Clin. North Am., 27: 503-19 (1998)).

Numerosos receptores de lipoproteínas pueden estar implicados en la absorción celular de lípidos. Estos receptores incluyen: receptores captadores; receptor de proteína/\alpha2-macroglobulina relacionado con el receptor de LDL (LRP); receptor de LDL; y receptor de VLDL. Con la excepción del receptor de LDL, todos estos receptores son expresados en lesiones ateroscleróticas mientras los receptores captadores son expresados muy comúnmente en macrófagos, los receptores LRP y VLDL pueden jugar un importante papel en la mediación de la absorción de lípidos en las células de la musculatura lisa (Hiltunen et al., Atherosclerosis, 137 supl.: S81-8 (1998)).

Un avance principal en el tratamiento farmacológico de la hipercolesterolemia ha sido el desarrollo de la clase "estatina" de los fármacos inhibidores de la 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa (HMG CoA Reductasa). La 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa es la enzima controladora de la velocidad en la biosíntesis del colesterol, y su inhibición en el hígado estimula la expresión del receptor de LDL. Como consecuencia, tanto los niveles de colesterol de LDL en plasma como el riesgo de aterosclerosis disminuyen. El descubrimiento y el análisis del sistema receptor de LDL han tenido un profundo impacto sobre la biología celular, la fisiología, y la medicina.

Se piensa que la HDL elimina el colesterol no esterificado, o libre (FC) de los tejidos periféricos, después de lo cual la mayor parte del colesterol es convertido en éster de colesterilo (CE) por las enzimas del plasma. Con posterioridad, el colesterol de HDL es eficazmente liberado directamente en el hígado y los tejidos estereogénicos por medio de una ruta de absorción selectiva y el receptor de HDL, SR-BI (receptor captador de tipo I de clase B) o, en algunas especies, transferido a otras lipoproteínas para el transporte adicional en el metabolismo. Para un estudio adicional sobre el metabolismo de HDL y LDL véase Krieger, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 95:4077-4080, 1998.

En PCT/GB98/01102 (WO-A-98/46743) se describe el gen de la proteína 3 relacionada con el receptor de LDL (LRP-3). El gen está asociado con la diabetes de tipo I (diabetes melitus insulinodependiente) y la evidencia experimental sugiere que éste es el gen de la susceptibilidad a la IDDM IDDM4.

Recientemente, se ha desarrollado un gran interés en el control genético de la masa ósea pico en el campo de la osteoporosis. El interés se ha centrado principalmente en los genes candidatos con polimorfismos adecuados para someter a ensayo la asociación con la variación en la masa ósea dentro del intervalo normal, o se ha centrado en el examen de los genes y los loci de los genes asociados con una masa ósea baja en el intervalo encontrado en los pacientes con osteoporosis. El locus del receptor de la vitamina D (VDR) (Morrison et al., Nature, 367:284-287 (1994)), el gen PTH (Howard et al., J Clin. Endocrinol. Metab., 80:2800-2805 (1995); Johnson et al., J. Bone Miner. Res., 8:11-17 (1995); Gong et al., J. Bone Miner. Res., 10:S462 (1995)) y el gen del receptor de estrógenos (Hosoi et al., J. Bone Miner. Res., 10:S170 (1995); Morrison et al., Nature, 367:284-287 (1994)) han figurado muy notablemente en este trabajo. Estos estudios son difíciles debido a que la masa ósea (el fenotipo) es un rasgo poligénico, cuantitativo, continuo, y está conformado por factores medioambientales tales como la nutrición, la enfermedad co-mórbida, la edad, la actividad física, y otros factores. Asimismo, este tipo de diseño de estudio requiere un gran número de sujetos. En particular, los resultados de los estudios de VDR hasta la fecha han sido confusos y contradictorios (Garnero et al., J. Bone Miner. Res., 10:1283-1288 (1995); Eisman et al., J. Bone. Miner. Res., 10:1289-1293 (1995); Peacock, J. Bone Miner. Res., 10:1294-1297 (1995)). Además, el trabajo no ha arrojado hasta ahora mucha luz sobre el mecanismo o los mecanismos por medio de los cuales las confluencias genéticas podrían ejercer su efecto sobre la masa ósea.

Aunque es bien sabido que la masa ósea pico está determinada en gran parte por factores genéticos en vez de medioambientales, los estudios para determinar los loci de los genes (y por último los genes) relacionados con la variación en la masa ósea son difíciles y costosos. Los diseños de los estudios que utilizan el poder del análisis de asociación, p. ej., par sib o familia ampliada, son generalmente más informativos que los simples estudios de asociación, aunque los últimos tienen valor. No obstante, los estudios de asociación genética que implican la masa ósea están impedidos por dos problemas principales. El primer problema es el fenotipo, como se ha comentado brevemente antes. La masa ósea es un rasgo cuantitativo, continuo, y establecer un fenotipo discreto es difícil. Cada sitio anatómico para la medición puede estar influenciado por diversos genes, muchos de los cuales pueden ser diferentes entre sitio y sitio. El segundo problema es el componente edad del fenotipo. En el tiempo que un individuo puede ser identificado por tener una masa ósea baja, hay una gran probabilidad de que sus padres u otros miembros de generaciones anteriores fallezcan y por lo tanto no están disponibles para el estudio, y las generaciones más jóvenes pueden no haber alcanzado aún la masa ósea pico, haciendo su tipificación fenotípica incierta para el análisis genético.

A pesar de todo, el análisis de asociación se puede utilizar para encontrar la localización de un gen causante de un "trastorno" hereditario y no requiere conocimiento alguno de la naturaleza bioquímica del trastorno, esto es, no es necesario conocer la proteína mutada que se cree que causa el trastorno. Los enfoques tradicionales dependen de las suposiciones concernientes al proceso de la enfermedad que podría implicar la evaluación de una proteína conocida como candidato. El enfoque de la localización genética utilizando el análisis de asociación se puede utilizar para encontrar primero la región cromosómica general en la cual está localizado el gen defectuoso y después reducir gradualmente el tamaño de la región con el fin de determinar la localización del gen mutado específico tan precisamente como sea posible. Una vez que el propio gen es descubierto en la región candidata, se identifican el ARN mensajero y la proteína y, junto con el ADN, se verifican en cuanto a las mutaciones.

El enfoque de la localización genética tiene implicaciones prácticas puesto que la localización de la enfermedad se puede utilizar para la diagnosis prenatal incluso antes de que el gen alterado que causa la enfermedad sea descubierto. El análisis de asociación puede permitir a las familias, incluso a muchas de las que no tienen un hijo enfermo, conocer si son portadoras de un gen de la enfermedad y evaluar el estado de un niño no nacido por medio de la diagnosis molecular. La transmisión de una enfermedad dentro de las familias se puede utilizar después para encontrar el gen defectuoso. Según se utiliza en la presente memoria, la referencia a la "masa ósea elevada" (HBM) es análoga a la referencia a un estado de enfermedad, aunque desde un punto de vista práctico la masa ósea elevada puede ayudar realmente a un sujeto a evitar la enfermedad conocida como osteoporosis.

El análisis de asociación es posible debido a la naturaleza hereditaria de los cromosomas de padres a vástagos. Durante la meiosis, los dos pares homólogos parentales se emparejan para guiar su separación apropiada a las células hijas. Mientras se alinean y se emparejan, las dos moléculas intercambian porciones de los cromosomas, en un evento denominado "entrecruzamiento" o "recombinación". Los cromosomas resultantes son quiméricos, esto es, contienen partes que se originan a partir de ambos homólogos parentales. Cuanto más cerca están las dos secuencias sobre el cromosoma, menor es la probabilidad de que se produzca un evento de recombinación entre ellas, y más íntimamente asociadas están. En un experimento de análisis de asociación, dos posiciones de los cromosomas se siguen de una generación a la siguiente para determinar la frecuencia de recombinación entre ellas. En un estudio de una enfermedad heredada, una de las posiciones cromosómicas está marcada por el gen de la enfermedad o su contraparte normal, esto es, la herencia de la región cromosómica se puede determinar examinando si el individuo presenta síntomas del trastorno o no. La otra posición está marcada por una secuencia de ADN que muestra una variación natural en la población de manera que los dos homólogos se pueden distinguir basándose en la copia de la secuencia "marcadora" que poseen. En cada familia, la herencia de la secuencia marcadora genética se compara con la herencia del estado de enfermedad. Si, en una familia que porta un trastorno dominante autosómico tal como la masa ósea elevada, cada individuo afectado porta la misma forma del marcador y todos los individuos no afectados portan al menos una forma de marcador diferente, existe una gran probabilidad de que el gen de la enfermedad y el marcador estén localizados próximos entre sí. De este modo, los cromosomas pueden ser verificados sistemáticamente con marcadores conocidos y comparados con el estado de enfermedad. Los datos obtenidos de las diferentes familias se combinan, y se analizan juntos por medio de un ordenador utilizando métodos estadísticos. El resultado es la información que indica la probabilidad de conexión entre el marcador genético y la enfermedad que permite distancias diferentes entre ellos. Un resultado positivo puede significar que la enfermedad está muy próxima al marcador, mientras un resultado negativo indica que está alejado en ese cromosoma, o en un cromosoma completamente diferente.

El análisis de las asociaciones se realiza mediante tipificación de todos los miembros de la familia afectada en un locus de marcador dado y evaluación de la herencia simultánea de un estado de enfermedad concreto con la sonda marcadora, determinando de ese modo cuán a menudo se heredan simultáneamente los dos. La frecuencia de recombinación se puede utilizar como medida de la distancia genética entre dos loci de genes. Una frecuencia de recombinación del 1% es equivalente a 1 unidad de mapa, o 1 centiMorgan (cM), que es más o menos equivalente a 1.000 kb de ADN. Esta relación se mantiene hasta frecuencias de aproximadamente 20% o 20 cM.

El genoma humano completo es de 3.300 cM de longitud. Con el fin de encontrar un gen de una enfermedad desconocida en 5-10 cM de un locus marcador, se puede investigar el genoma humano completo más o menos con 330 loci marcadores informativos espaciados a intervalos de aproximadamente 10 cM (Botstein et al., Am. J. Hum. Genet., 32:314-331 (1980)). La fiabilidad de estos resultados de la asociación se establece utilizando numerosos métodos estadísticos. El método más comúnmente utilizado para el análisis de la conexión en humanos es el método de puntuación LOD (Morton, Prog. Clin. Biol. Res., 147:245-265 (1984), Morton et al., Am. J. Hum. Genet., 38:868-883 (1986)) que fue incorporado al programa de ordenador LIPED por Ott, Am. J. Hum. Genet., 28:528-529 (1976). Las puntuaciones LOD son el logaritmo de la proporción de la probabilidad de que dos loci estén asociados a una distancia dada con respecto a la de que no estén asociados (separados >50 cM). La ventaja de utilizar los valores logarítmicos es que se pueden sumar entre las familias con la misma enfermedad. Esto se hace necesario dado el tamaño relativamente pequeño de las familias humanas.

Por convenio, se considera que una puntuación LOD total mayor de + 3,0 (esto es, siendo las probabilidades de asociación a la frecuencia de recombinación especificada 1.000 veces mayores que las probabilidades de no asociación) es una evidencia significativa de asociación a esa frecuencia de recombinación concreta. Se considera que una puntuación LOD total de menos de - 2,0 (esto es, siendo las probabilidades de no asociación 100 veces mayores que las probabilidades de asociación a la frecuencia especificada) es una evidencia fuerte de que los dos loci en consideración no están asociados a esa frecuencia de recombinación concreta. Hasta hace poco, la mayoría de los análisis de asociación se han realizado basándose en datos bipuntuales, que es la relación entre el trastorno en consideración y el marcador genético concreto. No obstante, como resultado de los rápidos avances en el mapeo del genoma humano a lo largo de los últimos años, y las mejoras concomitantes en la metodología de los ordenadores, se ha hecho posible llevar a cabo análisis por ordenador utilizando datos multipuntuales. El análisis multipuntual proporciona un análisis simultáneo de la asociación entre la enfermedad y los numerosos marcadores genéticos asociados, cuando la distancia de recombinación entre los marcadores es conocida.

El análisis multipuntual es ventajoso por dos razones. Primero, la cantidad de información de la genealogía normalmente aumenta. Cada genealogía tiene una cierta cantidad de información potencial, dependiente del número de padres heterocigotos para los loci marcadores y del número de individuos afectados de la familia. No obstante, pocos marcadores son suficientemente polimórficos como para ser informativos en todos esos individuos. Si se consideran simultáneamente los marcadores múltiples, la probabilidad de que un individuo sea heterocigoto para al menos uno de los marcadores aumenta enormemente. Segundo, se puede determinar una indicación de la posición del gen de la enfermedad entre los marcadores. Esto permite la identificación de los marcadores contiguos, y de este modo permite finalmente el aislamiento de una pequeña región en la que reside el gen de la enfermedad. Lathrop et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:3443-3446 (1984) han escrito el paquete de ordenador más ampliamente utilizado, LINKAGE, para el análisis mutipuntual.

Existe la necesidad en la técnica de identificar el gen asociado con un fenotipo de elevada masa ósea. La presente invención está dirigida a esto, así como a otros propósitos importantes.

Compendio de la invención

La presente invención está basada en la identificación del gen Zmax1 y el gen HBM en el cromosoma 11q13.3 mediante análisis de asociación genética y mutación. El uso de marcadores genéticos adicionales asociados con los genes ha ayudado a este descubrimiento. Utilizando el análisis de asociación y el análisis de mutación, se pueden identificar rápidamente las personas predispuestas a los trastornos asociados con los lípidos. Los métodos de clonación utilizando Cromosomas Artificiales Bacterianos han permitido a los autores de la presente invención centrarse en la región cromosómica de 11q13.3 y acelerar la secuenciación del gen dominante autosómico. El gen Zmax1 y el gen HBM también han sido identificados, como lo ha sido la mutación de polimorfismo guanina-a-timina en la posición 582 del gen Zmax1 que produce el gen HBM y el fenotipo HBM así como niveles alterados de lípidos.

El gen Zmax1 y el gen HBM descritos aquí se pueden utilizar para determinar si las personas están predispuestas a niveles anormales de lípidos y, por lo tanto, son susceptibles a enfermedades mediadas por lípidos, incluyendo, por ejemplo, aterosclerosis, arteriosclerosis y afecciones asociadas. Los individuos con el gen HBM tienen niveles de LDL, triglicéridos y VLDL inferiores y niveles de HDL superiores. En otras palabras, el gen HBM es un supresor de la arteriosclerosis y las afecciones asociadas. Esta observación in vivo es una fuerte evidencia de que el tratamiento de individuos normales con el gen o la proteína HBM, o fragmentos de los mismos, aliviará la aterosclerosis, la arteriosclerosis y las afecciones relacionadas con ellas.

Por otra parte, semejante tratamiento estará indicado en el tratamiento de las enfermedades mediadas por lípidos, concretamente la arteriosclerosis y las afecciones relacionadas con ella. Por ejemplo, las personas predispuestas a niveles de lípidos elevados (esto es, diabetes, hipercolesterolemia y otras enfermedades genéticas, obesidad, género masculino, e individuos que fuman) pueden ser identificadas y/o tratadas. Por otra parte, tales tratamientos tendrán uso en el tratamiento o la prevención de la enfermedad aterosclerótica diabética, las afecciones neurovasculares causadas por la formación de la placa (p. ej., apoplejía), enfermedad cardiovascular, mala circulación debida a la formación de la placa y asociada con una mala curación de las heridas.

Adicionalmente, el gen Zmax1 y el gen HBM descritos en la presente memoria pueden ser utilizados, por ejemplo, en la terapia génica, el desarrollo farmacéutico, y los análisis de diagnóstico para los trastornos del desarrollo óseo. En las realizaciones preferidas, la presente invención está dirigida a métodos para tratar, diagnosticar, prevenir y escrutar la osteoporosis.

Según la invención, se proporciona de este modo un método para identificar una molécula implicada en la regulación de lípidos que comprende:

(A) construir un primer anfitrión que contiene un gen que tiene la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 1 o un polipéptido codificado de ese modo;

(B) construir un segundo anfitrión que contiene un gen que tiene la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 2 o un polipéptido codificado de ese modo;

(C) analizar una diferencia entre el primer anfitrión y el segundo anfitrión; y

(D) identificar una molécula que, cuando se añade al primer anfitrión, hace que el primer anfitrión muestre niveles de lípidos característicos del segundo anfitrión.

La invención también proporciona:

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un método para identificar un paciente que tiene una mayor disposición a la arteriosclerosis, una afección asociada con la arteriosclerosis, hipercolesterolemia, hipolipidemia o aterosclerosis, cuyo método comprende escrutar una muestra del paciente para determinar la presencia o ausencia de un polipéptido que tiene la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 3 o un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido en dicha muestra, para determinar de ese modo si el paciente tiene una predisposición genética a dicha afección; y

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un método de expresión del polipéptido que tiene la secuencia del SEQ ID NO: 3 en un tejido que comprende construir un vector de expresión que comprende un promotor que dirige la expresión en el tejido conectado operablemente al SEQ ID NO:1 y el tejido en el cual es expresado dicho polipéptido es una célula reguladora de lípidos o una célula implicada en el metabolismo de los lípidos.

Breve descripción de las figuras

Las Figs. 1A y 1B muestran la genealogía de los individuos utilizados en los estudios de asociación genética. Bajo cada individuo hay un número ID, la puntuación z para BMD espinal, y las llamadas de los alelos para los marcadores críticos en el cromosoma 11. Los símbolos rellenos representan individuos "afectados". Los símbolos que contienen "N" son individuos "no afectados". Se sometió a tipificación genotípica el ADN de 37 individuos. Las marcas de interrogación indican genotipos desconocidos o individuos que no fueron sometidos a tipificación
genotípica.

Las Figs. 2A y 2 representan el mapa físico que contiene BAC/STS de la región HBM de 11q13.3. Los marcadores STS derivados de los genes, los EST, los microsatélites, las secuencias al azar, y las secuencias finales de BAC se indican por encima de la línea horizontal larga. Para los marcadores que están presentes en GDB se ha utilizado la misma nomenclatura. Los nombres de los loci (D11S\alm{4}) se enumeran entre paréntesis después del primer nombre si lo tiene. Los STS derivados de las secuencias finales de BAC se enumeran con el primer nombre BAC seguido de L o R para el extremo izquierdo y derecho del clon, respectivamente. Las dos flechas grandes indican los marcadores genéticos que definen la región crítica de HBM. Las líneas horizontales por debajo de los STS indican los clones de BAC identificados mediante escrutinio basado en la PCR de una genoteca BAC con un cobertura de nueve veces. Los círculos vacíos indican que el marcador no amplificó la correspondiente dirección de la genoteca BAC durante el escrutinio de la genoteca. Los nombres de los clones utilizan el siguiente convenio: B para BAC, la dirección de la placa, fila y columna, seguido de -H que indica el proyecto HBM (esto es, B36F16-H).

Las Figs. 3A-3F muestran la estructura genómica de Zmax1 con secuencias intrónicas contiguas. La traducción se inicia por el "ATG" subrayado del exón 1. El sitio del polimorfismo en el gen HBM está en el exón 3 y está representado por la "G" subrayada, por medio de lo cual este nucleótido es una "T" en el gen HBM. La región no traducida 3' del ARNm está subrayada en el exón 23 (exón 1, SEQ ID NO: 40, exón 2, SEQ ID NO: 41; exón 3, SEQ ID NO:42; exón 4, SEQ ID NO:43; exón 5, SEQ ID NO:44; exón 6, SEQ ID NO:45; exón 7, SEQ ID NO:46; exón 8, SEQ ID NO:47; exón 9, SEQ ID NO:48; exón 10, SEQ ID NO:49; exón 11, SEQ ID NO:50; exón 12, SEQ ID NO:51; exón 13, SEQ ID NO:52; exón 14, SEQ ID NO:53; exón 15, SEQ ID NO:54; exón 16, SEQ ID NO:55; exón 17, SEQ ID NO:56; exón 18, SEQ ID NO:57; exón 19, SEQ ID NO:58; exón 20, SEQ ID NO:59; exón 21, SEQ ID NO:60; exón 22, SEQ ID NO:61; y exón 23; SEQ ID NO:62).

La Fig. 4 muestra la organización del dominio de Zmax1, incluyendo los espaciadores YWTD, el sitio de anclaje extracelular, el sitio de unión para LDL y calcio, las repeticiones del factor de crecimiento rico en cisteína, la región transmembrana, la región PEST ideal con el sitio de fosforilación CK-II y el dominio de internalización. La Fig. 4 también muestra el sitio del cambio de glicina por valina que se produce en la proteína HBM. El péptido señal se localiza en los aminoácidos 1-22, el dominio extracelular se localiza en los aminoácidos 23-1385, el segmento transmembrana se localiza en los aminoácidos 1386-1413, y el dominio citoplásmico se localiza en los aminoácidos 1414-1615.

La Fig. 5 muestra una ilustración esquemática de los cóntigos de BAC B527D12 y B200E21 con relación al gen HBM.

Las Figs. 6A-6J muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del gen de tipo salvaje, Zmax1. La localización para la sustitución del par de bases en el nucleótido 582, guanina por timina, está subrayada. Esta variante alélica es el gen HBM. El gen HBM codifica una proteína con una sustitución de aminoácidos de glicina por valina en la posición 171. La región no traducida 5' (UTR) consiste en las bases 1 a 70, y la UTR 3' consiste en las bases 4916-5120.

Las Figs. 7A y 7B muestran los análisis de transferencia northern que muestran la expresión de Zmax1 en diversos tejidos.

La Fig. 8 muestra un análisis del producto de la PCR.

La Fig. 9 muestra la detección de oligonucleótidos alelo-específica de la mutación del exón 3 de Zmax1.

Las Figs. 10A y 10B muestran la localización celular de Zmax1 de ratón mediante hibridación in situ a un aumento de 100X utilizando sondas efectoras y antisentido.

Las Figs. 11A y 11B muestran la localización celular de Zmax de ratón mediante hibridación in situ a un aumento de 400X utilizando sondas efectoras y antisentido.

Las Figs. 12A y 12B muestran la localización celular de Zmax1 de ratón mediante hibridación in situ de osteoblastos en el endostio a un aumento de 400X utilizando sondas efectoras y antisentido.

La Fig. 13 muestra la inhibición antisentido de la expresión de Zmax1 en células MC-3T3.

Descripción detallada de la invención

Para ayudar a comprender la memoria y las reivindicaciones, se proporcionan las siguientes definiciones.

"Gen" hace referencia a una secuencia de ADN que codifica por medio de su molde o ARN mensajero una secuencia de aminoácidos característica de un péptido específico. El término "gen" incluye regiones intermedias, no codificantes, así como regiones reguladoras, y puede incluir los extremos 5' y 3'.

"Secuencia génica" hace referencia a una molécula de ADN, incluyendo una molécula de ADN que contiene una secuencia no transcrita o no traducida. También se pretende que el término incluya cualquier combinación de genes, fragmentos de genes, secuencias no transcritas o secuencias no traducidas que están presentes en la misma molécula de ADN.

Las secuencias para su uso en la presente invención pueden derivar de una variedad de fuentes incluyendo ADN, ADNc, ADN sintético, ARN sintético o combinaciones de los mismos. Tales secuencias pueden comprender ADN genómico que puede incluir o no intrones de origen natural. Por otra parte, semejante ADN genómico puede ser obtenido asociado con regiones promotoras o secuencias poli (A). Las secuencias, el ADN genómico o el ADNc pueden ser obtenidos de distintas maneras. El ADN genómico se puede extraer y purificar a partir de células adecuadas por medios bien conocidos en la técnica. Alternativamente, el ARNm se puede aislar de una célula y utilizar para producir ADNc mediante transcripción inversa u otro método.

"ADNc" hace referencia a ADN complementario o copia producido a partir de un molde de ARN mediante la acción de la ADN polimerasa dependiente de ARN (transcriptasa inversa). De este modo, un "clon de ADNc" representa una secuencia de ADN dúplex complementaria a una molécula de ARN de interés, portada en un vector de clonación o amplificada mediante PCR. Este término incluye genes de los cuales se han eliminado secuencias inter-
medias.

"ADN recombinante" representa una molécula que se ha recombinado mediante empalme in vitro de ADNc o de una secuencia de ADN genómico.

"Clonación" hace referencia al uso de técnicas de recombinación in vitro para insertar un gen concreto u otra secuencia de ADN en una molécula vectora. Con el fin de clonar con éxito un gen deseado, es necesario utilizar métodos para generar fragmentos de ADN, para unir los fragmentos en moléculas vectoras, para introducir la molécula de ADN compuesta en una célula anfitriona en la que se pueda replicar, y para seleccionar el clon que tiene el gen diana entre las células anfitrionas receptoras.

"Genoteca de ADNc" hace referencia a una colección de moléculas de ADN recombinante que contienen insertos de ADNc que comprenden juntos el genoma completo de un organismo. Semejante genoteca de ADNc se puede preparar mediante métodos conocidos por un experto en la técnica y descritos, por ejemplo, por Cowell y Austin, "cDNA Library Protocols", Methods in Molecular Biology (1997). Generalmente, el ARN es aislado primero de las células de un organismo a partir de cuyo genoma se desea clonar un gen concreto.

"Vehículo de clonación" hace referencia a un ADN de plásmido o fago u otra secuencia de ADN que es capaz de replicarse en una célula anfitriona. El vehículo de clonación se caracteriza por uno o más sitios de reconocimiento de la endonucleasa en los cuales se pueden cortar semejantes secuencias de ADN de una manera determinable sin pérdida de función biológica esencial del ADN, que pueden contener un marcador adecuado para su uso en la identificación de células transformadas.

"Secuencia de control de la expresión" hace referencia a una secuencia de nucleótidos que controla o regula la expresión de genes estructurales cuando se une operablemente a esos genes. Estos incluyen, por ejemplo, sistemas lac, el sistema trp, las regiones operadoras y promotoras principales del fago lambda, la región de control de la proteína de la envoltura fd y otras secuencias conocidas que controlan la expresión de genes en células procarióticas y eucarióticas. Las secuencias de control de la expresión variarán dependiendo de si el vector está diseñado para expresar el gen conectado operablemente en un anfitrión procariótico o eucariótico, y pueden contener elementos transcripcionales tales como elementos intensificadores, secuencias de terminación, elementos de especificidad de los tejidos y/o sitios de iniciación y terminación de la traducción.

"Vehículo de expresión" hace referencia a un vehículo o vector similar a un vehículo de clonación pero que es capaz de expresar un gen que ha sido clonado en él, tras la transformación en un anfitrión. El gen clonado se coloca normalmente bajo el control de una secuencia de control de la expresión (esto es, conectado operablemente).

"Operador" hace referencia a una secuencia de ADN capaz de interaccionar con el represor específico, controlando de ese modo la transcripción de uno o varios genes adyacentes.

"Promotor" hace referencia a una secuencia de ADN que puede ser reconocida por una ARN polimerasa. La presencia de semejante secuencia permite que la ARN polimerasa se una e inicie la transcripción de las secuencias génicas conectadas operablemente.

Se pretende que "región promotora" incluya el promotor así como otras secuencias génicas que pueden ser necesarias para el inicio de la transcripción. La presencia de una región promotora es suficiente para ocasionar la expresión de una secuencia génica conectada operablemente.

"Conectado operablemente" significa que el promotor controla el inicio de la expresión del gen. Un promotor está conectado operablemente a una secuencia de ADN proximal si tras la introducción en una célula anfitriona el promotor determina la transcripción de la secuencia o las secuencias de ADN proximal en una o más especies de ARN. Un promotor está conectado operablemente a una secuencia de ADN si el promotor es capaz de iniciar la transcripción de esa secuencia de ADN.

"Procariota" hace referencia a todos los organismos sin un núcleo verdadero, incluyendo bacterias.

"Eucariota" hace referencia a organismo y células que tienen un núcleo verdadero, incluyendo células de mamíferos.

"Anfitrión" incluye procariotas y eucariotas, tales como levaduras y hongos filamentosos, así como células vegetales y animales. El término incluye un organismo o célula que es el receptor de un vehículo de expresión replicable.

Se pretende que "animal" incluya los vertebrados. Los vertebrados preferidos incluyen mamíferos y aves, pero también incluyen peces, reptiles y anfibios. Los mamíferos preferidos incluyen: humanos, primates, roedores, cánidos, félidos y ganado.

"Fragmento" de un gen hace referencia a cualquier variante del gen que posee la actividad biológica de ese gen.

"Variante" hace referencia a un gen que es sustancialmente similar en estructura y actividad biológica o características inmunológicas o bien al gen completo o bien a un fragmento del gen. Siempre que los dos genes poseen una actividad similar, se consideran variantes ya que el término se utiliza en la presente memoria incluso si la secuencia de restos aminoácido no es idéntica.

"Amplificación de ácidos nucleicos" hace referencia a métodos tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la amplificación por ligación (o reacción en cadena de ligasa, LCR) y métodos de amplificación basados en el uso de la replicasa Q-beta Estos métodos son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.683.195 y 4.683.202. Los reactivos y el soporte físico para realizar la PCR están disponibles en el mercado. Los cebadores útiles para amplificar secuencias de las región HBM son preferiblemente complementarios a, e hibridan específicamente con las secuencias de la región HBM o las regiones que flanquean allí una región diana. Las secuencias HBM generadas por amplificación pueden ser secuenciadas directamente. Alternativamente, la secuencia o secuencias amplificadas pueden ser clonadas antes del análisis de la secuencia.

"Anticuerpos" puede hacer referencia a anticuerpos policlonales y/o monoclonales y fragmentos de los mismos, y equivalentes de unión inmunológica de los mismos, que se pueden unir a las proteínas HBM y Zmax1 y fragmentos de las mismas o a secuencias de ácido nucleico de la región HBM o Zmax1, concretamente del locus HBM o una porción del mismo. El término anticuerpo se utiliza para hacer referencia a una entidad molecular homogénea, o una mezcla tal como un producto de suero formado por una pluralidad de entidades moleculares diferentes. Las proteínas se pueden preparar sintéticamente en un sintetizador de proteínas y acoplarlas a una molécula portadora e inyectarlas a lo largo de varios meses en conejos. El suero de conejo se somete a ensayo en cuanto a la inmunorreactividad a la proteína HBM o su fragmento. Los anticuerpos monoclonales se pueden elaborar inyectando las proteínas o fragmentos de las mismas en ratones. Los anticuerpos monoclonales serán escrutados mediante ELISA y serán sometidos a ensayo en cuanto a la inmunorreactividad específica con la proteína HBM o fragmentos de la misma. Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988). Estos anticuerpos serán útiles en análisis y también como fármacos. Los anticuerpos pueden incluir fragmentos de anticuerpos (p. ej., scFv, Fab,
F(ab')_{2}, etc.) así como anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados y anticuerpos primatizados.

"HBM" hace referencia a masa ósea elevada, menos los polimorfismos asociados con el gen HBM, que también pueden estar implicados en la modulación de lípidos.

"Proteína HBM" hace referencia a una proteína que es idéntica a la proteína Zmax1 excepto que contiene una alteración de la glicina 171 por valina. Una proteína HBM está definida por cualquier organismo que codifica un homólogo verdadero de Zmax1. Por ejemplo, una proteína HBM de ratón hace referencia a la proteína Zmax1 de ratón que tiene la sustitución de la glicina 170 por valina.

"Gen HBM" hace referencia a la secuencia de ADN genómico encontrado en individuos que muestran la característica o el fenotipo HBM, donde la secuencia codifica la proteína indicada por el SEQ ID NO: 4. El gen HBM y el gen Zmax1 son alélicos. La proteína codificada por el gen HBM tiene la propiedad de ocasionar una masa ósea elevada y también de alterar los niveles fisiológicos de lípidos, mientras la proteína codificada por Zmax1 no. El gen HBM y el gen Zmax1 difieren en que el gen HBM tiene una timina en la posición 582, mientras el gen Zmax1 tiene una guanina en la posición 582. El gen HBM comprende la secuencia de ácido nucleico mostrada en el SEQ ID NO: 2. El gen HBM también puede ser referido como "polimorfismo HBM".

"Normal", "de tipo salvaje", "no afectado" y "Zmax1" hacen referencia todos a la secuencia de ADN genómico que codifica la proteína indicada por el SEQ ID NO: 3. El gen Zmax1 tiene una guanina en la posición 582. El gen Zmax1 comprende la secuencia de ácido nucleico mostrada como SEQ ID NO: 1. "Normal", "de tipo salvaje", "no afectado" y "Zmax1" también hacen referencia a variantes alélicas de la secuencia genómica que codifica las proteínas que no contribuyen a la masa ósea elevada. El gen Zmax1 es común en la población humana, mientras el gen HBM es raro.

"5YWT+EGF" hace referencia a una unidad repetitiva encontrada en la proteína Zmax1, que consiste en cinco repeticiones YWT seguidas de una repetición EGF.

"Desarrollo óseo" hace referencia generalmente a cualquier proceso implicado en el cambio de hueso a lo largo del tiempo, incluyendo, por ejemplo, el desarrollo normal, los cambios que se producen durante estados de enfermedad, y los cambios que se producen durante el envejecimiento. "Trastorno del desarrollo óseo" hace referencia concretamente a cualquiera de los trastornos en el desarrollo del hueso incluyendo, por ejemplo, los cambios que se producen durante los estados de enfermedad y los cambios que se producen durante el envejecimiento. El desarrollo del hueso puede ser de naturaleza progresiva o cíclica. Los aspectos del hueso que pueden cambiar durante el desarrollo incluyen, por ejemplo, mineralización, formación de rasgos anatómicos específicos, y número relativo y absoluto de diversos tipos celulares.

"Modulación ósea" o "modulación de la formación ósea" hace referencia a la capacidad para afectar a cualquiera de los procesos fisiológicos implicados en la remodelación ósea, como apreciará un experto en la técnica, incluyendo, por ejemplo, la resorción ósea y el crecimiento óseo aposicional, entre otros factores, por medio de la actividad osteoclástica y osteoblástica, y puede comprender parte o toda la formación y el desarrollo óseo según se utiliza en la presente memoria.

"Densidad ósea normal" hace referencia a una densidad ósea dentro de dos desviaciones típicas o una puntuación Z de 0.

Por "regulación de lípidos" o "modulación de lípidos" se quiere significar la capacidad para alterar, modulando los genes HBM o Zmax1, el ARNm o la proteína codificada de ese modo, los niveles de un lípido. Los niveles alterados de lípido incluyen lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), lipoproteínas de baja densidad (LDL), lipoproteínas de alta densidad (HDL) y triglicéridos. La regulación o modulación puede suponer un aumento o disminución del nivel de lípido por un agente, que cuando se administra a un sujeto modula la actividad de HBM o Zmax1. Por "metabolismo de lípidos" se quiere significar el ciclo fisiológico por medio del cual continúan los diversos triglicéridos y lipoproteínas. También se puede decir que los agentes de la invención modulan el metabolismo de los diversos lípidos.

"Lípido" incluye preferiblemente las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), las lipoproteínas de baja densidad (LDL), las lipoproteínas de densidad intermedia (IDL), las lipoproteínas de alta densidad (HDL) y los triglicéridos. Los lípidos también pueden incluir apolipoproteínas, tales como la apolipoproteína A-1 (APO A-1), la apolipoproteína B (APO B), la apolipoproteína E (APO E) y las lipoproteínas tales como la lipoproteína a (LIPOa).

En "enfermedad o afección mediada por lípidos" se pretende incluir la arteriosclerosis y las afecciones relacionadas, la hipercolesterolemia, la hiperlipidemia, la aterosclerosis, y las afecciones o estilos de vida asociados con los niveles elevados de lípidos (p. ej., diabetes melitus, el hábito de fumar y la obesidad) tales como las tratadas en la presente memoria.

En "arteriosclerosis" se pretende incluir la hipertrofia de la fibrosis media y subíntima con degeneración hialina que puede producir ectasia, aneurisma, aumento de la presión sistólica, formación de trombos y embolia. Los trastornos asociados con la arteriosclerosis incluyen, pero no están limitados a, condiciones de arteriosclerosis no ateromatosa tales como: diabetes melitus, insuficiencia renal crónica, intoxicación crónica por vitamina D, pseudoxantoma elástico, calcificación arterial idiopática en la infancia, calcificación valvular aórtica en la vejez, y síndrome de Werner. Los trastornos adicionales asociados con la arteriosclerosis y la aterosclerosis incluyen: diabetes melitus, hipertensión, hipercolesterolemia familiar, hiperlipidemia combinada familiar, disbetalipoproteinemia familiar, hipoalfalipoproteinemia familiar, hipotiroidismo, enfermedad de almacenamiento de éster de colesterol, lupus eritematoso generalizado y homocisteinemia.

Por "aterosclerosis" se quiere significar un engrosamiento intramural desigual de la subíntima que invade el lúmen arterial y puede ocasionar obstrucción. La placa aterosclerótica consiste en la acumulación de lípidos, células, tejido conectivo y glicosaminoglicanos. Esta puede ocasionar las siguientes afecciones: estenosis, trombosis, aneurisma, o sobreviene un coágulo, así como angina así como las afecciones enumeradas antes.

Un "sistema Zmax1" hace referencia a una proteína purificada, extracto celular, célula, animal, ser humano o cualquier otra composición de materia en la cual está presente Zmax1 en una forma normal o mutante.

Un "marcador indirecto" hace referencia a una indicación de diagnóstico, síntoma, signo u otro rasgo que se pueda observar en una célula, tejido, humano o animal que se corresponda con el gen HBM o una masa ósea elevada o ambos, pero que es más fácil de medir que la densidad ósea. El concepto general de un marcador indirecto es bien aceptado en la medicina diagnóstica.

En la presente memoria se describen el gen Zmax1 y la proteína Zmax1 en las formas indicadas por los SEQ ID NOS: 1 y 3, respectivamente, y otras variantes íntimamente relacionadas, así como las regiones cromosómicas adyacentes de Zmax1 necesarias para su expresión exacta. Asimismo se describe en la presente memoria una secuencia que tiene al menos 15 nucleótidos contiguos de la secuencia de ácido nucleico del SEQ ID NO: 1.

Asimismo se describen en la presente memoria el gen HBM y la proteína HBM en las formas indicadas por los SEQ ID NO: 2 y 4, respectivamente, y otras variantes íntimamente relacionadas, así como las regiones cromosómicas adyacentes del gen HBM necesarias para su expresión exacta. Asimismo se describe una secuencia que tiene al menos 15 nucleótidos contiguos de la secuencia de ácido nucleico del SEQ ID NO: 2, por ejemplo, una secuencia que tiene al menos 15 nucleótidos contiguos de la secuencia de ácido nucleico del SEQ ID NO: 2, donde uno de los 15 nucleótidos contiguos es la timina en el nucleótido 582.

Hasta ahora, se han descrito la secuencia de nucleótidos de la región del gen Zmax1, así como la secuencia de nucleótidos de la región del gen HBM. Más concretamente, se describen los clones de BAC que contienen segmentos de la región del gen Zmax1 B200E21-H y B527D12-H tales como las secuencias de nucleótidos de los clones de BAC que consisten en los SEQ ID NOS: 5-12.

La secuencia de nucleótidos se puede utilizar para identificar las sondas de ADN para el gen Zmax1 y el gen HBM, los cebadores de la PCR para amplificar el gen Zmax1 y el gen HBM, los polimorfismos de nucleótidos del gen Zmax1 y el gen HBM, y los elementos reguladores del gen Zmax1 y el gen HBM.

Las localizaciones cromosómicas del gen Zmax1 y el gen HBM sobre el cromosoma 11q13.3 están entre los marcadores genéticos D11S987 y SNP_CONTIG033-6, así como las secuencias de ADN del gen Zmax1 y el gen HBM. La localización cromosómica fue refinada mediante la adición de más marcadores genéticos al panel de mapeo utilizado para mapear el gen, y mediante la ampliación de la genealogía para incluir más individuos. La ampliación de la genealogía era crítica debido a que los nuevos individuos que se han sometido a tipificación genotípica albergan eventos de recombinación críticos que estrechan la región. Para identificar los genes de la región de 11q13.3, se identificó un grupo de clones de BAC que contenían esta región cromosómica. Los clones de BAC servían como molde para la secuenciación genómica, y también como reactivo para identificar las secuencias codificadoras mediante selección de ADNc directa. La secuenciación genómica y la selección directa de ADNc se utilizaron para caracterizar más de 1,5 millones de pares de bases de ADN de 11q13.3. El gen Zmax1 fue identificado en esta región y el gen HBM fue descubierto después del análisis mutacional de los individuos afectados y no afectados.

Cuando un gen ha sido localizado genéticamente en una región cromosómica, los genes de esta región se pueden caracterizar a nivel molecular por medio de una serie de etapas que incluyen: clonación de la región completa de ADN en un grupo de clones solapantes (mapeo físico), caracterización de genes codificados por estos clones por medio de una combinación de selección directa de ADNc, "caza" de exones y secuenciación de ADN (identificación de genes), e identificación de mutaciones en estos genes mediante secuenciación comparativa de ADN de los miembros afectados y no afectados de la familia con HBM (análisis de mutaciones).

El mapeo físico se completa escrutando genotecas de ADN humano clonado en vectores que se propagan en E. coli o S. cereviseae utilizando análisis de PCR diseñados para amplificar marcas moleculares únicas en la región cromosómica de interés. Para generar un mapa físico de la región candidato de HBM, se escrutó una genoteca de ADN humano clonado en Cromosomas Artificiales Bacterianos (BAC) con un grupo de marcadores de Lugares Etiquetados por su Secuencia (STS) que habían sido mapeados previamente para el cromosoma 11q12-q13 con el esfuerzo del Proyecto Genoma Humano.

Los STS son marcas moleculares únicas en el genoma humano que pueden ser analizadas mediante PCR. A través de los esfuerzos combinados del Proyecto Genoma Humano, se ha determinado la localización de miles de STS en los veintidós autosomas y dos cromosomas sexuales. Para una tentativa de clonación posicional, el mapa físico está ligado al mapa genético debido a que los marcadores utilizados para el mapeo genético también se pueden utilizar como STS para el mapeo físico. Escrutando una genoteca BAC con una combinación de STS derivados de marcadores genéticos, genes, y fragmentos de ADN al azar, se puede ensamblar un mapa físico formado por clones solapantes que representan todo el ADN de la región cromosómica de interés.

Los BAC son vectores de clonación para segmentos grandes (80 kilobases a 200 kilobases) de ADN humano u otro que se propagan en E. coli. Para construir un mapa físico utilizando BAC, se escruta una genoteca de clones de BAC de manera que se identifican los clones individuales que albergan la secuencia de ADN correspondiente a un STS o grupo de STS dado. En todo el genoma humano, los marcadores STS están espaciados aproximadamente de 20 a 50 kilobases, de manera que un clon de BAC individual contiene típicamente al menos dos marcadores STS. Además, las genotecas de BAC que fueron escrutadas contienen suficiente ADN clonado para abarcar más de seis veces el genoma humano. Por lo tanto, un STS individual identifica típicamente más de un clon de BAC. Escrutando una genoteca de BAC con una cobertura de seis veces con una serie de marcadores STS espaciados aproximadamente 50 kilobases, se puede ensamblar un mapa físico que consiste en una serie de clones de BAC solapantes, esto es cóntigos de BAC, para cualquier región del genoma humano. Este mapa está íntimamente ligado al mapa genético debido a que muchos de los marcadores STS utilizados para preparar el mapa físico también son marcadores
genéticos.

Cuando se construye un mapa físico, a menudo sucede que hay espacios en el mapa de STS del genoma que dan como resultado la incapacidad de identificar clones de BAC que son solapantes en una localización dada. Típicamente, el mapa físico se construye primero a partir de un grupo de STS que han sido identificados por medio de la literatura disponible públicamente y las fuentes de la World Wide Web. El mapa inicial consiste en varios cóntigos de BAC separados que están separados por espacios de distancia molecular desconocida. Para identificar los clones de BAC que llenan estos espacios, es necesario desarrollar nuevos marcadores STS desde los extremos de los clones a cualquier lado del espacio. Esto se realiza secuenciando los 200 a 300 pares de bases terminales de los BAC que flanquean el espacio, y desarrollando un análisis de PCR para amplificar una secuencia de 100 o más pares de bases. Si se demuestra que las secuencias terminales son únicas en el genoma humano, los nuevos STS se pueden utilizar para escrutar la genoteca de BAC para identificar BAC adicionales que contienen el ADN del espacio en el mapa fisiológico. Para ensamblar un cóntigo de BAC que abarque una región del tamaño de la región candidato de HBM (2.000.000 o más pares de bases), a menudo es necesario desarrollar nuevos marcadores de STS a partir de los extremos de diversos clones.

Después de construir un cóntigo de BAC, este grupo de clones solapantes sirve como molde para identificar los genes codificados en la región cromosómica. La identificación del gen se puede completar mediante muchos métodos. Tres métodos son utilizados comúnmente: (1) se puede secuenciar un grupo de BAC seleccionados del cóntigo de BAC para representar la región cromosómica completa, y se pueden utilizar métodos computacionales para identificar todos los genes, (2) se pueden utilizar los BAC del cóntigo de BAC como reactivo para clonar los ADNc correspondientes a los genes codificados en la región mediante un método denominado selección directa de ADNc, o (3) se pueden utilizar los BAC del cóntigo de BAC para identificar las secuencias codificadoras seleccionando motivos de secuencia de ADN específicos en un procedimiento denominado "caza" de exones.

Para secuenciar el cóntigo de BAC completo que representa la región candidata de HBM, se eligió un grupo de BAC para la subclonación en vectores plasmídicos y la posterior secuenciación de ADN de estos subclones. Puesto que el ADN clonado en los BAC representa ADN genómico, esta secuenciación es referida como secuenciación genómica para distinguirla de la secuenciación de ADNc. Para iniciar la secuenciación genómica para una región cromosómica de interés, se eligen numerosos clones de BAC no solapantes. Se prepara el ADN para cada clon de BAC, y los clones se someten a cizalla en pequeños fragmentos al azar que son clonados con posterioridad en vectores plasmídicos normalizados tales como pUC18. Los clones plasmídicos se hacen crecer después para propagar los fragmentos más pequeños, y estos son los moldes para la secuenciación. Para asegurar una cobertura adecuada y una calidad de la secuencia para la secuencia de ADN de BAC, se secuencian suficientes clones plasmídicos para producir una cobertura de seis veces el clon de BAC. Por ejemplo, si el BAC tiene 100 kilobases de longitud, los fagémidos se secuencian para producir 600 kilobases de secuencia. Puesto que el ADN de BAC fue sometido a cizalla al azar antes de clonar el vector del fagémido, las 600 kilobases de la secuencia de ADN bruta se pueden ensamblar mediante métodos computacionales en secuencias de ADN solapantes denominadas cóntigos de secuencia. Para los propósitos de la identificación inicial del gen mediante métodos computacionales, es suficiente una cobertura de seis veces de cada BAC para producir de diez a veinte cóntigos de secuencia de 1.000 pares de bases a 20.000 pares de bases.

La estrategia de secuenciación empleada fue secuenciar inicialmente BAC de "siembra" del cóntigo de BAC en la región candidata de HBM. La secuencia de los BAC de "siembra" se utilizó después para identificar los BAC mínimamente solapantes del cóntigo, y éstos se secuenciaron con posterioridad. De esta manera, se secuenció la región candidato completa, dejando diversos espacios de secuencia pequeños en cada BAC. Esta secuencia sirvió como molde para la identificación computacional del gen. Un método para la identificación computacional del gen consiste en comparar la secuencia del cóntigo de BAC con las bases de datos de ADNc y las secuencias genómicas disponibles públicamente, p. ej., unigene, dbEST, genbank. Estas comparaciones se realizan típicamente utilizando la familia de algoritmos de ordenador y los programas BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)). La secuencia de BAC también se puede traducir a secuencia de proteína, y la secuencia de proteína se puede utilizar para investigar las bases de datos de proteínas disponibles públicamente, utilizando una versión de BLAST diseñada para analizar secuencias de proteínas (Altschul et al., Nucl. Acids Res., 25:3339-3402 (1997)). Otro método consiste en utilizar algoritmos de ordenador tales como MZEF (Zhang, Proc. Natl. Acad. Sci., 94:565-568 (1997)) y GRAIL (Uberbacher et al., Methods Enzymol., 266:259-281 (1996)), que pronostican la localización de los exones en la secuencia basándose en la presencia de motivos de secuencia de ADN específicos que son comunes a todos los exones, así como la presencia del uso de codones típica de las secuencias que codifican proteínas en seres humanos.

Además de identificar genes mediante métodos computacionales, los genes también se identifican mediante selección directa de ADNc (Del Mastro et al., Genome Res. 5(2):185-194 (1995)). En la selección directa de ADNc, se preparan las reservas de ADNc de tejidos de interés, y se utilizan los BAC de la región candidato en un análisis de hibridación en líquido para capturar los ADNc que emparejan las bases con las regiones codificadoras de BAC. En los métodos descritos en la presente memoria, se crearon las reservas de ADNc a partir de varios tejidos diferentes mediante cebado al azar del ADNc de la primera hebra de ARN poliA, sintetizando el ADNc de la segunda hebra mediante métodos normalizados, y añadiendo conectores a los extremos de los fragmentos de ADNc. Los conectores se utilizan para amplificar las reservas de ADNc. Los clones de BAC se utilizan como molde para la síntesis de ADN in vitro para crear una copia marcada con biotina del ADN de BAC. La copia marcada con biotina del ADN de BAC se desnaturaliza después y se incuba con un exceso de las reservas de ADNc con conectores, amplificadas mediante PCR que también han sido desnaturalizadas. Se permite que el ADN de BAC y el ADNc hibriden en solución, y se aíslan los heterodúplex entre el BAC y el ADNc utilizando cuentas magnéticas recubiertas con estreptavidina. Los ADNc que son capturados por el BAC se amplifican después utilizando cebadores complementarios a las secuencias de los conectores, y se repite el proceso de hibridación/selección una segunda ronda. Después de dos rondas de selección directa de ADNc, los fragmentos de ADNc se clonan, y se crea una genoteca de estos fragmentos de selección directa.

Los clones de ADNc aislados mediante selección directa se analizan mediante dos métodos. Puesto que se utiliza una reserva de BAC de la región candidata de HBM para proporcionar la secuencia de ADN genómico, los ADNc deben ser mapeados para los BAC individuales. Esto se logra ordenando los BAC en placas de microtitulación, y replicando su ADN en gradillas de alta densidad. Los clones de ADNc individuales se hibridan después con la gradilla para confirmar que tienen una identidad de secuencia con un BAC individual del grupo utilizado para la selección directa, y para determinar la identidad específica de ese BAC. Los clones de ADNc que se confirma que corresponden a BAC individuales se secuencian. Para determinar si los clones de ADNc aislados mediante selección directa comparten identidad de secuencia o similitud con los genes identificados previamente, se comparan el ADN y las secuencias codificadoras de la proteína con las bases de datos disponibles públicamente utilizando la familia de programas BLAST.

La combinación de la secuencia de ADN genómico y la secuencia de ADNc proporcionada por la secuenciación de BAC y mediante selección directa del ADNc produce una lista inicial de supuestos genes en la región. Los genes de la región eran todos candidatos al locus de HBM. Para caracterizar adicionalmente cada gen, se realizaron transferencias Northern para determinar el tamaño del transcrito correspondiente a cada gen, y para determinar qué supuestos exones eran transcritos juntos para constituir un gen individual. Para el análisis de transferencia Northern de cada gen, se prepararon sondas de clones de ADNc sometidos a selección directa o amplificando mediante PCR fragmentos específicos de ADN genómico o del BAC que codifica el supuesto gen de interés. Las transferencias Northern proporcionaron información sobre el tamaño del transcrito y los tejidos en los cuales se expresaba. Para los transcritos que no eran altamente expresados, a veces fue necesario realizar un análisis de PCR de transcripción inversa utilizando ARN de los tejidos de interés como molde para la reacción.

La identificación del gen mediante métodos computacionales y mediante selección directa de ADNc proporciona una información única acerca de los genes en una región de un cromosoma. Cuando se identifican los genes, es posible examinar diferentes individuos en cuanto a las mutaciones en cada gen.

I. Tipificación genotípica utilizando Mediciones de DXA

Las mediciones del contenido mineral óseo espinal (BMC) y de la densidad mineral ósea (BMD) realizadas en la Creighton University (Omaha, Nebraska) se llevaron a cabo mediante DXA utilizando un densitómetro Norland Instruments (Norland XR2600 Densitometer, Dual Energy X-ray Absorptiometry, DXA). Las mediciones de BMC y BMD espinales en otros lugares utilizaban la maquinaria disponible. Se estima que existen 800 máquinas de DXA funcionando actualmente en los Estados Unidos. Las ciudades más grandes tienen oficinas o centros de formación de imágenes que tienen capacidad para DXA, normalmente una máquina Lunar u Hologic. Cada lugar que proporcionaba los datos de BMC y BMD espinales incluía copias de las impresiones de sus máquinas para proporcionar la verificación de que las regiones de interés para la medición de BMD se habían seleccionado apropiadamente. Se obtuvieron las historias clínicas completas y las radiografías esqueléticas.

El fenotipo de HBM se define por los siguientes criterios: BMD espinal muy elevada; una historia clínica desprovista de cualquier síndrome de masa ósea elevada conocido; y radiografías esqueléticas que muestran una forma normal del esqueleto apendicular.

II. Tipificación Genotípica de Marcadores Microsatélite

Para estrechar el intervalo genético a una región más pequeña que la referida originalmente por Johnson et al., Am. J. Hum. Genet., 60:1326-1332 (1997), se tipificaron marcadores microsatélite adicionales en el cromosoma 11q12-13. Los nuevos marcadores incluían: D11S4191, D11S1883, D11S1785, D11S4113, D11S4136, D11S4139, (Dib,
et al., Nature, 380:152-154 (1996), FGF3 (Polymeropolous, et al., Nucl. Acid Res., 18:7468 (1990)), as
well as GTC_HBM_Marker_1, GTC_HBM_Marker_2, GTC_HBM_Marker_3, GTC_HBM_Marker_4, GTC_HBM_
Marker_5, GTC_HBM_Marker_6, and GTC_HBM_Marker_7 (Véase la Fig. 2).

Se recogió sangre (20 ml) en tubos con tapón lavender (que contenían EDTA) por medio de un flebotomista certificado. La sangre se almacenó refrigerada hasta la extracción del ADN. El ADN se ha extraído de sangre almacenada hasta durante 7 días en el refrigerador sin reducción en la calidad o cantidad de rendimiento. Para aquellos sujetos a los que se extrajo la sangre en sitios distantes, se utilizó con éxito un protocolo de transporte marítimo en más de una docena de ocasiones. Las muestras de sangre se embarcaron en expreso nocturno en un contenedor de Styrofoam® con envases congeladores para proporcionar refrigeración. Los tubos con tapón lavender se colocaron sobre tubos para transporte marítimo de plástico individuales y después en bolsas para objetos biopeligrosos con "cierre de cremallera". Cuando las muestras llegaron al día siguiente, se procesaron inmediatamente para extraer el ADN.

El procedimiento de extracción de ADN utilizó un kit adquirido de Gentra Systems, Inc. (Minneapolis, Minnesota). Brevemente, el procedimiento implicaba añadir 3 volúmenes de tampón de lisis de glóbulos rojos a la sangre completa. Tras incubaciones de 10 minutos a la temperatura ambiente, la solución se centrifugó en una centrífuga de mesa Beckam a 2.000 X g durante 10 minutos. El sedimento de glóbulos blancos se resuspendió en Tampón de Lisis Celular. Una vez que el sedimento se hubo resuspendido completamente y estuvo libre de agrupaciones, la solución fue digerida con ARNasa A durante 15 minutos a 37ºC. Las proteínas se hicieron precipitar mediante la adición de la Solución de Precipitación de Proteína proporcionada y se separaron mediante centrifugación. El ADN se hizo precipitar del sobrenadante mediante la adición de isopropanol. Este método era simple y rápido, requiriendo solamente 1-2 horas, y permitía el procesamiento de docenas de muestras simultáneamente. El rendimiento de ADN era rutinariamente >8 mg
para una muestra de 20 ml de sangre completa y tenía un PM >50 kb. El ADN fue archivado almacenando alícuotas de 50 \mug codificadas a -80ºC en forma de producto precipitado en etanol.

Se sometió el ADN a tipificación genotípica utilizando un cebador oligonucleotídico marcado fluorescentemente y un cebador oligonucleotídico no marcado. Los oligonucleótidos marcado y no marcado se obtuvieron de Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, Iowa). Todos los demás reactivos para la tipificación genotípica de microsatélites fueron adquiridos de Perkin Elmer-Applied Biosystems, Inc. ("PE-ABI") (Norwalk, Connecticut). Se realizaron reacciones de PCR individuales para cada marcador, como se describe en PE-ABI utilizando AmpliTag DNA Polymerase. Las reacciones se añadieron a 3,5 \mul de tampón de carga que contenía formamida desionizada, dextrano azul y patrones TAMRA con un tamaño de 350 (PE-ABI). Después de calentar a 95ºC durante 5 minutos para desnaturalizar el ADN, las muestras se cargaron y se sometieron a electroforesis como se describe en el manual del operario para el Model 377 DNA Sequencer (PE-ABI, Foster City, California). Tras la electroforesis en gel, los datos se analizaron utilizando el soporte lógico PE-ABI GENESCAN® y GENOTYPER®. Primero, en el soporte lógico GENESCAN®, se optimizó manualmente el rastreo de las calles antes de la primera etapa de análisis. Una vez extraídos los datos de las calles del gel, se examinaron los perfiles de la curva normalizada de cada calle y se verificó la linealidad y el tamaño de la lectura. Las calles, que tenían problemas con cualquiera de estos parámetros, fueron rastreadas de nuevo y verificadas. Una vez que se hubieron rastreado todas las calles y se hubieron identificado correctamente los patrones de tamaño, se importaron los datos al GENOTYPER® para la identificación de alelos. Para acelerar la lectura de los alelos ("binning"), se utilizó el programa Linkage Designer del sitio de Internet del Dr. Guy Van Camp (http://alt.www.uia.ac.be/u/dnalab/1d.htm1). Este programa facilita enormemente la importación de los datos generados por GENOTYPER® al programa de trazado de la genealogía Cyrillic (Versión 2.0, Cherwell Scientific Publishing Limited, Oxford, Great Britain) y el posterior análisis de asociación utilizando el programa LINKAGE (Lathrop et al., Am. J. Hum. Genet., 37:482-498 (1985)).

III. Análisis de Asociación

La Fig. 1 demuestra la genealogía de los individuos utilizados en los estudios de asociación genética para esta invención. Específicamente, se realizó el análisis de asociación bipuntual utilizando los componentes MLINK y LINKMAP del programa LINKAGE (Lathrop et al., Am. J. Hum. Genet., 37:482-498 (1985)). Los datos de genealogía/marcador se exportaron de Cyrillic en forma de un pre-file al programa Makeped y se convirtieron en un ped-file adecuado para el análisis de asociación.

El análisis de asociación original se realizó utilizando tres modelos: (i) modelo completamente penetrante, dominante autosómico, (ii) un modelo dominante autosómico, con penetrancia reducida, y (iii) un modelo de rasgos cuantitativo. Se mapeó el locus HBM para el cromosoma 11q12-13 analizando el ADN para los marcadores asociados de 22 miembros de una familia ampliada, grande. Se utilizó una tecnología altamente automatizada con un panel de 345 marcadores fluorescentes que abarcaban los 22 autosomas a un intervalo de espacio que oscilaba de 6 a 22 cM. Solamente los marcadores de esta región del cromosoma 11 mostraban evidencia de asociación (puntuación LOD \sim3,0).
La puntuación LOD más alta (5,74) obtenida mediante análisis bipuntual y multipuntual era D11S987 (posición 55 en el mapa de la Fig. 2). El intervalo de confianza del 95% situaba el locus HBM entre los marcadores D11S905 y D11S937 (posición 41-71 del mapa de la Fig. 2). El análisis del haplotipo también sitúa el gen Zmax1 en esta misma región. Se pueden encontrar descripciones adicionales de los marcadores D11S987, D11S905, y D11S937 en Gyapay et al., Nature Genetics, Vol. 7, (1994).

En esta invención, los autores refieren el estrechamiento del intervalo de HBM para la región entre los marcadores D11S987 y GTC_HBM_Marker_5. Estos dos marcadores se encuentran entre los marcadores delimitantes del análisis original (D11S11S905 y D11S937) y están a aproximadamente 3 cM entre sí. El estrechamiento del intervalo se completó utilizando los datos genotípicos de los marcadores D11S4191, D11S1883, D11S1785, D11S4113, D11S4136, D11S4139, (Dib et al., Nature, 380:152-154 (1996)), FGF3 (Polymeropolous et al., Nucl. Acid Res., 18:7468 (1990)) (se puede encontrar información sobre los marcadores genéticos en el sitio de internet de Genome Database, http://gdbwww.gdb.org/), así como los marcadores GTC_HBM_Marker_1, GTC_HBM_Marker_2, GTC_HBM_Marker_3, GTC_HBM_Marker_4, GTC_HBM_Marker_5, GTC_HBM_Marker_6, y GTC_HBM_
Marker_7.

Como se muestra en la Fig. 1, el análisis del haplotipo con los marcadores genéticos anteriores identifica los eventos de recombinación (entrecruzamientos) en los individuos 9019 y 9020 que afinan significativamente el intervalo del cromosoma 11 en el cual está localizado el gen Zmax1. El individuo 9019 es un individuo afectado de HBM que hereda una porción de cromosoma 11 del cromosoma materno con el gen HBM, y una porción del homólogo del cromosoma 11. La porción heredada del cromosoma que porta el gen HBM incluye los marcadores D11S935, D11S1313, GTC_HBM_Marker_4, D11S987, D11S1296, GTC_HBM_Marker_6, GTC_HBM_Marker_2, D11S970, GTC_HBM_Marker_3, D11S4113, GTC_HBM_Marker_1, GTC_HBM_Marker_7 y GTC_HBM_Marker_5. La porción de D11S4136 y que continúa en la dirección telomérica deriva del cromosoma no-HBM. Este dato sitúa el gen Zmax1 en una localización centromérica con respecto al marcador GTC_HBM_Marker_5. El individuo 9020 es un individuo no afectado que también muestra un evento de recombinación crítico. Este individuo hereda un cromosoma 11 paterno recombinante que incluye los marcadores D11S935, D11S1313, GTC_HBM_Marker_4, D11S987, D11S1296 y GTC_HBM_Marker_6 del homólogo del cromosoma 11 del padre de ella (individuo 0115) que porta el gen HBM, y los marcadores GTC_HBM_Marker_2, D11S970, GTC_HBM_Marker_3, GTC_HBM_Marker_1, GTC_HBM_Marker_7, GTC_HBM_Marker_5, D11S4136, D11S4139, D11S1314, y D11S937 del cromosoma 11 del padre de ella que no porta el gen HBM. El marcador D11S4113 no es informativo debido su naturaleza homocigótica en el individuo 0115. Este evento de recombinación sitúa el límite centromérico de la región HBM entre los marcadores D11S1296 y D11S987.

También se utilizó el análisis de asociación bipuntual para confirmar la localización del gen Zmax1 en el cromosoma 11. Los resultados de la asociación para el análisis bipuntual bajo un modelo de penetrancia total se presentan en la siguiente Tabla 1. Esta tabla enumera los marcadores genéticos en la primera columna y las fracciones de recombinación a través de la parte superior de la tabla. Cada celda de la columna muestra la puntuación LOD para un marcador individual sometido a ensayo en cuanto a la asociación al gen Zmax1 en la fracción de recombinación mostrada en la primera fila. Por ejemplo, la puntuación LOD pico de 7,66 aparece en el marcador D11S970, que está en el intervalo definido mediante análisis del haplotipo.

TABLA 1

1

Un polimorfismo de un único nucleótido (SNP) define adicionalmente la región HBM. Este SNP se denomina SNP_Contig033-6 y está localizado 25 kb centromérico con respecto al marcador genético GTC_HBM_Marker_5. Este SNP es telomérico con respecto al marcador genético GTC_HBM_Marker_7. SNP_Contig033-6 está presente en el individuo 0113 afectado de HBM. No obstante, el individuo 9019 afectado de HBM, que es el hijo de 0113, no porta este SNP. Por lo tanto, esto indica que el entrecruzamiento es centromérico con respecto a este SNP. La secuencia del cebador para los marcadores genéticos GTC_HBM_Marker_5 y GTC_HBM_Marker_7 se muestra en la Tabla 2 más abajo.

TABLA 2

2

Los parientes descritos tienen numerosos rasgos de gran interés, siendo los más importantes sus huesos, si bien muy densos, tienen una forma absolutamente normal. Las dimensiones externas de los esqueletos de los individuos afectados por HBM son normales, y, aunque se encuentran presentes cavidades medulares, no hay interferencia con la hematopoyesis. Los miembros afectados por HBM parecen ser resistentes a la fractura, y no hay síntomas neurológicos, ni síntomas de deterioro de la función de ningún órgano o aparato en los miembros examinados. Los miembros afectados por HBM de la familia viven hasta una edad avanzada sin enfermedad o discapacidad indebida. Además, el fenotipo de HBM no lleva emparejados otros trastornos tales como osteoporosis, pseudoglioma por osteoporosis, enfermedad de Engelmann, enfermedad de Ribbing, hiperfosfatasemia, enfermedad de Van Buchem, meloreostosis, osteopetrosis, picnodisostosis, escleroestenosis, osteopoiquilosis, acromegalia, enfermedad de Paget, displasia fibrosa, estenosis tubular, osteogenesis imperfecta, hipoparatiroidismo, pseudohipoparatiroidismo, pseudopseudohipoparatiroidismo, hiperparatiroidismo primario y secundario y síndromes asociados, hipercalciuria, carcinoma medular de la glándula tiroidea, osteomalacia y otras enfermedades. Claramente, el locus HBM en esta familia tiene un papel muy poderoso y sustancial en la regulación de la densidad ósea, y su identificación es una etapa importante en el conocimiento de la ruta o las rutas que regulan la densidad ósea y la patogénesis de enfermedades tales como la
osteoporosis.

Además, los individuos mayores que portan el gen HBM, y por lo tanto la expresión de la proteína HBM, no muestran la pérdida de masa ósea característica de los individuos normales. Por otra parte, los individuos que portan el gen HBM presentan un bajo contenido de triglicéridos, VLDL, y LDL y/o un incremento de HDL. En otras palabras, el gen HBM es un supresor de la osteoporosis y puede disminuir las afecciones asociadas con el riesgo cardiovascular arteriosclerótico y/o aterosclerótico. En esencia, los individuos que portan el gen HBM tienen una dosis de proteína HBM, y, como resultado, niveles inferiores de lípidos perjudiciales (p. ej., VLDL, LDL y triglicéridos). Esta observación in vivo es una fuerte evidencia de que el tratamiento de los individuos normales con el gen HBM o la proteína, o un fragmento de la misma, mejorará la osteoporosis y las afecciones o enfermedades arterio- o ateroscleróticas.

IV. Mapeo Físico

Para proporcionar reactivos para la clonación y caracterización del locus HBM, se utilizaron los datos del mapeo genético descrito antes para construir un mapa físico de la región que contiene Zmax1 en el cromosoma 11q13.3. El mapeo físico consiste en un grupo ordenado de marcas moleculares, y un grupo de clones de BAC que contienen la región del gen Zmax1 del cromosoma 11q13.3.

Se utilizaron diversas fuentes de mapeo disponibles al público para identificar los marcadores STS existentes (Olson et al., Science, 245:1434-1435 (1989)) en la región HBM. Las fuentes incluían GDB, Whitehead Institute Genome Center, dbSTS y dbEST (NCBI), 11db, University of Texas Southwestern GESTEC, Stanford Human Genome Center, y diversas referencias de la literatura (Courseaux et al., Genomics, 40:13-23 (1997), Courseaux et al., Genomics, 37:354-365 (1996), Guru et al., Genomics, 42:436-445 (1997), Hosoda et al., Genes Cells, 2:345-357 (1997), James et al., Nat. Genet., 8:70-76 (1994), Kitamura et al., DNA Research, 4:281-289 (1997), Lemmens et al., Genomics, 44:94-100 (1997), Smith et al., Genome Res., 7:835-842 (1997)). Los mapas fueron integrados manualmente para identificar los marcadores que mapean la región que contiene Zmax1.

Los cebadores para los STS existentes obtenidos de GDB o de referencias de la literatura se enumeran en la siguiente Tabla 3. De este modo, la Tabla 3 muestra los marcadores STS utilizados para preparar el mapa físico de la región del gen Zmax1.

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(Tabla pasa a página siguiente)

3

4

5

6

7

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Los STS novedosos fueron desarrollados o bien de secuencias genómicas disponibles para el público o bien de extremos de insertos de BAC derivados de la secuencia. Los cebadores se seleccionaron utilizando una escritura que realiza automáticamente el enmascaramiento de la secuencia vectora y repetitiva utilizando Cross_match (P. Green, U. of Washington) y la posterior selección de cebadores utilizando Primer3 (Rozen, Skaletsky (1996, 1997). Primer3 está disponible en www.genome.wi.mit. edu/genome_software/other/primer3.html.

Las condiciones para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para cada par de cebadores se optimizaron inicialmente con respecto a la concentración de MgCl_{2}. El tampón estándar fue Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, MgCl_{2}, cada uno de los dNTP 0,2 mM, cada cebador 0,2 \muM, 2,7 ng/\mul de ADN humano, 0,25 U de AmpliTaq (Perkin Elmer) y concentraciones de MgCl_{2} de 1,0 mM, 1,5 mM, 2,0 mM o 2,4 mM. Las condiciones de ciclación incluían una desnaturalización inicial a 94ºC durante 2 minutos seguido de 40 ciclos a 94ºC durante 15 segundos, 55ºC durante 25 segundos, y 72ºC durante 25 segundos seguido de una prolongación final a 72ºC durante 3 minutos. Dependiendo de los resultados de la ronda inicial de optimización las condiciones se optimizaron adicionalmente si era necesario. Las variables incluyeron aumentar la temperatura de hibridación a 58ºC o 60ºC, aumentar el número de ciclos a 42 y los tiempos de hibridación y prolongación a 30 segundos, y utilizar AmpliTaqGold (Perkin Elmer).

Se obtuvieron clones de BAC (Kim et al., Genomics, 32:213-218 (1996), Shizuya et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:8794-8797 (1992)) que contenían marcadores STS de interés mediante escrutinio por PCR de reservas de ADN de una genoteca de BAC humana total adquirida de Research Genetics. Se utilizaron reservas de ADN derivadas de las placas de la genoteca 1-596 correspondientes a nueve equivalentes genómicos de ADN humano. El proceso de escrutinio inicial implicaba reacciones de PCR de marcadores individuales frente a las súper-reservas, esto es, una mezcla de ADN derivado de todos los clones de BAC de ocho placas de la genoteca de 384 pocillos. Para cada súper-reserva positiva, se escrutaron las reservas por placa (8), fila (16) y columna (24) para identificar una única dirección de la genoteca. Los productos de la PCR se sometieron a electroforesis en geles de agarosa al 2% (Sigma) que contenían 0,5 mg/ml de bromuro de etidio en 1X TBE a 150 voltios durante 45 minutos. Las unidades de electroforesis utilizadas fueron los sistemas del Modelo A3-1 de Owl Scientific Products. Típicamente, los geles contenían 10 series de calles con 50 pocillos/serie. Los marcadores de peso molecular (escala 100 pb, Life Technologies, Bethesda, MD) se cargaron en ambos extremos del gel. Las imágenes de los geles fueron capturadas con una cámara Kodak DC40 CCD y procesadas con el soporte lógico Kodak 1D. Los datos del gel fueron exportados en forma de archivos de texto delimitados por etiquetas; los nombres de los archivos incluían información a cerca de la genoteca escrutada, los archivos de imágenes del gel y el marcador escrutado. Estos datos fueron importados automáticamente utilizando una escritura Per1 a medida del usuario a las bases de datos Filemaker^{TM} PRO (Claris Corp.) para el almacenamiento y análisis de los datos. En los casos en los que se obtenía una información sobre la dirección del clon incompleta o ambigua, se realizaron experimentos adicionales para recuperar una única dirección de la genoteca completa.

La recuperación de cultivos de BAC clonales de la genoteca implicaba aplicar en estrías una muestra del pocillo de la genoteca sobre agar LB (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982)) que contenía 12,5 \mug/ml de cloramfenicol (Sigma). Se sometieron a ensayo dos colonias individuales y una porción del cuadrante de estrías inicial con marcadores STS apropiados mediante PCR de la colonia para la verificación. Los clones positivos fueron almacenados en caldo LB que contenía 12,5 \mug/ml de cloramfenicol y 15% de glicerol a -70ºC.

Se utilizaron varios tipos diferentes de métodos de preparación de ADN para el aislamiento del ADN de BAC. Se utilizó con éxito el protocolo de miniprep para la lisis alcalina manual enumerado más abajo (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982)) para la mayoría de las aplicaciones, esto es, mapeo de restricción, análisis en gel CHEF, mapeo FISH, pero no era reproducible con éxito en la secuenciación terminal. Se utilizaron específicamente los protocolos Autogen y Qiagen para la preparación de ADN de BAC con el propósito de la secuenciación final.

Las bacterias se hicieron crecer en 15 ml de Caldo Terrific que contenía 12,5 \mug/ml de cloramfenicol en un tubo cónico de 50 ml a 37ºC durante 20 horas con sacudimiento a 300 rpm. Los cultivos se centrifugaron en Sorvall RT 6000 D a 3000 rpm (\sim1800 g) a 4ºC durante 15 min. Después el sobrenadante se aspiró tan completamente como fue posible. En algunos casos los sedimentos celulares se congelaron a -20ºC en esta etapa hasta durante 2 semanas. El sedimento se sometió a vórtice después para homogeneizar las células y minimizar las agrupaciones. Se añadieron 250 \mul de solución P1 (glucosa 50 mM, Tris-HCl 15 mM, pH 8, EDTA 10 mM, y 100 \mug/ml de ARNasa A) y la mezcla se pipeteó arriba y abajo para mezclar. Luego se transfirió la mezcla a un tubo Eppendorf de 2 ml. Después se añadieron 350 \muL de solución P2 (NaOH 0,2 N, SDS al 1%), la mezcla se mezcló suavemente y se incubó durante 5 minutos a la temperatura ambiente. Se añadieron 350 \mul de solución P3 (KOAc 3M, pH 5,5) y la mezcla se mezcló suavemente hasta que se formó un producto precipitado de color blanco. La solución se incubó sobre hielo durante 5 minutos y después se centrifugó a 4ºC en una microcentrífuga durante 10 minutos. El sobrenadante se transfirió cuidadosamente (evitando el producto precipitado de color blanco) a un tubo Eppendorf de 2 ml nuevo, y se añadieron 0,9 ml de isopropanol, la solución se mezcló y se dejó sobre hielo durante 5 minutos. Las muestras se centrifugaron durante 10 minutos, y el sobrenadante se separó cuidadosamente. Los sedimentos se lavaron en etanol del 70% y se secaron al aire durante 5 minutos. Los sedimentos se resuspendieron en 200 \mul de TE8 (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1,0 mM), y se añadió ARNasa A (Boehringer Mannheim) a 100 \mug/ml. Las muestras se incubaron a 37ºC durante 30 minutos, después se hicieron precipitar mediante adición de C_{2}H_{3}O_{2}Na\cdot3H_{2}O 0,5 M y 2 volúmenes de etanol. Las muestras se centrifugaron durante 10 minutos, y los sedimentos se lavaron con etanol del 70% seguido de secado al aire y disolución en 50 \mul de TE8. Los rendimientos típicos para esta prep de ADN fueron de 3-5 \mug/15 ml de cultivo bacteriano. Se utilizaron de 10 a 15 \mul para el análisis de restricción con HindIII; se utilizaron 5 \mul para la digestión con NotI y la clasificación por tamaños de los insertos de clones mediante electroforesis en gel CHEF.

Se inocularon BAC en 15 ml de 2X Caldo LB que contenía 12,5 \mug/ml de cloramfenicol en un tubo cónico de 50 ml. Se inocularon 4 tubos para cada clon. Los cultivos se hicieron crecer durante la noche (\sim16 horas) a 37ºC con sacudimiento vigoroso (>300 rpm). Se siguieron las condiciones normalizadas para el aislamiento del ADN de BAC recomendadas por el fabricante de Autogen 740. Se colocaron muestras de cultivo de 3 ml en tubos Autogen para un total de 60 ml o 20 tubos por clon. Las muestras se disolvieron finalmente en 100 \mul de TE8 con 15 segundos de sacudimiento como parte del protocolo de Autogen. Una vez que hubo finalizado el protocolo de Autogen se transfirieron las soluciones de ADN de cada tubo individual y se reunieron en un tubo Eppendorf de 2 ml. Se evitaron los tubos con grandes cantidades de restos (remanente de la etapa de sedimentación de los desechos). Los tubos se enjuagaron después con 0,5 ml de TE8 sucesivamente y esta solución se añadió al material reunido. Las soluciones de ADN se almacenaron a 4ºC; tendía a producirse agrupamiento tras congelar a -20ºC. Este ADN se utilizó directamente para el mapeo de restricción, el análisis en gel CHEF o el mapeo FISH o se purificó adicionalmente como se describe más abajo para su uso en las reacciones de secuenciación terminal.

El volumen de las soluciones de ADN se ajustó a 2 ml con TE8, después las muestras se mezclaron suavemente y se calentaron a 65ºC durante 10 minutos. Las soluciones de ADN se centrifugaron después a 4ºC durante 5 minutos y los sobrenadantes se transfirieron a un tubo cónico de 15 ml. La concentración de NaCl se ajustó después a 0,75 M (\sim0,3 ml de NaCl 5 M a la muestra de 2 ml). El volumen total se ajustó después a 6 ml con tampón de equilibrado de la columna Qiagen (Buffer QBT). Después se aplicó el sobrenadante que contenía el ADN a la columna y se permitió que entrara mediante flujo por gravedad. Las columnas se lavaron dos veces con 10 ml de Tampón QC de Qiagen. El ADN unido se hizo eluir después con cuatro alícuotas separadas de 1 ml de Tampón QF mantenido a 65ºC. El ADN se hizo precipitar con 0,7 volúmenes de isopropanol (\sim2,8 ml). Cada muestra fue transferida después a 4 tubos Eppendorf de 2,2 ml individuales e incubada a la temperatura ambiente durante 2 horas o durante la noche. Las muestras fueron centrifugadas en una microcentrífuga durante 10 minutos a 4ºC. El sobrenadante se separó cuidadosamente y se añadió 1 ml de etanol del 70%. Las muestras se centrifugaron de nuevo y debido a que los sedimentos de ADN a menudo se perdían en esta fase, el sobrenadante se separó cuidadosamente. Las muestras se centrifugaron de nuevo para concentrar el líquido restante que se separó con una punta de micropipeta. Los sedimentos de ADN se secaron después en una secadora durante 10 minutos. Se añadieron a cada tubo 20 \mul de H_{2}O destilada estéril y desionizada que después se colocó a 4ºC durante la noche. Las cuatro muestras de 20 \mul para cada clon se reunieron y los tubos se enjuagaron con otros 20 \mul de H_{2}o destilada estéril y desionizada para un volumen final de 100 \mul. Las muestras se calentaron después a 65ºC durante 5 minutos y después se mezclaron suavemente. Los rendimientos típicos fueron de 2-5 \mug/60 ml cultivo evaluado mediante digestión con NotI y comparación con ADN de lambda sin cortar.

Se dispensaron 3 ml de Caldo LB que contenía 12,5 \mug/ml de cloramfenicol en tubos Autogen sometidos a autoclave. Se utilizó un único tubo para cada clon. Para la inoculación, se separaron las provisiones de glicerol del almacenamiento a -70ºC y se colocaron sobre hielo seco. Una pequeña porción de la provisión de glicerol se separó del tubo original con un palillo estéril y se transfirió al tubo Autogen; el palillo se dejó en el tubo Autogen durante al menos dos minutos antes del descarte. Tras la inoculación los tubos se cubrieron con cinta asegurándose de que el sello estaba bien cerrado. Cuando todas las muestras estuvieron inoculadas, las unidades de los tubos fueron transferidas a un soporte de rejilla Autogen y se colocaron en un sacudidor rotatorio a 37ºC durante 16-17 horas a 250 rpm. Después del crecimiento, se utilizaron condiciones normalizadas para la preparación de ADN de BAC, como define el fabricante, para programar el Autogen. Las muestras no se disolvieron en TE8 como parte del programa y se dejó que los sedimentos de ADN se secaran. Cuando el programa se hubo completado, los tubos se separaron de la bandeja de salida y se añadieron 30 \mul de H_{2}O destilada estéril y desionizada directamente en el fondo del tubo. Después los tubos se sacudieron suavemente durante 2-5 segundos y se cubrieron con Parafilm y se incubaron a la temperatura ambiente durante 1-3 horas. Las muestras de ADN se transfirieron después a un tubo Eppendorf y se utilizaron directamente para la secuenciación o se almacenaron a 4ºC para su uso más tarde.

V. Caracterización del Clon de BAC para el Mapeo Físico

Las muestras de ADN preparadas mediante lisis alcalina manual o protocolo Autogen fueron digeridas con HindIII para el análisis de los tamaños de los fragmentos de restricción. Estos datos se utilizaron para comparar el grado de solapamiento entre los clones. Típicamente se utilizaron 1-2 \mug para cada reacción. Las mezclas de reacción incluían: 1X Tampón 2 (New England Biolabs), 0,1 mg/ml seralbúmina bovina (New England Biolabs), 50 \mug/ml ARNasa A (Boehringer Mannheim), y 20 unidades de HindIII (New England Biolabs) en un volumen final de 25 \mul. Las digestiones se incubaron a 37ºC durante 4-6 horas. El ADN de BAC también fue digerido con NotI para la estimación del tamaño del inserto mediante análisis en gel CHEF (véase más abajo). Las condiciones de reacción fueron idénticas a las de HindIII excepto que se utilizaron 20 unidades de NotI. Se añadieron seis \mul de 6X tampón de carga con Ficoll que contenía azul de bromofenol y xileno cianol antes de la electroforesis.

Los productos digeridos con HindIII fueron analizados sobre agarosa al 0,6% (Seakem, FMC Bioproducts) en 1X TBE que contenía 0,5 \mug/ml de bromuro de etidio. Los geles (20 cm X 25 cm) fueron sometidos a electroforesis en una unidad de electroforesis Modelo A4 (Owl Scientific) a 50 voltios durante 20-24 horas. Los marcadores de tamaño de peso molecular incluían ADN de lambda no digerido, ADN de lambda digerido con HindIII, y ADN _X174 digerido con HaeIII. Los marcadores de peso molecular se calentaron a 65ºC durante 2 minutos antes de cargar el gel. Las imágenes se capturaron con una cámara Kodak DC40 CCD y se analizaron con el soporte lógico Kodak 1D.

Los productos digeridos con NotI se analizaron en una unidad de electroforesis CHEF DRII (BioRad) según las recomendaciones del fabricante. Brevemente, se prepararon geles de agarosa al 1% (grado de campo pulsado BioRad) en 0,5X TBE, equilibrado durante 30 minutos en la unidad de electroforesis a 14ºC, y se sometieron a electroforesis a 6 voltios/cm durante 14 horas con circulación. Los tiempos de cambio estaban escalonados de 10 segundos a 20 segundos. Los geles fueron teñidos después de la electroforesis en 0,5 \mug/ml de bromuro de etidio. Los marcadores de peso molecular incluían ADN de lambda no digerido, ADN de lambda digerido con HindIII, Lambda ladder PFG ladder, y marcador PFG Low Range (todos de New England Biolabs).

Los ADN de BAC preparados mediante lisis alcalina manual o protocolos Autogen fueron etiquetados para el análisis FISH utilizando un kit de etiquetado Bioprime (BioRad) según la recomendación del fabricante con pequeñas modificaciones. Aproximadamente 200 ng de ADN fueron utilizados para cada 50 \mul de reacción. Se analizaron 3 \mul en un gel de agarosa al 2% para determinar el grado de etiquetado. Las reacciones se purificaron utilizando una columna giratoria Sephadex G50 antes de la hibridación in situ. Se realizó una metafase FISH como se ha descrito (Ma et al., Cytogenet. Cell Genet., 74:266-271 (1996)).

VI. Secuenciación terminal de BAC

La secuenciación de los extremos del inserto de BAC utilizaba ADN preparado mediante cualquiera de los dos métodos descritos antes. Se utilizaron los cebadores de transferencia de energía DYEnamic y los kits de secuenciación por ciclos Dynamic Direct de Amersham para las reacciones de secuenciación. Se utilizó la mezcla de secuenciación preparada incluyendo el cebador de secuenciación directo -40 de M13 (Núm. de Catálogo US79730) para el extremo del vector BAC de T7; se mezcló la mezcla de secuenciación preparada (Núm. de Catálogo US79530) con el cebador de secuenciación inverso -28 de M13 (Núm. de Catálogo US79339) para el extremo del vector BAC de SP6. Las mezclas de reacción de secuenciación incluían uno de los cuatro colorantes-cebadores marcados fluorescentemente, una de las cuatro mezclas de terminación didesoxi, dNTP, tampón de reacción, y Thermosequenase. Para cada muestra de ADN de BAC, se tomaron alícuotas de 3 \mul de la muestra de ADN de BAC para 4 tubos con tiras para PCR. Después se añadieron a cada uno de los cuatro tubos 2 \mul de una de las cuatro combinaciones de colorante cebador/mezcla de terminación. Los tubos se sellaron después y se centrifugaron brevemente antes de la PCR. Las condiciones de termociclado implicaban 1 minuto de desnaturalización a 95ºC, 15 segundos de hibridación a 45ºC, y una prolongación de 1 minuto a 70ºC durante un total de 35 ciclos. Después de la ciclación las placas se centrifugaron brevemente para recoger todo el líquido del fondo de los tubos. Después se añadieron 5 \mul de H_{2}O destilada estéril y desionizada a cada tubo, las placas se sellaron y se centrifugaron de nuevo brevemente. Las cuatro muestras para cada BAC se reunieron. El ADN se hizo precipitar añadiendo 1,5 \mul de NH_{4}OAc 7,5 M y 100 \mul de etanol del 100% a -20ºC a cada tubo. Las muestras se mezclaron pipeteando arriba y abajo una vez. Las placas se sellaron después y se incubaron sobre hielo durante 10 minutos. Las placas se centrifugaron en una centrífuga de mesa Haraeus a 4.000 rpm (3.290 xg) durante 30 minutos a 4ºC para recuperar el ADN. El sobrenadante se separó y el exceso de líquido se absorbió sobre toallas de papel. Los sedimentos se lavaron añadiendo 100 \mul de etanol del 70% a -20ºC a cada tubo y volviendo a centrifugar a 4.000 rpm (3.290 xg) durante 10 minutos a 4ºC. El sobrenadante se separó y el líquido en exceso se separó de nuevo absorbiéndolo sobre una toalla de papel. Los vestigios de líquido restantes se separaron colocando las placas con la parte superior hacia abajo sobre una toalla de papel y centrifugando solamente hasta que la centrífuga alcanzó 800 rpm. Las muestras se secaron al aire después a la temperatura ambiente durante 30 minutos. Los tubos se taparon y se almacenaron en seco a -20ºC hasta la electroforesis. Inmediatamente antes de la electroforesis el ADN se disolvió en 1,5 \mul de colorante de carga de Amersham. Luego las placas se sellaron y se centrifugaron a 2.000 rpm (825 xg). Las placas se sometieron a vórtice sobre un aparto oscilatorio para placas durante 1-2 minutos. Después las muestras se volvieron a centrifugar a 2.000 rpm (825 xg) brevemente. Luego las muestras se calentaron a 65ºC durante 2 minutos e inmediatamente se colocaron sobre hielo. Se realizó una electroforesis en gel normalizada sobre secuenciadores fluorescentes ABI 377 según la recomendación del
fabricante.

VII. Sub-clonación y Secuenciación del ADN de BAC de HBM

El mapa físico de la región del gen Zmax1 proporciona un grupo de clones de BAC que contienen el gen Zmax1 y el gen HBM. Se ha completado la secuenciación de ADN de diversos BAC de la región. Los datos de la secuencia de ADN son el único reactivo que incluye datos que puede utilizar un experto en la técnica para identificar el gen Zmax1 y el gen HBM, o para preparar sondas para identificar el gen o los genes, o para identificar los polimorfismos de la secuencia de ADN que identifican el gen o los genes.

El ADN de BAC fue aislado según uno de dos protocolos, o bien una purificación Qiagen del ADN de BAC (Qiagen, Inc. como se describe en la literatura del producto) o bien una purificación manual que es una modificación de la lisis alcalina normalizada/preparación con Cloruro de Cesio de ADN plasmídico (véase p. ej., Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1997)). Brevemente para el protocolo manual, las células fueron sedimentadas, resuspendidas en GTE (glucosa 50 mM, Tris-Cl 25 mM (pH 8), EDTA 10 mM) y lisozima (50 mg/ml solución), seguido de NaOH/SDS (SDS 1%/NaOH 0,2N) y después una solución enfriada con hielo de KOAc 3 M (pH 4,5-4,8). Se añadió ARNasa A al sobrenadante filtrado, seguido de Proteinasa K y SDS al 20%. Después el ADN se hizo precipitar con isopropanol, se secó y se resuspendió en TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM (pH 8,0)). El ADN de BAC se purificó adicionalmente mediante centrifugación en gradiente de densidad de Cloruro de Cesio (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1997)).

Después del aislamiento, el ADN de BAC se sometió a cizalla hidrodinámicamente utilizando una HPLC (Hengen, Trends in Biochem. Sci., 22:273-274 (1997)) para un tamaño de inserto de 2.000-3.000 pb. Después de la cizalla, el ADN se concentró y se separó sobre un gel de agarosa al 1% normalizado. Una única fracción, correspondiente al tamaño aproximado, fue escindido del gel y purificado mediante electroelución (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring, NY (1989)).

Se volvieron romos los extremos de los fragmentos de ADN purificados utilizando ADN polimerasa de T4. El ADN con los extremos romos se ligó después a adaptadores del conector de BstXI únicos (5'-GTCTTCACCACGGGG y 5' GTGGTGAAGAC en un exceso molar de 100-1.000 veces). Estos conectores eran complementarios a los vectores pMPX cortados con BstXI (construidos por los autores de la invención), si bien el saliente no era auto-complementario. Por lo tanto, los conectores no concatamerizaban ni el vector de corte podría religarse consigo mismo fácilmente. Los insertos adaptados con el conector fueron separados de los conectores no incorporados sobre un gel de agarosa al 1% y purificados utilizando GeneClean (BIO 101, Inc.). El inserto adaptado con el conector fue ligado después a un vector pBlueScript modificado para construir una genoteca de subclones fragmentados al azar ("shotgun"). El vector contenía un gen lacZ fuera del marco en el sitio de clonación que quedaba en marco en el evento en el que se clona un dímero adaptador, permitiendo que estos sean evitados por su color azul.

Todas las etapas posteriores se basaban en la secuenciación mediante métodos de secuenciación de ADN automatizados en ABI377. Solamente están destacadas las modificaciones principales de los protocolos. Brevemente, la genoteca se transformó después en células DH5\alpha competentes (Life Technologies, Bethesda, MD, DH5\alpha transformation protocol). Se evaluó cultivando en placa sobre placas con antibiótico que contenían ampicilina e IPTG/Xgal. Las placas se incubaron durante la noche a 37ºC. Los transformantes acertados se utilizaron después para cultivar en placa los clones y seleccionar para la secuenciación. Los cultivos se hicieron crecer durante la noche a 37ºC. El ADN se purificó utilizando un método de preparación de ADN en cuentas de sílice (Ng et al., Nucl. Acids Res., 24:5045-5047 (1996)). De esta manera, se obtuvieron 25 \mug de ADN por clon.

Estas muestras de ADN purificadas se secuenciaron después utilizando la química del ABI Dye-Terminator. Las lecturas de la secuencia del ABI Dye Terminator se realizaron en máquinas ABI377 y los datos fueron transferidos directamente a máquinas UNIX después del rastreo de las calles de los geles. Todas las lecturas se ensamblaron utilizando PHRAP (P. Green, Abstracts of DOE Human Genome Program Contractor-Grantee Workshop V, Jan. 1996, p.157) con los parámetros por defecto y las puntuaciones de calidad. El ensamblaje inicial se realizó a una cobertura de 6 veces y rindió una media de 8-15 cóntigos. Tras el ensamblaje inicial, los emparejamientos perdidos (secuencias de clones que solamente proporcionan lecturas de una hebra) fueron identificados y secuenciados con la tecnología ABI para permitir la identificación de cóntigos solapantes adicionales. Los cebadores para el paseo fueron seleccionados utilizando un programa Pick_primer de Genome Therapeutics cerca de los extremos de los clones para facilitar el cierre del espacio. Estos paseos fueron secuenciados utilizando los clones y cebadores seleccionados. Los datos fueron ensamblados de nuevo con PHRAP en cóntigos de secuencias.

VIII. Identificación de Genes Mediante Métodos Computacionales

Tras el ensamblaje de las secuencias de BAC en cóntigos, los cóntigos fueron sometidos a análisis computacional para identificar las regiones codificadoras y las regiones que portaban una similitud de secuencia de ADN con genes conocidos. Este protocolo incluía las siguientes etapas:

1. Quitar los espacios ("degap") de los cóntigos: los cóntigos de secuencia a menudo contienen símbolos (indicados por un símbolo de punto) que representan localizaciones donde las lecturas de la secuencia del ABI individuales tienen inserciones o deleciones. Antes del análisis computacional automatizado de los cóntigos, se eliminaron los puntos. Los datos originales se mantuvieron para una referencia futura.

2. Las secuencias del vector de BAC fueron "enmascaradas" en la secuencia utilizando el programa Cross Match (Phil Green, http:\\chimera.biotech.washington.edu\UWGC). Puesto que la construcción de genotecas de fragmentos al azar detallada antes deja algún vector de BAC en las genotecas de fragmentos al azar, se utilizó este programa para comparar la secuencia de los cóntigos de BAC con el vector de BAC y para enmascarar cualquier secuencia del vector antes de las etapas siguientes. Las secuencias enmascaradas fueron marcadas con una "X" en los archivos de la secuencia, y permanecieron inertes durante los análisis posteriores.

3. Las secuencias de E. coli que contaminaban las secuencias de BAC estaban enmascaradas por la comparación de los cóntigos de BAC con la secuencia de ADN de E. coli completa.

4. Los elementos repetitivos que se sabe que son comunes en el genoma humano fueron enmascarados utilizando Cross Match. En esta implementación de Cross Match, la secuencia de BAC se comparó con una base de datos de elementos repetitivos humanos (Jerzy Jerka, Genetic Information Research Institute, Palo Alto, CA). Las repeticiones enmascaradas estaban marcadas con X y permanecían inertes durante los análisis posteriores.

5. La localización de los exones de la secuencia fue pronosticada utilizando el programa de ordenador MZEF (Zhang, Proc. Natl. Acad. Sci., 94:565-568 (1997)).

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6. La secuencia se comparó con la base de datos Unigen disponible para el público (National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, 38A, 8N905, 8600 Rockville Pike, Bethesda, MD 20894; www.ncbi.nlm.nih.gov) utilizando el algoritmo blastn2 (Altschul et al., Nucl. Acids Res., 25:3389-3402 (1997)). Los parámetros para esta búsqueda fueron: E=0,05, v=50, B=50 (donde E es el corte de puntuación de la probabilidad esperada, V es el número de entradas de la base de datos que reaparecían en el informe de los resultados, y B es el número de alineamientos de la secuencia que reaparecían en el informe de los resultados (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)).

7. La secuencia fue traducida a proteína para los seis marcos de lectura, y las secuencias de proteína se compararon con una base de datos de proteínas no redundante recopilada de Genpept Swissprot PIR (National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, 38A, 8N905, 8600 Rockville Pike, Bethesda, MD 20894; www.ncbi.nlm:nih.gov). Los parámetros para esta búsqueda fueron E=0,05, V=50, B= 50, donde E, V, y B se definen como antes.

8. La secuencia de ADN de BAC se comparó con la base de datos de los clones de ADNc derivados de experimentos de selección directa (descritos más abajo) utilizando blastn2 (Altschul et al., Nucl. Acids. Res., 25:3389-3402 (1997)). Los parámetros para esta búsqueda fueron E=0,05, V=250, B=250, donde E, V, y B se definen como antes.

9. La secuencia de BAC se comparó con las secuencias de todos los demás BAC de la región de HBM del cromosoma 11q12-13 utilizando blastn2 (Altschul et al., Nucl. Acids. Res., 25:3389-3402 (1997)). Los parámetros para esta investigación fueron E=0,05, V=50, B=50, donde E, V, y B se definen como antes.

10. La secuencia de BAC se comparó con las secuencias derivadas de los extremos de los BAC de la región de HBM en el cromosoma 11q12-13 utilizando blastn2 (Altschul et al., Nucl. Acids. Res., 25:3389-3402 (1997)). Los parámetros para esta búsqueda fueron E=0,05, V=50, B=50, donde E, V, y B se definen como antes.

11. Se comparó la secuencia de BAC con la base de datos de Genbank (National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, 38A, BN905, 8600 Rockville Pike, Bethesda, MD 20894; www.ncbi.nlm.nih.gov) utilizando blastn2 (Altschul et al., Nucl. Acids. Res., 25:3389-3402 (1997)). Los parámetros para esta búsqueda fueron E=0,05, V=50, B=50, donde E, V, y B se definen como antes.

12. La secuencia de BAC se comparó con la división de STS de la base de datos de Genbank (National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, 38A, 8N905, 8600 Rockville Pike, Bethesda, MD 20894; www.ncbi.nlm.nih.gov) utilizando blastn2 (Altschul et al., 1997). Los parámetros para esta búsqueda fueron E=0,05, V=50, B= 50, donde E, V, y B se definen como antes.

13. La secuencia de BAC se comparó con la base de datos de Expressed Sequence (EST) Tag Genbank (National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, 38A, 8N905, 8600 Rockville Pike, Bethesda, MD 20894; www.ncbi.nlm.nih.gov) utilizando blastn2 (Altschul et al., Nucl. Acids. Res., 25:3389-3402 (1997)). Los parámetros para esta búsqueda fueron E=0,05, V=250, B=250, donde E, V, y B se definen como antes.

IX. Identificación de Genes mediante Selección Directa de ADNc

Las reservas de ADNc con conectores primarios se prepararon a partir de médula ósea, hueso calvarial, hueso femoral, riñón, músculo esquelético, testículo y cerebro completo. Se preparó poli (A) + ARN del tejido de hueso calvarial y femoral (Chomczynski et al., Anal. Biochem., 162:156-159 (1987); D'Alessio et al., Focus, 9:1-4 (1987)) y el resto del ARNm se adquirió de Clontech (Palo Alto, California). Con el fin de generar reservas de ADNc oligo(dT) y cebado al azar del mismo tejido, se mezclaron 2,5 \mug de ARNm con cebador oligo(dT) en una reacción y se mezclaron 2,5 \mug de ARNm con hexámeros al azar en otra reacción, y ambos se convirtieron en el ADNc de la primera y la segunda hebra según las recomendaciones de los fabricantes (Life Technologies, Bethesda, MD). Los conectores de ADNc fosforilados emparejados (véase la secuencia de más abajo) se hibridaron entre sí mezclando a una razón 1:1 (10 \mug cada uno) se incubaron a 65ºC durante cinco minutos y se dejaron enfriar a la temperatura ambiente.

Conectores Emparejados oligo 1/2

Oligo 1:	5'CTG AGC GGA ATT CGT GAG ACC3'	(SEQ ID NO: 12)
Oligo 2:	5'TTG GTC TCA CGT ATT CCG CTC GA3'	(SEQ ID NO: 13)

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Conectores Emparejados oligo 3/4

Oligo 3:	5'CTC GAG AAT TCT GGA TCC TC3'	(SEQ ID NO: 14)
Oligo 4:	5'TTG AGG ATC CAG AAT TCT CGA G3'	(SEQ ID NO: 15)

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Conectores emparejados oligo 5/6

Oligo 5:	5'TGT ATG CGA ATT CGC TGC GCG3'	(SEQ ID NO: 16)
Oligo 6:	5'TTC GCG CAG CGA ATT CGC ATA CA3'	(SEQ ID NO: 17)

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Conectores emparejados 7/8

Oligo 7:	5'GTC CAC TGA ATT CTC AGT GAG3'	(SEQ ID NO: 18)
Oligo 8:	5'TTG TCA CTG AGA ATT CAG TGG AC3'	(SEQ ID NO: 19)

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Conectores emparejados oligo 1/12

Oligo 11:	5'GAA TCC GAA TTC CTG GTC AGC3'	(SEQ ID NO: 20)
Oligo 12:	5'TTG CTG ACC AGG AAT TCG GAT TC3'	(SEQ ID NO: 21)

\vskip1.000000\baselineskip

Los conectores se ligaron a todas las reservas de ADNc oligo(dT) y cebado al azar (véase más abajo) según las instrucciones de los fabricantes (Life Technologies, Bethesda, MD).

El oligo 1/2 se ligó con las reservas de ADNc oligo(dT) y cebado al azar preparadas a partir de médula ósea. El oligo 3/4 se ligó con las reservas de ADNc oligo(dT) y cebado al azar preparadas a partir de hueso calvarial. El oligo 5/6 se ligó con las reservas de ADNc oligo(dT) y cebado al azar preparadas a partir de músculo esquelético. El oligo 7/8 se ligó con las reservas de ADNc oligo(dT) y cebado al azar preparadas a partir de riñón. El oligo 11/12 se ligó con las reservas de ADNc oligo(dT) y cebado al azar preparadas a partir de hueso femoral.

Las reservas de ADNc se evaluaron en cuanto a la distribución de la longitud mediante amplificación por PCR utilizando 1 \mul de una dilución 1:1, 1:10, y 1:100 de la reacción de ligación, respectivamente. Las reacciones de PCR se realizaron en un Perkin Elmer 9600, cada reacción con un volumen de 25 \mul contenía 1 \mul de ADN, Tris-HCl 10 mM (pH 83), KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, gelatina al 0,001%, cada dNTP 200 mM, cebador 10 \muM y 1 unidad de ADN polimerasa Taq (Perkin Elmer) y se amplificaron en las siguientes condiciones: 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 60ºC y 2 minutos a 72ºC durante 30 ciclos. La distribución de la longitud de las reservas de ADNc amplificadas se evaluó mediante electroforesis sobre gel de agarosa al 1%. La reacción de PCR que proporcionaba la mejor representación de las reservas de ADNc cebado al azar y cebado con oligo(dT) se aumentó a escala de manera que se producían \sim2-3 \mug de cada reserva de ADNc. El ADNc de partida para la reacción de selección directa comprendía 0,5 \mug de ADNc cebados al azar mezclados con 0,5 \mug de ADNc cebados con
oligo(dT).

Los ADN de los 54 BAC que se utilizaron en el procedimiento de selección directa del ADNc fueron aislados utilizando columnas Nucleobond AX como describe el fabricante (The Nest Group, Inc.).

Los BAC fueron reunidos en cantidades equimolares y 1 \mug del ADN genómico aislado se marcó con biotina 16-UTP mediante traslado de cortes según las instrucciones de los fabricantes (Boehringer Mannheim). La incorporación de la biotina fue controlada mediante métodos que podían ser puestos en práctica por un experto en la técnica (Del Mastro and Lovett, Methods in Molecular Biology, Humana Press Inc., NJ (1996)).

La selección directa de ADNc se realizó utilizando métodos que podían ser puestos en práctica por un experto en la técnica (Del Mastro and Lovett, Methods in Molecular Biology, Humana Press Inc., NJ (1996)). Brevemente, las reservas de ADNc fueron multiplexadas en dos reacciones separadas: En una reacción se mezclaron las reservas de ADNc de médula ósea, hueso calvarial, cerebro y testículo, y en la otra se mezclaron las reservas de ADNc de músculo esquelético, riñón y hueso femoral. La supresión de las repeticiones, secuencias de levadura y plásmidos en las reservas de ADNc se realizó a un Cot de 20. Se mezclaron 100 ng de ADN de BAC biotinilado con los ADNc suprimidos y se hibridaron en solución con un Cot de 200. El ADN biotinilado y los ADNc cognados se capturaron sobre cuentas paramagnéticas recubiertas de estreptavidina. Las cuentas se lavaron y los ADNc seleccionados primarios se hicieron eluir. Estos ADNc fueron amplificados mediante PCR y se realizó una segunda ronda de selección directa. El producto de la segunda ronda de selección directa es referido como material seleccionado secundario. Se utilizó un clon de ADNc Galanin, mostrado previamente para mapear 11q12-13 (Evans, Genomics, 18:473-477 (1993)), para controlar el enriquecimiento durante las dos rondas de selección.

El material seleccionado secundario de médula ósea, hueso calvarial, hueso femoral, riñón, músculo esquelético, testículo y cerebro completo fue amplificado mediante PCR utilizando cebadores modificados de los oligos 1, 3, 5, 7 y 11, mostrados más abajo, y clonado en el vector UDG pAMP10 (Life Technologies, Bethesda, MD), según las recomendaciones del fabricante. Secuencias de cebadores modificados:

Oligo1-CUA:	5'CUA CUA CUA CUA CTG AGC GGA ATT CGT GAG ACC3'	(SEQ ID NO:22)
Oligo3-CUA:	5'CUA CUA CUA CUA CTC GAG AAT TCT GGA TCC TC3'	(SEQ ID NO: 23)
Oligo5-CUA:	5'CUA CUA CUA CUA TGT ATG CGA ATT CGC TGC GCG3'	(SEQ ID NO: 24)
Oligo7-CUA:	5'CUA CUA CUA CUA GTC CAC TGA ATT CTC AGT GAG3'	(SEQ ID NO: 25)
Oligo11-CUA:	5'CUA CUA CUA CUA GAA TCC GAA TTC CTG GTC AGC3'	(SEQ ID No: 26)

El material seleccionado secundario clonado, de cada fuente de tejido, fue transformado en MAX Efficiency DH5a Competent Cells (Life Technologies, Bethesda, MD) como recomendaba el fabricante. Se seleccionaron 384 colonias de cada fuente transformada y se dispusieron en cuatro placas de microtitulación de 96 pocillos.

Todos los clones de ADNc seleccionados en segundo lugar fueron secuenciados utilizando el kit de secuenciación M13 Dye Primer Terminator Cycle (Applied Biosystems), y los datos fueron recogidos por el ABI 377 Automated Fluorescence Sequencer (Applied Biosystems).

Todas las secuencias fueron analizadas utilizando los programas BLASTN, BLASTX y FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990), Altschul et al., Nucl. Acids. Res., 25:3389-3402 (1997)). Las secuencias de ADNc fueron comparadas con una base de datos que contenía secuencias derivadas de repeticiones humanas, ADN mitocondrial, ARN ribosómico, ADN de E. coli para separar los clones del fondo del grupo de datos utilizando el programa Cross_Match. También se realizó una ronda adicional de comparación utilizando el programa BLASTN2 frente a genes conocidos (Genbank) y las secuencias de BAC de la región HBM. Aquellos ADNc que eran homólogos en más del 90% a estas secuencias se archivaron según el resultado y los datos se almacenaron en una base de datos para su posterior análisis. Las secuencias de ADNc que fueron identificadas pero no tenían similitud significativa con las secuencias de BAC de la región HBM o bien fueron eliminadas mediante Cross_Match se hibridaron a membranas de nailon que contenían los BAC de la región HBM, para averiguar si hibridaban con la diana.

Se utilizó el análisis de hibridación para mapear los clones de ADNc con respecto a la diana de BAC que los seleccionó. Los BAC que fueron identificados de la región HBM fueron ordenados y se hicieron crecer en una placa de microtitulación de 96 pocillos. El agar LB que contenía 25 \mug/ml de kanamicina se vertió en tapas de placas de microtitulación de 96 pocillos. Una vez que el agar se hubo solidificado, se pusieron sobre la parte superior del agar membranas de nailon Hybond N+ cortadas previamente (Amersham) y los BAC fueron estampados sobre las membranas por duplicado utilizando un cultivador en placa de réplica de 96 pocillos de mano (V&P Scientific, Inc.). Las placas se incubaron durante la noche a 37ºC. Las membranas se procesaron según las recomendaciones de los fabricantes.

Los ADNc que necesitaron ser mapeados mediante hibridación fueron amplificados mediante PCR utilizando el cebador relevante (oligos 1, 3, 5, 7 y 11) que amplificaría ese clon. Para esta amplificación mediante PCR, los cebadores fueron modificados para que contuvieran una molécula de digoxigenina en el extremo 5' del oligonucleótido. La amplificación mediante PCR se realizó en las mismas condiciones descritas en Preparación de Reservas de ADNc (arriba). Los productos de la PCR fueron evaluados en cuanto a la calidad y la cantidad mediante electroforesis sobre gel de agarosa al 1% cargando 5 \mul de la reacción de PCR. Las membranas de nailon que contenían los BAC estampados se prehibridaron individualmente en tubos cónicos de 50 ml que contenían 10 ml de solución de hibridación (5x SSPE, 0.5x Blotto, 2.5% SDS and 1 mM EDTA (pH 8.0)). Los tubos cónicos de 50 ml de colocaron en un horno con rosticero (Robbins Scientific) durante 2 horas a 65ºC. Se desnaturalizaron 25 ng de cada sonda de ADNc y se añadieron a tubos cónicos de 50 ml individuales que contenían la membrana de nailon y la solución de hibridación. La hibridación se realizó durante la noche a 65ºC. Los filtros se lavaron durante 20 minutos a 65ºC en cada una de las siguientes soluciones: 3x SSPE, SDS al 0,1%; 1x SSPE, SDS al 0,1% y 0,1 x SSPE, SDS al 0,1%.

Se retiraron las membranas de los tubos cónicos y se colocaron en una fuente. Se colocaron láminas de acetato entre cada membrana para evitar que se pegaran entre sí. La incubación de las membranas con Anti-DIG-AP y CDP-Star se realizó según las recomendaciones de los fabricantes (Boehringer Mannheim). Las membranas se envolvieron en envoltura Saran y se expusieron a película para rayos X Kodak Bio-Max durante 1 hora.

X. Clonación de ADNc y Análisis de la Expresión

Para caracterizar la expresión de los genes identificados mediante selección directa de ADNc y secuenciación de ADN genómico en comparación con las bases de datos disponibles al público, se realizaron una serie de experimentos para caracterizar adicionalmente los genes de la región de HBM. Primero, se diseñaron cebadores oligonucleotídicos para su uso en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de manera que las porciones de ADNC, EST, o ADN genómico pudieran ser amplificadas a partir de una reserva de moléculas de ADN (una genoteca de ADNc) o una población de ARN (RT-PCR y RACE). Los cebadores de la PCR se utilizaron en una reacción que contenía ADN genómico para verificar que generaban un producto del tamaño pronosticado basado en la secuencia genómica (BAC). Después se examinaron numerosas genotecas de ADNc en cuanto a la presencia de ADNc o EST específico. La presencia de un fragmento de una unidad de transcripción en una genoteca de ADNc concreta indica una alta probabilidad de que porciones adicionales de la misma unidad de transcripción estén también presentes.

Una parte crítica de los datos que es requerida cuando se caracterizan genes novedosos es la longitud, en nucleótidos, del transcrito procesado o el ARN mensajero (ARNm). Un experto en la técnica determina principalmente la longitud del ARNm mediante hibridación de transferencia Northern (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY (1989)). Los grupos de EST y los clones de ADNc de selección directa que presentaban una similitud de secuencia significativa con los BAC secuenciados en la región crítica fueron agrupados por conveniencia en unidades de aproximadamente 30 kilobases. En cada unidad de 30 kilobases había de uno a cincuenta EST y clones de ADNc de selección directa que comprendían una o más unidades de transcripción independientes. Se utilizaron uno o más EST o ADNc de selección directa como sondas de hibridación para determinar la longitud del ARNm en una variedad de tejidos, utilizando reactivos disponibles en el mercado (Multiple Tissue Northern blot; Clontech, Palo Alto, California) en las condiciones recomendadas por el fabricante.

Las genotecas de ADNc clonadas direccionalmente a partir de tejido de hueso femoral, y hueso calvarial se construyeron mediante métodos familiares para los expertos en la técnica (por ejemplo, Soares en Automated DNA Sequencing and Analysis, Adams, Fields y Venter, Eds., Academic Press, NY, páginas 110-114 (1994)). Los huesos se rompieron inicialmente en fragmentos con un martillo, y los trozos pequeños se congelaron en nitrógeno líquido y se redujeron a polvo en un pulverizador de tejidos (Spectrum Laboratory Products). Se extrajo el ARN del hueso pulverizado homogeneizando el hueso pulverizado con un tampón de extracción de Tiocianato de Guanidinio-Fenol-Cloroformo Ácido normalizado (p. ej. Chomczynski y Sacchi, Anal. Biochem., 162:156-159 (1987)) utilizando un homogeneizador Polytron (Brinkman Instruments). Adicionalmente, se adquirió ARN total de cerebro y de pulmón humanos de Clontech. Se aisló el ARN poli A del ARN total utilizando Dynabeads-dT según las recomendaciones del fabricante (Dynal, Inc.).

La síntesis del ADNc de la primera hebra se inició utilizando un cebador oligonucleotídico con la secuencia: 5'-AACTGGAAGAATTCGCGGCCGCAGGAATTTTTTTTTTTTTTTTTT-3' (SEQ ID NO: 27). Este cebador introduce un sitio de restricción NotI (subrayado) en el extremo 3' del ADNc. La síntesis de la primera y segunda hebras se realizó utilizando el kit de síntesis de ADNc de "un tubo" ("one-tube") como describe en fabricante (Life Technologies, Bethesda, MD). Los ADNc de doble hebra se trataron con la polinucleótido quinasa de T4 para asegurarse de que los extremos de las moléculas eran romos (Soares, en Automated DNA Sequencing and Analysis, Adams, Fields y Venter, Eds., Academic Press, NY, páginas 110-114 (1994)), y los ADNc de extremos romos se seleccionaron después por tamaños por medio de una columna Biogel (Huynh et al.. in DNA Cloning, Vol. 1, Glover, Ed., IRL Press, Oxford, páginas 49-78 (1985)) o con una columna de Sepharose Size-Sep 400 (Pharmacia, núm. de catálogo 27-5105-01). Solamente se utilizaron ADNc de 400 pares de bases o más en las etapas posteriores. Después se ligaron adaptadores de EcoRI (secuencia: 5' OH-AATTCGGCACGAG-OH 3' (SEQ ID NO: 28), y 5' p-CTCGTGCCG-OH 3' (SEQ ID NO: 29)) a los ADNc de doble hebra mediante métodos familiares para el experto en la técnica (Soares, 1994). Los adaptadores de EcoRI se separaron después del extremo 3' del ADNc mediante digestión con NotI (Soares, 1994). El ADNc se ligó después en el vector plasmídico pBluescript II KS+ (Stratagene, La Jolla, California), y el material ligado se transformó en un anfitrión E. coli DH10B o DH12S mediante métodos de electroporación familiares para un experto en la técnica (Soares, 1994). Después de crecer durante la noche a 37ºC, se recuperó el ADN de las colonias de E. coli después de rascar las placas mediante procesamiento dirigido por el kit Mega-prep (Qiagen, Chatsworth, California). La calidad de las genotecas de ADNc se estimó sometiendo a recuento una porción de los números totales de transformantes primarios y determinando el tamaño medio de los insertos y el porcentaje de plásmidos sin inserto de ADN. Se adquirieron genotecas de ADNc adicionales (cerebro completo humano, corazón, riñón, leucocito, y cerebro fetal) de Life Technologies, Bethesda, MD.

Se utilizaron genotecas de ADNc, cebadas con oligo (dT) y hexámeros al azar (N_{6}), para aislar los clones de ADNc transcritos en la región de HBM: hueso humano, cerebro humano, riñón humano y músculo esquelético humano (todas las genotecas de ADNc fueron elaboradas por los autores de la invención, excepto las genotecas de ADNc de músculo esquelético (dT) y riñón (dT)). Se prepararon cuatro matrices 10 x 10 de cada una de las genotecas de ADNc como sigue: las genotecas de ADNc se titularon a 2,5 x 10^{6} utilizando transformantes primarios. Se utilizó el volumen apropiado de provisión congelada para inocular 2 L de LB/ampicilina (100 mg/ml). Se formaron alícuotas de este cultivo líquido inoculado en 400 tubos de 4 ml cada uno. Cada tubo contenía aproximadamente 5.000 cfu. Los tubos se incubaron a 30ºC durante la noche con agitación suave. Los cultivos se hicieron crecer hasta una DO de 0,7-0,9. Se prepararon provisiones congeladas para cada uno de los cultivos tomando alícuotas de 100 \mul de cultivo y 300 \mul de glicerol al 80%. Las provisiones se congelaron en un baño de hielo seco/etanol y se almacenaron a -70ºC. El cultivo restante se preparó para el ADN utilizando el kit Spin Miniprep de Qiagen (Chatsworth, CA) según las instrucciones del fabricante. Los ADN de los 400 cultivos se reunieron para formar 80 reservas de columnas y filas. Se determinó que las genotecas de ADNc contenían los clones de ADNc de HBM de interés mediante PCR. Se diseñaron marcadores para amplificar los supuestos exones. Una vez que se hubo realizado la optimización por PCR normalizada y se hubo determinado que las genotecas de ADNc específicas contenían los clones de ADNc de interés, se utilizaron los marcadores para escrutar la genoteca ordenada. Las direcciones positivas que indicaban la presencia de los clones de ADNc fueron confirmadas mediante una segunda PCR utilizando los mismos marcadores.

Una vez que se ha identificado una genoteca de ADNc por contener probablemente clones de ADNc que corresponden a un transcrito específico de interés de la región de HBM, éste fue manipulado para aislar el clon o los clones que contenían los insertos de ADNc idénticos al EST o el ADNc de selección directa de interés. Esto se completó mediante una modificación del método de "escrutinio de colonias" normalizado (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY (1989)). Específicamente, se diseminaron 20.000 unidades formadoras de colonias (cfu) en veinte placas de agar LB+ampicilina de 150 mm y se dejó que las colonias crecieran durante la noche a 37ºC. Las colonias fueron transferidas a filtros de nailon (Hybond de Amersham, o equivalente) y se prepararon duplicados presionando dos filtros juntos como se la descrito esencialmente (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY (1989)). Después se incubó la placa "maestra" 6-8 horas más para permitir que las colonias volvieran a crecer. El ADN de las colonias bacterianas fue fijado después a los filtros de nailon tratando los filtros sucesivamente con solución desnaturalizante (NaOH 0,5 N, NaCl 1,5 M) durante dos minutos, solución de neutralización (Tris-Cl 0,5 M pH 8,0, NaCl 1,5 M) durante dos minutos (dos veces). Las colonias bacterianas se separaron de los filtros lavando en una solución de 2X SSC/SDS 0,1% durante un minuto mientras se frotaba con papel Tissue. Los filtros se secaron al aire y se cocieron a vacío a 80ºC durante 1-2 horas.

Se preparó una sonda de hibridación de ADNc mediante marcaje de hexámeros al azar (Fineberg y Vogelstein, Anal. Biochem., 132:6-13 (1983)) o incluyendo cebadores específicos del gen y hexámeros no al azar en la reacción (para fragmentos pequeños). La actividad específica se calculó y fue >5X10^{8} cpm/10^{8} \mug de ADNc. Las membranas de las colonias se prelavaron después en Tris-Cl 10 mM pH 8,0, NaCl 1 M, EDTA 1 mM, SDS al 0,1% durante 30 minutos a 55ºC. Después del prelavado, los filtros se prehibridaron en > 2 ml/filtro de 6X SSC, formamida desionizada al 50%, SDS al 2%, 5X solución de Denhardt, y 100 mg/ml ADN de esperma de salmón desnaturalizado, a 42ºC durante 30 minutos. Después se transfirieron los filtros a solución de hibridación (6X SSC, SDS al 2%, 5X solución de Denhardt, 100 mg/ml ADN de esperma de salmón desnaturalizado) que contenía una sonda de ADNc marcada con dCTP-\alphaP^{32} desnaturalizada y se incubó a 42ºC durante 16-18 horas.

Tras una incubación de 16-18 horas, los filtros se lavaron con agitación constante en 2X SSC, SDS al 2% a la temperatura ambiente durante 20 minutos, seguido de dos lavados a 65ºC durante 15 minutos cada uno. Se realizó un segundo lavado en 0,5 X SSC, SDS al 0,5% durante 15 minutos a 65ºC. Los filtros se envolvieron después en una envoltura de plástico y se expusieron a una película radiográfica varias horas durante la noche. Tras el revelado de la película, se alinearon las colonias individuales en las placas con la autorradiografía de manera que pudieran ser escogidas en una solución de 1 ml de Caldo LB conteniendo ampicilina. Después de sacudir a 37ºC durante 1-2 horas, se cultivaron en placa alícuotas de la solución sobre placas de 150 mm para un escrutinio secundario. El escrutinio secundario fue idéntico al escrutinio primario (anterior) excepto que se realizó sobre placas que contenían \sim250 colonias de manera que se pudieran identificar claramente las colonias individuales para su selección.

Después de que el escrutinio de las colonias con sondas radiomarcadas rindiera clones de ADNc, los clones fueron caracterizados por medio de escisión con endonucleasas de restricción, PCR, y secuenciación directa para confirmar la identidad de secuencia entre la sonda original y el clon aislado. Para obtener el ADNc completo, se utilizó la secuencia novedosa del extremo del clon para sondear la genoteca de nuevo. Este procedimiento se repitió hasta que la longitud del ADNc clonado coincidió con la que se estimaba que era la completa mediante análisis de transferencia northern.

Se utilizó la RT-PCR como otro método para aislar clones completos. El ADNc fue sintetizado y amplificado utilizando un kit "Superscript One Step RT-PCR" (Life Technologies, Gaithersburg, MD). El procedimiento implicaba añadir 1,5 \mug de ARN a lo siguiente: 25 \mul de la mezcla de reacción proporcionada que es una mezcla tampón de la empresa con MgSO_{4} y los dNTP, 1 \mul de cebador efector (10 \muM) y 1 \mul de cebador anti-sentido (10 \muM), 1 \mul de transcriptasa inversa y mezcla de ADN polimerasa Taq proporcionada y agua que ha pasado por autoclave para una mezcla de reacción total de 50 \mul. Luego se colocó la reacción en un Thermocycler para un ciclo a 50ºC durante 15 a 30 minutos, después 94ºC durante 15 segundos, 55-60ºC durante 30 segundos y 68-72ºC durante 1 minuto por kilobase de producto anticipado y finalmente 1 ciclo de 72ºC durante 5-10 minutos. La muestra se analizó sobre gel de agarosa. El producto se escindió del gel y se purificó del gel (GeneClean, Bio 101). El producto purificado se clonó en pCTNR (General Contractor DNA Cloning System, 5 Prime - 3 Prime, Inc.) y se secuenció para verificar que el clon era específico para el gen de interés.

La amplificación rápida de los extremos del ADNc (RACE) se realizó siguiendo las instrucciones del fabricante utilizando una Marathon cDNA Amplification Kit (Clontech, Palo Alto, CA) como método para la clonación de los extremos 5' y 3' de los genes candidato. Se prepararon reservas de ADNc a partir del ARN total realizando la síntesis de la primera hebra, donde una muestra de la muestra de ARN total se mezcló con un cebador oligo (dT) modificado, se calentó a 70ºC, se enfrió sobre hielo, seguido de la adición de: 5x tampón para la primera hebra, mezcla de dNTP 10 mM, y Transcriptasa Inversa de AMV (20 U/\mul). El tubo se incubó a 42ºC durante una hora y después se colocó el tubo de reacción sobre hielo. Para la síntesis de la segunda hebra, se añadieron los siguientes componentes directamente al tubo de reacción: 5x tampón para la segunda hebra, mezcla de dNTP 10 mM, agua estéril, 20x cóctel de enzima para la segunda hebra y el tubo de reacción se incubó a 16ºC durante 1,5 horas. Se añadió ADN Polimerasa de T4 al tubo de reacción y se incubó a 16ºC durante 45 minutos. La síntesis de la segunda hebra se terminó con la adición de una mezcla EDTA/Glucógeno. La muestra se sometió a extracción con fenol/cloroformo y precipitación con acetato de amonio. Se verificó la calidad de las reservas de ADNc analizando sobre gel de agarosa la distribución por tamaños. Después se ligaron los adaptadores de ADNc de Marathon (Clontech) sobre los extremos de ADNc. Los adaptadores específicos contenían sitios de cebado que permitían la amplificación de los extremos 5' o 3', dependiendo de la orientación del cebador específico del gen (GSP) que se escogiera. Se añadió una alícuota del ADNc de doble hebra a los siguientes reactivos: 10 \muM de adaptador de ADNc de Marathon, 5x tampón de ligación de ADN, ADN ligasa de T4. La reacción se incubó a 16ºC durante la noche. La reacción se inactivó con calor para terminar la reacción. Se realizó la PCR mediante la adición de lo siguiente a la reserva de ADNc de doble hebra diluida: 10x tampón de reacción de PCR de ADNc, mezcla de dNTP 10 \muM, GSP 10 \muM, cebador AP1 10 \muM (kit), 50x Advantage cDNA Polymerase Mix. Las condiciones del Ciclo Térmico fueron 94ºC durante 30 segundos, 5 ciclos de 94ºC durante 5 segundos, 72ºC durante 4 minutos, 5 ciclos de 94ºC durante 5 segundos, 70ºC durante 4 minutos, 23 ciclos de 94ºC durante 5 segundos, 68ºC durante 4 minutos. Después de realizar la primera ronda de PCR utilizando el GSP para ampliar el extremo del adaptador para crear el sitio de unión al cebador adaptador, se observó una amplificación exponencial del ADNc específico de interés. Normalmente se realiza una segunda PCR anidada para confirmar el ADNc específico. El producto de RACE se analizó sobre gel de agarosa y después se separó por corte y se purificó del gel (GeneClean, BIO 101). El producto de RACE se clonó después en pCTNR (General Contractor DNA Cloning System, 5' - 3', Inc.) y la secuencia de ADN se determinó para verificar que el clon es específico para el gen de interés.

XI. Análisis de Mutaciones

Se identificaron los genes comparativos utilizando los procedimientos anteriores y los exones de cada gen se sometieron a análisis para la detección de mutaciones. Se utilizó la secuenciación de ADN comparativa para identificar los polimorfismos en los genes candidatos de HBM del cromosoma 11q12-13. Las secuencias de ADN para los genes candidato se amplificaron a partir de líneas celulares linfoblastoides de pacientes.

Los autores de la invención desarrollaron un método basado en el análisis de la secuenciación de ADN directa de los productos de la PCR amplificados a partir de las regiones candidato para investigar el polimorfismo causante. El procedimiento consistía en tres fases que utilizaban diferentes subgrupos de la familia de HBM para encontrar los polimorfismos segregantes y un panel de población para evaluar la frecuencia de los polimorfismos. Los expedientes de las familias resultaban de un único fundador conduciendo a la suposición de que todos los individuos afectados compartían el mismo polimorfismo causante.

Las regiones candidato fueron escrutadas primero en un subgrupo de la familia de HBM que consistía en el probando, la hija, y su madre, padre y hermano. Las secuencias de referencia monocromosómicas se produjeron concurrentemente y se utilizaron para la comparación. La madre y la hija portaban el polimorfismo HBM en esta familia nuclear, proporcionando la capacidad de controlar la transmisión del polimorfismo. El resultado neto es que se escrutaron dos cromosomas HBM y seis cromosomas no HBM. Esto permitió la exclusión de numerosos alelos frecuentes. Solamente los alelos exclusivamente presentes en los individuos afectados pasaban al siguiente nivel del análisis.

Los polimorfismos que segregaban exclusivamente con el fenotipo de HBM en esta familia original eran examinados después de nuevo en una porción ampliada de la genealogía de HBM que consistía en dos familias nucleares adicionales. Estas familias consistían en cinco individuos afectados por HBM y tres no afectados. Los individuos con HBM de este grupo incluían los dos individuos con entrecruzamiento crítico, proporcionando los límites centroméricos y teloméricos de la región crítica. El rastreo de la herencia de los polimorfismos entre estos individuos y sus parientes afectados permitía un afinado adicional de la región crítica. Este grupo llevaba el total de los cromosomas de HBM escrutados a siete y el total de cromosomas no de HBM a diecisiete.

Cuando un polimorfismo dado continuaba segregándose exclusivamente con el fenotipo de HBM en el grupo ampliado, se examinaba después el panel de población. Este panel de 84 personas consistía en 42 individuos que se sabe que tienen una densidad mineral ósea normal y 42 individuos que se sabe que no están relacionados pero con densidad mineral ósea no sometida a tipificación. La densidad mineral ósea normal está en dos desviaciones típicas de puntuación Z de BMD de 0. El segundo grupo era del panel de individuos CEPH ampliamente utilizado. Cualquiera de los polimorfismos segregantes que se encontró que eran raros en esta población fueron examinados con posterioridad sobre la genealogía de HBM completa y una población más grande.

Se utilizó la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para generar moldes de secuenciación a partir del ADN de la familia de HBM y los controles monocromosómicos. La amplificación enzimática de los genes en la región de HBM en 11q12-13 se completó utilizando la PCR con oligonucleótidos que flanqueaban cada exón así como los supuestos elementos reguladores 5' de cada gen. Los cebadores se seleccionaron para amplificar cada exón así como 15 o más pares de bases en cada intrón de cada lado del empalme. Todos los cebadores de la PCR se elaboraron en forma de quimeras para facilitar la secuenciación del cebador colorante. Los sitios de unión al cebador M13-21F (5'- GTA A CGA CGG CCA GT -3') (SEQ m NO: 30) y -28REV (5'- AAC AGC TAT GAC CAT G -3') (SEQ ID NO: 31) se construyeron sobre el extremo 5' de cada cebador de la PCR directo e inverso, respectivamente, durante la síntesis. Se utilizaron 150 ng de ADN genómico en una PCR de 50 \mul con 2UAmpliTaq, cebador 500 nM y dNTP 125 \muM. El tampón y las condiciones de ciclación fueron específicos para cada grupo de cebadores. Se utilizó el anticuerpo TaqStart (Clontech) para la PCR de inicio en caliente para minimizar la formación de dímeros del cebador. Se examinó el 10% del producto sobre gel de agarosa. Se diluyeron las muestras apropiadas 1:25 con agua desionizada antes de la secuenciación.

Cada producto de la PCR fue secuenciado según el protocolo del cebador Energy Transfer normalizado (Amersham). Todas las reacciones tuvieron lugar en bandejas de 96 pocillos. Se realizaron 4 reacciones separadas, una para cada uno de A, C, G y T para cada molde. Cada reacción incluyó 2 \mul de la mezcla de reacción de secuenciación y 3 \mul de molde diluido. Las placas se sellaron después con calor con cinta de aluminio y se colocaron en un Ciclador Térmico y se ciclaron según la recomendación del fabricante. Después de la ciclación, se reunieron 4 reacciones. Se transfirieron 3 \mul de producto reunido a una placa de 96 pocillos nueva y se añadió 1 \mul del colorante de carga del fabricante a cada pocillo. Todos los procedimientos de pipeteado de los 96 pocillos tuvieron lugar en una estación de pipetas Hydra 96 (Robbins Scientific, USA). Se cargó directamente 1 \mul de material reunido sobre un gel de 48 calles que corría sobre un secuenciador de ADN ABI 377 durante una ronda de 10 horas, 2,4 kV.

Se utilizó Polyphred (Universidad de Washington) para ensamblar grupos de secuencias para inspeccionar con Consed (University of Washington). Las secuencias se ensamblaron en grupos que representaban todos los miembros relevantes de la familia y los controles para una región diana especificada. Esto se realizó por separado para cada una de las tres fases. Las lecturas directa e inversa estaban incluidas para cada individuo junto con las lecturas de los moldes monocromosómicos y una secuencia de referencia con un comentario de color. Polyphred indicaba los sitios polimórficos potenciales con una bandera de color púrpura. Dos lectores inspeccionaron independientemente la validez de los sitios marcados con la bandera púrpura.

Se evaluaron un total de 23 exones presentes en el ARNm maduro y otras numerosas porciones del transcrito primario en cuanto al carácter heterocigótico en la familia nuclear de dos individuos afectados por HBM y dos no afectados. Se identificaron veinticinco polimorfismos de nucleótidos individuales (SNP), como se muestra en la siguiente
tabla.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 4 Polimorfismos de un Único Nucleótido en el gen Zmax1 e Inmediaciones

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Además de los polimorfismos presentados en la Tabla 4, también pueden estar presentes dos polimorfismos adicionales en el SEQ ID NO: 2. Esto es un cambio en la posición 2002 del SEQ ID NO: 2. En esta posición pueden aparecer guanina o adenina. Este polimorfismo es silencioso y no está asociado con ningún cambio en la secuencia de aminoácidos. El segundo cambio está en la posición 4059 del SEQ ID NO: 2 que corresponde a un cambio de citosina (C) por timina (T). Este polimorfismo da como resultado el correspondiente cambio de aminoácido de valina (V) a alanina (A). Se encontraron otros polimorfismos en las secuencias de los exones del gen candidato y del intrón adyacente. Cualquiera o una combinación de los polimorfismos enumerados en la Tabla 4 o los dos mencionados antes también podrían tener un efecto mínimo sobre la masa ósea o el nivel de lípidos cuando estuvieran presentes en el SEQ ID NO: 2.

Por consiguiente, en la presente memoria se describen secuencias de ácido nucleico que tienen la secuencia de ácido nucleico del SEQ ID NO: 1 con las mutaciones puntuales identificadas antes.

Asimismo se describe una secuencia que abarca el ácido nucleico del SEQ ID NO: 2. Específicamente, se identificó una sustitución del par de bases cambiando G por T en la posición 582 en la secuencia codificadora de Zmax1 (el gen HBM) como heterocigota en todos los individuos con HBM, y no se encontró en los individuos no afectados (esto es, b527d12-h_Contig087C_1.nt). La Fig. 5 muestra el orden de los cóntigos en B527D12. La dirección de la transcripción para el gen HBM es de izquierda a derecha. La secuencia del cóntigo 308G de B527D12 es el complemento inverso de la región codificadora para el gen HBM. Por lo tanto, el polimorfismo relativo en el cóntigo 308G mostrado en la Tabla 4 como sustitución de cambio de base de C a A es el complemento para la sustitución de G a T en el gen HBM. Esta mutación ocasiona una sustitución de glicina 171 por valina (G171V).

El polimorfismo de HBM fue confirmado examinando la secuencia de ADN de diferentes grupos de individuos. En todos los miembros de la genealogía de HBM (38 individuos), se observó el polimorfismo de HBM en la forma heterocigótica en los individuos afectados (esto es, masa ósea elevada) solamente (N=18). En los parientes no afectados (N=20) (BMDZ<2.0) nunca se observó el polimorfismo de HBM. Para determinar si este gen se observaba en individuos fuera de la genealogía de HBM, se caracterizaron 297 individuos sometidos a tipificación fenotípica en el sitio del gen HBM. Ninguno era heterocigótico en el sitio del polimorfismo de HBM. En un grupo de control no sometido a tipificación fenotípica, se observó que 1 de 42 individuos era heterocigótico en la posición 582. Puesto que este individuo había fallecido, su densidad mineral ósea no pudo se obtenida. Tomados juntos, estos datos demuestran que el polimorfismo observado en la familia que presentaba el fenotipo de masa ósea elevada está fuertemente correlacionado con el polimorfismo G\rightarrowT en la posición 582 de Zmax1. Tomados juntos, estos resultados establecen que el polimorfismo de HBM se segrega genéticamente con el fenotipo de HBM, y que el polimorfismo de HBM y el fenotipo son ambos raros en la población general.

XII. Análisis de Oligonucleótidos Alelo Específicos (ASO)

El amplicón que contenía el polimorfismo de HBM1 fue amplificado mediante PCR utilizando cebadores específicos para el exón de interés. La población apropiada de los individuos fue amplificada mediante PCR en las placas de microtitulación de 96 pocillos como sigue. Las reacciones de PCR (20 \mul) que contenían 1X tampón de PCR Promega (Núm. de Catálogo M1883 conteniendo MgCl_{2} 1,5 mM), dNTP 100mM, cebadores de PCR 200 nM (1863F: CCAAGTTCTGAGAAGTCC y 1864R: AATACCTGAAACCAT ACCTG), 1 U de Amplitaq, y 20 ng de ADN genómico se prepararon y se amplificaron en las siguientes condiciones de PCR: 94ºC, 1 minuto, (94ºC, 30 seg.; 58ºC, 30 seg.; 72ºC, 1 min.) X35 ciclos), 72ºC, 5', 4ºC, mantener. Después se añadió colorante de carga y se sometieron a electroforesis 10 \mul de los productos sobre geles de agarosa al 1,5% que contenían 1 \mug/ml de bromuro de etidio a 100-150 V durante 5-10 minutos. Los geles se trataron 20 minutos en solución desnaturalizante (NaCl 1,5 M, NaOH 0,5 N), y se enjuagaron brevemente con agua. Los geles se neutralizaron después en Tris-HCl 1 M, pH 7,5, NaCl 1,5 M, durante 20 minutos y se enjuagaron con agua. Los geles se empaparon en 10 X SSC durante 20 minutos y se transfirieron a membrana de transferencia de nailon (Hybond N+- Amersham) en 10X SSC durante la noche. Los filtros se enjuagaron en 6X SSC durante 10 minutos y se entrecruzaron con UV.

Los oligonucleótidos alelo específicos (ASO) fueron diseñados con el polimorfismo aproximadamente en el medio. Los oligonucleótidos estaban libres de fosfato en el extremo 5' y fueron adquiridos de Gibco BRL. Las secuencias de los oligonucleótidos son:

2326 Zmax1.ASO.g: AGACTGGGGTGAGACGC

2327 Zmax1.ASO.t: CAGACTGGGTTGAGACGCC

Los nucleótidos polimórficos están subrayados. Para marcar los oligos, se mezclaron 1,5 \mul de 1 \mug/\mul de oligo ASO (2326.Zmax1.ASO.g o 2327.Zmax1.ASO.t), 11 \mul de ddH_{2}O, 2 \mul de 10X tampón de quinasa directo, 5 \mul de ATP-\gamma-P^{32} (6000 Ci/mMol), y 1 \mul de polinucleótido quinasa de T4 (10 U/\mul), y la reacción se incubó a 37ºC durante 30-60 minutos. Las reacciones se colocaron después a 95ºC durante 2 minutos y se añadieron 30 ml de H_{2}O. Las sondas se purificaron utilizando una columna MicroSpin G25 (Pharmacia).

Las transferencias fueron pre-hibridadas en 10 ml de 5X SSPE, 5X Denhardt, SDS al 2%, y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón sometido a sonicación, desnaturalizado a 40ºC durante 2 hr. La mezcla de reacción completa del oligo tratado con quinasa se añadió después a 10 ml de tampón de hibridación de nueva aportación (5X SSPE, 5X Denhardt, SDS al 2%) y se hibridó a 40ºC durante al menos 4 horas durante la noche.

Todos los lavados se realizaron en 5X SSPE, SDS al 0,1%. El primer lavado fue a 45ºC durante 15 minutos; la solución se cambió después y los filtros se lavaron a 50ºC durante 15 minutos. Después los filtros se expusieron a una película Biomax de Kodak con 2 pantallas intensificadoras a -70ºC durante 15 minutos a 1 hora. Si era necesario se lavaron los filtros a 55ºC durante 15 minutos y se expusieron a la película de nuevo. Los filtros se desprendieron lavando en 0,1X SSC hirviendo, SDS al 0,1% durante 10 minutos al menos 3 veces.

Las dos películas que capturaban mejor el análisis alelo específico con los 2 ASO fueron convertidas en imágenes digitales escaneándolas en Adobe PhotoShop. Estas imágenes se superpusieron entre sí en Graphic Converter y después se puntuaron y se almacenaron en FileMaker Pro 4.0 (véase la Fig. 9).

XIII. Localización Celular de Zmax1 A. Expresión del Gen en tibia de Rata mediante Hibridación In Situ no isotópica

Se realizó una hibridación in situ mediante Pathology Associates International (PAI), Frederick, MD. Este estudio se acometió para determinar los tipos de células específicas que expresan el gen Zmax1 en hueso de rata con un énfasis concreto en las zonas de crecimiento y remodelación del hueso. Las sondas de Zmax1 utilizadas en este estudio fueron generadas a partir de ADNc tanto humano (HuZmax1) como de ratón (MsZmax1), que comparten una identidad de secuencia del 87%. La homología de Zmax1 de humano y ratón con Zmax1 de rata es desconocida.

Por ejemplo, la expresión génica mediante hibridación in situ no isotópica se realizó como sigue, pero el artesano experto podría conocer otros métodos. Se recogieron tibias de dos ratas Sprague Dawley de 6 a 8 semanas de edad sometidas a eutanasia mediante asfixia con dióxido de carbono. Se separaron los extremos distales y las tibias proximales se congelaron sobre placa fría en nieve carbónica en medio de imbibición OCT con nitrógeno líquido inmediatamente después de la muerte. Los tejidos se almacenaron en un congelador a -80ºC.

Las sondas para amplificar los productos de la PCR del ADNc se prepararon como sigue. Los cebadores para amplificar los productos de la PCR a partir de un clon de ADNc se eligieron utilizando secuencias publicadas de LRP5 humano (Genbank Núm. de Acceso ABO17498) y LRP5 de ratón (Genbank Núm. de Acceso AFO64984). Con el fin de minimizar la reactividad cruzada con otros genes en la familia del receptor de LDL, los productos de la PCR derivaron de una porción intracelular de la región codificadora de la proteína. La PCR se realizó en un volumen de reacción de 50 \mul utilizando clones de ADNc como molde. Las reacciones de PCR contenían MgCl_{2} 1,5 mM, 1 unidad de Amplitaq, dNTP 200 \muM y cada cebador 2 \muM. Las condiciones de ciclación de PCR fueron 94ºC durante 1 min., seguido de 35 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 30 segundos; seguido de una ampliación de 5 minutos a 72ºC. Las reacciones se hicieron circular después sobre un gel de agarosa con Tris-Acetato al 1,5%. Se hizo eluir ADN de la agarosa, se precipitó en etanol y se resuspendió en Tris 10 mM, pH 8,0. Se prepararon los productos purificados en gel para los ADNc tanto de ratón como de seres humanos y se suministraron a Pathology Associates International para su hibridación in situ.

La secuencia de los cebadores y productos de la PCR de ser humano y de ratón fueron los siguientes:

Cebador efector Zmax1 Humano (HBM12531)

CCCGTGTGCTCCGCCGCCCAGTTC

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Cebador antisentido Zmax1 Humano (HBM1465)

GGCTCACGGAGCTCATCATGGACTT

Producto de la PCR de Zmax1 Humano

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Cebador Efector de Zmax1 de Ratón (HBM1655)

AGCGAGGCCACCATCCACAGG

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Cebador antisentido Zmax1 de Ratón (HBM1656)

TCGCTGGTCGGCATAATCAAT

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Producto de la PCR de Zmax1 de Ratón

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Se sintetizaron ribosondas como sigue. Los productos de la PCR se re-amplificaron con cebadores quiméricos diseñados para incorporar o bien un promotor de T3 aguas arriba, o bien un promotor de T7 aguas abajo de los productos de re-amplificación. Los productos de la PCR resultantes se utilizaron como molde para sintetizar ribosondas marcadas con digoxigenina mediante transcripción in vitro (IVT). Las sondas antisentido y efectoras se sintetizaron utilizando ARN polimerasas de T7 y T3, respectivamente, en presencia de digoxigenina-11-UTP (Boehringer-Mannheim) utilizando un kit MAXIscript IVT (Ambion) según el fabricante. Después el ADN fue degradado con AdNasa-1, y la digoxigenina no incorporada se separó mediante ultrafiltración. La integridad de la ribosonda se evaluó mediante electroforesis a través de un gel de poliacrilamida desnaturalizante. El tamaño molecular se comparó con la movilidad electroforética de una escala "ladder" de ARN de 100-1.000 pares de bases (pb) (Ambion). El rendimiento y el marcaje de la sonda se evaluaron mediante inmunoquímica de transferencia. Las ribosondas se almacenaron en alícuotas de 5 \mul a -80ºC.

La hibridación in situ se realizó como sigue. Se cortó hueso de rata congelado en secciones de 5 \muM en un criostato Jung CM3000 (Leica) y se montó sobre portas adherentes (Instrumedics). Las secciones se mantuvieron en el criostato a -20ºC hasta que todos los portas estuvieron preparados con el fin de evitar la degradación del ARNm antes de la post-fijación durante 15 minutos en paraformaldehído al 4%. Tras la post-fijación, las secciones se incubaron con 1 ng/\mul de ribosonda antisentido o efectora en tampón de hibridación a medida del usuario de Pathology Associates International (PAI) durante aproximadamente 40 horas a 58ºC. Tras la hibridación, los portas se sometieron a una serie de lavados restrictivos post-hibridación para reducir la unión de la sonda no específica. La hibridación se visualizó mediante inmunohistoquímica con un anticuerpo anti-digoxigenina (fragmento FAB) conjugado con fosfatasa alcalina. Se utilizó cloruro de nitroazul de tetrazolio/fosfato de bromocloroindolilo (Boehringer-Mannheim), un sustrato de la fosfatasa alcalina precipitante, como cromógeno para teñir las células hibridantes de púrpura a casi negro, dependiendo del grado de tinción. Las secciones de tejido se contra-tiñeron con rojo rápido nuclear. Los controles del análisis incluían la omisión de la sonda, la omisión de la sonda y el anticuerpo anti-digoxigenina.

Se evaluaron los tipos de células específicos en cuanto a la demostración de la hibridación con sondas antisentido visualizando una tinción citoplásmica y/o peri-nuclear de púrpura a negro indicando una señal de hibridación positiva para el ARNm. Cada tipo de célula se comparó con las secciones replicadas, que fueron hibridadas con la respectiva sonda efectora. Los resultados se consideraban positivos si se observaba tinción con la sonda antisentido y no se observaba tinción o un fondo débil con la sonda efectora.

La localización celular de la señal de hibridación para cada una de las sondas del estudio se resume en la Tabla 5. La hibridación para Zmax1 se detectaba principalmente en las zonas de hueso implicadas en la remodelación, incluyendo el endostio y el hueso trabecular en la metáfisis. También se observaba hibridación en las células de recubrimiento del hueso seleccionadas del periostio y la epífisis. La señal positiva también se observaba en los condrocitos en la placa de crecimiento, concretamente en los condrocitos en proliferación, Véanse las Figs. 10, 11 y 12 para las fotomicrografías representativas de los resultados de la hibridación in situ.

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TABLA 5

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Estos estudios confirman la expresión posicional de Zmax1 en células implicadas en la remodelación ósea y la formación de hueso. La expresión de Zmax1 en la zona de proliferación y en los osteoblastos y osteoclastos de la metafisis proximal, sugiere que el gen Zmax1 está implicado en el proceso de crecimiento y mineralización óseos. La actividad y diferenciación de los osteoblastos y osteoclastos están íntimamente coordinadas durante el desarrollo a medida que el hueso se forma y durante el crecimiento así como en la vida adulta a medida que el hueso experimenta una remodelación continua. La formación de estructuras óseas internas y la remodelación del hueso resultan de la resorción ósea por la actividad de los osteoclastos con el subsiguiente depósito de nuevo material por los osteoblastos. Zmax1 está relacionado con el gen del receptor de LDL, y de este modo puede ser un receptor implicado en la mecanosensación y la subsiguiente señalización en el proceso de remodelación ósea. Por lo tanto, los cambios en el nivel de expresión de este gen podrían tener impacto en la tasa de remodelación y el grado de mineralización del hueso. Se pueden diseñar estudios similares para el análisis in situ de HBM o Zmax1 en otras células o tejidos.

XIV. Antisentido

Los oligonucleótidos antisentido son ácidos nucleicos sintéticos cortos que contienen secuencias de bases complementarias a un ARN elegido como diana. La hibridación del ARN en las células vivas con el oligonucleótido antisentido interfiere en la función del ARN y por último bloquea la expresión de proteínas. Por lo tanto, cualquier gen cuya secuencia parcial es conocida puede ser elegido como diana por un oligonucleótido antisentido.

La tecnología antisentido se está convirtiendo en una herramienta ampliamente utilizada y jugará un papel importantemente creciente en la validación y elucidación de dianas terapéuticas identificadas por intentos de secuenciación genómica.

Se desarrolló la tecnología antisentido para inhibir la expresión génica utilizando un oligonucleótido complementario al ARNm que codifica el gen diana. Existen numerosos mecanismos posibles para los efectos inhibidores de los oligonucleótidos antisentido. Entre ellos, se considera que la degradación del ARNm por la ARNasa H es el principal mecanismo de inhibición de la función de la proteína. Esta técnica fue utilizada originalmente para esclarecer la función de un gen diana, pero también puede tener aplicaciones terapéuticas, siempre que se diseñe cuidadosamente y apropiadamente.

Un ejemplo de materiales y métodos para preparar oligonucleótidos antisentido se puede realizar como sigue. Se han acometido estudios preliminares en colaboración con Sequiter (Natick, MA) utilizando la tecnología antisentido en la línea celular de ratón de tipo osteoblasto, MC3T3. Se puede provocar que estas células se desarrollen a lo largo de la diferenciación celular. Un período de proliferación inicial se caracteriza por una expresión mínima de los marcadores de diferenciación y una síntesis inicial de la matriz extracelular colagenosa. La síntesis de la matriz de colágeno es requerida para la posterior inducción de los marcadores de diferenciación. Una vez que la síntesis de la matriz comienza, los genes marcadores de osteoblastos se activan en una clara secuencia temporal: se induce la fosfatasa alcalina en los primeros momentos mientras la sialoproteína y la osteocalcina del hueso aparecen más tarde en el proceso de diferenciación. Esta secuencia temporal de la expresión génica es útil en el control de los procesos de maduración y mineralización. La mineralización de la matriz, que no comienza hasta varios días después de que se haya iniciado la maduración, implica depósito de minerales sobre y en las fibrillas de colágeno dentro de la matriz cerca de la interfaz capa de células-placa de cultivo. El mineral asociado a las fibrillas de colágeno formado por los osteoblastos cultivados se parece al encontrado en el hueso reticular in vivo y por lo tanto se utiliza frecuentemente como reactivo de estudio.

Se transfectaron células MC3T3 con oligonucleótidos antisentido durante la primera semana de la diferenciación, según las especificaciones del fabricante (Patente de los Estados Unidos Núm. 5.849.902).

Los oligonucleótidos diseñados para Zmax1 se proporcionan más abajo:

10875: AGUACAGCUUCUUGCCAACCCAGUC

10876: UCCUCCAGGUCGAUGGUCAGCCCAU

10877: GUCUGAGUCCGAGUUCAAAUCCAGG

La Figura 13 muestra los resultados de la inhibición antisentido de Zmax1 en las células MC3T3. Los tres oligonucleótidos mostrados antes fueron transfectados en MC3T3 y el ARN fue aislado según los procedimientos normalizados. El análisis Northern muestra claramente niveles en estado estacionario notablemente inferiores del transcrito de Zmax1 mientras el gen GAPDH de control permanecía sin cambios. De este modo, la tecnología antisentido utilizando los cebadores descritos antes permite el estudio del papel de la expresión de Zmax1 en la biología del hueso. Se pueden utilizar cebadores similares para estudiar la expresión de Zmax1 y su capacidad para regular los niveles de lípidos en un animal.

La proteína codificada por Zmax1 está relacionada con el receptor de Lipoproteína de Baja densidad (receptor LDL). Véase, Goldstein et al., Ann. Rev. Cell Biology, 1:1-39 (1985); Brown et al., Science, 232:34-47 (1986). El receptor de LDL es el responsable de la absorción de las lipoproteínas de baja densidad, un agregado de lípido-proteína que incluye el colesterol. Los individuos con un defecto en el receptor de LDL tienen una eliminación defectuosa del colesterol y tienden a desarrollar arteriosclerosis. Además, las células con un receptor de LDL defectuoso muestran un aumento de la producción de colesterol, en parte debido a la regulación alterada de la retroalimentación de las enzimas sintéticas de colesterol y debido en parte al incremento de la transcripción de los genes para estas enzimas. En algunos tipos de células, el colesterol es un precursor de la formación de hormonas esteroides.

De este modo, el receptor de LDL puede funcionar, directa o indirectamente, como proteína de transducción de la señal y puede regular la expresión génica. Debido a que Zmax1 está relacionada con el receptor de LDL, esta proteína también puede estar implicada en la señalización entre células de un modo que afecta a la remodelación ósea así como puede regular los niveles de lípidos y por lo tanto las enfermedades mediadas por lípidos.

Es probable que el aminoácido 171 glicina sea importante para la función de Zmax1 puesto que este aminoácido también se encuentra en el homólogo de Zmax1 de ratón. La proteína LRP6 íntimamente relacionada también contiene glicina en la posición correspondiente (Brown et al., Biochemical and Biophysical Research Comm., 248:879-888 (1988)). Los aminoácidos que son importantes en la estructura o la función de una proteína tienden a estar conservados entre las especies, debido a que la selección natural evita la aparición de mutaciones con aminoácidos alterados en las posiciones importantes.

Además, el dominio extracelular de Zmax1 contiene cuatro repeticiones que consisten en cinco motivos YWT seguidos de un motivo EFG. Es probable que esta repetición 5YWT+EGF forme un dominio de la proteína plegada distinto, ya que esta repetición también se encuentra en el receptor de LDL y otras proteínas relacionadas con el receptor de LDL. Las tres primeras repeticiones 5YWT+EGF tienen una estructura muy similar, mientras la cuarta es altamente divergente. La glicina 171 aparece en el motivo YWT central de la primera repetición 5YWT+EGF en Zmax1. Las otras dos repeticiones 5YWT+EGF similares de Zmax1 también contienen glicina en la posición correspondiente, como la repetición 5YWT+EGF en la proteína receptora de LDL. No obstante, solamente el 17,6% de los aminoácidos son idénticos entre las tres primeras repeticiones 5YWT+EGF de Zmax1 y la única repetición del receptor de LDL. Estas observaciones indican que la glicina 171 es esencial para la función de esta repetición, y la mutación de la glicina 171 ocasiona una alteración funcional de Zmax1. El ADNc y las secuencias peptídicas se muestran en las Figs. 6A-6J. La base crítica en la posición del nucleótido 582 está indicada en negrita y está
subrayada.

El análisis de transferencia Northern (Figs. 7A-B) revela que Zmax1 es expresado en tejido de hueso humano así como en otros numerosos tejidos. Se sondeó una transferencia Northern de múltiples tejidos (Clontech, Palo Alto, CA) con exones de Zmax1. Como se muestra en la Fig. 7A, el transcrito de Zmax1 de 5,5 kb era altamente expresado en corazón, riñón, pulmón, hígado y páncreas y es expresado a niveles más bajos en músculo esquelético o cerebro. Una segunda transferencia northern, mostrada en la Fig. 7B, confirmó el tamaño de transcrito en 5,5 kb, e indicó que Zmax1 es expresado en hueso, médula ósea, calvaria y líneas celulares osteoblásticas humanas.

Tomados juntos, estos resultados indican que el polimorfismo de HBM del gen Zmax1 es responsable del fenotipo HBM, y que el gen Zmax1 es importante en el desarrollo óseo. Además, debido a que la mutación de Zmax1 puede alterar la mineralización y el desarrollo óseo así como el nivel de lípidos, es probable que las moléculas que se unen a Zmax1 puedan alterar de manera útil el desarrollo óseo y los niveles de lípidos. Tales moléculas pueden incluir, por ejemplo, pequeñas moléculas, proteínas, aptámeros de ARN, aptámeros de péptidos, y similares.

XV. Preparación de Ácidos Nucléicos, Vectores, Transformaciones y Células Anfitrionas

Se pueden producir grandes cantidades de los ácidos nucleicos de la presente invención mediante replicación en una célula anfitriona adecuada. Los fragmentos de ácido nucleico naturales o sintéticos que codifican un fragmento deseado se incorporarán a constructos de ácido nucleico recombinante, normalmente constructos de ADN, susceptibles de introducción y replicación en una célula procariótica o eucariótica. Normalmente los constructos de ácido nucleico serán adecuados para la replicación en un anfitrión unicelular, tal como una levadura o una bacteria, pero también pueden estar destinados a la introducción en líneas celulares de mamífero o planta cultivados (con o sin la integración en el genoma) u otro eucariota. La purificación de ácidos nucleicos producidos mediante los métodos de la presente invención son descritos, por ejemplo, por Sambrook et al., en Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) o Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley and Sons, NY (1992).

Los ácidos nucleicos de la presente invención también pueden ser producidos mediante síntesis química, p. ej., mediante el método de la fosforamidita descrito por Beaucage et al., Tetra. Letts., 22:1859-1862 (1981) o el método del triéster según Matteucci, et al., J. Am. Chem. Soc., 103:3185 (1981), y se puede realizar en sintetizadores de oligonucleótidos automatizados, disponibles en el mercado. Se puede obtener un fragmento de doble hebra a partir del producto de hebra sencilla de la síntesis química sintetizando la hebra complementaria e hibridando las hebras entre sí en condiciones apropiadas o añadiendo la hebra complementaria utilizando ADN polimerasa con una secuencia cebadora apropiada.

Los constructos de ácido nucleico preparados para la introducción en un anfitrión procariótico o eucariótico pueden comprender un sistema de replicación reconocido por el anfitrión, incluyendo el fragmento de ácido nucleico deseado que codifica la proteína deseada, y también incluirán preferiblemente secuencias reguladoras del inicio de la transcripción y la traducción conectadas operablemente al segmento que codifica la proteína. Los vectores de expresión pueden incluir, por ejemplo, un origen de replicación o una secuencia autónomamente replicante (ARS) y secuencias de control de la expresión, un promotor, un intensificador y sitios de información para el procesamiento necesarios, tales como los sitios de unión al ribosoma, los sitios de empalme con ARN, los sitios de poliadenilación, las secuencias terminadoras de la transcripción, y las secuencias estabilizadoras del ARNm. Cuando sea apropiado también se pueden incluir señales de secreción, ya sea de una proteína HBM o Zmax1 nativa o de otros receptores o de proteínas secretadas de la misma especie o una afín, que permitan que la proteína cruce y/o se hospede en las membranas celulares, y de este modo alcance su topología funcional, o sea secretada de la célula. Tales vectores se pueden preparar por medio de técnicas recombinantes normalizadas bien conocidas en la técnica y comentadas, por ejemplo, por Sambrook et al., en Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2ª Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) o Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley and Sons, NY (1992).

Se seleccionarán un promotor apropiado y otras secuencias vectoras necesarias con el fin de que sean funcionales en el anfitrión, y pueden incluir, cuando sea apropiado, aquellas asociadas naturalmente con los genes Zmax1 o HBM. Los ejemplos de las combinaciones factibles de líneas celulares y vectores de expresión son descritos por Sambrook et al., en Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2ª Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) or Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley and Sons, NY (1992). Muchos vectores útiles son conocidos en la técnica y se pueden obtener de proveedores como Stratagene, New England BioLabs, Promega Biotech, y otros. Los promotores tales como trp, lac y promotores de fagos, promotores de ARNt y promotores de enzimas glicolíticas pueden ser utilizados en células procarióticas. Los promotores de levadura útiles incluyen regiones promotoras para la metalotioneína, la 3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas glicolíticas tales como enolasa o gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa, y otras. Los vectores y promotores adecuados para su uso en la expresión en levaduras se describen adicionalmente en EP 73.675A. Los promotores de mamíferos no nativos apropiados podrían incluir los promotores temprano y tardío de SV40 (Fiers et al., Nature, 273:113 (1978)) o los promotores derivados del virus de la leucemia de Moloney de ratón, el virus de tumores de ratón, virus del sarcoma aviar, adenovirus II, virus del papiloma bovino o polioma. Además, el constructo se puede unir a un gen amplificable (p. ej. DHFR) de manera que se puedan elaborar múltiples copias del gen. Para los intensificadores apropiados y otras secuencias de control de la expresión, véase también Enhancers and Eukaryotic Gene Expression, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1983).

Si bien tales vectores de expresión pueden replicar autónomamente, también pueden replicar al ser insertados en el genoma de la célula anfitriona, mediante métodos bien conocidos en la técnica.

Los vectores de expresión y clonación contendrán probablemente un marcador seleccionable, un gen que codifique una proteína necesaria para la supervivencia o crecimiento de una célula anfitriona transformada con el vector. La presencia de este gen solamente asegura el crecimiento de aquellas células anfitrionas que expresan los insertos. Los genes de selección típicos codifican proteínas que a) confieren resistencia a antibióticos u otras sustancias tóxicas, p. ej. ampicilina, neomicina, metotrexato, etc.; b) complementan deficiencias auxotróficas, o c) suministran nutrientes críticos no disponibles de medios complejos, p. ej., el gen que codifica la D-alanina racemasa para los Bacilos. La elección del marcador seleccionable apropiado dependerá de la célula anfitriona, y los marcadores apropiados para los diferentes anfitriones son bien conocidos en la técnica.

Los vectores que contienen los ácidos nucleicos de interés pueden ser transcritos in vitro, y el ARN resultante introducido en la célula anfitriona mediante métodos bien conocidos, p. ej., mediante inyección (véase, Kubo et al., FEBS Letts. 241:119 (1988)), o los vectores pueden ser introducidos directamente en las células anfitrionas mediante métodos bien conocidos en la técnica, que varían dependiendo del tipo de anfitrión celular, incluyendo la electroporación; la transfección empleando cloruro de calcio, cloruro de rubidio, fosfato de calcio, DEAE-dextrano, u otras sustancias; el bombardeo con microproyectiles; la lipofección; la infección (donde el vector es un agente infeccioso, tal como un genoma retroviral); y otros métodos. Véase generalmente, Sambrook et al., 1989 y Ausubel et al., 1992. La introducción de los ácidos nucleicos en la célula anfitriona mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo los descritos antes, será referida en la presente memoria como "transformación". Se pretende que las células en las cuales se han introducido los ácidos nucleicos descritos antes incluyan la progenie de tales células.

Se pueden preparar grandes cantidades de los ácidos nucleicos y proteína de la presente invención expresando los ácidos nucleicos de Zmax1 o HBM o porciones de los mismos en vectores u otros vehículos de expresión en células anfitrionas procarióticas o eucarióticas compatibles. Los anfitriones procarióticos más comúnmente utilizados son cepas de Escherichia coli, aunque también se pueden utilizar otros procariotas, tales como Bacillus subtilis o Pseudomonas.

Las células anfitrionas de mamífero u otros eucariotas, tales como las de levadura, hongos filamentosos, plantas, insectos, o anfibios o especies de aves, también pueden ser útiles para la producción de las proteínas de la presente invención. La propagación de células de mamífero en cultivo es bien conocida per se. Véase, Jakoby y Pastan (eds.), Cell Culture. Methods in Enzymology, volumen 58, Academic Press, Inc., Harcourt Brace Jovanovich, NY, (1979)). Los ejemplos de las líneas celulares de anfitriones mamíferos comúnmente utilizadas son células VERO y HeLa, células de ovario de hámster Chino (CHO), y las líneas celulares WI38, BHK, y COS, aunque será bien apreciado por los expertos en la técnica que pueden ser apropiadas otras líneas celulares, p. ej., para proporcionar patrones de glicosilación deseables de expresión superior, u otros rasgos.

Los clones se seleccionan utilizando marcadores dependiendo del modo de construcción del vector. El marcador puede estar en la misma molécula de ADN o en una diferente, preferiblemente la misma molécula de ADN. En los anfitriones procarióticos, el transformante puede ser seleccionado, p. ej., por la resistencia a la ampicilina, tetraciclina u otros antibióticos. La producción de un producto concreto basada en la sensibilidad a la temperatura también puede servir como marcador apropiado.

Las células procarióticas o eucarióticas transformadas con los ácidos nucleicos descritos en la presente memoria serán útiles no solamente para la producción de los ácidos nucleicos y proteínas de la presente invención, si no también, por ejemplo, en el estudio de las características de las proteínas Zmax1 o HBM.

Las secuencias de ácido nucleico antisentido son útiles en la prevención o disminución de la expresión de Zmax1 o HBM, como apreciará un experto en la técnica. Por ejemplo, los vectores de ácido nucleico que contienen todo o una porción del gen Zmax1 o HBM u otras secuencias de la región de Zmax1 o HBM se pueden situar bajo el control de un promotor en orientación antisentido e introducir en una célula. La expresión de semejante constructo antisentido en una célula interferirá en la transcripción y/o traducción y/o replicación de Zmax1 o HBM.

Las sondas y cebadores basados en las secuencias génicas de Zmax1 y HBM descritas en la presente memoria se utilizan para identificar secuencias génicas de Zmax1 y HBM homólogas y proteínas en otras especies. Estas secuencias génicas y proteínas de Zmax1 y HBM se utilizan en los métodos de diagnóstico/pronóstico, terapéuticos y de escrutinio de fármacos descritos en la presente memoria para las especies de las cuales han sido aislados.

XVI. Expresión y Purificación de Proteínas

La expresión y purificación de la proteína HBM descrita antes se pueden realizar esencialmente como se esboza más abajo. Para facilitar la clonación, expresión y purificación de la proteína de membrana y secretada del gen HBM, se seleccionó un sistema de expresión génico, tal como el pET System (Novagen), para clonar y expresar proteínas recombinantes en E. coli. Asimismo, se fusionó una secuencia de ADN que codificaba una etiqueta peptídica, His-Tap, con el extremo 3' de las secuencias de ADN de interés para facilitar la purificación de los productos de la proteína recombinante. El extremo 3' se seleccionó para fusionarlo para evitar la alteración de cualquier secuencia señal 5' terminal.

Los ácidos nucleicos seleccionados, por ejemplo, entre los ácidos nucleicos mostrados en los SEQ ID NOS: 1,3 y 5-12 para la clonación de HBM fueron preparados mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los cebadores oligonucleotídicos sintéticos específicos para los extremos 5' y 3' de la secuencia de nucleótidos de HBM fueron diseñados y adquiridos de Technologies (Gaithersburg, MD). Todos los cebadores directos (específicos para el extremo 5' de la secuencia) fueron diseñados para incluir un sitio de clonación NcoI en el extremo 5'. Estos cebadores fueron diseñados para permitir el inicio de la traducción de proteínas en el resto metionina codificado en el sitio NcoI seguido de un resto valina y la proteína codificada por la secuencia de ADN de HBM. Todos los cebadores inversos (específicos para el extremo 3' de la secuencia) incluían un sitio EcoRI en el extremo 5' para permitir la clonación de la secuencia de HBM en el marco de lectura de pET-28b. El vector pET-28b proporcionaba una secuencia que codificaba 20 aminoácidos carboxilo terminales adicionales incluyendo seis restos histidina (en el extremo C), que comprendía la etiqueta de afinidad de histidina.

El ADN genómico preparado a partir del gen HBM fue utilizado como fuente de ADN molde para la amplificación por PCR (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1994)). Para amplificar una secuencia de ADN que contiene la secuencia de nucleótidos de HBM, se introdujo ADN genómico (50 ng) en un vial de reacción que contenía MgCl_{2} 2 mM, cebadores oligonucleotídicos sintéticos 1 \muM (cebadores directo e inverso) complementarios y que flanqueban un HBM definido, 0,2 mM de cada desoxinucleótido trifosfato, dATP, dGTP, dCTP, dTTP y 2,5 unidades de ADN polimerasa termoestable (Amplitaq, Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ) en un volumen final de 100 \mul.

Una vez completadas las reacciones de ciclación térmica, cada muestra de ADN amplificado fue purificada utilizando el kit de purificación Qiaquick Spin PCR (Qiagen, Gaithersburg, MD). Todas las muestras de ADN amplificadas fueron sometidas a digestión con las endonucleasas de restricción, p. ej., NcoI y EcoRI (New England BioLabs, Beverly, MA) (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)). Las muestras de ADN fueron sometidas después a electroforesis en geles de agarosa NuSeive 1,0% (FMC BioProducts, Rockland, ME). El ADN fue visualizado mediante exposición a bromuro de etidio e irradiación con UV de onda larga. El ADN contenido en las porciones aisladas del gel de agarosa fue purificado utilizando el protocolo de Bio 101 GeneClean Kit (Bio 101, Vista, CA).

El vector pET-28b fue preparado clonando mediante digestión con endonucleasas de restricción, p. ej., Ncol y EcoRI (New England BioLabs, Beverly, MA) (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)). El vector pET-28a, que codifica la etiqueta de afinidad de histidina que se puede fusionar con el extremo 5' de un gen insertado, se preparó mediante digestión con endonucleasas de restricción apropiadas.

Tras la digestión, los insertos de ADN fueron clonados (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)) en el vector de expresión pET-28b digerido previamente. Los productos de la reacción de la ligación se utilizaron después para transformar la cepa BL21 de E. coli (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)) como se describe más abajo.

Se transformaron bacterias competentes, E. coli cepa BL21 o E. coli cepa BL21 (DE3), con plásmidos de expresión pET recombinantes que portaban la secuencia de HBM clonada según los métodos normalizados (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)). Brevemente, se mezcló un 1 \mul de reacción de ligación con 50 \mul de células electrocompetentes y se sometió a pulsos de alto voltaje, después de lo cual las muestras se incubaron en 0,45 ml de medio SOC (extracto de levadura al 0,5%, triptona al 2,0%, NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgCl_{2} 10 mM, MgSO_{4} 10 mM y glucosa 20 mM) a 37ºC con sacudimiento durante 1 hora. Después las muestras fueron diseminadas sobre placas de agar LB que contenían 25 \mug/ml de sulfato de kanamicina para su crecimiento durante la noche. Las colonias de BL21 transformadas fueron seleccionadas después y analizadas para evaluar los insertos clonados, como se describe más abajo.

Los clones de BL21 individuales transformados con las secuencias de nucleótidos de HBM de pET-28b recombinante fueron analizados mediante amplificación por PCR de los insertos clonados utilizando los mismos cebadores directo e inverso específicos para las secuencias de HBM que se utilizaron en las reacciones de clonación con amplificación por PCR originales. La amplificación exitosa verifica la integración de la secuencia de HBM en el vector de expresión (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)).

Los clones individuales de los vectores pET-28b recombinantes que portaban secuencias de nucleótidos de HBM clonadas apropiadamente fueron seleccionados e incubados en 5 ml de caldo LB mas 25 \mug/ml de sulfato de kanamicina durante la noche. Al día siguiente se aisló el ADN plasmídico y se purificó utilizando el protocolo de purificación de plásmidos de Qiagen (Qiagen Inc., Chatsworth, CA).

El vector pET se puede propagar en cualquier cepa K-12 de E. coli, p. ej., HMS174, HB101, JM109, DH5 y similares, para la clonación o preparación de plásmidos. Los anfitriones para la expresión incluyen cepas de E. coli que contienen una copia cromosómica del gen para la ARN polimerasa de T7. Estos anfitriones eran lisógenos del bacteriófago DE3, un derivado de lambda que porta el gen lacI, el promotor lacUV5 y el gen para la ARN polimerasa de T7. La ARN polimerasa de T7 fue inducida mediante la adición de isopropil-\beta-D-tiogalactósido (IPTG), y la ARN polimerasa de T7 transcribe cualquier plásmido diana que contiene un promotor de T7 funcional, tal como pET-28b, que portaba su gen de interés. Las cepas incluyen, por ejemplo, BL21(DE3) (Studier et al., Meth. Enzymol., 185:60-89(1990)).

Para expresar la secuencia de HBM recombinante, se aislaron 50 ng de ADN plasmídico como se ha descrito antes para transformar bacterias BL21(DE3) competentes como se ha descrito antes (proporcionado por Novagen como parte del kit de expresión de pET). El gen lacZ (\beta-galactosidasa) es expresado en el pET-System como se describe para las construcciones recombinantes de HBM. Las células transformadas se cultivaron en medio SOC durante 1 hora, y el cultivo se cultivó en placa sobre placas LB que contenían 25 \mug/ml de sulfato de kanamicina. Al día siguiente, las colonias bacterianas se reunieron y se hicieron crecer en medio LB que contenía sulfato de kanamicina (25 \mug/ml) hasta una densidad óptica a 600 nm de 0,5 a 1,0 unidades de D.O., punto en el cual se añadió IPTG 1 mM al cultivo durante 3 horas para inducir la expresión génica de las construcciones de ADN recombinante de HBM.

Tras la inducción de la expresión génica con IPTG, se recogieron las bacterias por centrifugación en una centrífuga Sorvall RC-3B a 3.500 x g durante 15 minutos a 4ºC. Los sedimentos se resuspendieron en 50 ml de Tris-HCl mM frío, pH 8,0, NaCl 0,1 M y EDTA 0,1 mM (tampón STE). Las células se centrifugaron después a 2.000 x g durante 20 minutos a 4ºC. Los sedimentos húmedos se pesaron y se congelaron a -80ºC hasta que estuvieron listos para la purificación de proteínas.

Se pueden utilizar una variedad de metodologías conocidas en la técnica para purificar las proteínas aisladas (Coligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons (1995)). Por ejemplo, las células congeladas pueden ser descongeladas, resuspendidas en tampón y rotas mediante varios pases a través de un microfluidificador de pequeño volumen (Modelo M-1105, Microfluidics International Corp., Newton, MA). El producto homogeneizado resultante es centrifugado para producir un sobrenadante claro (extracto bruto) y, tras la filtración, el extracto bruto es fraccionado sobre columnas. Las fracciones se controlan mediante la absorbancia a DO_{280} nm y las fracciones pico se pueden analizar mediante SDS-PAGE.

Las concentraciones de las preparaciones de proteína purificadas se cuantifican espectrofotométricamente utilizando coeficientes de absorbancia calculados a partir del contenido en aminoácidos (Perkins, Eur. J. Biochem., 157:169-180 (1986)). Las concentraciones de proteína también se miden mediante el método de Bradford, Anal. Biochem., 72:248-254 (1976) y Lowry et al., J. Biol. Chem., 193:265-275 (1951) utilizando seralbúmina bovina como patrón.

Se adquirieron geles de poliacrilamida-SDS de diversas concentraciones de BioRad (Hercules, CA), y se tiñeron con azul de Coomassie. Los marcadores de peso molecular pueden incluir miosina de músculo esquelético de conejo (200 kDa), \beta-galatosidasa de E. coli (116 kDa), fosforilasa B de músculo de conejo (97,4 kDa), seralbúmina bovina (66,2 kDa), ovoalbúmina (45 kDa), anhidrasa carbónica bovina (31 kDa), inhibidor de tripsina de soja (21,5 kDa), lisozima de clara de huevo (14,4 kDa) y aprotinina bovina (6,5 kDa).

Una vez que se ha obtenido una cantidad suficiente de la proteína deseada, ésta se puede utilizar para diversos fines. Un uso típico es la producción de anticuerpos específicos para la unión. Estos anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales, y se pueden producir mediante mecanismos in vitro o in vivo bien conocidos en la técnica. Los anticuerpos monoclonales para los epítopos de cualquiera de los péptidos identificados y aislados como se ha descrito se pueden preparar a parir de hibridomas de ratón (Kohler, Nature, 256:495 (1975)). En resumen, un ratón es inoculado con unos pocos gramos de proteína HBM durante un período de dos semanas. Después el ratón es sacrificado. Las células que producen los anticuerpos son separadas del bazo del ratón. Las células del bazo se fusionan después con polietilenglicol con células de mieloma de ratón. Las células fusionadas con éxito se diluyen en una placa de microtitulación y el crecimiento del cultivo continúa. La cantidad de anticuerpo por pocillo se mide mediante métodos de inmunoanálisis tales como ELISA (Engvall, Meth. Enzymol., 70:419 (1980)). Los clones que producen anticuerpo se pueden ampliar y propagar adicionalmente para producir anticuerpos para HBM. Otras técnicas adecuadas implican la exposición in vitro de linfocitos a los polipéptidos antigénicos, o alternativamente, a la selección de genotecas de anticuerpos en fagos o vectores similares. Véase Huse et al., Science, 246:1275-1281 (1989). Para una información adicional sobre la
producción de anticuerpos véase Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, NY, Sección 21-2 (1989).

Se conocen protocolos normalizados para evaluar la influencia de un agente (p. ej., anticuerpo, proteína HBM, polimorfismo de proteína o proteína o compuesto Zmax1) para alterar los niveles de lípidos en una célula o los niveles fisiológicos en un sujeto. Por ejemplo, véase F.W. HEMMING, LIPID ANALYSIS (Bios Scientific Pub. 1996) y J. M. ORDOVAS, LIPOPROTEIN PROTOCOLS (Humana Press Inc. 1997). Más específicamente, se pueden realizar análisis de colesterol y triglicéridos utilizando el método Olympus AU5000 Cholesterol. Este método de medición del colesterol combina el uso de las enzimas con una modificación del sistema peroxidasa-fenol-4-aminoantipirina, sustituyendo el ácido 2-hidroxi-3,5-diclorobencenosulfónico (2-OH 3,5 DCBSA) por el grupo fenólico para la medición del colesterol total en suero del sujeto. El análisis se basa en una serie de reacciones enzimáticas acopladas. Los ésteres de colesterol presentes en suero se hidrolizan a colesterol libre y ácidos grasos por la colesterol esterasa. El colesterol es oxidado a su vez por la colesterol oxidasa a colest-4-en-3-ona con la producción simultánea de hidrógeno peroxidasa. La hidrógeno peroxidasa reacciona con 4-aminoantipirina en presencia de 2-OH-3,5-DCBSA para producir un cromóforo que absorbe a 570 nm. La absorbancia de la mezcla de reacción se mide biocromáticamente a 570/750 nm y es proporcional a la concentración de colesterol de la muestra.

Para el análisis de triglicéridos en suero, también se puede utilizar el procedimiento para triglicéridos de Olympus AU5000. Brevemente, se basa en una serie de reacciones enzimáticas acopladas. Los triglicéridos del suero son hidrolizados a ácidos grasos libres y glicerol por la lipoproteína lipasa. El glicerol es fosforilado enzimáticamente y después oxidado con glicerolfosfato oxidasa. La hidrógeno peroxidasa reacciona con el cromógeno 4-amino-antipirina en presencia de Ácido DCB Sulfónico para dar un cromóforo con absorción que se mide biocromáticamente a 520/660 nm. El incremento en la absorbancia de la mezcla de reacción es proporcional a la concentración de triglicéridos de la muestra.

XVII. Métodos de Uso: Terapia Génica

En los últimos años, se han realizado avances tecnológicos significativos en el área de la terapia génica para enfermedades tanto genéticas como adquiridas (Kay et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:12744-12746 (1997)). La terapia génica puede ser definida como la transferencia deliberada del ADN para fines terapéuticos. La mejora en los métodos de transferencia génica ha permitido el desarrollo de protocolos de terapia génica para el tratamiento de diversos tipos de enfermedades. La terapia génica también puede sacar ventaja de los recientes avances en la identificación de nuevos genes terapéuticos, la mejora de los sistemas de liberación génica virales y no virales, el mejor conocimiento de la regulación génica, y las mejoras en el aislamiento y el trasplante celulares.

Los experimentos de más abajo identifican el gen HBM como una mutación dominante que confiere una masa ósea elevada y que altera los niveles de lípidos. El hecho de que esta mutación sea dominante indica que la expresión de la proteína HBM causa una masa ósea elevada y quizás cambios en los niveles de lípidos. Los individuos mayores que portan el gen HBM, y, por lo tanto expresan la proteína HBM, no padecen osteoporosis. Estos individuos son equivalentes a individuos que están siendo tratados con la proteína HBM. Estas observaciones constituyen una fuerte indicación experimental de que el tratamiento terapéutico con la proteína HBM evita la osteoporosis. La actividad elevadora de la masa ósea del gen HBM se denomina "función de HBM".

Por lo tanto, la función de HBM puede ser suministrada a células del tallo mesenquimático (Onyia et al., J. Bone Miner. Res., 13:20-30 (1998); Ko et al., Cancer Res., 56:4614-4619 (1996)). El suministro de semejante función proporciona protección frente a la osteoporosis. Para regular los niveles de lípidos, la función de HBM puede ser suministrada a las células del hígado, así como a otras células implicadas en el metabolismo de los lípidos y la regulación de los lípidos (p. ej., células del músculo, las células de las lesiones, las células espumosas cargadas de lípidos y megacarioblastos). El gen HBM o parte del gen puede ser introducido en la célula en un vector de manera que el gen permanezca extracromosómico. En semejante situación, el gen será expresado por la célula desde la localización extracromosómica.

Los vectores para la introducción de genes tanto para la recombinación como para el mantenimiento extracromosómico son conocidos en la técnica, y se puede utilizar cualquier vector adecuado. Los métodos para introducir ADN en las células tales como la electroporación, la co-precipitación con fosfato de calcio, y la transducción viral son conocidos en la técnica, y la elección del método está dentro de la competencia del experto en la técnica (Robbins, Ed., Gene Therapy Protocols, Human Press, NJ (1997)). Las células transformadas con el gen HBM pueden ser utilizadas como sistemas modelo para estudiar la osteoporosis y los tratamientos con fármacos que promueven el crecimiento óseo así como estudiar las enfermedades mediadas por lípidos.

Como se ha comentado generalmente más arriba, el gen HBM o fragmento, cuando sea aplicable, se puede utilizar en los métodos de terapia génica para incrementar la cantidad de productos de expresión de tales genes en las células del tallo mesenquimático o en otras células. También puede ser útil incrementar el nivel de expresión de una proteína HBM dada, o un fragmento de la misma, incluso en aquellas células en las que se expresa normalmente el gen de tipo salvaje. La terapia génica se llevaría a cabo según los métodos aceptados generalmente como describen, por ejemplo, Friedman, Therapy for Genetic Diseases, Friedman, Ed., Oxford University Press, páginas 105-121 (1991).

Se prepara un vector o virus plasmídico que contiene una copia del HBM conectado a elementos de control de la expresión y capaz de replicar dentro de las células del tallo mesenquimáticas o las células del hígado. Se conocen vectores adecuados y se describen por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos 5.252.479 y en la publicación WO 93/07282. El vector es inyectado después en el paciente, ya sea localmente en la médula ósea o el en hígado, o sistémicamente (con el fin de alcanzar cualquiera de las células del tallo mesenquimático localizadas en otros sitios, esto es, en la sangre). Si el gen transfectado no es incorporado permanentemente en el genoma de cada una de las células elegidas como diana, el tratamiento puede tener que repetirse periódicamente.

Los sistemas de transferencia génica conocidos en la técnica pueden ser útiles en la práctica de los métodos de terapia génica descritos en la presente memoria. Estos incluyen métodos de transferencia génica viral y no viral. Se han utilizado numerosos virus como vectores de transferencia génica, incluyendo polioma, es decir, SV40 (Madzak et al., J. Gen. Virol., 73:1533-1536 (1992)), adenovirus (Berkner, Curr. Top. Microbiol. Immunol, 158:39-61 (1992); Berkner et al., Bio Techniques, 6:616-629 (1988); Gorziglia et al., J. Virol., 66:4407-4412 (1992); Quantin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:2581-2584 (1992); Rosenfeld et al., Cell, 68:143-155(1992); Wilkinson et al., Nucl. Acids Res., 20:2233-2239 (1992); Stratford-Perricaudet et al., Hum. Gene Ther., 1:241-256 (1990)), virus vaccinia (Mackett et al., Biotechnology, 24:495-499 (1992)), virus adeno-asociados virus (Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:91-123 (1992); Ohi et al., Gene, 89:279-282 (1990)), herpes virus incluyendo HSV y EBV (Margolskee, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:67-90 (1992); Johnson et al., J. Virol., 66:2952-2965 (1992); Fink et al., Hum. Gene Ther., 3:11-19 (1992); Breakfield et al., Mol. Neurobiol., 1:337-371 (1987;) Fresse et al., Biochem. Pharmacol., 40:2189-2199 (1990)), y retrovirus de aves (Brandyopadhyay et al., Mol. Cell Biol., 4:749-754 (1984); Petropouplos et al., J. Virol., 66:3391-3397 (1992)), de ratón (Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:1-24 (1992); Miller et al., Mol. Cell Biol., 5:431-437 (1985); Sorge et al., Mol. Cell Biol., 4:1730-1737 (1984); Mann et al., J. Virol., 54:401-407 (1985)), y de origen humano (Page et al., J. Virol., 64:5370-5276 (1990); Buchschalcher et al., J. Virol., 66:2731-2739 (1992)). La mayoría de los protocolos de terapia génica en seres humanos se han basado en retrovirus de ratón incapacitados.

Los métodos de transferencia génica no viral conocidos en la técnica incluyen mecanismos químicos tales como la co-precipitación con fosfato de calcio (Graham et al., Virology, 52:456-467 (1973); Pellicer et al., Science, 209:1414-1422 (1980)), los mecanismos mecánicos, por ejemplo, la microinyección (Anderson et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 77:5399-5403 (1980); Gordon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:7380-7384 (1980); Brinster et al., Cell, 27:223-231 (1981); Constantini et al., Nature, 294:92-94 (1981)), la transferencia mediada por fusión de membranas vía liposomas (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417 (1987); Wang et al., Biochemistry, 28:9508-9514 (1989); Kaneda et al., J. Biol. Chem., 264:12126-12129 (1989); Stewart et al., Hum. Gene Ther., 3:267-275 (1992); Nabel et al., Science, 249:1285-1288 (1990); Lim et al., Circulation, 83:2007-2011 (1992)), y la absorción directa de ADN y la transferencia de ADN mediada por receptores (Wolff et al., Science, 247:1465-1468 (1990); Wu et al., BioTechniques, 11:474-485 (1991); Zenke et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 87:3655-3659 (1990); Wu et al., J. Biol. Chem., 264:16985-16987 (1989); Wolff et al., BioTechniques, 11:474-485 (1991); Wagner et al., 1990; Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:4255-4259 (1991); Cotten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:4033-4037 (1990); Curiel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8850-8854 (1991); Curiel et al., Hum. Gene Ther., 3:147-154 (1991)). La transferencia génica mediada por virus se puede combinar con vectores directos in vivo para las células del tallo mesenquimático y no para otras células (Romano et al., In Vivo, 12(1):59-67 (1998); Gonez et al., Hum. Mol. Genetics, 7(12):1913-9 (1998)). Alternativamente, la línea celular productora del vector retroviral puede ser inyectada en la médula ósea (Culver et al., Science, 256:1550-1552 (1992)). La inyección de células productoras podría proporcionar en ese caso una fuente continua de partículas de vector. Esta técnica ha sido aprobada para su uso en seres humanos con tumores de cerebro inoperables.

En un enfoque que combina los métodos de transferencia génica biológica y física, el ADN plasmídico de cualquier tamaño se combina con un anticuerpo conjugado con polilisina específico para la proteína hexona del adenovirus, y el complejo resultante se une a un vector de adenovirus. El complejo trimolecular se utiliza después para infectar células. El vector de adenovirus permite una unión, una internalización, y una degradación eficaz, del endosoma antes de que el ADN acoplado sea dañado.

Se ha demostrado que los complejos de liposoma/ADN son capaces de mediar la transferencia génica directa in vivo. Aunque en las preparaciones de liposomas normalizadas el proceso de transferencia génica no es específico, se ha informado de la absorción y la expresión in vivo, localizada en depósitos tumorales, por ejemplo, tras la administración directa in situ (Nabel, Hum. Gene Ther., 3:399-410 (1992)).

XVIII. Métodos de Uso: Anfitriones Transformados, Desarrollo de Fármacos y herramientas de Investigación

Las células y animales que portan el gen HBM se pueden utilizar como sistemas modelo para estudiar y someter a ensayo sustancias que tienen potencial como agentes terapéuticos (Onyia et al., J. Bone Miner. Res., 13:20-30 (1998); Broder et al., Bone, 21:225-235 (1997)). Las células son típicamente células del tallo mesenquimático o células del hígado cultivadas. Estas pueden ser aisladas de individuos con genes HBM somáticos o de la línea germinal. Alternativamente, la línea celular puede ser diseñada para portar el gen HBM, como se ha descrito antes. Una vez que una sustancia de ensayo se aplica a las células, se determina el fenotipo transformado de la célula. Cualquier rasgo de las células transformadas puede ser evaluado, incluyendo la formación de matriz ósea en cultivo (Broder et al., Bone, 21:225-235 (1997)), las propiedades mecánicas (Kizer et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 94:1013-1018 (1997)), y la respuesta a la aplicación de supuestos agentes terapéuticos.

Los animales para someter a ensayo los agentes terapéuticos pueden ser seleccionados después del tratamiento de las líneas germinales o zigotos. Tales tratamientos incluyen la inserción del gen Zmax1, así como la inserción del gen HBM y de los genes homólogos desorganizados. Alternativamente, se pueden desorganizar uno o más genes Zmax1 y/o genes HBM insertados de los animales mediante mutaciones por inserción o deleción de otras alteraciones genéticas convencionales utilizando mecanismos convencionales, tales como los descritos, por ejemplo, por Capechi, Science, 244:1288 (1989); Valancuis et al., Mol. Cell Biol., 11: 1402 (1991); Hasty et al., Nature, 350:243 (1991); Shinkai et al., Cell, 68:855 (1992); Mombaerts et al., Cell, 68:869 (1992); Philpott et al., Science, 256:1448 (1992); Snouwaert et al., Science, 257:1083 (1992); Donehower et al., Nature, 356:215 (1992). Una vez que las sustancias de ensayo han sido administradas a los animales, se debe evaluar el crecimiento del hueso o la modulación de los lípidos. Si la sustancia de ensayo potencia el crecimiento del hueso o regula el nivel de lípidos, la sustancia de ensayo es un agente terapéutico candidato. Estos modelos animales proporcionan un vehículo extremadamente importante para productos terapéuticos potenciales. Los modelos preferidos para estudiar la modulación de los lípidos incluyen ratones (Smith et al., J. Intern. Med., 242: 99-109 (1997)) y cobayas.

Los individuos que portan el gen HBM tienen una masa ósea elevada y niveles de lípidos alterados como se comenta en el ejemplo de más abajo. El gen HBM ocasiona este fenotipo alterando las actividades, niveles, patrones de expresión, y estados de modificación de otras moléculas implicadas en el desarrollo óseo. Utilizando una variedad de mecanismos establecidos, es posible identificar moléculas, preferiblemente proteínas o ARNm, cuyas actividades, niveles, patrones de expresión, y estados de modificación son diferentes entre los sistemas que contienen el gen Zmax 1 y los sistemas que contienen el gen HBM. Tales sistemas pueden ser, por ejemplo, extractos libres de células, células, tejidos u organismos vivos, tales como ratones o seres humanos. Para una forma mutante de Zmax1, se pueden utilizar una deleción completa de Zmax1, mutaciones que carecen de la porción extracelular o intracelular de la proteína, o cualquier mutación del gen Zmax1. También es posible utilizar la expresión del ARN o los oligonucleótidos de Zmax1 antisentido para inhibir la producción de la proteína Zmax1. Para una forma mutante de HBM, se puede utilizar una deleción completa de HBM, mutaciones que carecen de la porción extracelular o intracelular de la proteína HBM, o cualquier mutación del gen HBM. También es posible utilizar la expresión del ARN o los oligonucleótidos de HBM antisentido para inhibir la producción de la proteína HBM.

Las moléculas identificadas mediante la comparación de sistemas de Zmax1 y sistemas de HBM se pueden utilizar como marcadores informativos en el desarrollo farmacéutico o en la diagnosis de enfermedades óseas en seres humanos o animales. Alternativamente, tales moléculas se pueden utilizar en el tratamiento de enfermedades óseas. Véase, Schena et al., Science, 270:467-470 (1995).

Por ejemplo, se construye un ratón transgénico que porta el gen HBM en el homólogo de ratón. Un ratón de genotipo HBM/+ es viable, sano y tiene una masa ósea elevada. Para identificar los marcadores informativos para la masa ósea elevada, se sacrifican ratones HBM/+ (esto es, heterocigotos) e isogénicos +/+ (esto es, de tipo salvaje). Se extrae el ARNm del tejido óseo de cada animal, y se construye un "chip génico" correspondiente a los ARNm expresados en el individuo +/+. Se aísla el ARNm de diferentes tejidos de los animales de cada genotipo, se somete a transcripción inversa, se marca fluorescentemente, y después se hibrida con fragmentos génicos fijados a un soporte sólido. La razón de la intensidad fluorescente entre las dos poblaciones es indicativa de la abundancia relativa de los ARNm específicos en los animales +/+ y HBM/+. Los genes que codifican los ARNm expresados al alza y a la baja en relación con el control de tipo salvaje son candidatos para genes coordinadamente regulados por el gen HBM. Esta estrategia se puede utilizar de un modo similar para estudiar la regulación de lípidos.

Los ratones también sirven como el modelo experimental más común para la investigación de la aterosclerosis. Existen al menos tres modos de inducir aterosclerosis en ratones: (1) inducida por la dieta, inducida por deficiencia en apoE e inducida por deficiencia en receptor de LDL. Los métodos para utilizar un modelo de ratón para someter a ensayo agentes que modulan los niveles de lípidos in vivo se pueden realizar como describen Smith et al., en J. Intern. Med. 242: 99-109 (1997).

Un procedimiento normalizado para la identificación de nuevas proteínas que son parte de la misma cascada de señalización que la proteína ya descubierta es el siguiente. Las células se tratan con fósforo radiactivo, y la proteína ya descubierta se manipula para que sea más o menos activa. El estado de fosforilación de otras proteínas de la célula se controla después mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y autorradiografía, o técnica similares. Los niveles de actividad de la proteína conocida pueden ser manipulados mediante muchos métodos, incluyendo, por ejemplo, la comparación de proteínas mutantes de tipo salvaje utilizando inhibidores específicos tales como fármacos o anticuerpos, simplemente añadiendo o no añadiendo una proteína extracelular conocida, o utilizando la inhibición antisentido de la expresión de la proteína conocida (Tamura et al., Science, 280(5369):1614-7 (1998); Meng, EMB4 J., 17(15):4391-403 (1998); Cooper et al., Cell, 1:263-73 (1982)).

En otro ejemplo, se identifican las proteínas con diferentes niveles de fosforilación en células de osteosarcoma TE85 que expresan el ADNc efector o antisentido para Zmax1. Las células TE85 expresan normalmente elevados niveles de Zmax1 (Dong et al., Biochem. & Biophys. Res. Comm., 251:784-790 (1998)). Las células que contienen el constructo efector expresan niveles incluso más altos de Zmax1, mientras las células que expresan el constructo antisentido expresan niveles más bajos. Las células se hacen crecer en presencia de P^{32}, se cosechan, se someten a lisis, y los productos lisados se hacen correr sobre geles de SDS poliacrilamida para separar las proteínas, y los geles se someten a autorradiografía (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1997)). Las bandas que difieren en intensidad entre las líneas celulares efectoras y antisentido representan fosfoproteínas cuyo estado de fosforilación o nivel absoluto varía en respuesta a los niveles de Zmax1. Como alternativa al marcaje con P^{32}, las proteínas no marcadas se pueden separar mediante SDS-PAGE y someter a inmunotransferencia, utilizando el anticuerpo anti-fosfotirosina disponible en el mercado como sonda (Thomas et al., Nature, 376(6537):267-71 (1995)). Como alternativa a la expresión de ARN antisentido, se puede utilizar la transfección con oligonucleótidos antisentido modificados químicamente (Woolf et al., Nucleic Acids Res., 18(7):1763-9 (1990)).

Muchos trastornos óseos, tales como la osteoporosis, tienen un comienzo lento y una lenta respuesta al tratamiento. Por lo tanto es útil desarrollar marcadores informativos para el desarrollo y la mineralización ósea. Tales marcadores pueden ser útiles en el desarrollo de tratamientos para los trastornos óseos, y para diagnosticar pacientes que pueden estar en riesgo de desarrollar más tarde trastornos óseos. Los ejemplos de los marcadores preferidos son los marcadores telopeptídicos N- y C-terminales descritos, por ejemplo en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.455.179, 5.641.837 y 5.652.112. En el área de las enfermedades por HIV los recuentos de CD4 y la carga viral son marcadores informativos útiles para el progreso de la enfermedad (Vlahov et al., JAMA, 279(1):35-40 (1998)). Existe la necesidad de marcadores informativos análogos en el área de las enfermedades óseas.

Un marcador informativo puede ser cualquier característica que sea fácilmente sometida a ensayo y relativamente insensible a las influencias no específicas. Por ejemplo, un marcador informativo puede ser una molécula tal como una proteína o un ARNm de un tejido o suero sanguíneo. Alternativamente, un marcador informativo puede ser un signo de diagnóstico tal como la sensibilidad al dolor, una respuesta refleja o similar.

En otro ejemplo más, los marcadores informativos para la masa ósea elevada se identifican utilizando una genealogía de seres humanos que portan el gen HBM. Las muestras de sangre se retiran de tres individuos que portan el gen HBM, y de tres individuos íntimamente relacionados que no. Las proteínas del suero de estos individuos son sometidas a electroforesis sobre un sistema de gel bidimensional, en el que una dimensión separa las proteínas por tamaños, y la otra dimensión separa las proteínas por el punto isoeléctrico (Epstein et al., Electrophoresis, 17(11):1655-70 (1996)). Se identifican las manchas que corresponden a las proteínas. Se espera que unas pocas manchas estén presentes en cantidades diferentes o en posiciones ligeramente diferentes para los individuos comparados con sus parientes normales. Estas manchas corresponden a proteínas que son marcadores informativos candidato. Las identidades de las proteínas se determinan mediante microsecuenciación, y los anticuerpos para las proteínas se pueden producir mediante métodos normalizados para su uso en procedimientos de ensayo diagnóstico. Los análisis de diagnóstico para las proteínas HBM u otros marcadores informativos candidato incluyen el uso de anticuerpos descritos en esta invención y una molécula informadora para detectar el HBM en fluidos corporales humanos, membranas, huesos, células, tejidos o extractos de los mismos. Los anticuerpos pueden ser marcados uniéndolos covalentemente o no covalentemente a una sustancia que proporciona una señal detectable. En muchas publicaciones científicas y de patentes, se describen una variedad de moléculas informadoras o etiquetas incluyendo radionúclidos, enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes o cromogénicos (Patentes de los Estados Unidos Núms. 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149; y 4.366.241).

Utilizando estos anticuerpos, se miden los niveles de marcadores informativos candidato en individuos normales y en pacientes que padecen un trastorno óseo, tal como osteoporosis, pseudoglioma por osteoporosis, enfermedad de Engelmann, enfermedad de Ribbing, hiperfosfatasemia, enfermedad de Van Buchem, meloreostosis, osteopetrosis, picnodisostosis, esclerostenosis, osteopoiquilosis, acromegalia, enfermedad de Paget, displasia fibrosa, estenosis tubular, osteogenesis imperfecta, hipoparatiroidismo, pseudohipoparatiroidismo, pseudopseudohipoparatiroidismo, hiperparatiroidismo primario y secundario y síndromes asociados, hipercalciuria, carcinoma medular de la glándula tiroidea, osteomalacia y otras enfermedades incluyendo las enfermedades mediadas por lípidos. Las técnicas para medir los niveles de proteína en suero en un entorno clínico utilizando anticuerpos están bien establecidas. Una proteína que está continuamente presente a niveles superiores o inferiores en los individuos que portan una enfermedad o tipo de enfermedad concreto es un marcador informativo útil.

Se puede utilizar un marcador informativo en la diagnosis de un trastorno óseo. Por ejemplo, supóngase un niño que se presenta a un médico con elevada frecuencia de fracturas óseas. La causa subyacente puede ser un maltrato infantil; un comportamiento inapropiado por parte del niño, o un trastorno óseo. Para someter a ensayo rápidamente el trastorno óseo, se miden los niveles de la proteína marcadora informativa utilizando el anticuerpo descrito antes.

Los niveles de los estados de modificación de los marcadores informativos se pueden medir como indicadores de la probable efectividad de un fármaco que está siendo desarrollado. Es especialmente conveniente utilizar marcadores informativos en la creación de tratamientos para los trastornos óseos, debido a que las alteraciones en el desarrollo o la mineralización óseos pueden requerir ser observados durante un largo período de tiempo. Por ejemplo, se ha encontrado que un grupo de ARNm óseos, denominados "grupo de ARNm inducible por HBM" es sobreexpresado en ratones HBM/+ en comparación con ratones +/+, como se ha descrito antes. La expresión de este grupo se puede utilizar como marcador informativo. Específicamente, si el tratamiento de los ratones +/+ con un compuesto da como resultado la sobreexpresión del grupo de ARNm inducible por HBM, se considera ese compuesto un candidato prometedor para el desarrollo adicional.

La proteína Zmax1 o HBM o un fragmento de unión de las mismas se pueden utilizar para escrutar compuestos mediante cualquiera de una variedad de técnicas de escrutinio de fármacos.

La proteína Zmax1 o HBM o un fragmento empleado en semejante ensayo pueden estar libres en solución, fijados a un soporte sólido, o portados por una superficie celular. Un método de escrutinio de fármacos utiliza células anfitrionas eucarióticas o procarióticas que están transformadas establemente con ácidos nucleicos recombinantes que expresan la proteína o fragmento, preferiblemente en análisis de unión competitivos. Tales células, ya sea en forma viable o fijada, pueden ser utilizadas para análisis de unión normalizados. Se puede medir, por ejemplo, la formación de complejos entre una proteína Zmax1 o HBM o fragmento y el agente que está siendo sometido a ensayo, o examinar el grado en el que es interferida la formación de un complejo entre una proteína Zmax1 o HBM o fragmento y un ligando conocido por el agente que está siendo sometido a ensayo.

De este modo, los métodos de escrutinio para fármacos pueden comprender poner en contacto semejante agente con una proteína Zmax1 o HBM o fragmento de la misma, y analizar (i) la presencia de un complejo entre el agente y la proteína Zmax1 o HBM o fragmento, o (ii) la presencia de un complejo entre proteína Zmax1 o HBM o fragmento y un ligando, mediante métodos bien conocidos en la técnica. En tales análisis de unión competitiva la proteína Zmax1 o HBM o fragmento están típicamente marcados. La proteína Zmax1 o HBM o fragmento libre son separados del que está presente en el complejo proteína-proteína, y la cantidad de marca libre (esto es, que no forma complejo) es una medida de la unión del agente que está siendo sometido a ensayo a Zmax1 o HBM o su interferencia con la unión Zmax1 o HBM:ligando, respectivamente.

Otra técnica para el escrutinio de fármacos proporciona un escrutinio de alto rendimiento para los compuestos que tienen una afinidad de unión adecuada a las proteínas Zmax1 o HBM y se describe con detalle en WO 84/03564. En resumen, se sintetizan un gran número de compuestos de ensayo peptídicos pequeños diferentes sobre un sustrato sólido, tales como alfileres de plástico o alguna otra superficie. Los compuestos de ensayo peptídicos se hacen reaccionar con las proteínas Zmax1 o HBM y se lavan. La proteína Zmax1 o HBM unida se detecta después mediante métodos bien conocidos en la técnica. Se pueden recubrir directamente placas con Zmax1 o HBM purificada para su uso en las técnicas de escrutinio de fármacos anteriormente mencionadas. No obstante, se pueden utilizar anticuerpos no neutralizadores de la proteína para capturar anticuerpos para inmovilizar la proteína Zmax1 o HBM sobre la fase sólida.

Se pueden utilizar análisis de escrutinio de fármacos competitivos en los que anticuerpos neutralizadores capaces de unirse específicamente a la proteína Zmax1 o HBM compiten con un compuesto de ensayo por la unión a la proteína Zmax1 o HBM o fragmentos de las mismas. De esta manera, se pueden utilizar los anticuerpos para detectar la presencia de cualquier péptido que comparta uno o más determinantes antigénicos de la proteína Zmax1 o HBM.

Una técnica adicional para el escrutinio de fármacos implica el uso de líneas celulares o células eucarióticas (tales como las descritas antes) que tienen un gen Zmax1 o HBM no funcional. Estas líneas celulares o células anfitrionas son defectuosas a nivel de la proteína Zmax1 o HBM. Las líneas celulares o células anfitrionas se hacen crecer en presencia del compuesto fármaco. Se mide la tasa de crecimiento de las células anfitrionas o el impacto sobre el metabolismo de lípidos para determinar si el compuesto es capaz de regular el crecimiento o el metabolismo de lípidos de las células defectuosas en Zmax1 o HBM.

El objetivo del diseño de fármacos racional es producir análogos estructurales de proteínas biológicamente activas de interés o de pequeñas moléculas con las que pueden interaccionar (p. ej., agonistas, antagonistas, inhibidores) con el fin de formar fármacos que son, por ejemplo, formas más activas o estables de la proteína, o que, p. ej., potencian o interfieren en la función de una proteína in vivo. Véase, p. ej., Hodgson, Bio/Technology, 9:19-21 (1991). En un enfoque, se determina la estructura tridimensional de una proteína de interés (p. ej., proteína Zmax1 o HBM) o, por ejemplo, del complejo receptor o ligando de Zmax1 o HBM, mediante cristalografía de rayos X, mediante modelado por ordenador o muy típicamente, mediante una combinación de enfoques. Menos a menudo, se puede conseguir la información útil referente a la estructura de una proteína mediante modelado basado en la estructura de proteínas homólogas. Un ejemplo del diseño de fármacos racional es el desarrollo de inhibidores de la proteasa de HIV (Erickson et al., Science, 249:527-533 (1990)). Además, los péptidos (p. ej., la proteína Zmax1 o HBM) se analizan mediante barrido con alanina (Wells, Methods in Enzymol., 202:390-411 (1991)). En esta técnica, un resto aminoácido se reemplaza por Ala, y se determina su efecto sobre la actividad del péptido. Cada uno de los restos aminoácido del péptido se analiza de esta manera para determinar las regiones importantes del péptido.

También es posible aislar un anticuerpo específico de la diana, seleccionado mediante un análisis funcional, y después resolver su estructura cristalina. En principio, este enfoque produce un núcleo de fármaco en el cual se puede basar el posterior diseño de fármacos. Es posible evitar enteramente la cristalografía de la proteína generando anticuerpos anti-idiotípicos (anti-id) para un anticuerpo farmacológicamente activo, funcional. Como una imagen especular de una imagen especular, cabría esperar que el sitio de unión de los anti-id sea un análogo del receptor original. El anti-id se podría utilizar después para identificar y aislar péptidos de bancos de bancos de péptidos producidos químicamente o biológicamente. Los péptidos seleccionados actuarían después como el núcleo del fármaco.

De este modo, se pueden diseñar fármacos que tienen, p. ej., una actividad o estabilidad mejorada de la proteína Zmax1 o HBM o que actúan como inhibidores, agonistas, antagonistas, etc. de la actividad de la proteína Zmax1 o HBM. En virtud de la disponibilidad de las secuencias de Zmax1 o HBM clonadas, se puede hacer que estén disponibles cantidades suficientes de la proteína Zmax1 o HBM para realizar estudios analíticos tales como la cristalografía. Además, el conocimiento de la secuencia de la proteína Zmax1 o HBM proporcionada en la presente memoria orientará a aquellos que emplean técnicas de modelado por ordenador en lugar de, o además de la cristalografía de
rayos x.

XIX. Métodos de Uso: Cría de Aves y Animales Mamíferos

El ADN de Zmax1 y la proteína Zmax1 y/o el ADN de HBM y la proteína HBM se pueden utilizar para agentes terapéuticos para vertebrados y preferiblemente seres humanos y para agentes veterinarios para aves y mamíferos, incluyendo la reproducción de ganado. Los animales contemplados como sujetos incluyen ganado (p. ej., ganado vacuno, cerdos, ovejas, cabras, caballos, búfalos, etc.), primates, cánidos, félidos, roedores, aves, así como reptiles, peces, y anfibios. Las aves, incluyendo, por ejemplo, pollos, gallos, gallinas, pavos, avestruces, patos, faisanes y codornices, se pueden beneficiar de la identificación del gen y la ruta para la masa ósea elevada. En muchos ejemplos citados en la literatura (por ejemplo, McCoy et al., Res. Vet. Sci., 60(2):185-186 (1996)), los huesos debilitados debidos a las condiciones de cría causan el síndrome de fatiga en jaula, osteoporosis y elevadas tasas de mortalidad. Los agentes terapéuticos adicionales para tratar la osteoporosis u otros trastornos óseos en aves pueden tener efectos beneficiosos considerables sobre el bienestar aviar y las condiciones económicas de la industria ganadera, incluyendo, por ejemplo, la producción de carne y huevos.

XX. Métodos de uso: Análisis diagnósticos utilizando oligonucleótidos específicos de Zmax1 para la detección de alteraciones genéticas que afectan al desarrollo óseo y la regulación de lípidos

En los casos en los que se sospecha que una alteración o enfermedad del desarrollo óseo o del metabolismo de lípidos implica una alteración del gen Zmax1 o del gen HBM, se pueden construir oligonucleótidos específicos y utilizarlos para evaluar el nivel de ARNm de Zmax1 o ARNm de HBM, respectivamente, en tejido óseo o en otro tejido que afecte al desarrollo óseo.

Por ejemplo, para someter a ensayo si una persona tiene el gen HBM, que afecta a la densidad ósea y la regulación de lípidos, se puede utilizar la reacción en cadena de la polimerasa. Se sintetizan dos oligonucleótidos mediante métodos normalizados o se obtienen de un proveedor comercial de oligonucleótidos hechos a la medida. Se determinan la longitud y la composición de bases mediante criterios normalizados utilizando el Programa de Selección de cebadores Oligo 4.0 (Wojchich Rychlik, 1992). Uno de los oligonucleótidos es diseñado de manera que hibride solamente con el ADN de HBM en las condiciones de PCR utilizadas. El otro oligonucleótido se diseña para que hibride con un segmento del ADN genómico de Zmax1, de manera que la amplificación de ADN utilizando estos cebadores oligonucleotídicos produzca un fragmento de ADN convenientemente identificado. Por ejemplo, el par de cebadores CCAAGTTCTGAGAAGTCC (SEQ ID NO: 32) y AATACCTGAAACCATACCTG (SEQ ID NO: 33) amplificará un fragmento de ADN de 530 pares de bases de una muestra de ADN cuando se utilicen las siguientes condiciones: etapa 1 a 95ºC durante 120 segundos; etapa 2 a 95ºC durante 30 segundos; etapa 3 a 58ºC durante 30 segundos; etapa 4 a 72ºC durante 120 segundos; donde las etapas 2-4 se repiten 35 veces. Las muestras de tejido pueden ser obtenidas de folículos pilosos, sangre completa, o de la cavidad bucal.

El fragmento generado mediante el procedimiento anterior es secuenciado mediante mecanismos normalizados. Los individuos heterocigóticos para el gen HBM mostrarán una cantidad igual de G y T en la segunda posición del codón para la glicina 171. Los individuos de tipo salvaje normales u homocigóticos mostrarán solamente G en esta posición.

Se pueden utilizar como alternativa otras técnicas de amplificación además de la PCR, tales como la PCR mediada por ligación o las técnicas que implican la replicasa Q-beta (Cahill et al., Clin. Chem., 37(9):1482-5 (1991)). Por ejemplo, se pueden hibridar los oligonucleótidos AGCTGCTCGTAGCTGTCTCTCCCTGGATCACGGGTACATG
TACTGGACAGACTGGGT (SEQ ID NO: 34) y TGAGACGCCCCGGATTGAGCGGGCAGGGATA GCTTATTCCC
TGTGCCGCATTACGGC (SEQ m NO: 35) con una muestra de ADN humano desnaturalizado, tratar con una ADN ligasa, y después someter a amplificación por PCR utilizando los oligonucleótidos cebadores AGCTGCTCGTAGCTGT
CTCTCCCTGGA (SEQ ID NO: 36) y GCCGTAATGCGGCACAGGGAATAAGCT (SEQ ID NO: 37). En los dos primeros oligonucleótidos, las 27 bases externas son una secuencia al azar correspondiente a sitios de unión al cebador, y las 30 bases externas corresponden a secuencias en el gen Zmax1. La T del extremo del primer oligonucleótido corresponde al gen HBM. Los dos primeros oligonucleótidos se ligan solamente cuando hibridan con ADN humano que porta el gen HBM, lo que da como resultado la formación de un fragmento de 114 pb amplificable.

Los productos de la amplificación pueden ser detectados mediante electroforesis en gel de agarosa, hibridación cuantitativa, o mecanismos equivalentes para la detección de ácido nucleico conocidos por los expertos en la técnica de la biología molecular (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring, NY (1989)).

Otras alteraciones en el gen Zmax1 o el gen HBM pueden ser diagnosticadas por el mismo tipo de procedimientos de detección mediante amplificación, utilizando oligonucleótidos diseñados para identificar esas alteraciones. Estos procedimientos pueden ser utilizados en animales así como en seres humanos para identificar alteraciones en Zmax1 o HBM que afectan al desarrollo óseo y/o metabolismo o niveles de lípidos.

La expresión de Zmax1 o HBM en tejido óseo se puede completar fusionando el ADNc de Zmax o HBM, respectivamente, con un promotor específico del hueso en el contexto de un vector para diseñar genéticamente células de vertebrados. Los constructos de ADN son introducidos en células empaquetando el ADN en cápsidas de virus, mediante el uso de liposomas catiónicos, electroporación, o mediante transfección con fosfato de calcio. Las células transfectadas, preferiblemente los osteoblastos, pueden ser estudiados en cultivo o pueden ser introducidos en tejido óseo en animales mediante inyección directa en el hueso o mediante inyección intravenosa de osteoblastos, seguido de incorporación en tejido óseo (Ko et al., Cancer Research, 56(20):4614-9 (1996)). Por ejemplo, se puede utilizar el promotor de la osteocalcina, que es específicamente activo en osteoblastos, para dirigir la transcripción del gen Zmax1 o el gen HBM. Se puede utilizar cualquiera de los diversos vectores y métodos de transfección, tales como vectores retrovirales, vectores de adenovirus, o vectores que se mantienen después de la transfección utilizando liposomas catiónicos, u otros métodos y vectores descritos en la presente memoria.

De un modo similar, se pueden expresar Zmax1, o HBM en tejido de hígado o en otras células del metabolismo de lípidos o reguladoras de lípidos, tales como las células espumosas cargadas de lípidos o las células de las lesiones. Esto se puede completar fusionando el ADNc de Zmax o HBM respectivamente, por ejemplo, con un promotor específico de hígado u otro promotor adecuado en el contexto de un vector para diseñar genéticamente células de vertebrados. Los constructos de ADN son introducidos en las células empaquetando el ADN, por ejemplo, en cápsidas de virus, mediante el uso de liposomas catiónicos, electroporación, o transfección con fosfato de calcio. Las células transfectadas, preferiblemente las células del hígado, pueden ser estudiadas en cultivo o pueden ser introducidas en animales mediante inyección directa en el hígado u otra célula implicada en la regulación el metabolismo de lípidos. Los vectores y los métodos de transfección que se van a utilizar son similares a los descritos en la presente memoria.

La alteración del nivel de proteína Zmax1 o proteína HBM funcional afecta al nivel de mineralización ósea y a los niveles de lípidos. Manipulando los niveles de proteína Zmax1 o proteína HBM funcional, es posible afectar al desarrollo óseo e incrementar o disminuir los niveles de mineralización ósea así como los niveles de lípidos. Por ejemplo, puede ser útil incrementar la mineralización ósea en pacientes con osteoporosis. Alternativamente, puede ser útil disminuir la mineralización ósea en pacientes con osteopetrosis o enfermedad de Paget. La alteración de los niveles e Zmax1 o HBM también se puede utilizar como herramienta de investigación. Específicamente, es posible identificar proteínas, ARNm y otras moléculas cuyo nivel o estado de modificación es alterado en respuesta a cambios en los niveles funcionales de Zmax1 o HBM. La patología y patogénesis de los trastornos óseos son conocidas y descritas, por ejemplo, por Rubin y Farber (Eds.), en Pathology, 2ª Ed., S.B. Lippincott Co., Philadelphia, PA (1994).

Los niveles de Zmax1 y HBM pueden ser alterados para regular los niveles de lípidos en una célula o un sujeto. La patología y patogénesis de la aterosclerosis y la arterosclerosis son conocidas y descritas, por ejemplo, por Edwin L. Bierman, en "Atherosclerosis and Other Forms of Arteriosclerosis", en Harrison's Principles of Internal Medicine, 1106-1116 (13ª Ed., 1994). La modulación de los niveles de lípidos puede ser útil para disminuir ciertos niveles de lípidos (p. ej., LDL) en pacientes con arteriosclerosis y/o aterosclerosis, así como condiciones y enfermedades relacionadas con la aterosclerosis y la arteriosclerosis, como describe Bierman (1994).

Se pueden utilizar una variedad de técnicas para alterar los niveles de Zmax1 o HBM funcionales. Por ejemplo, la inyección intravenosa o intraósea de la porción extracelular de Zmax1 o mutaciones de la misma, o de HBM o mutaciones de la misma, alterarán el nivel de actividad de Zmax1 o actividad de HBM, respectivamente, en el organismo del ser humano, animal o ave tratado. Las versiones truncadas de la proteína Zmax1 o la proteína HBM también pueden ser inyectadas para alterar los niveles de proteína Zmax1 o proteína HBM funcionales, respectivamente. Ciertas formas de Zmax1 o HBM intensifican la actividad de la proteína endógena, mientras otras formas son inhibidoras.

La proteína HBM puede ser utilizada para tratar la osteoporosis o la arteriosclerosis, o alternativamente, se utiliza la porción extracelular de la proteína HBM. Esta proteína HBM puede ser modificada opcionalmente mediante la adición de un radical que hace que la proteína se adhiera a la superficie de las células. La proteína se prepara en una solución farmacéuticamente aceptable y se administra mediante inyección u otro método que logre una farmacocinética y distribución aceptables.

En el método descrito en la presente memoria, los niveles de Zmax1 o HBM pueden ser incrementados o disminuidos mediante técnicas de terapia génica. Para incrementar los niveles de Zmax1 o HBM, se diseñan genéticamente osteoblastos u otro tipo de célula útil para expresar niveles elevados de Zmax1 o HBM como se ha descrito antes. Alternativamente, para disminuir los niveles de Zmax1 o HBM, se pueden utilizar constructos antisentido que reduzcan específicamente el nivel de ARNm de Zmax1 o HBM traducible. En general, se puede utilizar un promotor no específico del tejido, tal como el promotor de CMV u otro promotor disponible en el mercado encontrado en vectores de expresión (Wu et al., Toxicol. Appl. Pharmacol., 141(1):330-9 (1996)). Se puede transcribir un ADNc de Zmax1 o su antisentido mediante un promotor específico del hueso, tal como la osteocalcina u otro promotor, para lograr la expresión específica en tejido óseo. De esta manera, si se introduce un constructo de ADN que expresa Zmax1 o un constructo que expresa HBM en un tejido no óseo, este no será expresado. De un modo similar, si se utiliza un promotor específico para expresar las proteínas HBM o Zmax1 en hígado u otra célula implicada en la regulación o el metabolismo de lípidos, el constructo de ADN, por ejemplo, con un promotor específico del hígado, no será expresado en otros tejidos que no sean el hígado.

Alternativamente, se pueden utilizar anticuerpos contra Zmax1 o HBM para inhibir su función. Tales anticuerpos se identifican en la presente memoria.

Además, se pueden utilizar fármacos que inhiben la función de Zmax1 o la función de HBM. Tales fármacos se describen en la presente memoria y se optimizan según los mecanismos de la química médica bien conocidos por los expertos en la técnica del desarrollo farmacéutico.

Zmax1 y HBM interaccionan con diversas proteínas, tales como ApoE. Se espera que las moléculas que inhiben la interacción entre Zmax1 o HBM y ApoE u otro compañero de unión alteren el desarrollo y la mineralización ósea. Tales inhibidores pueden ser útiles como fármacos en el tratamiento de la osteoporosis, la osteopetrosis, u otras enfermedades de mineralización ósea. Tales inhibidores pueden ser compuestos de bajo peso molecular, proteínas u otros tipos de moléculas. Véase, Kim et al., J. Biochem. (Tokyo), 124(6):1072-1076 (1998).

Los inhibidores de la interacción entre Zmax1 o HBM y las proteína que interaccionan pueden ser aislados mediante técnicas de escrutinio de fármacos normalizadas. Por ejemplo, la proteína Zmax1, (o un fragmento de la misma) o la proteína HBM (o un fragmento de la misma) pueden ser inmovilizados sobre un soporte sólido tal como la base de un pocillo de microtitulación. Una segunda proteína o fragmento de proteína, tal como ApoE se transforma para ayudar a la detección, por ejemplo con fluoresceína. Después se añaden yodo, o biotina a Zmax1 o HBM en presencia de compuestos candidato que puedan inhibir específicamente este dominio proteína-proteína de Zmax1 o HBM, respectivamente, y de ese modo evitar los problemas asociados con su segmento transmembrana. Los escrutinios con fármacos de este tipo son bien conocidos para los expertos en la técnica del desarrollo farmacéutico.

Debido a que Zmax1 y HBM están implicadas en el desarrollo óseo y la regulación de lípidos, también se espera que las proteínas que se unen a Zmax1 y HBM estén implicadas en el desarrollo óseo y la regulación de lípidos. Tales proteínas de unión pueden ser identificadas mediante métodos normalizados, tales como co-inmunoprecipitación, co-fraccionamiento, o el escrutinio de dos híbridos (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1997)). Por ejemplo, para identificar las proteínas que interaccionan con Zmax1 o las proteínas que interaccionan con HBM utilizando el sistema de dos híbridos, se fusiona el dominio extracelular de Zmax1 o HBM con LexA y se expresa para el vector de levadura pEG202 (el "cebo") y se expresa en la cepa de levadura EGY48. La cepa de levadura es transformada con una genoteca "presa" en el vector apropiado, que codifica una secuencia de activación de la transcripción inducible por galactosa fusionada a las proteínas interaccionantes con el candidato. Los mecanismos para seleccionar inicialmente y verificar con posterioridad las proteínas interaccionantes mediante este método son bien conocidos por los expertos en la técnica de la biología molecular (Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1997)).

Las proteínas que interaccionan con HBM, pero no con Zmax1 pueden ser identificadas utilizando una variación del procedimiento anterior (Xu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94(23):12473-8 (Nov. 1997)). Esta variación del sistema de dos híbridos utiliza dos cebos, y Zmax1 y HBM se fusionan cada una con LexA y TetR, respectivamente. Alternativamente, también se aíslan las proteínas que interaccionan con HBM pero no con Zmax1. Estos procedimientos son bien conocidos por los expertos en la técnica de la biología molecular, y son una simple variación de los procedimientos de dos híbridos normalizados.

Como método alternativo de aislamiento de las proteínas que interaccionan con Zmax1 o HBM, se utiliza un enfoque bioquímico. La proteína Zmax1 o un fragmento de la misma, tal como el dominio extracelular, o la proteína HBM o un fragmento de la misma, tal como el dominio extracelular son acoplados químicamente a cuentas de Sepharose. Las cuentas acopladas a Zmax1 o HBM se vierten en una columna. A la columna se le añade un extracto de proteínas, tales como proteínas del suero, proteínas del sobrendante de una biopsia de hueso, o proteínas intracelulares de células osteoblásticas TE85 sometidas a lisis suave. Las proteínas unidas no específicamente se hacen eluir, la columna se lava varias veces con un tampón con bajo contenido de sal, y después se hacen eluir las proteínas fuertemente unidas con un tampón con un elevado contenido de sal. Estas son proteínas candidato que se unen a Zmax1 o HBM, y pueden ser sometidas a ensayo en cuanto a la unión específica por medio de ensayos normalizados y experimentos de control. Las cuentas de Sepharose utilizadas para acoplar las proteínas y los métodos para realizar el acoplamiento están disponibles en el mercado (Sigma), y los procedimientos descritos aquí son bien conocidos por los expertos en la técnica de la bioquímica de las proteínas.

Como variación del procedimiento anterior, las proteínas que se hacen eluir mediante un elevado contenido de sal de la columna de Sepharose se añaden después a una columna HBM-Zmax1-Sepharose. Las proteínas que fluyen a través sin pegarse son proteínas que se unen a Zmax1 pero no a HBM. Alternativamente, las proteínas que se unen a la proteína HBM y no se unen e Zmax1 se pueden aislar invirtiendo el orden en el cual se utilizan las columnas. Se pueden preparar columnas similares para su uso en la evaluación de la regulación de lípidos en el hígado y otros tejidos y células implicados en la regulación y/o el metabolismo de lípidos.

XXI. Método de Uso: Clonación Recombinante Asociada a la Transformación (TAR)

Es esencial para la identificación de variantes alélicas novedosas de Zmax1 la capacidad para examinar la secuencia de ambas copias del gen en un individuo. Para completar esto, se identifican dos "ganchos", o regiones de similitud significativa en la secuencia genómica de manera que flanquean la porción de ADN que va a ser clonada. Muy preferiblemente, el primero de estos ganchos deriva de secuencias 5' con respecto al primer exón de interés y el segundo deriva de secuencias 3' con respecto al último exón de interés. Estos dos "ganchos" son clonados en un vector lanzadera bacteriano/de levadura tal como el descrito por Larionov et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 94:7384-7387 (1997). También se pueden utilizar otros sistemas vectores similares. Para recuperar la copia genómica completa del gen Zmax1, se linealiza el plásmido que contiene los dos "ganchos" con una endonucleasa de restricción o se produce mediante otro método tal como la PCR. Este fragmento de ADN lineal es introducido en células de levadura junto con ADN genómico humano. Típicamente, se utiliza la levadura Saccharomyces cerevisiae como célula anfitriona, aunque también se pueden utilizar células anfitrionas de pollo (Larionov et al., Genet. Eng. (NY). 21:37-55 (1999). Durante y después del procedimiento de transformación, la célula anfitriona endógena convierte el plásmido lineal en un círculo mediante un evento de recombinación por medio del cual la región del ADN genómico humano homólogo a los "ganchos" es insertado en el plásmido. Este plásmido puede ser recuperado y analizado mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Obviamente, la especificidad de esta reacción requiere que la maquinaria de la célula anfitriona reconozca secuencias similares a los "ganchos" presentes en el fragmento lineal. No obstante, no se requiere una identidad de secuencia del 100%, como muestran Kouprina et al., en Genomics, 53(1):21-28 (Octubre 1998), donde el autor describe el uso de secuencias repetidas degeneradas comunes en el genoma humano para recuperar fragmentos de ADN humano de una línea celular híbrida de roedor/humano.

En otro ejemplo, solamente se requiere un "gancho", como describen Larionov et al., en Proc. Natl. Acad Sci. USA, 95(8):4469-74 (Abril 1998). Para este tipo de experimento, denominado "clonación TAR radial", la otra región de similitud de secuencia para conducir la recombinación deriva de una secuencia repetida del genoma. De esta manera, se pueden recuperar regiones de ADN adyacentes a la región codificadora del gen Zmax1 y examinar en cuanto a las alteraciones que pueden afectar a la función.

XXII. Métodos de Uso: Escrutinio Genómico

El uso de marcadores genéticos polimórficos conectados al gen HBM o a Zmax1 es muy útil al predecir la susceptibilidad a la osteoporosis u otras enfermedades óseas. Los marcadores genéticos polimórficos conectados al gen HBM o al gen Zmax1 también se pueden utilizar para pronosticar la susceptibilidad a la arteriosclerosis o a la aterosclerosis y las condiciones relacionadas con ellas. Koller et al., Amer. J. Bone Min. Res., 13:1903-1908 (1998) han demostrado que el uso de marcadores genéticos polimórficos es útil para el análisis de asociación. De un modo similar, la identificación de marcadores genéticos polimórficos en el gen HBM permitirá la identificación de variantes alélicas específicas que están en desequilibrio de asociación con otras lesiones genéticas que afectan al desarrollo óseo. Utilizando la secuencia de ADN de los BAC, se identificó un dinucleótido CAn y se diseñaron dos cebadores de PCR únicos que amplificaban el ADN genómico que contiene esta repetición: como se muestra más abajo:

B200E21C16_L:	GAGAGGCTATATCCCTGGGC	(SEQ ID NO: 38)
B200E21C16_R:	ACAGCACGTGTTTAAAGGGG	(SEQ ID NO: 39)

y se utilizaron en el estudio de mapeo genético.

Este método ha sido utilizado con éxito por otros expertos en la técnica (p. ej., Sheffield et al., Genet., 4:1837-1844 (1995); LeBlanc-Straceski et al., Genomics, 19:341-9 (1994); Chen et al., Genomics, 25:1-8 (1995)). El uso de estos reactivos con poblaciones o individuos pronosticará su riesgo de osteoporosis. De un modo similar, también se pueden utilizar polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), tales como los mostrados en la Tabla 4 anterior, para pronosticar el riesgo de desarrollar enfermedades óseas o resistencia a la osteoporosis en el caso del gen HBM. También se contempla que se puedan utilizar polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) tales como los descritos antes, para pronosticar el riesgo en un sujeto de desarrollar arteriosclerosis y aterosclerosis y condiciones relacionadas.

XXIII. Métodos de Uso: Moduladores de la Calcificación en Tejidos

La calcificación de tejidos en el cuerpo humano está bien documentada. Towler et al., J. Biol. Chem., 273:30427-34 (1998) demostraron que varias proteínas que se sabe que regulan la calcificación del cráneo en desarrollo en un sistema modelo son expresadas en la aorta calcificada. La expresión de Msx2, un gen transcrito en células osteoprogenitoras, en tejido vascular calcificado indica que los genes que son importantes en el desarrollo óseo están implicados en la calcificación de otros tejidos. El tratamiento con proteína HBM, agonistas o antagonistas es probable que alivie la calcificación (por ejemplo vasculatura, dentina y hueso de la visera del cráneo) debido a su demostrado efecto sobre la densidad mineral ósea. En los sistemas experimentales donde se ha demostrado la calcificación de tejidos, la sobre-expresión o represión de la actividad de Zmax1 permite la identificación de moléculas que están directamente reguladas por el gen Zmax1. Estos genes son dianas potenciales para la terapéutica dirigida a modular la calcificación de tejidos. Por ejemplo, un animal, tal como el ratón LDLR -/-, se alimenta con una dieta con elevado contenido de grasa y se observa para demostrar la expresión de los marcadores de la calcificación de tejidos, incluyendo Zmax1. Estos animales se tratan después con anticuerpos para la proteína Zmax1 o HBM, oligonucleótidos antisentido dirigidos contra el ADNc de Zmax1 o HBM, o con compuestos que se sabe que se unen a la proteína Zmax1 o HBM o su compañero de unión o ligando. El ARN o las proteínas se extraen del tejido vascular y se determinan los niveles de expresión relativos de los genes expresados en el tejido mediante métodos bien conocidos en la técnica. Los genes que están regulados en el tejido son dianas terapéuticas potenciales para el desarrollo farmacéutico como moduladores de la calcificación de tejidos.

Los ácidos nucleicos, proteínas, péptidos, aminoácidos, pequeñas moléculas u otros compuestos farmacéuticamente útiles descritos en la presente memoria que van a ser administrados a un individuo se pueden administrar en forma de una composición con un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable, que son bien conocidos en la técnica. El individuo puede ser un mamífero o un ave, preferiblemente un ser humano, una rata, un ratón o un ave. Tales composiciones pueden ser administradas a un individuo en una cantidad farmacéuticamente eficaz. La cantidad administrada variará dependiendo de la condición que esté siendo tratada y del paciente que esté siendo tratado. Las composiciones pueden ser administradas solas o combinadas con otros tratamientos.

XXIV. Composiciones Farmacéuticas

Las composiciones farmacéuticas pueden comprender un agente mediador de lípidos que modula la actividad de HBM y/o Zmax1 combinado con un agente modulador de lipoproteínas (p. ej., blofibrato, gemfibrozil, ácido nicotínico, colestiramina, colestipol, lovastatina, simvastatina, pravastatin, probucol, premarin o estradiol.). Los agentes moduladores de lipoproteínas pueden incluir compuestos o composiciones que modulan (p. ej., regulan al alza o regulan a la baja) los niveles de LDL, VLDL, HDL o IDL.

El agente mediador de lípidos, que modula la actividad de HBM y/o Zmax1, puede incluir proteínas, anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos, agentes químicos, y miméticos. Una composición farmacéutica contemplada puede comprender el anticuerpo monoclonal y un portador farmacéuticamente aceptable. Para los fines de la presente invención, un "portador farmacéuticamente aceptable" puede ser cualquiera de los portadores normalizados bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los portadores adecuados pueden incluir soluciones salinas tamponadas con fosfato, emulsiones tales como emulsiones de aceite/agua, y diversos tipos de agentes humectantes. Otros portadores también pueden incluir soluciones estériles, comprimidos, comprimidos recubiertos, y cápsulas. Típicamente, tales portadores también pueden contener excipientes tales como almidón, leche, azúcar, tipos de arcilla, gelatina, ácido esteárico, o sales del mismo, estearato de magnesio o calcio, talco, grasas o aceites vegetales, gomas, gliceroles, u otros excipientes conocidos. Tales portadores también pueden incluir aromas y aditivos de color, conservantes, u otros ingredientes. Las composiciones que comprenden tales portadores se formulan por medios convencionales bien conocidos. Véase REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE (15ª ed. 1980).

Con fines diagnósticos, los anticuerpos y proteínas de unión recombinantes pueden estar marcados o no marcados. Típicamente, los análisis de diagnóstico abarcan la detección de la formación de un complejo por medio de la unión del anticuerpo monoclonal o proteína de unión recombinante a una proteína HBM o una proteína Zmax1. Cuando no están marcados, los anticuerpos y proteínas de unión recombinantes encuentran uso en análisis de aglutinación. Además, los anticuerpos no marcados pueden ser utilizados combinados con otros anticuerpos marcados (anticuerpos secundarios) que son específicamente reactivos con el anticuerpo monoclonal o la proteína de unión recombinante, tales como los anticuerpos específicos para la inmunoglobulina. Alternativamente, los anticuerpos monoclonales y las proteínas de unión recombinantes pueden estar marcados directamente. Se puede emplear una amplia variedad de marcas, tales como radionúclidos (p. ej., Tc^{99}, In^{111}, I^{123} y I^{131}), agentes de fluorescencia, enzimas, sustratos de enzimas, cofactores de enzimas, inhibidores de enzimas, ligandos (concretamente haptenos), etc. Numerosos tipos de inmunoanálisis son bien conocidos en la técnica.

Comúnmente, los anticuerpos monoclonales y las proteínas de unión recombinantes de la presente invención se utilizan en análisis fluorescentes, donde los anticuerpos o las proteínas de unión recombinantes sujeto se conjugan con una molécula fluorescente, tal como isotiocianato de fluoresceína (FITC).

Los ejemplos proporcionados más abajo ilustran la invención:

Ejemplos

Se utilizaron mecanismos normalizados bien conocidos en la técnica o mecanismos descritos específicamente más abajo.

Ejemplo 1

El propositus fue remitido por sus médicos al Creighton Osteoporosis Center para la evaluación de lo que parecían huesos inusualmente densos. Ella tenía 18 años y vino a la atención médica dos años antes debido a un dolor de espalda, que se precipitó por un accidente de automóvil en cual el automóvil en el que viajaba como pasajero fue golpeado por detrás. Su única lesión fue una lesión leve en el dorso inferior que se manifestó por dolor y sensibilidad muscular. No había evidencia de fractura o subluxación en las radiografías. El dolor duró dos años, aunque ella fue capaz de acudir al colegio todo el tiempo. En el tiempo que ella fue observada en el Centro, el dolor casi se había resuelto y ella había regresado a sus actividades normales como estudiante del instituto. El examen físico reveló una mujer joven sana normal que medía 167 cm y pesaba 58,05 kg. Las radiografías del esqueleto completo revelaban huesos de apariencia densa con cortices gruesos. Todos los huesos del esqueleto estaban implicados. Muy importantemente, las formas de todos los huesos eran completamente normales. La BMC espinal era de 94,48 gramos en L1-4, y la BMD espinal era de 1,667 gm/cm^{2} en L1-4. La BMD era de 5,62 desviaciones típicas (SD) por encima de la masa esquelética del pico para mujeres. Estas fueron medidas mediante DXA utilizando un Hologic 2000\sim. Después su madre fue escaneada y se le encontraron una MC espinal lumbar de 58,05 gramos y una BMD de 1,500 gm/cm^{2}. Los valores de su madre la situaban 4,12 SD por encima de la masa pico y 4,98 SD por encima de sus pares. Su madre tenía 51 años, medía 165 cm y pesaba 63,50 kg. Su madre tenía una salud excelente sin historia de músculo esquelético u otros síntomas. La BMC lumbar de su padre era de 75,33 gramos y su BMD era de 1,118 gm/cm^{2}. Estos valores lo sitúan 0,25 SD por encima de la masa ósea de los hombres. Tenía buena salud, medía 182 cm de alto, y pesaba 84,82 kg.

Estos datos clínicos sugerían que el propositus heredaba un rasgo de su madre, que daba como resultado una masa ósea muy elevada, pero un esqueleto por otra parte normal, y la atención se centró en la familia materna. En la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.691.153, veintidós de estos miembros tenían una medición de la masa ósea mediante DXA. En un caso, el abuelo materno del propositus, había fallecido, no obstante, se obtuvieron los registros médicos, las radiografías esqueléticas ante mortem y un espécimen de vesícula biliar embebido en parafina para la tipificación genotípica del ADN. Sus radiografías mostraban una densidad ósea extrema obvia de todos los huesos disponibles para el examen incluyendo el fémur y la columna vertebral, y fue incluido entre los miembros afectados. En esta invención, la genealogía se ha ampliado para incluir 37 individuos informativos. Estas adiciones representan una mejora significativa sobre el parentesco original (Johnson et al., Am. J. Hum. Genet., 60:1326-1332 (1997)) porque, entre los catorce individuos añadidos desde el estudio original, dos individuos albergan entrecruzamientos clave. La asociación con X está descartada por la presencia de transmisión hombre-a-hombre del individuo 12 al 14 y 15.

Ejemplo 2

La presente invención describe secuencias de ADN derivadas de dos clones de BAC de la región del gen HBM, como resulta evidente en la siguiente Tabla 6, que es un montaje de estos clones. El clon b200e21-h (ATCC Núm. 980812; SEQ ID NOS: 10-11) fue depositado en la Colección de Cultivos Tipo Americana (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 U.S.A., el 30 de Diciembre, 1997. El clon b527d12-h (ATCC Núm. 980720; SEQ ID NOS: 5-9) fue depositado en la Colección de Cultivos Tipo Americana (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 U.S.A., el 2 de Octubre, 1998. Estas secuencias son reactivos únicos que pueden ser utilizados por un experto en la técnica para identificar sondas de ADN para el gen Zmax1, cebadores de PCR para amplificar el gen, polimorfismos de nucleótidos en el gen Zmax1, o elementos reguladores del gen Zmax1.

TABLA 6

14

Ejemplo 3

Puesto que Zmax1 tiene similitud con la familia de genes del receptor de LDL, este puede ser implicado en el metabolismo de lípidos. No obstante, otros han informado que las variables del perfil lipídico no mostraban una asociación significativa con la masa ósea y no podían ser utilizadas como indicadores de la densidad mineral ósea (Zabaglia et al., "An exploratory study of association between lipid profile and bone mineral density in menopausal women in a Campinas reference hospital", Cad. Saude Publica 14: 779-86 (1998)). Zmax1 puede ser implicada normalmente en la regulación de la densidad ósea depositando calcio durante la remodelación ósea. La mutación de HBM puede dar como resultado un aumento del depósito confiriendo de ese modo una estructura ósea más densa. Interesantemente, las placas ateroscleróticas contienen material calcificado y expresan una variedad de genes implicados en la diferenciación ósea.

Para someter a ensayo si el gen HBM estaba implicado en la regulación de lípidos, se realizaron ensayos bioquímicos para medir el nivel en suero de diversas moléculas o precursores que contienen lípidos en miembros de la familia con HBM afectados y no afectados para someter a ensayo si la mutación de HBM en el gen HBM afecta al metabolismo lipídico. La Tabla 7 muestra los resultados de someter a ensayo ocho individuos con HBM y siete individuos no afectados. Se llevaron a cabo tests de la suma de rangos de Wilcoxon (equivalente no paramétrico de un test de la T) para evaluar si los niveles de los marcadores bioquímicos de individuos afectados por HBM se desviaban de los individuos no afectados. Los datos obtenidos fueron analizados por separado por géneros, así como combinando valores de hombres y mujeres, cuando fue apropiado.

Se utilizaron protocolos de diagnóstico normalizados para determinar la concentración (mg/dL) con triglicéridos, colesterol, lipoproteína de alta densidad (HDL), lipoproteína de baja densidad (LDL), lipoproteína de muy baja densidad (VLDL), apolipoproteína A-1 (APO A-1), apolipoproteína B (APO B), y lipoproteína a (LIPOa). Para tales procedimientos véase por ejemplo, F. W. HEMMING, LIPID ANALYSIS (Bios Scientific Pub. 1996) and J. M. ORDOVAS, LIPOPROTEIN PROTOCOLS (Humana Press Inc., 1997). También se informó sobre el genotipo para la apolipoproteína E (APO E). Existen tres alelos comunes (p. ej., E2, E3 y E4). Los miembros de la familia con HBM afectados y no afectados son heterocigotos u homocigotos para los alelos.

Los resultados obtenidos eran estadísticamente significativos: (1) Los niveles de triglicéridos son generalmente más bajos en individuos afectados que en individuos no afectados, y (2) los niveles de lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) son generalmente más bajos en individuos afectados que en individuos no afectados. Adicionalmente, las siguientes comparaciones se aproximaban a la significación estadística (p=0,06): (1) los niveles de lipoproteína de alta densidad (HDL) eran más altos en hombres afectados que en hombres no afectados, y (2) la razón de lipoproteína de baja densidad (LDL) con respecto a lipoproteína de alta densidad (HDL) era generalmente más alta en hombres afectados que en hombres no afectados.

En la Tabla 7, "ARUP" significa ARUP Laboratories, 500 Chipeta Way, Salt Lake City, UT 84108 donde se realizó uno de los estudios. "SJH" hace referencia al segundo centro que realizó estos estudios, Creighton Medical Laboratories, 28th & Burt, Dental-Rm 306, Omaha, NE 68178. APO-A1, APO-B y LIPO-a son referidas en mg.dL. Los niveles totales en suero también están en mg/dL.

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(Tabla pasa a página siguiente)

15

<110> John P. Carulli et al.

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<120> REGULATING LIPID LEVELS VIA THE ZMAX1 or HBM GENE

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<130> 032796-019

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<150> No asignado

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<151> 2000-05-26

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<150> US 09/543,771

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<151> 2000-04-05

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<150> US 09/544,398

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<151> 2000-04-05

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<160> 62

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<210> 1

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<211> 5120

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

46

47

48

49

50

51

52

53

54

55

56

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<210> 2

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<211> 5120

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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57

58

59

60

61

62

63

64

65

66

67

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<210> 3

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<211> 1615

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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68

69

70

71

72

73

74

75

76

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<210> 4

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<211> 1615

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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77

78

79

80

81

82

83

84

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<210> 5

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<211> 3096

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

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85

86

87

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<210> 6

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<211> 26928

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> no seguro

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<222> (12044),(12489),(26433),(26434),(26435),(26436), (26439),(26441)

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<223> Las identidades de las secuencias de nucleótidos en las localizaciones anteriores son desconocidas.

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<400> 6

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88

89

90

91

92

93

94

95

96

97

98

99

100

101

102

103

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<210> 7

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<211> 29430

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> no seguro

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<222> (4336),(4345),(4349),(4392),(4447),(4490)

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<223> La identidad de las secuencias de nucleótidos de las localizaciones anteriores son desconocidas.

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<400> 7

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104

105

106

107

108

109

110

111

112

113

114

115

116

117

118

119

120

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<210> 8

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<211> 33769

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> no seguro

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<222> (33739),(33749),(33758)

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<223> Las identidades de las secuencias de nucleótidos en las localizaciones anteriores son desconocidas.

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<400> 8

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121

122

123

124

125

126

127

128

129

130

131

132

133

134

135

136

137

138

139

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<210> 9

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<211> 72049

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> no seguro

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<222> (8356),(8385),(38585)

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<223> Las identidades de las secuencias de nucleótidos en las localizaciones anteriores son desconocidas.

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<400> 9

140

141

142

143

144

145

146

147

148

149

150

151

152

153

154

155

156

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160

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166

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169

170

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172

173

174

175

176

177

178

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<210> 10

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<211> 8705

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 10

179

180

181

182

183

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<210> 11

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<211> 66933

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<212> ANA

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<213> Homo sapiens

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<400> 11

184

185

186

187

188

189

190

191

192

193

194

195

196

197

198

199

200

201

202

203

204

205

206

207

208

209

210

211

212

213

214

215

216

217

218

219

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<210> 12

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> La Secuencia artificial es un cebador.

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<400> 12

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\hskip-.1em\dddseqskip

ctgagcggaa ttcgtgagac c

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21

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<210> 13

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<211> 23

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> La secuencia artificial es un cebador.

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<400> 13

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ttggtctcac gtattccgct cga

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23

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<210> 14

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> La Secuencia artificial es un cebador.

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<400> 14

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ctcgagaatt ctggatcctc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> La secuencia artificial es un cebador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttgaggatcc agaattctcg ag

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> La secuencia artificial es un cebador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtatgcgaa ttcgctgcgc g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> La secuencia artificial es un cebador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttcgcgcagc gaattcgcat aca

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> La secuencia artificial es un cebador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtccactgaa ttctcagtga g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> La secuencia artificial es un cebador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttgtcactga gaattcagtg gac

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> La secuencia artificial es un cebador.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaatccgaat tcctggtcag c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> La secuencia artificial es un cebador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttgctgacca ggaattcgga ttc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> La secuencia artificial es un cebador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cuacuacuac uactgagcgg aattcgtgag acc

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> La secuencia artificial es un cebador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cuacuacuac uactcgagaa ttctggatcc tc

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> La secuencia artificial es un cebador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cuacuacuac uatgtatgcg aattcgctgc gcg

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> La secuencia artificial es un cebador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cuacuacuac uagtccactg aattctcagt gag

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> La secuencia artificial es un cebador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cuacuacuac uagaatccga attcctggtc agc

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> La secuencia artificial es un cebador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aactggaaga attcgcggcc gcaggaattt tttttttttt ttttt

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> La secuencia artificial es un cebador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattcggcac gag

\hfill

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> La secuencia artificial es un cebador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctcgtgccg

\hfill

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> La secuencia artificial es un cebador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtacgacggc cagt

\hfill

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> La secuencia artificial es un cebador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aacagctatg accatg

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> La secuencia artificial es un cebador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccaagttctg agaagtcc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> La secuencia artificial es un cebador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aatacctgaa accatacctg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> La secuencia artificial es un cebador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agctgctcgt agctgtctct ccctggatca cgggtacatg tactggacag actgggt

\hfill

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> La secuencia artificial es un cebador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgagacgccc ggattgagcg ggcagggata gcttattccc tgtgccgcat tacggc

\hfill

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> La secuencia artificial es un cebador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agctgctcgt agctgtctct ccctgga

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> La secuencia artificial es un cebador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gccgtaatgc ggcacaggga ataagct

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> La secuencia artificial es un cebador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagaggctat atccctgggc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> La secuencia artificial es un cebador.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acagcacgtg tttaaagggg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 163

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

220

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 419

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

221

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 221

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

222

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 221

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

223

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 156

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

224

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 416

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

225

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 198

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

226

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 244

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

227

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 313

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

228

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 255

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

229

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 210

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

230

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 352

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

231

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 225

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

232

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 235

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

233

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 218

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

234

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 234

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

235

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 157

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

236

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 272

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

237

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 134

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

2000

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 274

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

239

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 164

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

240

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 130

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

241

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 496

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

242

Claims (12)

1. Un método para identificar una molécula implicada en la regulación de lípidos de comprende:

(A)

construir un primer anfitrión que contiene un gen que tiene la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 1 o un polipéptido codificado de ese modo;

(B)

construir un segundo anfitrión que contiene un gen que tiene la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 2 o un polipéptido codificado de ese modo;

(C)

analizar la diferencia entre el primer anfitrión y el segundo anfitrión; y

(D)

identificar una molécula que, cuando se añade al primer anfitrión, hace que el primer anfitrión muestre niveles de lípidos característicos del segundo anfitrión.

2. El método de la reivindicación 1, donde dicha molécula es una proteína.

3. El método de la reivindicación 2, que comprende adicionalmente producir un anticuerpo para la proteína.

4. El método de la reivindicación 1, 2 o 3, donde los niveles de lípidos característicos del segundo anfitrión son más bajos en triglicéridos, lipoproteínas de muy baja densidad y lipoproteínas de baja densidad inferiores y/o más altos en lipoproteínas de alta densidad.

5. El método de cualquier de las reivindicaciones 1 a 4, donde el primer y el segundo anfitriones son células eucarióticas o procarióticas.

6. El método de la reivindicación 5, donde las células eucarióticas son células mesenquimáticas o células del hígado.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 4, donde el anfitrión es un animal no humano.

8. El método de la reivindicación 7, donde el animal es un animal del ganado, un primate, un cánido, un félido, un roedor, un ave, un reptil, un pez, o un anfibio.

9. Un método para identificar a un paciente que tiene una propensión incrementada a la arteriosclerosis, una condición asociada con la arteriosclerosis, hipercolesterolemia, hipolipidemia o aterosclerosis, cuyo método comprende escrutar una muestra del paciente para determinar la presencia o ausencia de un polipéptido que tiene la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 3 o un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido en dicha muestra, para determinar de ese modo si el paciente tiene una predisposición genética a dicha condición.

10. El método de la reivindicación 9, donde se utiliza el análisis del haplotipo para determinar si dicho ácido nucleico está presente o no en dicha muestra.

11. El método de la reivindicación 9, donde se utiliza un anticuerpo para determinar si dicho polipéptido está presente o no en dicha muestra.

12. Un método de expresión del polipéptido que tiene la secuencia del SEQ ID NO: 3 en tejido que comprende construir un vector de expresión que comprende un promotor que dirige la expresión en tejido conectado operablemente al SEQ ID NO: 1 y el tejido en el cual es expresado dicho polipéptido es una célula reguladora de lípidos o una célula implicada en el metabolismo de lípidos.