ES2281112T3

ES2281112T3 - Proteina que presenta una actividad de supresion del envejecimiento.

Info

Publication number: ES2281112T3
Application number: ES97947918T
Authority: ES
Inventors: Youichi Nabeshima; Makoto Kuroo; Susumu Sekine; Akihiro Iida
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1996-12-26
Filing date: 1997-12-12
Publication date: 2007-09-16
Anticipated expiration: 2017-12-12
Also published as: DE69737418T2; EP0945506A1; CN1247566A; EP0945506B1; DE69737418D1; AU739057B2; WO1998029544A1; US20080227158A1; AU5411398A; CA2276108A1; JP4112627B2; KR20000062345A; US6579850B1; CN1167795C; US7667005B2; US20030176348A1; CA2276108C; HK1020988A1; ATE355371T1; EP0945506A4

Abstract

SE EXPONE UN POLIPEPTIDO QUE TIENE LA ACTIVIDAD DE RETRASAR EL ENVEJECIMIENTO; UN ADN QUE CODIFICA DICHO POLIPEPTIDO; UN PROCEDIMIENTO PARA ALIMENTAR EL GANADO CON EL USO DE ESTE ADN; UN ADN RECOMBINANTE OBTENIDO POR INTEGRACION DE ESTE ADN EN UN VECTOR; UN TRANSFORMANTE QUE CONTIENE ESTE RECOMBINANTE; UN PROCEDIMIENTO PARA OBTENER DICHO POLIPEPTIDO CON EL USO DEL TRANSFORMANTE; UN ANTICUERPO CAPAZ DE RECONOCER EL POLIPEPTIDO; UN LIGANDO PARA EL POLIPEPTIDO; UN COMPUESTO QUE INHIBE EL ENLACE ESPECIFICO ENTRE EL POLIPEPTIDO Y ESTE LIGANDO; UN COMPUESTO QUE PROMUEVE LA EXPRESION DEL GEN DE RETRASO DEL ENVEJECIMIENTO QUE CODIFICA EL POLIPEPTIDO DE RETRASO DEL ENVEJECIMIENTO; UN OLIGONUCLEOTIDO QUE TIENE UNA SECUENCIA FORMADA POR 10 A 50 BASES EN LA SECUENCIA BASE DEL CITADO ADN; Y REMEDIOS PARA EL ENVEJECIMIENTO PRECOZ, REMEDIOS PARA ENFERMEDADES DEL ADULTO Y AGENTES PARA LA LUCHA CONTRA EL ENVEJECIMIENTO PREPARADOS CON EL USO DE LOS MISMOS.

Description

Proteína que presenta una actividad de supresión del envejecimiento.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un nuevo polipéptido que suprime el envejecimiento en animales, al ADN que codifica el polipéptido y a un anticuerpo que reconoce al polipéptido.

Antecedentes de la técnica

El fenómeno del envejecimiento se refiere al deterioro de los individuos, desde el punto de vista del cambio en sus funciones y aspectos, que está favorecido generalmente por el avance en el envejecimiento. Es sabido que la frecuencia del comienzo de varias enfermedades en adultos aumenta con el envejecimiento. Por lo tanto, en cierta manera es de esperar que los agentes farmacéuticos capaces de controlar el envejecimiento se desarrollen como agentes terapéuticos o agente preventivos de enfermedades de adultos y como agentes protectores o agentes preventivos contra el deterioro funcional y aparente. Sin embargo, no se ha descrito ningún agente farmacéutico que presente estos efectos científicamente constatados.

En todo el mundo, la investigación dirigida al envejecimiento en individuos a nivel genético acaba de empezar, y ninguna información genética molecular en relación con envejecimiento en individuos se ha presentado hasta ahora. Sin embargo, se conocen varios tipos de síndromes de envejecimiento prematuro genético, incluyendo el síndrome de Werner, el síndrome de Hutchinson-Gilford (progeria), el síndrome de Down, el síndrome de Turner, el síndrome de Louis Barr, el síndrome de Rothmond Thomson y similares (Daizabuzo Fujimoto, eds., Mechanism and Control of Aging, IPC, 1993).

El gen causante del síndrome de Werner ha sido identificado como el gen que codifica la helicasa [Science, 272: 258 (1996)]. Se han observado varias mutaciones en los genes en los pacientes con el síndrome de Werner. Se cree que no se produce ninguna proteína helicasa normal en los pacientes debido a la mutación del gen y, por consiguiente, su función no se expresa de modo que puede desarrollarse un síndrome que se asemeja al envejecimiento prematuro.

Basándose en lo anterior, se ha presentado la sugerencia de que un gen relacionado con el envejecimiento está presente y que el envejecimiento se ve favorecido por la mutación del gen. Debido a que otros genes causantes están también presentes en otros tipos de síndromes de envejecimiento prematuro genético, se cree que una variedad de genes puede estar implicada en el envejecimiento.

Si un síndrome de envejecimiento se produce como resultado de la pérdida en la función de un gen implicado en el envejecimiento, el tratamiento terapéutico sería útil, comprendiendo dicho tratamiento complementar la función del gen, es decir, administrar un producto de proteína codificado por el gen o expresar el producto de la proteína en modo de tratamiento genético. Asimismo, si el envejecimiento puede controlarse, excepto para un síndrome de envejecimiento prematuro genético, varias enfermedades de adultos que tienen lugar en relación íntima con el envejecimiento serían tratadas o prevenidas.

El gen de la presente invención es diferente del gen patógeno del síndrome de Werner.

Exposición de la invención

No se conoce ninguna medida para tratar, prevenir o diagnosticar las enfermedades de adultos de las que la frecuencia de la aparición aumenta sobre la base del envejecimiento, para proteger, prevenir o diagnosticar el deterioro funcional y aparente basado en el envejecimiento; o para tratar y diagnosticar un síndrome de envejecimiento prematuro. La presente invención es útil para dicha medida.

La presente invención se refiere a un polipéptido con actividad de suprimir el envejecimiento en animales incluyendo los seres humanos; a un agente terapéutico para un síndrome que se asemeja al envejecimiento prematuro, a un agente terapéutico para enfermedades de adultos o a un agente de supresión del envejecimiento, comprendiendo cada uno el polipéptido; el ADN que codifica al polipéptido; a un método para prolongar la vida de los animales de granja no humanos que comprende expresar en exceso el ADN según la reivindicación 1, a un ADN recombinante preparado mediante la inserción del ADN en un vector; a una célula huésped que contiene el vector recombinante; a un método para producir el polipéptido de la presente invención utilizando la célula huésped, a un anticuerpo que reconoce el polipéptido; y a un método para detectar el polipéptido de la presente invención o a un método para diagnosticar el envejecimiento, utilizando cada uno el anticuerpo.

El polipéptido de la presente invención puede producirse mediante los procedimientos 1 a 7 siguientes.

Procedimiento 1

Un ratón que presenta un síndrome característico que se asemeja al envejecimiento prematuro se investiga a partir de los homocigotos de los ratones utilizando ratones transgénicos, que es un ratón transgénico en el que se introduce un gen extraño, p. ej. un transportador inverso de Na^{+}/H^{+} unido al conocido activador del factor de elongación 1\alpha humano (activador del EF-1\alpha) (solicitud de patente japonesa publicada no examinada nº 268856/1993). El gen extraño introducido en el ratón transgénico, que funciona como marcador, se denomina en adelante "gen de introducción". Puede utilizarse cualquier gen como tal gen de introducción, siempre que pueda detectarse el gen una vez se ha introducido el gen en los ratones.

Los ratones que presentan un síndrome que se asemeja al envejecimiento prematuro incluyen los ratones con mayor frecuencia de corta duración, arteriosclerosis juvenil, osteoporosis, atrofia de los tejidos glandulares, reducción de las células nerviosas y similares, y más específicamente, incluyen un ratón que presenta un síndrome que se asemeja al envejecimiento prematuro como se describió en el 18th Annual Meeting of The Molecular Biology Society of Japan (Nabeshima et al., 2K-02, 1995).

Como resultado de la observación, el ratón que presenta un síndrome que se asemeja al envejecimiento prematuro tiene las propiedades descritas a continuación:

Ejemplo 1 de observación

Observación aparente

Un homocigoto de un ratón viejo (de 8 a 9 semanas) tiene una longitud corporal de aproximadamente 4 cm, que es considerablemente pequeña, comparada con la longitud corporal de un ratón salvaje de la misma edad en semanas (aproximadamente 6 cm). Además, la proporción de la parte de la cabeza al perímetro de la cintura es grande. Aunque el tamaño del cuerpo del ratón viejo (macho, de 8 semanas) es muy pequeña, no se encuentra ninguna anomalía en el brillo del cabello corporal o en las uñas de las patas. El comportamiento es normal.

En cuanto a la longevidad,

1): el crecimiento se interrumpe a aproximadamente las tres semanas después del nacimiento, lo que implica la reducción gradual de actividad;

2): la longevidad es disminuida de modo que la longevidad media es de 8,0 \pm 0,9 semanas (n = 13) en los machos mientras que en las hembras, la longevidad media es de 9,3 \pm 0,9 semanas (n = 13); estos ratones son característicos en su síndrome que se asemeja al envejecimiento prematuro de modo que todos los ratones mueren a las 15 semanas después del parto.

Cinco machos homocigóticos y 5 hembras homocigóticas, de aproximadamente 8 semanas, y 4 ratones machos y 4 ratones hembras salvajes como camada de la misma madre, se sometieron a una autopsia, seguida de observación macroscópica, y a continuación, estos ratones se sometieron a fijación en formalina, empapada con parafina, procedimientos de corte fino y tinción con HE, para la observación patológica por un procedimiento conocido (editado por Kei-ichi Watanabe y Kazuho Nekane, Enzyme Antibody Method, Gakusai Kikaku, 1992, 3ª edición revisada) (hasta el Ejemplo 12 de observación, en adelante, los animales se observarían por los mismos procedimientos).

Ejemplo de observación 2

Examen patológico de la glándula pituitaria

Se observó la reducción de numerosas células acidófilas. Las células acidófilas de la glándula pituitaria son células que producen hormona de crecimiento (GH) o prolactina (PRL), y numerosas de éstas se reducen. Es sabido que la secreción de GH se reduce en los individuos viejos.

Ejemplo de observación 3

Observación patológica de las gónadas

La gónada se atrofia de manera característica, lo que indica que los animales son infecundos. En los machos, el testículo se atrofia de forma perceptible, lo que puede observarse a simple vista. El tamaño del túbulo seminífero se atrofia hasta un punto tan pequeño como aproximadamente 1/3 el tamaño en el salvaje, de modo que la maduración del esperma avanza únicamente a la etapa de paquiteno de los espermatocitos, sin observarse absolutamente nada de esperma. En las hembras, el ovario y el útero están atrofiados de manera acusada incluso macroscópicamente. La maduración del huevo avanza únicamente hasta el folículo del ovario principal, sin observarse en el folículo del ovario secundario o cuerpo lúteo.

Ejemplo de observación 4

Examen patológico de la glándula salivar submaxilar

En machos normales, una amplia cantidad de gránulos acidófilos está contenida en su parte estriada, mientras que en homocigotos, las células en la parte estriada son de longitud corta, sin casi gránulos acidófilos observados.

Ejemplo de observación 5

Examen patológico del riñón

Se observa mineralización en la epidermis del túbulo urinífero, en la pared de la cápsula de Bowman y similares. La pared de la cápsula de Bowman está compuesta de epidermis escamosa.

Ejemplo de observación 6

Examen patológico del sistema vascular

La arteriosclerosis fue importante en los homocigotos. El tamaño de la aorta torácica fue irregular y un grado mayor de mineralización estaba presente en el medio del endometrio. Además, se observó hipertrofia de la íntima del endometrio. Se observó arteriosclerosis, que implica principalmente mineralización del medio del endometrio e hipertrofia de la íntima del endometrio, en un vaso sanguíneo medio tal como la arteria renal hasta un vaso sanguíneo pequeño en los órganos parenquimatosos. Específicamente, la mineralización del medio del endometrio del vaso sanguíneo en el parénquima renal estaba diferenciada, pero en el glomérulo y en el túbulo urinífero era casi normal. La tinción de Kossa verificó que el depósito era desde luego Ca^{2+}. Se observó mineralización del medio del endometrio de la aorta frecuentemente en los individuos viejos.

Ejemplo de observación 7

Observación patológica del tejido pulmonar

El daño a la estructura, particularmente a la pared, de los alveolos pulmonares era importante. Se observó también mineralización en la pared de los alvéolos pulmonares.

Ejemplo de observación 8

Observación del tejido blando y cartílagos

Se observó mineralización en la capa intrínseca a la tráquea de mucosa del endometrio, en la capa intrínseca de la mucosa gástrica y en la fascia de la mucosa, y en la epidermis de los alvéolos pulmonares. Se observó también mineralización en las células del fondo de la glándula del ventrículo y en el tejido conectivo debajo de la mucosa y en la capa muscular. La mineralización de la mucosa gástrica es similar al descubrimiento observado en ratas y ratones alimentados durante un plazo prolongado. Además, la mineralización del anillo mitral del corazón se observó en algunos individuos. La mineralización del anillo mitral es una observación característica en personas viejas. Además, se observó también mineralización en el cartílago de la articulación, el cartílago traqueal y el cartílago costocondrial. La mineralización de estos cartílagos vítreos es un descubrimiento observado frecuentemente en personas viejas.

Ejemplo de observación 9

Observación patológica y observación a rayos X del tejido óseo

Se observó un aumento en la densidad ósea de la metáfisis del extremo distal del fémur, junto con hipertrofia condroepifisaria. Se observó una imagen de la mineralización irregular en todas las células del cartílago en el cartílago de la articulación. La transmisión por rayos X del fémur y la tibia se intensificó, lo que indica posiblemente la reducción de la densidad mineral. Se midió la densidad mineral existente del área diafisaria, del extremo distal de la tibia y del extremo proximal del fémur y presentaba reducción al máximo en aproximadamente 1/2 de las densidades en los ratones salvajes. Histológicamente, el hueso de la corteza se redujo de forma perceptible. El hueso esponjoso primario proliferó excepcionalmente en las diáfasis del extremo proximal de la tibia y del extremo distal del fémur, y la densidad mineral aumentó de forma desfavorable, solamente en esta parte.

Ejemplo de observación 10

Observación patológica del cerebelo

Se observó reducción del número de células de Purkinje en la capa celular del nervio del cerebelo, así como necrosis aislada y expansión del axón. Se ha conocido que las células de Purkinje disminuyen en el cerebelo tras el envejecimiento, lo que implica la expansión de la protuberancia del axón.

Ejemplo de observación 11

Observación patológica del hígado

No se observó casi ningún gránulo de glucógeno teñido como acidófilo. El citoplasma de las células del hígado es ligeramente pequeño, en comparación con el citoplasma en los sujetos normales.

Ejemplo de observación 12

Observación patológica del timo

El timo está atrofiado de manera perceptible, pero no puede confirmarse en algunos individuos visualmente a simple vista.

Procedimiento 2

La parte cromosómica dañada e inactivada por inserción del gen de introducción se aisló de un ratón que presentaba un síndrome que se asemeja al envejecimiento prematuro. El ADN presente en la zona cromosómica se analizó a continuación por técnicas de clonación.

Procedimiento 3

Tras confirmar el estado de expresión del ADN en cada uno de los tejidos de ratones normales, se determina el gen causante de un síndrome que recuerda el envejecimiento prematuro (denominado en adelante "gen que suprime el envejecimiento"), cuya expresión es improbable que sea observada en ratones normales.

Procedimiento 4

El gen que suprime el envejecimiento en seres humanos y similares se determina clonando un gen con gran homología con el gen que suprime el envejecimiento murino a partir de un banco de ADNc de seres humanos y similares.

Procedimiento 5

Se produce y acumula un polipéptido codificado por el gen expresando el gen que suprime el envejecimiento de ratones, seres humanos y similares en células de Escherichia coli, de insecto y células de mamífero y similares por métodos convencionales utilizando tecnología genética recombinante.

Procedimiento 6

Purificando el polipéptido acumulado por un método convencional y utilizando el polipéptido como antígeno, se produce un anticuerpo contra el polipéptido en ratas, ratones, conejos, ovejas, cobayas, caballos, vacas, monos y similares.

Procedimiento 7

Debe confirmarse que el anticuerpo producido reconoce al polipéptido producido y acumulado por Escherichia coli, células de insecto, células de mamífero y similares.

La presente invención se describe con detalle a continuación.

El ADN de la presente invención es un ADN que codifica un polipéptido que presenta una actividad de suprimir el envejecimiento, por ejemplo, el ADN que codifica el polipéptido de una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre las secuencias de aminoácidos representadas por las SEC. ID. nº: 1, nº: 2 y nº: 3; y el ADN que se hibrida con el ADN en condiciones severas.

El ADN que se hibrida en condiciones severas significa el ADN obtenido por hibridación de colonias, hibridación en placa o hibridación por transferencia Southern utilizando el ADN que codifica un polipéptido que presenta una actividad de supresión del envejecimiento como sonda, incluyendo específicamente el ADN identificado tras la hibridación, utilizando un filtro sobre el que se ha inmovilizado el ADN procedente de colonias o de placas en presencia de NaCl 0,7 a 1,0 M a 65ºC y lavando el filtro resultante utilizando soluciones 0,1 a 2 \times SSC (la composición de la solución 1 \times SSC comprende cloruro sódico 150 mM y citrato sódico 15 mM) a 65ºC. La hibridación puede realizarse según un procedimiento descrito, por ejemplo, en Molecular Cloning, A Laboratory Manual, la 2ª edición [Sambrook, Fritsch, & Maniatis eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 (en adelante denominado "Molecular Cloning, 2ª ed.")]. Los ejemplos específicos del ADN que se hibrida incluyen el ADN con una homología del 60% o más con una secuencia nucleotídica del ADN que codifica el polipéptido de una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre las secuencias de aminoácidos representadas por las SEC. ID. nº: 1, nº: 2 y nº: 3, preferentemente el ADN que presenta una homología del 80% o más, y más preferentemente el ADN que presenta una homología del 95% o
más.

El oligonucleótido descrito en la presente memoria incluye un oligonucleótido que comprende una secuencia nucleotídica que es idéntica o complementaria a una secuencia nucleotídica parcial de la secuencia nucleotídica del ADN, por ejemplo, un oligonucleótido que comprende una secuencia nucleotídica que es idéntica o complementaria a una secuencia nucleotídica de 5 a 60 restos continua, preferentemente de 10 a 50 restos, en la secuencia nucleotídica del ADN seleccionado de entre la SEC. ID. nº: 6 a nº: 8, y los derivados del oligonucleótido.

El polipéptido de la presente invención incluye el polipéptido codificado por el ADN, que incluye específicamente un polipéptido de una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre las secuencias de aminoácidos representadas por las SEC. ID. nº: 1, nº: 2 y nº: 3.

Un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos en la que se elimina, sustituye o añade por lo menos uno en la secuencia de aminoácidos del polipéptido y que presenta una actividad de supresión del envejecimiento puede prepararse según un método descrito, por ejemplo, en Nucleic Acids Research, 10: 6487 (1982); Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79:6409 (1982); Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:5662 (1984); Science, 224: 1431 (1984); PCT WO 85/00817 (1985); Nature, 316: 601 (1985); Gene, 34: 315 (1985); Nucleic Acids Research, 13: 4431 (1985); y Current Protocols in Molecular Biology, capítulo 8, Mutagenesis of Cloned DNA, John Wiley & Sons, Inc. (1989).

El anticuerpo de la presente invención incluye a los anticuerpos que reconocen al polipéptido de la invención.

El ligando descrito en la presente memoria significa una molécula que se une específicamente al polipéptido de la presente invención, y puede utilizarse como ligando cualquier molécula, con la condición de que sea capaz de unirse específicamente al polipéptido de la presente invención.

Un método para preparar el ADN que codifica el polipéptido que presenta una actividad de supresión del envejecimiento según la presente invención se describe a continuación.

1) Clonación del ADN cromosómico murino adyacente al punto de introducción del gen (i) Detección del gen de introducción

Pueden incorporarse múltiples copias de un gen de introducción en un ratón transgénico, pero generalmente, las copias se insertan en sucesión una tras otra en un punto del ADN cromosómico.

Para confirmar que el punto de inserción de un gen de introducción reside en un punto en un ratón transgénico que presenta un síndrome que se asemeja al envejecimiento prematuro, los ADN cromosómicos preparados a partir de los hígados del ratón salvaje, el heterocigoto y el homocigoto se digieren con enzimas de restricción (EcoRV, XbaI, etc.) sin potencia de escisión del gen de introducción, por transferencia Southern utilizando toda la longitud del gen de introducción como sonda.

Al confirmar que se detecta una sola señal en el heterocigoto y el homocigoto por transferencia Southern, se indica que el gen de introducción se inserta en un solo punto en el cromosoma murino.

La inserción del gen de introducción puede confirmarse también por hibridación fluorescente in situ (FISH) utilizando el gen de introducción como sonda.

(ii) La clonación del ADN cromosómico murino adyacente al punto de inserción del gen de introducción puede realizarse de la manera siguiente.

Si el gen de introducción insertado en un ratón transgénico contiene un vector plásmido, tal como pUC o similares, puede utilizarse el procedimiento de rescate del plásmido.

Es decir, una vez se digiere el ADN cromosómico del homocigoto con una enzima de restricción arbitraria sin potencia de escisión del vector plásmido, que es susceptible de autocircularización, el ADN resultante se transforma a continuación en el de Escherichia coli. La Escherichia coli transformada únicamente que contiene el ADN auto-circularizado que contiene un plásmido que expresa un gen con resistencia química (por ejemplo, el gen con resistencia a la ampicilina) procedente del vector plásmido forma colonias en un medio selectivo. El plásmido obtenido de Escherichia coli puede contener posiblemente en el gen de introducción por sí mismo y un fragmento del ADN cromosómico murino adyacente al gen.

Se realiza la transferencia Southern para confirmar que el segmento adyacente al gen de introducción procede del fragmento del ADN cromosómico murino utilizando el fragmento del segmento de ADN cromosómico murino contenido en el plásmido recuperado como sonda y la misma membrana utilizada para la transferencia Southern mencionada anteriormente. Más específicamente, debe confirmarse que únicamente la señal procedente del alelo natural (alelo natural en adelante se denomina ocasionalmente "+") se observa en el ratón salvaje; solamente la señal procedente del alelo mutante (alelo mutante se denomina en adelante ocasionalmente "pg") se observa en el homocigoto; y las señales procedentes de ambos alelos se observan en el homocigoto.

Además del método de recuperación, puede utilizarse también la clonación común del ADN cromosómico. Más específicamente el ADN cromosómico se digiere con una enzima de restricción, y los fragmentos digeridos resultantes se clonan utilizando los vectores plásmido generales o los vectores de fago para preparar un banco. Utilizando los fragmentos del gen de introducción como sonda y según un método similar al método de recuperación, puede realizarse la clonación del ADN cromosómico murino adyacente al punto del gen de introducción cribando el banco.

2) Clonación del gen supresor de envejecimiento procedente de ratón

Se obtiene un clon del fago que se hibrida con la sonda utilizando los fragmentos del segmento de ADN cromosómico murino y el plásmido obtenido por clonación del ADN cromosómico o por el método de rescate como sonda y cribando el banco genómico del ratón salvaje (Stratagene, banco genómico murino, \lambdaFIXII) según el manual adjunto.

A fin de identificar el gen que suprime el envejecimiento, se determina la secuencia nucleotídica sucesivamente, en la que el ADN cromosómico murino contenido en el plásmido obtenido centrando el método de clonación del ADN cromosómico o el método de rescate.

Debido a que se conoce que el primer exón y el segundo exón de un gen están frecuentemente presentes en el islote CpG (Bruce Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, Keiko Nakamura y Kenichi Matsubara como traductores responsables, Kyoikusha, 25 de abril de 1985), la zona del islote CpG debería identificarse durante la determinación de la secuencia nucleotídica, y a continuación, el ADN cromosómico murino contenido en el plásmido obtenido por el método de clonación del ADN cromosómico o el método de rescate debería digerirse con una enzima de restricción apropiada, por ejemplo, SacII o similar de modo que contenga el islote CpG.

Si no se observa la zona del islote CpG, debería predecirse una zona del exón por un método de atropamiento del exón [por ejemplo, utilizando el Exon Trapping System (fabricado por GIBCO BRL, CO.)] o utilizando un programa informático para predecir una zona del exón en una secuencia nucleotídica [por ejemplo, HEXON: Human Genome Center, Baylor College of Medicine, Houston on Internet; disponible en la dirección http://dot.imgen.bcm.tmc.edu:
9331/gene-finder/gf.html como zona de análisis de la estructura génica TX], y a continuación, puede aislarse un fragmento de ADN que contiene posiblemente un exón utilizando enzimas de restricción.

Puede confirmarse por el método siguiente que el fragmento está implicado en el gen que suprime el envejecimiento.

El fragmento de ADN está marcado con \alpha-[^{32}P]-dCTP, por ejemplo, utilizando el kit Megaprima de marcado de ADN (fabricado por Amersham Co.) o similares.

La hibridación Northern se realiza utilizando el ADN marcado como sonda y utilizando un filtro poli(A)^{+} ARN de corazón, cerebro, pulmón, hígado, músculo esquelético, riñón y bazo murinos [Filter of Mouse Multiple Tissue Northern Blots (fabricado por Clontech Co.)] según las condiciones del manual para Hybond N^{+}.

Los tejidos con bandas se identifican por hibridación Northern.

A partir de ratones homocigóticos y heterocigóticos salvajes, se recogen los tejidos descritos de manera específica anteriormente, a partir de los cuales se preparan los poli(A)^{+} ARN utilizando el kit de purificación de ARNm QuickPrep (fabricado por Pharmacia Co.) o similar.

Los ARN procedentes de cada uno de los tejidos murinos se electroforizan y se transfieren a un filtro Hybond N^{+} por un método convencional, y se efectúa la hibridación Northern utilizando el fragmento de ADN marcado como sonda.

Basándose en las bandas obtenidas por la hibridación Northern, debería confirmarse que la expresión en el homocigoto es diferente de la expresión en el salvaje y en el heterocigoto. Ejemplos de dicha expresión diferente no incluyen absolutamente ninguna expresión con banda alguna observada. Basándose en la confirmación, puede verificarse que el fragmento de ADN escindido por restricción tiene alguna relación con el gen que suprime el envejeci-
miento.

Posteriormente, se extrae el tejido especificado anteriormente del ratón salvaje, y se prepara un banco de ADNc del tejido por un método convencional. Por ejemplo, puede prepararse un banco de ADNc preparando sintéticamente el ADNc del poli(A)^{+} ARN renal utilizando el cDNA Synthesis System (fabricado por GIBCO BRL, CO.) y añadiendo un adaptador EcoRI-NotI-SalI (SuperScript Choice System for cDNA Synthesis; fabricado por GIBCO BRL, CO.) para ambos terminales, e incorporando posteriormente el ADNc resultante en la secuencia EcoRI de un vector de clonación \lambda ZAP II [\lambda ZAP II Cloning Kit (fabricado por STRATAGENE Co.)].

El vector de clonación para preparar el banco de ADNc puede ser cualquier vector de fago o vector plásmido y similares, siempre que dicho vector pueda replicarse de manera autónoma en K12 de Escherichia coli. Los ejemplos específicos de vector incluyen ZAP Express [fabricado por STRATAGENE Co., Strategies, 5: 58 (1992)], pBlueScript II SK(+) [Nucleic Acids Research, 17: 9494 (1989)], \lambda ZAP II (fabricado por STRATAGENE Co.), \lambdagt10, \lambdagtII [DNA Cloning, A Practical Approach, 1: 49 (1985)], \lambdaTriplEx (fabricado por CloneTech Co.), \lambdaExCell (fabricado por Pharmacia Co.), pT7T318U (fabricado por Pharmacia Co.), pcD2 [H. Okayama y P. Berg; Mol. Cell. Biol., 3: 280 (1983)].

Como microorganismo hospedador, puede utilizarse cualquier microorganismo, siempre que pertenezca a Escherichia coli. Los ejemplos preferidos incluyen XL1-Blue de Escherichia coli y similares.

Los ejemplos específicos incluyen XL2-Blue de Escherichia coli, XL1-Blue MRF' de Escherichia coli [fabricado por STRATAGENE Co., Strategies, 5: 81 (1992)], C600 de Escherichia coli [R.K. Appleyard; Genetics, 39: 440 (1954)], Y1088 de Escherichia coli [R. A. Young y R. W. Davis; Science, 222: 778 (1983)], Y1090 de Escherichia coli [R. A. Young y R. W. Davis; Science, 222: 778 (1983)], NM522 de Escherichia coli [J. A. Gough y N. E. Murray; J. Mol. Biol., 166: 1 (1983)], K802 de Escherichia coli [W. B. Word; J. Mol. Biol., 16: 118 (1966)], JM105 de Escherichia coli [L. J. Reha-Krantz; Gene, 38: 275 (1985)], DH1 de Escherichia coli, MC1000 de Escherichia coli y similares.

Un ejemplo de preparación de un banco de ADNces el siguiente: se sintetiza ADNc del poli(A)^{+} ARN renal utilizando el Sistema de Síntesis de ADNc (cDNA Synthesis System fabricado por GIBCO BRL, CO.) se añade un adaptador EcoRI-NotI-SalI (SuperScript Choice System for cDNA Synthesis; fabricado por GIBCO BRL, CO.) para ambos terminales, y el ADNc resultante se inserta en la secuencia EcoRI de un vector de clonación \lambda ZAP II [\lambda ZAP II Cloning Kit (fabricado por STRATAGENE Co.)].

El banco de ADNc se criba por hibridación de colonias o en placa utilizando el fragmento de ADN marcado como sonda según procedimientos convencionales.

A partir del clon (transformante) obtenido por cribado, se aisla el gen supresor de envejecimiento y se determina su secuencia de ADN por métodos convencionales, por ejemplo, el método didesoxi de Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74: 5463 (1977)] o similar. La secuencia nucleotídica puede analizarse utilizando un analizador automático de secuencias nucleotídicas, por ejemplo, 373A DNA Sequencer, fabricado por Applied Biosystems Co. o similar.

Ejemplos de una secuencia génica que suprime el envejecimiento determinada según los ejemplos anteriores incluyen el ADN que comprende una secuencia representada por la SEC. ID. nº: 8. El ENKM101 de Escherichia coli que contiene el plásmido pNKM101 que contiene el ADN se deposita como FERM BP-5765 el 5 de diciembre de 1996 en el National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón (Zip code 305).

El ADN obtenido anteriormente puede prepararse por síntesis química basándose en la secuencia nucleotídica del ADN que utiliza un sintetizador de ADN.

Dicho sintetizador de ADN incluye un sintetizador de ADN según un método de tiofosfito, fabricado por Shimadzu Corporation; un sintetizador de ADN del modelo 1392 según un método de fosforamidita, fabricado por Perkin Elmer Co. y similares. De manera similar, el ADN que presenta la secuencia determinada en la presente invención descrita a continuación puede sintetizarse utilizando un sintetizador de ADN.

El ADN de la presente invención puede prepararse por PCR utilizando un cebador transcrito ADN que presenta la misma secuencia de los nucleótidos 10 a 50 consecutivos en la secuencia nucleotídica del ADN seleccionado de entre los ADN representados por la SEC. ID. nº:6 a nº:8, un ADN cebador complementario de una secuencia complementaria a la del ADN, y utilizando como plantilla el ADNc preparado a partir del ARNm de una célula que expresa el ARNm complementario del ADN. Como tal cebador transcrito y cebador complementario, se prefieren los oligonucleótidos mencionados anteriormente que tienen temperaturas de fusión y números de nucleótido similares entre sí.

Ejemplos de polipéptidos que codifican el gen que suprime el envejecimiento obtenido como se describió anteriormente incluyen un polipéptido que comprende una secuencia representada por la SEC. ID. nº:3.

3) Clonación del ADNc del gen supresor de envejecimiento secretor procedente de ratón

Puede obtenerse un gen supresor de envejecimiento secretor procedente de ratón utilizando el gen supresor de envejecimiento obtenido anteriormente en 2) o 4). Más específicamente, el gen puede obtenerse por el método siguiente.

En cuanto a la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 535º a 549º en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº:2 distinta de la SEC. ID. nº:1 desde el punto de vista de la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 535º a 549º obtenida a partir del cribado del poli(A)^{+} ARN renal humano procedente del banco de ADNc procedente del riñón murino se realiza según el método 5' RACE utilizando un ADN sintético que codifica una secuencia de aminoácidos con homología con la secuencia. El fragmento de ADNc resultante se utiliza para aislar un gen en un método similar al descrito anteriormente, y se determina la secuencia nucleotídica.

Un gen que presenta una gran homología con la SEC. ID. nº:2 está incluido como gen supresor de envejecimiento secretor de interés procedente de ratón. Un ejemplo de un gen que presenta gran homología con la SEC. ID. nº:2 es un ADN que tiene una secuencia representada por la SEC. ID. nº:9 y similares. Un ejemplo del polipéptido codificado por el gen incluye un polipéptido que comprende una secuencia representada por la SEC. ID. nº:4.

El ENKM 112 de Escherichia coli que contiene el plásmido pNKM112 que contiene el ADN se deposita como FERM BP-6184 con fecha 28 de noviembre de 1997 en el National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón (Zip code 305).

4) Clonación del ADNc del gen supresor de envejecimiento humano

(i): Pueden obtenerse genes que suprimen el envejecimiento de otros animales, por ejemplo de seres humanos, utilizando el gen que suprime el envejecimiento de ratón obtenido anteriormente por el método siguiente.

: El fragmento de ADN que contiene el gen de ratón que suprime el envejecimiento obtenido anteriormente se marca con \alpha-[^{32}P]-dCTP utilizando, por ejemplo, el kit de marcado de ADN Megaprime (fabricado por Amersham Co.).

: A partir del tejido animal objetivo, por ejemplo, riñón humano, tejido de hipocampo humano o similares, se prepara un banco de ADNc por un método similar al del ratón descrito anteriormente para el ratón.

: La hibridación de colonias o la hibridación en placa se realiza utilizando el fragmento de ADN marcado como sonda para cribar el banco de ADNc.

: Se aisla el gen de un clon (transformante) obtenido por cribado para determinar la secuencia nucleotídica en un método similar al descrito anteriormente para el ratón.

: La secuencia nucleotídica que presenta gran homología con la secuencia nucleotídica del gen que suprime el envejecimiento murino se considera que es el gen que suprime el envejecimiento del animal de interés.

: Los ejemplos de la secuencia génica incluyen el ADN que comprende una secuencia representada por la SEC. ID. nº: 6 o nº: 7 procedente del riñón humano. El ENKM103 de Escherichia coli que contiene el plásmido pNKM103 y ENKH106 de Escherichia coli que contiene el plásmido pNKM106 y que contiene el ADN se depositan cada uno como FERM BP-5942 y FERM BP-5767, respectivamente, en las fechas 15 de mayo de 1997 y 5 de diciembre de 1996, respectivamente, en el National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón (Zip code 305).

(ii): El ADNc de un gen que suprime el envejecimiento procedente de otros tejidos del animal o procedente de otros animales puede obtenerse utilizando los genes supresores de envejecimiento del animal obtenidos de este modo por el método siguiente.

: Marcando el fragmento de ADN que contenido el gen que suprime el envejecimiento obtenido anteriormente con \alpha-[^{32}P]-dCTP utilizando, por ejemplo, el kit de marcado de ADN Megaprima (fabricado por Amersham Co.), el fragmento de ADN resultante se define como sonda. Realizando la PCR que utiliza un conjunto de cebador apropiado y un ARN plantilla o ADNc de un tejido animal objetivo, tal como el páncreas humano o similar, y marcando a continuación isotópicamente el fragmento de ADN ampliado de la misma manera que la descrita anteriormente o marcando el fragmento con digoxigenina (DIG) y similares que utilizan, por ejemplo, el kit DIG de marcado de ADN (fabricado por Boehringer Mannheim Co.), el producto marcado resultante se define como sonda. Específicamente como tal conjunto de cebador, resultan preferidos por ejemplo los ADN sintéticos con las secuencias nucleotídicas representadas por las SEC. ID. nº:19 y nº:20.

: La hibridación de colonias o la hibridación en placa se realiza en un banco de ADNc procedente de un tejido animal objetivo, tal como el páncreas humano o similar, utilizando el fragmento de ADN marcado como sonda para identificar el banco de ADNc. El gen se aisla de un clon (transformante) obtenido por identificación en un método similar a los métodos de ratón y humano como se describió anteriormente para determinar la secuencia nucleotídica.

: Ejemplos de la secuencia de ADN incluyen el ADN con la secuencia representada por la SEC. ID. nº: 10 procedente del páncreas humano. XL!-Blue/pRYHH102 de Escherichia coli que contiene el plásmido pRYHH102 que contiene el ADN se deposita como FERM BP-6193, en fecha 4 de diciembre de 1997, respectivamente, en el National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón (Zip code 305).

5) Producción del polipéptido que suprime el envejecimiento

A fin de expresar el gen que suprime el envejecimiento obtenido anteriormente en una célula huésped, se digiere en primer lugar un fragmento de ADN que contiene el gen que suprime el envejecimiento con enzimas de restricción o se escinde con DNasa para preparar un fragmento de ADN de una longitud apropiada que contiene el ADN que codifica el polipéptido que suprime el envejecimiento; a continuación se inserta el fragmento de ADN corriente abajo del activador en un vector de expresión, y por último el vector de expresión insertado con el ADN se introduce dentro de la célula huésped adecuada al vector de expresión.

Puede utilizarse cualquier célula huésped, siempre que pueda expresar el gen de interés. Los ejemplos incluyen a los procariotas que pertenecen al género Escherichia, Serratia, Corynebacterium, Brevibacterium, Pseudomonas, Bacillus, Microbacterium, y similares; a las levaduras que pertenecen al género Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Trichosporon, Schwanniomyces y similares; a las células huésped de animales y similares.

Ejemplos de vector de expresión incluyen los que pueden replicarse de manera autónoma en la célula huésped o que pueden integrarse en cromosomas y que tienen un activador en tal posición que pueda transcribirse el gen que suprime el envejecimiento.

Cuando un procariota, tal como una bacteria o similar, se utiliza como célula huésped, se prefiere que el vector de expresión del gen que suprime el envejecimiento pueda replicarse de manera autónoma en el procariota y sea un vector recombinante construido con un activador, una secuencia de unión al ribosoma, el gen que suprime el envejecimiento y una secuencia de terminación de la transcripción. También puede estar contenido un gen controlador del
activador.

Ejemplos del vector de expresión incluyen pBTrp2, pBTac1, pBTac2 (todos comercializados por Boehringer Mannheim Co.), pKK233-2 (fabricado por Pharmacia Co.), pSE280 (fabricado por Invitrogen Co.), pGEMEX-1 (fabricado por Promega Co.), pQE-8 (fabricado por QIAGEN Co.), pKYP10 (solicitud de patente japonesa publicada no examinada nº 110600/1983), pKYP200 [Agricultural Biological Chemistry, 48: 669 (1984)], pLSA1 [Agricul. Biol. Chem., 53: 277 (1989)], pGEL1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 4306 (1985)], pBluescript II SK(-) (fabricado por Stratagene Co.), pGEX (fabricado por Pharmacia Co.), pET-3 (fabricado por Novagen Co.), pTerm2 (patentes U.S. nº 4.686.191, nº 4.939.094 y nº 5.160.735), pSupex, pUB110, pTP5, pC194 y similares.

Puede utilizarse cualquier activador, con tal que pueda expresarse en una célula huésped, tal como Escherichia coli o similar. Los ejemplos incluyen los activadores procedentes de Escherichia coli, los fagos y similares, tales como el activador trp (Ptrp), el activador lac (Plac), el activador P_{L}, el activador P_{R}, el activador P_{SE} y similares; el activador SPO1, el activador SPO2, el activador penP y similares. Además, pueden utilizarse activadores diseñados artificialmente y modificados, tales como el activador con dos Ptrp unidos en serie (Ptrp \times 2), el activador tac, el activador letI, el activador lacT7, y similares.

Con respecto a la secuencia de unión del ribosoma, puede utilizarse cualquier secuencia siempre que pueda expresarse en la célula huésped, tal como Escherichia coli o similar. Sin embargo, se prefiere utilizar un plásmido en el que el espacio entre la secuencia Shine-Dalgarno y el codón de iniciación se ajuste a una distancia apropiada (por ejemplo, 6 a 18 bases).

La secuencia de terminación de la transcripción no es siempre necesaria para la expresión del gen de supresión de envejecimiento de la presente invención. Sin embargo, se prefiere ordenar la secuencia de terminación de la transcripción justo corriente abajo del gen estructural.

Los ejemplos de célula huésped incluyen los microorganismos que pertenecen al género Escherichia, Serratia, Corynebacterium, Brevibacterium, Pseudomonas, Bacillus, y similares, tales como XL1-Blue de Escherichia coli, XL2-Blue de Escherichia coli, DH1 de Escherichia coli, MC1000 de Escherichia coli, KY3276 de Escherichia coli, W1485 de Escherichia coli, JM109 de Escherichia coli, HB101 de Escherichia coli, Escherichia coli nº 49, W3110 de Escherichia coli, NY49 de Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefacines, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium immariophilum ATCC 14068, Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium glutamicum ATCC 14067, Corynebacterium glutamicum ATCC 13869, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870, Microbacterium amoniaphilum ATCC 15354, y similares.

Como método para introducir el vector recombinante, puede utilizarse cualquier método para introducir ADN en la célula huésped tal como el método que utiliza un ión calcio [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69: 2110 (1972)], el método del protoplasto (solicitud de patente japonesa no examinada publicada nº 2483942/1988), los métodos descritos en Gene, 17: 107 (1982) y Molecular & General Genetics, 168: 111 (1979), y similares.

Cuando se utiliza levadura como célula huésped, los ejemplos del vector de expresión incluyen YEp13 (ATCC 37115), YEp24 (ATCC 37051), YCp50 (ATCC 37419), pHS19, pHS15 y similares.

Puede utilizarse cualquier activador, siempre que pueda dirigir la expresión en levadura. Ejemplos incluyen el activador PHO5, el activador PGK, el activador GAP, el activador ADH, el activador gal 1, el activador gal 10, el activador de la proteína del choque térmico, el activador de MF \alpha1, el activador de CUP 1 y similares.

Ejemplos de célula huésped incluyen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Trichosporon pullulans, Schwanniomyces alluvius, y similares.

Como método para introducir el vector recombinante, puede utilizarse cualquier método para introducir ADN en levadura, tal como el método de electroporación [Methods. Enzymol., 194: 182 (1990)], un método de esferoplasto [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 1929 (1978)], un método de acetato de litio [J. Bacterial., 153: 163 (1983)], un método descrito en Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 1929 (1978), y similares.

Cuando se utilizan células de animales como célula huésped, los ejemplos del vector de expresión incluyen pcDNAI, pcDM8 (disponibles en el comercio en Funakoshi Co.), pAGE107 [solicitud de patente japonesa publicada no examinada nº 22979/1991; Cytotechnology, 3: 133 (1990)], pAS3-3 (solicitud de patente japonesa no examinada publicada nº 227075/1990), pCDM8 [Nature, 329: 840 (1987)], pcDNAI/Amp (fabricado por Invitrogen Co.), pREP4 (fabricado por Invitrogen Co.), pAGE103 [J. Biochem., 101: 1307 (1987)], y pAGE210.

Puede utilizarse cualquier activador, siempre que pueda expresarse en células de animales. Los ejemplos incluyen un activador para el gen IE (precoz inmediato) de citomegalovirus (CMV humano), un activador precoz para SV40, un activador de retrovirus, un activador de metaloprotioneína, un activador del choque térmico y un activador de SR\alpha. Además, estos activadores pueden utilizarse en combinación con el potenciador del gen IE del CMV humano.

Ejemplos de célula huésped incluyen la célula de Namarba, HBT5637 (solicitud de patente japonesa no examinada publicada nº 299/1988), célula COS1, célula COS7, célula CHO y similares.

Como método para introducir el vector recombinante en células de animales, puede utilizarse cualquier método para introducir ADN en las células de animales, tales como el método de electroporación [Cytotechnology, 3: 133 (1990)], el método del fosfato cálcico (solicitud de patente japonesa publicada no examinada nº 227075/1990), un método de lipofección [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413 (1987)], un método descrito en Virology, 52: 458 (1973), y similares. Según el método descrito en la solicitud de patente japonesa no examinada publicada nº 227075/1990 o en la solicitud de patente japonesa no examinada publicada nº 257891/1990, pueden obtenerse y cultivarse transformantes.

Cuando se utilizan células de insecto como hospedadores, la proteína puede expresarse según un método descrito, por ejemplo, en Baculovirus Expresión Vectors, A Laboratory Manual, Current Protocols in Molecular Biology, suplemento 1-38 (1987-1997), Biol. Technology, 6, 47 (1988), y similares.

Es decir, un vector de transferencia génica recombinante y un baculovirus se incorporan simultáneamente a las células de insecto para obtener un virus recombinante en un sobrenadante del cultivo de células de insecto, y a continuación las células de insecto se infectan con el virus recombinante obtenido de este modo para expresar la proteína.

Ejemplos del vector introducido por el gen para su utilización en el método incluyen pVL1392, pVL1393 y pBlueBacIII (todos ellos fabricados por Invitrogen Co.).

Ejemplos de baculovirus incluyen el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica con el que se infectan los insectos de la familia Barathra, y similares.

Ejemplos de célula de insecto incluyen Sf9 y Sf21 como células de ovario de Spodoptera frugiperda [Baculovirus Expresión Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, Nueva Cork (1992)], High 5 como célula de ovario de Trichoplusia ni (fabricado por Invitrogen Co.), y similares.

Ejemplos de método para la introducción conjunta del vector introducido por el gen recombinante y el baculovirus para preparar un virus recombinante incluyen el método del fosfato cálcico (solicitud de patente japonesa no examinada publicada nº 227075/1990), un método de lipofección [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413 (1987)], y similares.

Como método para expresar el gen, la secreción y generación, la expresión de la proteína fusionada y similares pueden realizarse según el método descrito en Molecular Cloning, 2ª ed. y similares.

Cuando el gen se expresa en levadura, células de animal o células de insecto, puede obtenerse un polipéptido al que se ha añadido un azúcar o una cadena de azúcar.

El polipéptido que suprime el envejecimiento puede producirse cultivando un transformante que contiene el ADN recombinante al que el gen de expresión del envejecimiento se incorpora en un cultivo, produciendo y acumulando el polipéptido que suprime el envejecimiento en el cultivo y recuperando el péptido supresor el envejecimiento del cultivo.

El método para cultivar el transformante para producir el polipéptido que suprime el envejecimiento de la presente invención puede realizarse según el método convencional utilizado en el cultivo de hospedadores.

Si el transformante para producir el polipéptido que suprime el envejecimiento de la presente invención es un procariota, tal como Escherichia coli o similares, o un eucariota, tal como una levadura o similares, el medio para cultivar estos organismos puede ser cualquiera de los medios de cultivo naturales y de los medios de cultivo sintéticos, con tal que contenga una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, sales inorgánicas y similares que pueden ser asimiladas por estos organismos y pueden hacer eficaz el cultivo del transformante.

Como fuente de carbono, cualquiera de dichas fuentes que puede ser asimilada por cada uno de los organismos puede utilizarse. Los ejemplos incluyen carbohidratos, tales como glucosa, fructosa, sacarosa, molasas, almidón, hidrolizado de almidón y similares; ácidos orgánicos, tales como el ácido acético, el ácido propiónico y similares; y alcoholes, tales como el etanol, el propanol y similares.

Ejemplos de fuente de nitrógeno incluyen el amoniaco, varias sales de amonio de ácidos inorgánicos o de ácidos orgánicos, tales como cloruro amónico, sulfato amónico, acetato amónico, fosfato amónico, y similares; otros compuestos que contienen nitrógeno, peptona, extracto de carne, extracto de levadura, solución saturada de maíz, hidrolizado de caseína, harina de semillas de soja e hidrolizado de harina de semilla de soja, varias células fermentadas e hidrolizados de las mismas, y similares.

Ejemplos de sustancia inorgánica incluyen el fosfato dibásico de potasio, el fosfato monobásico dipotásico, el fosfato de magnesio, el sulfato de magnesio, el cloruro sódico, el sulfato ferroso, el sulfato de manganeso, el sulfato de cobre, el carbonato cálcico y similares.

El cultivo se realiza en condiciones aeróbicas mediante agitación, agitación con aireación o similares. La temperatura de cultivo está comprendida preferentemente entre 15 y 45ºC, y el tiempo de cultivo es generalmente de 16 a 96 horas. El pH del medio se mantiene entre 3,0 y 9,0 durante el cultivo. El ajuste del pH del medio se realiza utilizando un ácido inorgánico u orgánico, una solución alcalina, urea, carbonato cálcico, amoniaco y similares.

Asimismo, pueden añadirse antibióticos, tales como ampicilina, tetraciclina y similares al medio durante el cultivo según requiera la ocasión.

Cuando se cultiva un microorganismo transformado con un vector de expresión que contiene un activador inducible, puede añadirse un inductor al medio según requiera la ocasión. Por ejemplo, puede añadirse isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) o similares al medio cuando se cultiva un microorganismo transformado con un vector de expresión que contiene el activador lac, o ácido indolacrílico (IAA) o similares puede añadirse a éste cuando se cultiva un microorganismo transformado con un vector de expresión que contiene el activador trp.

Ejemplos de un medio para cultivar un transformante obtenido de células de animal como célula huésped incluyen los medios utilizados convencionalmente, tales como medio RPMI1640 [The Journal of the American Medical Association, 199: 519 (1967)], medio MEM de Tagle [Science, 122: 501 (1952)], medio DMEM [Virology, 8: 396 (1959)], medio 199 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73: 1 (1950)], y medios a los que se añade suero de feto de ternera o similares.

El cultivo se realiza generalmente en condiciones a pH entre 6 y 8 entre 30 y 40ºC en presencia de CO_{2} al 5% durante 1 a 7 días.

Asimismo, pueden añadirse al medio antibióticos, tales como kanamicina, penicilina y similares durante el cultivo.

Ejemplos de medio para cultivar el transformante obtenido de células de insectos como célula huésped incluyen medios utilizados convencionalmente, tales como medio TNM-FH [fabricado por Pharmingen Co.], medio Sf-900 II SFM [fabricado por GIBCO BRL, CO.], ExCell 400 y ExCell 405 [ambos fabricados por JRH Biosciences Co.], medio de insecto de Grace [Grace, T. C. C., Nature, 195: 788 (1962)], y similares.

El cultivo se realiza generalmente en condiciones a pH entre 6 y 7 y entre 25 y 30ºC durante 1 a 5 días.

Además, pueden añadirse antibióticos, tales como gentamicina y similares, al medio durante el cultivo.

Con el fin de aislar y purificar el polipéptido que suprime el envejecimiento de la presente invención del cultivo del transformante para producir el polipéptido que suprime el envejecimiento, pueden utilizarse métodos convencionales para aislar y purificar las enzimas.

Por ejemplo, cuando el polipéptido de la presente invención se expresa en condiciones disueltas en el interior de las células, las células se recuperan por centrifugación después del cultivo, se ponen en suspensión en un tampón acuoso y se descomponen con un descomponedor ultrasónico, French Press, homogeneizador Manton-Gaulin, Dinomil o similares para proporcionar una solución de extracto exenta de células. A partir del sobrenadante recuperado después de la centrifugación de la solución del extracto exenta de células, puede obtenerse una muestra purificada por un método convencional único o una combinación de métodos convencionales para aislar y purificar enzimas de un método de extracción del disolvente, un método de salado que utiliza sulfato amónico, un método de desalado, un método de precipitación que utiliza un disolvente orgánico, un método de cromatografía por intercambio aniónico que utiliza una resina, tal como dietilaminoetilo (DEAE)-Sepharosa, DIAION HPA-75 (fabricado por Mitsubishi Chemical Industry Co.), o similares, un método de cromatografía de intercambio catiónico, que utiliza una resina, tal como S-Sepharosa FF (fabricado por Pharmacia Co.) o similares, un método de filtración en gel que utiliza un tamiz molecular, un método de cromatografía por afinidad, un método de cromato-enfoque y un método de electroforesis, tal como enfoque isoeléctrico o similares.

Cuando el polipéptido se expresa después que el polipéptido forme una materia insoluble en el interior de las células, las células se recuperan asimismo y se descomponen, y se centrifugan para recuperar una fracción de precipitado. A partir de la fracción de precipitado, el polipéptido se recupera según métodos convencionales, y la materia insoluble del polipéptido se disuelve en un modificador de polipéptidos. La solución disuelta se diluye con una solución que no contiene modificador de polipéptido o se dializa frente a ésta o estando a una concentración de modificador de polipéptido casi a un grado de dilución tal que no ocurra ninguna modificación del polipéptido para descomponer el polipéptido que tiene una estereoestructura normal, una muestra de polipéptido puede recuperarse según un método de aislamiento y purificación similar al anterior.

Cuando el polipéptido de la presente invención o un derivado del mismo, tal como un producto modificado de azúcar o similares, se segrega fuera de las células, el polipéptido o un derivado del mismo, tal como el aducto de cadena de azúcar del mismo, puede recuperarse del cultivo sobrenadante. Más específicamente, se recoge una fracción soluble tratando el cultivo en un método similar al anterior, tal como centrifugación, y se obtiene una muestra purificada utilizando un método de aislamiento y purificación similar al anterior.

El polipéptido expresado por el método puede producirse por un método de síntesis química, tal como un método Fmoc (método de fluorenilmetiloxicarbonilo), un método de tBoc (método de t-butiloxicarbonilo) y similares. Además, el polipéptido puede producirse utilizando un sintetizador de péptidos producido por, por ejemplo, Souwa Trade (fabricado por Advanced ChemTech Co., EEUU), Perkin Elmer Japan (fabricado por Perkin-Elmer Co.), Pharmacia Biotech (fabricado por Pharmacia Biotech Co., Suecia), Aloka (fabricado por Protein Technology Instrument Co., EEUU), Kurabo (fabricado por Synthecell-Vega Co., EEUU), Japan PerSeptive Limited (fabricado por PerSeptive Co., EEUU), Shimadzu Corporation, y similares.

6) Preparación del anticuerpo que reconoce al polipéptido que suprime el envejecimiento (i) Preparación del anticuerpo policlonal

Junto con un adyuvante apropiado [por ejemplo, adyuvante completo de Freund o gel de hidróxido de aluminio junto con vacuna tosferinoide, o similares], una muestra (antígeno) purificada del fragmento completo o parcial del polipéptido que suprime el envejecimiento obtenido anteriormente en 4) o 5) se administra por vía subcutánea, intravenosa o peritoneal a una dosis comprendida entre 50 y 100 \mug/animal en conejos, cabras o ratas, ratones o hámsters de 3 a 20 semanas.

El antígeno se refuerza una vez, y a continuación, el antígeno se refuerza de 3 a 10 veces, cada 1 a 2 semanas. Después de cada refuerzo, se extrae sangre del plexo basilar los días 3 al 7. Se confirma por inmunoanálisis enzimático [ELISA, publicado por Igaku Shoin, 1976; Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)] y similares, que el suero reacciona con el antígeno utilizado para inmunización.

Se extraen lo sueros de conejos, cabras, ratones, ratas o hámsters con los sueros de títulos de anticuerpo suficientes contra el antígeno utilizado para la inmunización, y los anticuerpos purificados pueden obtenerse utilizando un método convencional, tal como un método de salado utilizando del 40 al 50% de sulfato amónico saturado, un método de precipitación con ácido caprílico, un método cromatográfico que utiliza, tal como una columna de DEAE-Sepharosa, una columna con proteína A, una columna de filtración en gel y similares.

(ii) Preparación de anticuerpo monoclonal (a) Preparación de la célula que produce el anticuerpo

Se utiliza como fuente de aporte de células productoras de anticuerpo una rata que tiene suero de un título de anticuerpo suficientemente alto contra el fragmento parcial del polipéptido que suprime el envejecimiento utilizado para la inmunización.

Los días 3 al 7 después de la dosificación final de la sustancia del antígeno a la rata que presenta el título de anticuerpo, se resecciona el bazo de la rata.

El bazo se corta en piezas en medio MEM (fabricado por Nissul Pharmaceuticals Co.), y las piezas se liberan a continuación con pinzas y se centrifuga a 1.200 rpm durante 5 minutos para descartar el sobrenadante resultante.

Se tratan los esplenocitos en la fracción de precipitado resultante con un tampón Tris-cloruro de amonio (pH 7,65) durante 1 a 2 minutos para eliminar los eritrocitos, y las células resultantes se lavan con medio MEM tres veces para utilizar los esplenocitos resultantes como células productoras de anticuerpo.

(b) Preparación de células de mieloma

Como células de mieloma, se utilizan células de una estirpe celular creada obtenida a partir de ratones o ratas. Los ejemplos incluyen las estirpes celulares de mieloma P3-X63Ag8-U1 (en adelante denominada "P3-U1") de ratón resistente a 8-azaguanina (procedente de BALB/c) [Curr. Topics Microbiol. Immunol., 81: 1 (1978)], [Europ. J. Immunol., 6: 511 (1976)], SP2/0-Ag14 (SP-2) [Nature, 276: 269 (1978)], P3-X63-Ag8653 (653) [J. Immunol., 123: 1548 (1979)], P3-X63-Ag8 (X63) [Nature, 256: 495 (1975)] y similares. Estas estirpes celulares se subcultivan en un medio de azaguanina [medio RPMI-1640 enriquecido con glutamine (1,5 mM), 2-mercaptoetanol (5\times10^{-5} M), gentamicina (10 \mug/ml) y suero de feto de ternero (FCS) (fabricado por CSL Co.; 10%) (en adelante denominado "medio normal") y enriquecido más con 8-azaguanina (15 \mug/l)]. Las células se cultivan en el medio normal durante 3 a 4 días antes de la fusión celular, y para la fusión celular, se utilizan las células a 2\times10^{7} o más.

(c) Preparación del hibridoma

Las células productoras de anticuerpo obtenidas en (a) y las células de mieloma obtenidas en (b) se lavan intensamente con medio MEM o PBS (fosfato disódico (1,83 g), fosfato monopotásico (0,21 g), sal común (7,65 g), y agua destilada (1 litro), pH 7,2) se mezclan para dar una proporción en número de célula final de 5:1 a 10:1 como proporción del número de células productoras de anticuerpo : número de células de mieloma, se centrifuga la mezcla a 1.200 rpm durante 5 minutos y se descarta el sobrenadante.

La población celular en la fracción de precipitado resultante se libera suficientemente, y a la población celular en agitación se le añaden 0,2 a 1 ml de una solución mezcla de polietilenglicol-1000 (PEG-1000; 2 g), MEM (2 ml) y sulfóxido de dimetilo (DMSO; 0,7 ml) por cada 10^{8} células productoras de anticuerpo, y 1 a 2 ml de medio MEM se le añade además cada 1 a 2 minutos.

Tras la adición, el medio MEM se añade a la mezcla resultante para dar el volumen final de 50 ml.

La solución preparada se centrifuga a 900 rpm durante 5 minutos, y se descarta el sobrenadante resultante.

Las células en la fracción de precipitado resultante se liberan suavemente y se ponen en suspensión suavemente en un medio HAT (100 ml) [medio preparado añadiendo hipoxantina (10^{-4} M), timidita (1,5\times10^{-5} M) y aminopterina (4\times10^{-7} M) al medio normal] por aspiración y soplado mediante una pipeta de medición.

La suspensión se divide en fracciones de 100 \mul en cada pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos para el cultivo a 37ºC en un incubador con CO_{2} al 5% durante 7 a 14 días.

Tras el cultivo, se toman muestras de una parte del sobrenadante de cultivo, y se identifican los hibridomas que reaccionan específicamente con un fragmento parcial del polipéptido que suprime el envejecimiento mediante el inmunoanálisis enzimático descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, capítulo 14 (1988) y similares.

Ejemplos específicos del inmunoanálisis enzimático incluyen el método siguiente.

El método comprende el recubrir el fragmento parcial del polipéptido que suprime el envejecimiento utilizado como antígeno en la inmunización en una placa apropiada; haciéndole reaccionar con el sobrenadante de hibridoma o el anticuerpo purificado obtenido en el apartado (d) descrito anteriormente como primer anticuerpo; hacerle reaccionar con un segundo anticuerpo, el anticuerpo de inmunoglobulina antirrata marcado con biotina, una enzima, una sustancia quimioluminiscente o un compuesto radioactivo, que lleva a cabo una reacción que depende de la sustancia marcadora e identificar una sustancia que presenta una reactividad específica al polipéptido que suprime el envejecimiento como hibridoma que produce anticuerpo monoclonal de polipéptido que suprime el antienvejecimiento.

Ejemplos específicos de hibridoma incluyen un hibridoma KM1902. El hibridoma KM1902 se deposita como FERM BP-5983 el 17 de junio de 1997 en la National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology.

Utilizando el hibridoma, se repite la clonación dos veces limitando la dilución [para la primera dilución, se utiliza medio HT (medio HAT del que se excluye la aminopterina); para la segunda dilución se utiliza el medio normal]. A continuación, una estirpe celular que tiene un título de anticuerpo fuerte estable se selecciona como hibridoma que produce un anticuerpo contra el polipéptido que suprime el envejecimiento.

(d) Preparación del anticuerpo monoclonal

A un ratón o a un ratón lampiño de 8 a 10 semanas, se le inyectan por vía peritoneal 5\times10^{6} a 20\times10^{6} células del anticuerpo monoclonal contra el polipéptido que suprime el envejecimiento que produce células de hibridoma obtenido en (c), y se trata con Pristano [tras la administración peritoneal de 0,5 ml de 2,6,10,14-tetrametilpentadecano (Pristano), se continuó la alimentación durante 2 semanas]. El hibridoma se convierte en ascítico en 10 a 21 días.

Se recoge la ascitis del ratón con tumor ascítico y se centrifuga a 3.000 rpm durante 5 minutos para eliminar la materia sólida.

Por un método de salado utilizando 40 a 50% de sulfato amónico saturado, por un método de precipitación con ácido caprílico [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)], por un método cromatográfico que utiliza una columna de DEAE-Sepharose, una columna de proteína A o una de Cellulofine GSL2000 (fabricada por Biochemical Industry Co.), se recoge una fracción de IgG o IgM del sobrenadante resultante, y la fracción se utiliza como anticuerpo monoclonal purificado.

Se determina la subclase de anticuerpo utilizando un kit de tipado del anticuerpo monoclonal de ratón o un kit de tipado del anticuerpo monoclonal de rata. La concentración de proteína se calcula por el método de Lowry o basándose en la absorbancia a 280 nm.

7) Teñido del inmunocito utilizando anticuerpo monoclonal

Para teñir los inmunocitos utilizando células adherentes, preferentemente, las células adherentes se someten al principio al siguiente tratamiento para desprender las células del matraz de cultivo.

Es decir, las células adherentes cultivadas se lavan con tampón PBS, y se añade a éste tampón PBS (3 ml) que contiene 0,05% de tripsina y 0,02% de EDTA (ácido etilendiamintetraacético). A partir de la mezcla resultante, se elimina la solución en exceso, y las células se desprenden del matraz por incubación a 37ºC durante 5 minutos (este procedimiento se denomina en adelante "tratamiento con tripsina-EDTA").

En cuanto a las células en suspensión, se utilizan células cultivadas tal cual.

Las células para la tinción de inmunocitos se ponen en suspensión en un tampón de tinción de inmunocitos (PBS que contiene 1% de BSA, 0,02% de EDTA y 0,05% de azida sódica), y se divide en porciones de 1\times10^{5} a 20\times10^{5} células en una placa con fondo redondo de 96 pocillos.

El sobrenadante del cultivo del hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal contra el polipéptido que suprime el envejecimiento obtenido en (c), el anticuerpo monoclonal purificado obtenido en (d) o el anticuerpo monoclonal marcado con biotina según el método conocido (Enzyme Antibody Method, publicado por Gakusai Kikaku, 1985) que se diluye con el tampón de tinción de inmunocitos o el tampón de tinción de inmunocitos que contiene 10% de suero animal para dar una concentración final de 0,1 a 50 \mug/ml se divide en los pocillos para dar un volumen final de 20 a 500 \mul/pocillo, y la placa se deja en reposo bajo enfriamiento con hielo durante 30 minutos.

Si se utiliza en el procedimiento anterior el sobrenadante del cultivo del anticuerpo monoclonal contra el polipéptido que suprime el envejecimiento obtenido en (c) o el anticuerpo monoclonal purificado obtenido en (d), el tampón de tinción de inmunocitos se añade a la placa para lavar las células, y el tampón de tinción de inmunocitos que contiene un anticuerpo contra la inmunoglobulina de ratón o un anticuerpo contra la inmunoglobulina de rata marcado al principio con un tinte fluorescente, tal como FITC/ficoeritrina o similares, a una concentración de entre aproximadamente 0,1 y 50 \mug/ml se divide en 50 a 500 \mul/pocillo. A continuación, la placa resultante se deja en reposo en oscuridad bajo enfriamiento con hielo durante 30 minutos.

Si se utiliza el anticuerpo monoclonal marcado con biotina, la estreptoavidina se divide en la placa en 50 a 100 \mul/pocillo, y la placa se deja en reposo a la oscuridad bajo enfriamiento con hielo durante 30 minutos.

En ambos procedimientos, tras la reacción, se añade un tampón de tinción de inmunocitos a las placas, y las células se lavan intensamente y se analizan con un clasificador de células.

8) Inmunoprecipitación del polipéptido que suprime el envejecimiento

Las células CHO o las células de insecto que expresan el polipéptido que suprime el envejecimiento de la presente invención se cultivan en un recipiente de cultivo tal como una placa Petri.

Se añade PBS al recipiente de cultivo para enjuagar las células.

Al recipiente de cultivo, se le añaden 100 a 500 \mul de un tampón enfriado anteriormente en hielo que es capaz de disolver la membrana celular, tal como un tampón que contiene 1% de Triton X100, Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM (denominado en adelante "tampón 1"), a 100 a 500 \mul, y la mezcla resultante se deja reposar en hielo durante 30 minutos y a continuación se vibra suavemente como tratamiento de solubilización.

Para preparar una muestra de sobrenadante de cultivo, el sobrenadante se concentra por un método, tal como membrana de ultrafiltración, liofilización o similares, y a continuación se lleva a cabo la reacción de inmunoprecipitación utilizando la muestra por el método siguiente.

La solución tras el tratamiento de solubilización se recupera en un tubo de centrifugadora de 1,5 ml y se centrifuga a 14.000 rpm durante 30 minutos.

Al sobrenadante resultante, se le añaden 10 a 50 \mul de proteína G-Sepharosa o proteína A-Sepharose equilibrada con el tampón en agitación a 4ºC durante una hora y se centrifuga a 5.000 rpm durante 2 minutos para recuperar el sobrenadante.

Al sobrenadante, se añade el sobrenadante del cultivo del hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal contra el polipéptido que suprime el envejecimiento obtenido en (c) o el anticuerpo monoclonal purificado obtenido en (d) para dar una concentración final del 0,01 al 50 \mug/m de 1, seguido de agitación a 4ºC durante una hora o
más.

A la solución agitada, se añaden 10 a 50 \mul de proteína G-Sepharosa o proteína A-Sepharosa, seguido de agitación a 4ºC durante una hora o más, y la mezcla se centrifuga a 5.000 rpm durante 2 minutos.

A la fracción de precipitado resultante, se le añaden 200 \mul del tampón que disuelve la membrana celular como se describió anteriormente para poner en suspensión el precipitado. Los mismos procedimientos se repiten 3 veces o más para enjuagar la fracción de precipitado.

Al precipitado, se le añade un tampón de muestra para la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, se calienta la mezcla utilizando un bloque calefactor, y se realiza la SDS-PAGE.

Tras la SDS-PAGE, el polipéptido en el gel resultante se transfiere sobre una membrana de PVDF o similar para detectar el polipéptido que suprime el envejecimiento por transferencia Western o similar utilizando un anticuerpo policlonal del polipéptido con un fragmento parcial anti que suprime el envejecimiento según la presente invención y similares.

Cortando el polipéptido que suprime el envejecimiento detectado procedente de la membrana de PVDF, puede purificarse la proteína. El análisis estructural del polipéptido purificado de la presente invención puede realizarse según el método descrito, por ejemplo, en Protein Structural Análisis for DNA Cloning (Hisashi Hirano, publicado por Tokio Kagaku Dojin, 1993).

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9) Producción de un ratón que presenta síndrome mejorado que se asemeja al envejecimiento prematuro en ratones que presentan el síndrome que se asemeja al envejecimiento prematuro que utilizan el gen que suprime el envejecimiento procedente del ratón (verificación de la eficacia del gen que suprime el envejecimiento para el tratamiento de un síndrome que se asemeja al envejecimiento prematuro, debido a la mejora del síndrome que se asemeja al envejecimiento prematuro debido a la introducción del gen que suprime el envejecimiento)

Para producir un ratón transgénico que expresa en exceso el gen que suprime el envejecimiento obtenido anteriormente, se construye el ADN que contiene el gen que suprime el envejecimiento para introducir y expresar el gen en un ratón (denominado en adelante "ADN que suprime el envejecimiento para introducción"). El ADN que suprime el envejecimiento para introducción se inyecta en el pronúcleo del macho de un óvulo fecundado de un ratón salvaje y a continuación se trasplanta en un ratón hembra que se produce al principio en un falso embarazo.

Un ratón transgénico recién nacido (+/+) que expresa en exceso el gen que suprime el envejecimiento se aparea con un heterocigoto (pg/+) obtenido a partir de ratones que presentan un síndrome que se asemeja al envejecimiento prematuro para producir un ratón que expresa el gen que suprime el envejecimiento y que presenta pg/+.

El ratón se aparea conjuntamente o el ratón se aparea con un ratón que presenta pg/+ para obtener un ratón que expresa el gen que suprime el envejecimiento y que presenta pg/pg.

Al confirmar que el ratón no presenta un síndrome que se asemeja al envejecimiento prematuro, se verifica que el gen que suprime el envejecimiento obtenido anteriormente es eficaz para el tratamiento.

Por el método descrito a continuación, por ejemplo, puede obtenerse un ratón que presenta un síndrome mejorado que se asemeja al envejecimiento prematuro de ratones que presentan un síndrome que se asemeja al envejecimiento prematuro.

(i) Construcción del ADN que suprime el envejecimiento para su introducción

El ADN que suprime el envejecimiento para su introducción se compone preferentemente de un activador, el gen que suprime el envejecimiento y una casete de la zona de corte y empalme precoz SV40 y señal de poliadenilación (denominada en adelante "casete SV40").

Como activador, puede utilizarse cualquier activador, siempre que pueda producir la expresión en ratones; sin embargo, se utiliza preferentemente un activador más potente. Los ejemplos incluyen un fragmento tratado con HindIII (zona activadora de 2,5 kb que contiene el 1^{er} exón y 2º exón de 5' UTR) del factor 1\alpha de elongación humano [pEF321CAT (Kim D. W. et al., Gene, 91: 217 (1990)].

Como gen que suprime el envejecimiento, puede utilizarse cualquiera de los genes obtenidos anteriormente en 2). Específicamente, se ejemplifica el ADN que codifica la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº:3.

Como casete SV40, pueden utilizarse los nucleótidos nº 1551 a nº 2427 de un vector de expresión pMAMneo (comercializado por Clontech Co.).

Mediante un método convencional, se ligan el activador, el gen que suprime el envejecimiento y la casete SV40 en este orden, y a continuación el producto de ligadura se escinde con una enzima apropiada, tal como NotI o similar, y a continuación se disuelve en tampón PBS para dar una concentración final de aproximadamente 500 copias/ml para su utilización como ADN que suprime el envejecimiento para su introducción.

(ii) Producción de ratón transgénico

Puede producirse un ratón transgénico por un método de microinyección de rutina (Developmental Engineering Experimental Manual - How to Prepare Transgenic Mouse, Tatsuji Nombra como editor responsable, Motoya Katsuki como editor, Kodansha Scientific, 1987).

Más específicamente, 7 unidades de serotropina (fabricada por Teikoku Hormone Mfg. Co., Ltd.) se administran por vía peritoneal a hembras F1 (BCF1), de 8 a 16 semanas, procedente de C57BL/6 y C3H. Después de 48 horas, se administran por vía peritoneal a éstos 7 unidades de gonadotropina (fabricada por Teikoku Hormone Mfg. Co., Ltd.) y se aparean con machos de C3H.

Al día siguiente, se recoge un óvulo fecundado de la ampolla de la trompa de Falopio de las hembras apareadas. La solución de ADN se inyecta en el pronúcleo masculino del óvulo fecundado utilizando un micromanipulador (fabricado por Narumo Co.) bajo un microscopio vertical.

El óvulo fecundado se trasplanta a una hembra que se aparea con un macho vasoligado (ICR) el día anterior, con el fin de provocar un falso embarazo en la hembra.

El día 20 después del trasplante, nacen los ratones de la camada, y se cortan sus colas cuando tienen 4 a 5 semanas de vida para extraer el ADN cromosómico destinado al tipado de ADN utilizando PCR como se describe a continuación.

(iii) Análisis de genotipo

A la cola de ratón obtenida anteriormente, se le añaden 2 ml de tampón de lisis [tampón de lisis; tampón que contiene Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), NaCl 100 mM, EDTA 20 mM, SDS al 1%, 0,15 ml/ml de proteinasa K (fabricada por SIGMA Co.) y 1 mg/ml de Pronasa E (fabricada por SIGMA Co.)] y la mezcla resultante se deja reposar a 50ºC durante la noche.

El tampón se extrae en un volumen igual de fenol, y se utiliza 1 ml de sobrenadante como plantilla para la PCR.

Como cebadores de PCR, se preparan los 5 cebadores siguientes y se mezclan para su utilización.

A partir de un segmento de una secuencia nucleotídica procedente del gen que suprime el envejecimiento obtenida en 2) y correspondiente a una zona con un intrón insertado en la secuencia del ADN genómico, se preparan dos cebadores (cebadores 1 y 2); se prepara un cebador procedente de una zona presente normalmente en el alelo mutante y un alelo natural (cebador 3); se prepara un cebador procedente de una zona presente solamente en el alelo mutante (cebador 4); y se prepara un cebador procedente de una zona presente solamente en el alelo mutante (cebador 5).

Ejemplos de los cebadores 1 y 2 incluyen la secuencia de ADN representada por las SEC. ID. nº:25 o nº:26.

Ejemplos del cebador 3 incluyen la secuencia de ADN representada por las SEC. ID. nº:27.

Ejemplos del cebador 4 incluyen la secuencia de ADN representada por las SEC. ID. nº:28.

Ejemplos del cebador 5 incluyen la secuencia de ADN representada por las SEC. ID. nº:29.

Si el gen que suprime el envejecimiento obtenido en 2) está presente en un ratón, se produce un fragmento que puede ampliarse por PCR con los cebadores 1 y 2; se produce en el homocigoto (pg/pg)un fragmento que puede ampliarse con los cebadores 3 y 4; se produce en el tipo natural (+/+) un fragmento que puede ampliarse con los cebadores 3 y 5; se producen en el homocigoto (pg/+) dos fragmentos que pueden ampliarse con los cebadores 3 y 4 y con los cebadores 3 y 5. De este modo, puede analizarse el genotipo de los ratones.

La PCR puede realizarse por un método convencional. Específicamente, la PCR se realiza en un sistema de 50 \mul [1 \times LA tampón II de PCR (Mg más), solución mezcla de dNTP de cada ingrediente a 400 mM, cada cebador de 0,2 mM, 2,5 U de TaKaRa LaTaq] calentando a 94ºC durante 1,5 minutos utilizando el ciclador térmico 480 para PCR TaKaRa y un kit LA de PCR (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.), seguido de 30 ciclos, consistente cada ciclo en 94ºC durante 30 segundos, 56ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 1,5 minutos y calentamiento posterior a 72ºC durante 10 minutos.

(iv) Apareamiento de ratón transgénico con un ratón que presenta pg/+

El genotipo de un ratón de la camada obtenida del apareamiento del ratón transgénico obtenido en (ii) con un ratón que presenta pg/+ se analiza según el método descrito en (iii) para confirmar que el ratón que expresa el gen que suprime el envejecimiento y que presenta pg/pg no presenta un síndrome que se asemeja al envejecimiento prematuro.

10) Obtención de un ratón que presenta el síndrome mejorado que se asemeja al envejecimiento prematuro de ratones que presentan el síndrome que se asemeja al envejecimiento prematuro utilizando adenovirus recombinante que contiene el gen que suprime el envejecimiento de ratones

Para introducir y expresar el gen que suprime el envejecimiento obtenido anteriormente en un ratón, se construye un adenovirus recombinante que contiene el gen que suprime el envejecimiento, y a continuación el virus recombinante se dosifica a un ratón que presenta un síndrome que se asemeja al envejecimiento prematuro para confirmar que el ratón no presenta el síndrome que se asemeja al envejecimiento prematuro y de este modo se verifica que el gen que suprime el envejecimiento obtenido anteriormente es terapéuticamente eficaz.

Mediante el método descrito a continuación, por ejemplo, puede obtenerse un ratón que presenta un síndrome mejorado que se asemeja al envejecimiento prematuro a partir de ratones que presentan un síndrome que se asemeja al envejecimiento prematuro.

(i) Construcción del cósmido recombinante que contiene el gen que suprime el envejecimiento

Preferentemente, la introducción del ADN del gen que suprime el envejecimiento que contiene un activador, el gen que suprime el envejecimiento y una zona de corte y empalme, y el ADN genómico del adenovirus tipo 5 que contiene una señal aditiva poli(A) a partir de la cual se eliminan E1A, E1B y E3.

Como cósmido que contiene cada uno de los elementos de la composición excepto para el gen que suprime el envejecimiento, se incluye pAxCAwt [Nucl. Acids. Res., 23: 3816 (1995)].

Como gen que suprime el envejecimiento, pueden utilizarse cualquiera de los genes obtenidos anteriormente en 2). Específicamente, puede utilizarse el ADN que codifica los aminoácidos representados por la SEC. ID. nº:3.

Según un método convencional, el cósmido se digiere con una enzima apropiada, tal como la SwaI o similar, y se liga con el gen que suprime el envejecimiento para preparar un cósmido recombinante.

(ii) Preparación del adenovirus recombinante que contiene el gen que suprime el envejecimiento

Pueden prepararse virus recombinantes por el método descrito por Miyake et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 1320 (1996)] y similares.

Más específicamente, el cósmido recombinante que contiene el gen que suprime el envejecimiento preparado en (i) se mezcla con adenovirus Ad5dIX ADN de tipo 5 escindido con EcoT22I con deleción de E3, E1A y E1B [J. Virology, 54: 711 (1985)], y la mezcla resultante se introduce a continuación en una estirpe celular que contiene los genes E1A y E1B, por ejemplo las células 293 procedentes del riñón del feto humano utilizando, por ejemplo, un método de fosfato potásico (solicitud de patente japonesa no examinada publicada nº 227075/1990) o similar. Si la recombinación entre el cósmido y el ADN del adenovirus tiene lugar en el interior de las células, se produce un adenovirus recombinante, que destruye las células, y por consiguiente, confirma que un adenovirus recombinante que contiene el gen que suprime el envejecimiento se produce y actúa como marcador de éste. Recuperando las células destruidas y descomponiendo las células mediante congelación y descongelación repetidas las células que utilizan un descomponedor de células se obtiene, por ejemplo, una solución de adenovirus recombinante que contiene el gen que suprime el
envejecimiento.

Además, el ADN del virus recombinante resultante se extrae del virus por un método convencional, y se escinde con una enzima de restricción, tal como XhoI o similar, para confirmar la estructura del mismo.

(iii) Purificación del adenovirus recombinante

Según el método de Kanegas, et al. [Jpn. J. Med. Sci. Biol, 47: 157 (1994)], por ejemplo, el virus recombinante resultante se purifica dos veces en un gradiente de densidad de cloruro de cesio, y a continuación se pone en suspensión en una solución, tal como PBS que contiene 10% de glicerol, HEPES-MgCl_{2} que contiene 10% de glicerol, HEPES-EDTA que contiene 10% de glicerol o similar, y puede almacenarse a -80ºC antes de su utilización
apropiada.

(iv) Dosificación del adenovirus recombinante que contiene el gen que suprime el envejecimiento en ratones que presentan el síndrome que se asemeja al envejecimiento prematuro

El virus recombinante obtenido de este modo se administra a 10^{8} a 10^{10} unidades formadoras de placa (PFU) a través de la vena caudal de un ratón que presenta un síndrome que se asemeja al envejecimiento prematuro, preferentemente de aproximadamente 3 a 4 meses. Tras la administración del virus recombinante, se observa la eliminación del síndrome que se asemeja al envejecimiento prematuro.

11) Cribado e identificación del ligando que se une específicamente al polipéptido que suprime el envejecimiento de la presente invención

Colocando el polipéptido que suprime el envejecimiento de la presente invención en contacto con una muestra de ensayo, dicho ligando puede cribarse e identificarse.

Ejemplos de la muestra de ensayo incluyen la orina, los fluidos corporales, los extractos tisulares, el sobrenadante del cultivo celular, los extractos celulares, y similares de mamíferos (por ejemplo, ratón, rata, cobaya, hámster, cerdo, oveja, bovinos, caballo, perro, gato, mono, seres humanos y similares).

Diluyendo, concentrando y fraccionando de manera apropiada la orina, los fluidos corporales, los extractos tisulares, los sobrenadantes del cultivo celular y los extractos celulares, colocándolos posteriormente en contacto con el péptido que suprime el envejecimiento de la presente invención, y fraccionándoles más utilizando la actividad estimulante celular como índice, puede aislarse un solo ligando.

Más específicamente, poniendo en contacto una muestra de ensayo con ambas células esencialmente que nunca expresan el gen que suprime el envejecimiento y las células después de la introducción y expansión el gen que suprime el envejecimiento, ensayando varias actividades de estimulación celular en los dos tipos de células, por ejemplo, el cambio de concentración de las moléculas de transmisión de la información celular, tal como el calcio celular, cAMP, cGMP, y similares, la fosforilación de la proteína celular, el cambio de la expresión del gen del factor de transcripción, el cambio del potencial de la membrana celular, el cambio del pH celular, la liberación de las moléculas de transmisión de la información extracelular, el cambio morfológico de las células, y similares, y comparando y analizando la diferencia en los dos tipos de células, se criba y se identifica un ligando.

Marcando la proteína natural o sintetizada artificialmente, el azúcar y el lípido, y sus productos y derivados modificados con radioisótopos y similares, y analizando la unión de los compuestos marcados en las células que expresan el polipéptido que suprime el envejecimiento, las fracciones de la membrana celular, o el polipéptido inmovilizado que suprime el envejecimiento en placas de microvaloración y similares según la presente invención, es posible identificar si el ligando descrito anteriormente es o no el ligando de la presente invención.

Por el método conocido que comprende la unión covalente el polipéptido que suprime el envejecimiento de la presente invención, o un producto parcialmente modificado o un péptido parcial del mismo al chip del sensor de BIAcore (fabricado por Pharmacia Biotech Co.) y a continuación se pone en contacto una muestra de ensayo con el polipéptido unido por enlace covalente [Nature, 368: 558 (1994)], el ligando puede ser cribado e identificado.

Utilizando además el polipéptido del gen que suprime el envejecimiento, marcado o no marcado, junto con un anticuerpo marcado contra el polipéptido, un ligando que se asocia específicamente con el polipéptido puede cribarse e identificarse por el siguiente método.

Es decir, fraccionando de manera apropiada la orina, los fluidos corporales, los extractos tisulares, los sobrenadantes del cultivo celular, los extractos celulares, o similares, fraccionándolos más por electroforesis, tales como electroforesis en poliacrilamida, electroforesis en agarosa, electroforesis en dos dimensiones, o similares, cromatografía en columna, tal como HPLC o similar y cromatografía en capa fina, comparando a continuación y analizando con detalle la diferencia entre los individuos que expresan el gen que suprime el envejecimiento y los individuos que no expresan nunca el gen o la diferencia entre las células que expresan el gen que suprime el envejecimiento y hacen aparición (desaparición) las células, bandas, manchas y tipos que no expresan el gen se identifica con una correlación específica con la expresión del gen que suprime el envejecimiento.

Las bandas, manchas y picos se transforman sobre un soporte, tal como membrana de nitrocelulosa, membrana de nilón, membrana de PVDF, o similar, en el gel o en la placa de capa fina, utilizando procedimientos de transferencia, bandas o manchas que se unen específicamente al polipéptido se identifican utilizando el polipéptido del gen que suprime el envejecimiento, marcado o no marcado, junto con un anticuerpo marcado contra el polipéptido, y se extrae un ligando de la banda o manchas y se identifica.

12) La presente memoria proporciona un método para el cribado y la identificación de compuestos que inhiben la unión específica entre el polipéptido que suprime el envejecimiento de la presente invención y el ligando descritos en la presente memoria

Comparando el caso cuando el polipéptido que suprime el envejecimiento de la presente invención se pone en contacto con el ligando descrito en la presente invención y el caso cuando el polipéptido que suprime el envejecimiento, el ligando descrito en la presente memoria y un compuesto de ensayo se ponen en contacto con los demás, un compuesto que inhibe la unión específica entre el polipéptido que suprime el envejecimiento y el ligando (por ejemplo, proteína, péptido, azúcar, lípido, compuestos no peptídicos, compuestos sintéticos, compuestos de fermentación, componentes biológicos o similares) puede identificarse en la muestra de análisis. El compuesto obtenido mediante la identificación incluye por ejemplo un compuesto (antagonista) que inhibe la unión específica del ligando al polipéptido que suprime el envejecimiento y que inhibe la actividad del polipéptido que suprime el envejecimiento, y un compuesto (agonista) que inhibe la unión específica pero que tiene las mismas funciones que las del ligando o que tiene una actividad alternativa.

Además de los compuestos sintéticos, proteínas, azúcares y lípidos de origen natural o sintetizados artificialmente, sus productos modificados y sus derivados, y similares, la muestra de análisis incluye, por ejemplo, orina, fluidos corporales, extractos tisulares, sobrenadantes del cultivo celular y extractos celulares de mamíferos (por ejemplo, ratón, rata, cobaya, hámster, cerdo, oveja, vacas, caballos, perros, gatos, monos, seres humanos, etc.) y además incluye productos de fermentación y extractos de plantas, otros organismos biológicos y similares.

El método para identificar los compuestos incluye por ejemplo, el método siguiente.

Se ilustra un método para cribar e identificar el compuesto que inhibe la unión específica entre el polipéptido del gen que suprime el envejecimiento de la presente invención y el ligando descrito en la presente memoria, que comprende poner en contacto una célula con el gen que suprime el envejecimiento introducido y expresado en la misma o una célula que expresa esencialmente el gen que suprime el envejecimiento con el ligando solo o en combinación con una muestra de ensayo y comparar entonces el caso del ligando solo con el caso del ligando puesto en contacto con la muestra de ensayo de varias actividades estimulantes de células, por ejemplo, el cambio de las concentraciones de moléculas de transmisión de información celular, tal como calcio celular, AMPc, CMPc, o similares, la fosforilación de la proteína celular, el cambio de expresión del gen del factor de transcripción precoz, el cambio del potencial de la membrana celular, el cambio del pH celular, la liberación de las moléculas de transmisión de la información extracelular, el cambio morfológico de las células y similares.

Marcando el ligando descrito en la presente memoria con radioactividad o similar, y analizando la unión del ligando marcado en las células que expresan el polipéptido que suprime el envejecimiento, la fracción de la membrana celular de las mismas, o el polipéptido que suprime el envejecimiento inmovilizado o una placa de microvaloración o similar según la presente invención, y a continuación comparando el nivel de unión entre el caso del ligando solo y el caso del ligando puesto en contacto con la muestra de ensayo, puede cribarse e identificarse un compuesto que inhibe la unión entre el polipéptido que suprime el envejecimiento y el ligando.

13) La memoria proporciona un método para el cribado y la identificación de un compuesto producido como consecuencia de la unión del polipéptido que suprime el envejecimiento de la presente invención y del ligando descrito en la misma

El sobrenadante del cultivo, las células, la fracción citoplásmica, la fracción de la membrana celular y similares de las células que expresan el polipéptido de la presente invención y las células que no expresan el polipéptido, por separado en contacto con el ligando descrito en la presente memoria o no en contacto con el ligando, se someten a electroforesis, tal como electroforesis en poliacrilamida, electroforesis en agarosa, electroforesis en dos dimensiones o similares, cromatografía en columna, tal como HPLC o similar, y cromatografía en capa fina para fraccionar componentes individuales, y los componentes se comparan entre sí. Por consiguiente, se identifican bandas, manchas o picos y similares, que se desarrollan específicamente o se eliminan en contacto con el ligando o que se desarrollan específicamente o se eliminan con una correlación de la expresión del polipéptido para obtener una molécula objetivo de las bandas, manchas y picos.

Se cree que la unión específica entre el polipéptido y el ligando se produce constantemente en los individuos que expresan el polipéptido de la presente invención, y que dicha interacción no se produce en los individuos que no expresan el polipéptido (los ejemplos específicos preferidos incluyen el ratón con envejecimiento prematuro descrito en la presente memoria). De este modo, varios órganos, tejidos, fluidos corporales, sangre, orina y similares del ratón normal y el ratón de envejecimiento prematuro descrito en la presente memoria) se fraccionan de manera apropiada, y a continuación se fraccionan más utilizando electroforesis, tal como electroforesis de poliacrilamida, electroforesis en agarosa, electroforesis en dos dimensiones, o similares, cromatografía en columna, tal como HPLC o similar, cromatografía en capa fina, o similar. Por comparación entre estos ratones, las bandas, manchas, picos y similares que presentan una diferencia de comportamiento entre los dos tipos de ratones se criban para recoger moléculas basadas en las bandas, manchas y picos e identificar un compuesto objetivo procedente de las bandas, manchas y
picos.

14) Cribado e identificación de un compuesto que potencia la expresión del polipéptido que suprime el envejecimiento de la presente invención (denominado en adelante "compuesto potenciador de la expresión") (i) Cribado e identificación que utiliza el anticuerpo que reconoce al polipéptido que suprime el envejecimiento de la presente invención

Después de poner en contacto las células que expresan el polipéptido que suprime el envejecimiento de la presente invención con una muestra de ensayo, un compuesto potenciador de la expresión presente en el sobrenadante del cultivo celular de las células puede cribarse e identificarse utilizando un anticuerpo que reconoce al polipéptido que suprime el envejecimiento de la presente invención.

Las células que expresan el polipéptido que suprime el envejecimiento de la presente invención incluyen las células del túbulo urinífero procedentes del riñón murino, que pueden prepararse por un método conocido, tal como el método de densidad de concentración, un método de separación resistente a la presión osmótica y un método de separación tubular [Kidney and Dialysis, Extra issue, 588 (1991)].

Además de los compuestos sintéticos, proteínas, péptidos, compuestos no peptídicos, azúcares y lípidos de origen natural y de los lípidos sintetizados artificialmente, sus productos modificados y derivados, y similares, el compuesto de ensayo incluye orina, fluidos corporales, extractos tisulares, sobrenadante del cultivo celular, extractos celulares de animales mamíferos (por ejemplo, ratones, ratas, cobayas, hámster, cerdos, ovejas, caballos, animales de granja no humanos bovino, perros, gatos, monos, seres humanos y similares); e incluye además productos de fermentación, extractos de plantas y otros organismos biológicos y similares; sin embargo no se limita a éstos.

Después de poner en suspensión las células que expresan el polipéptido que suprime el envejecimiento de la presente invención, por ejemplo, en un medio capaz de cultivar las células, y de añadir una muestra de ensayo en el medio para poner en contacto las células con la muestra de ensayo, el contenido del polipéptido que suprime el envejecimiento expresado por las células se analiza utilizando el anticuerpo policlonal o el anticuerpo monoclonal descrito en 6) según el método descrito anteriormente en 7).

Identificando una muestra de ensayo que podría aumentar el contenido del polipéptido que suprime el envejecimiento, en comparación con un sistema sin adición de la muestra de ensayo, puede identificarse un compuesto potenciador de la expresión.

(ii) Cribado e identificación que utiliza un sistema de ensayo del producto de transcripción del gen que suprime el envejecimiento de la presente invención

Después de poner en contacto las células que expresan el polipéptido que suprime el envejecimiento de la presente invención con una muestra de ensayo y de ensayar el producto de transcripción del gen que suprime el envejecimiento de la presente invención, puede cribarse e identificarse un compuesto potenciador de expresión.

Un ejemplo de las células que expresan el polipéptido que suprime el envejecimiento de la presente invención y de la muestra de ensayo se describió anteriormente en (i).

Después de poner en suspensión las células que expresan el polipéptido que suprime el envejecimiento de la presente invención, por ejemplo, en un medio capaz de cultivar las células, y de añadir una muestra de ensayo al medio para de este modo poner las células en contacto con la muestra de ensayo, se analiza la cantidad del producto de transcripción del polipéptido que suprime el envejecimiento expresado por las células por hibridación de transferencia Northern, hibridación de transferencia de manchas de ARN, RT-PCR, o similares.

La sonda que puede utilizarse para la hibridación y el cebador que puede utilizarse para RT-PCR incluyen fragmentos del gen que suprime el envejecimiento de la presente invención. Ejemplos específicos incluyen fragmentos de ADN que comprenden secuencias de ADN seleccionadas de las secuencias de ADN representadas por las SEC. ID. nº:6, nº:7 y nº:8.

Identificando una muestra de ensayo que podría aumentar el contenido del producto de transcripción del polipéptido que suprime el envejecimiento, en comparación con un sistema sin adición de la muestra de ensayo, puede identificarse un compuesto potenciador de la expresión.

(iii) Cribado e identificación que utiliza un gen indicador

Después de poner en contacto un transformante que contiene un ADN que contiene el plásmido con un gen indicador ligado corriente abajo de una zona que controla la transcripción del gen que codifica al polipéptido que suprime el envejecimiento de la presente invención (denominado en adelante "zona controladora de la transcripción") con una muestra de ensayo y de ensayar el nivel de expresión del polipéptido codificado por el gen indicador, puede cribarse e identificarse un compuesto potenciador de la expresión.

La zona controladora de la transcripción incluye una zona de aproximadamente 8 kb presente en un punto aproximadamente 6 kb corriente arriba del gen que suprime el envejecimiento en el que se observa que la zona está eliminada en el homocigoto descrito en el Ejemplo 2 descrito a continuación. Además, un fragmento de una longitud apropiada puede utilizarse también como zona controladora de la transcripción. Dicho fragmento se prepara escindiendo la zona utilizando una enzima de restricción apropiada.

Puede utilizarse cualquier gen indicador, con tal que el producto de la traducción del gen indicador sea estable en el interior de las células y la cantidad de producto de traducción presente se analice fácilmente. Los ejemplos incluyen cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), \beta-galactosidasa (\beta-gal), luciferasa (luc), proteína verde fluorescente (GFP) y similares.

Como muestra de ensayo, pueden utilizarse las descritas anteriormente en (i).

Después de ligar el gen indicador corriente abajo de la zona controladora de la transcripción por un método convencional, se transforma una célula huésped utilizando el plásmido preparado por un método convencional.

Poniendo en suspensión el transformante por ejemplo en un medio capaz de cultivar las células, de añadir una muestra de ensayo en el medio y de poner las células en contacto con la muestra de ensayo, se detecta el contenido del producto de la transcripción del gen indicador expresado por las células y se analiza por un método apropiado para el producto de la transcripción.

Ejemplos de métodos de detección y análisis incluyen el método descrito en Molecular Cloning, 2ª ed., capítulo 16, página 60 para CAT, el método descrito en Experimental Medicine, Supplementary Volume, Biomanual Series, 4, Gene Introduction and Expressoin Analysis, 81 (1994) para luc, y el método descrito en Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 4653 (1997) para GFP.

15) La memoria proporciona un método para la preparación de un oligonucleótido

Utilizando el ADN de la presente invención y los fragmentos de ADN del mismo, pueden prepararse oligonucleótidos (oligonucleótidos tanto complementarios como transcritos, y similares) que contienen una secuencia parcial del ADN de la presente invención.

El oligonucleótido incluye ADN que comprende una secuencia que es idéntica a 10 a 50 nucleótidos continuos de la secuencia de ADN o complementaria a la misma. Ejemplos específicos incluyen el ADN que comprende una secuencia que es idéntica o complementaria a 10 a 50 nucleótidos continuos en la secuencia de nucleótidos del ADN seleccionado de entre los ADN representados por las SEC. ID. nº:6 a nº:8.

El nucleótido está incluido como el oligonucleótido descrito en la presente memoria, y además, los derivados de dicho oligonucleótido están también incluidos como el oligonucleótido descrito en la presente memoria.

El ADN derivado incluye un ADN derivado preparado en el que el enlace diéster fosfato en el ADN está modificado en enlace fosforotioato, un ADN derivado en el que el enlace diéster fosfato en el ADN está modificado a un enlace N3'-P5' fosforoamidato, un ADN derivado en el que la ribosa y el enlace diéster fosfato en el ADN está modificado a enlace péptido-ácido nucleico, un ADN derivado en el que el uracilo en el ADN está sustituido por C-5 propionil-uracilo, un ADN derivado en el que el uracilo en el ADN está sustituido por C-5 tiazol uracilo, un ADN derivado preparado en el que la citosina en el ADN está sustituida por citosina modificada con fenoxazina, un ADN derivado en el que la ribosa en el ADN está sustituida por 2'-O-propilribosa, o un ADN derivado en el que la ribosa en el ADN está sustituida por 2'-metoxietoxirribosa, y similares [Cell Engineering, 16: 1463 (1997)].

16) Utilización del polipéptido que suprime el envejecimiento, del ADN que codifica el polipéptido, del anticuerpo que reconoce el polipéptido, del oligonucleótido descrito en la presente memoria, del ligando descrito en la presente memoria y del compuesto potenciador de la expresión

(i): El polipéptido que suprime el envejecimiento puede detectarse y analizarse en muestras de sangre, algunos órganos, células y similares, utilizando el anticuerpo contra el polipéptido que suprime el envejecimiento de la presente invención. Ejemplos específicos de medio preferido incluyen ELISA, un método con anticuerpo fluorescente y transferencia Western, y además, tinción de células inmunes que utilizan secciones de tejido patológico. Por consiguiente, el anticuerpo es útil para diagnosticar la posibilidad de la aparición de un síndrome que se asemeja al envejecimiento prematuro y varias enfermedades de adultos debidas a la disminución de la expresión del polipéptido que suprime el envejecimiento. Asimismo, el anticuerpo es también útil como reactivo de laboratorio para trabajos de investigación del péptido del asunto.

(ii): El envejecimiento puede suprimirse administrando el polipéptido que suprime el envejecimiento completo o parcial de la presente invención en organismos biológicos. Por consiguiente, el polipéptido que suprime el envejecimiento es útil como agente terapéutico o como agente preventivo para varias enfermedades de adultos que tienen lugar en íntima relación con la evolución del envejecimiento, por ejemplo, arteriosclerosis, hipertensión, osteoporosis y similares. Basándose en la supresión del envejecimiento, además, el polipéptido es útil de manera eficaz para la prolongación de la vida.

(iii): El gen que suprime el envejecimiento de la presente invención puede utilizarse para el tratamiento terapéutico por terapia génica una vez que el gen que suprime el envejecimiento de la presente invención se incorpora a vectores víricos y otros vectores, tales como retrovirus, adenovirus y similares.

(iv): Según la hibridación Northern o la PCR que utiliza el gen que suprime el envejecimiento u oligonucleótidos descritos en la presente memoria, se analiza el nivel de expresión del gen, y se diagnostican enfermedades de envejecimiento y de adultos. Además, el gen que suprime el envejecimiento o los oligonucleótidos pueden utilizarse para suprimir el envejecimiento o para suprimir el comienzo de enfermedades en adultos. Al detectar que un individuo está envejeciendo y que tiene mayores posibilidades de enfermedades de adultos debido a la anomalía congénita del gen que suprime el envejecimiento, utilizando el gen que suprime el envejecimiento u oligonucleótidos según la transferencia Southern o PCR, puede realizarse diagnóstico génico basándose en la información de la secuencia de los ácidos nucleicos en el individuo detectado. Además, el gen que suprime el envejecimiento o el oligonucleótido es sumamente útil como reactivo para trabajos de investigación genética.

(v): Administrando el producto del gen que suprime el envejecimiento procedente de animales de granja no humanos, tales como bovino, ovejas, cabras, cerdos, caballos, pollos y similares, proporcionado según la presente invención a un animal no humano adecuado o expresando el gen en un individuo utilizando un vector apropiado, tal como virus o similares, para terapia génica, puede prolongarse la vida de los animales de granja no humanos o puede suprimirse su envejecimiento. Como resultado, los animales de granja no humanos pueden criarse bien durante un periodo prolongado, de modo que pueden recogerse leche, huevos y fetos durante un periodo prolongado. Además, los animales de granja no humanos denominados transgénicos, pueden generarse introduciendo el gen en un óvulo no humano fertilizado e insertando el gen en el cromosoma de las células del cuerpo no humano entero para expresar el gen en el mismo, y el mismo efecto puede esperarse, que puede ser útil en la cría de animales de granja no humanos.

: Además, un clon mutante en el que el gen que suprime el envejecimiento en el cromosoma en una célula madre embrionaria no humana está inactivado o sustituido por una secuencia apropiada por una técnica recombinante homóloga conocida [por ejemplo, Nature, 326: 6110, 295 (1987); Cell, 51: 3, 503 (1987), etc.] puede prepararse [por ejemplo, Nature, 350: 6315, 243 (1991)] utilizando un vector que contiene el gen. Un híbrido no humano que comprende la célula madre embrionaria no humana y células normales puede prepararse utilizando el clon de la célula madre embrionaria no humana preparado de este modo según la técnica, tal como un método híbrido por inyección, un método coeno-híbrido o similar en el blastocisto de un óvulo fertilizado de un animal no humano. Aunque el apareamiento del híbrido no humano con un animal no humano normal, puede prepararse un animal no humano con una mutación apropiada en el gen que suprime el envejecimiento en las células del cuerpo completo y aunque el apareamiento de dichos animales, puede obtenerse un homocigoto en el que las mutaciones insertadas en ambos cromosomas homólogos.

: De tal manera, en las mutaciones de animales no humanos pueden introducirse en un punto apropiado del gen que suprime el envejecimiento. Introduciendo las mutaciones, tal como por sustitución, deleción, inserción, o similares, de nucleótidos en la zona de traducción del gen que suprime el envejecimiento, la actividad del producto puede modificarse. Además, aunque la inserción similar de mutaciones en la zona que controla la expresión, pueden modificarse el alcance, duración y especificidad del tejido y similares de la expresión. Mediante la combinación con la estirpe Cre-loxP, la duración de la expresión, el punto de expresión, el nivel de expresión y similares pueden ser controlados de manera más activa. Ejemplos conocidos de estas ideas incluyen la situación en la que se elimina un gen objetivo en una zona cerebral específica utilizando un activador expresado en la zona [Cell, 87: 7, 1317 (1996)] y un ejemplo en el que un gen objetivo se elimina en un tiempo objetivo en un método específico para órganos que utiliza el adenovirus que expresa a Cre [Science, 278: 5335 (1997)]. Respecto al gen que suprime el envejecimiento de la presente invención, puede prepararse un animal capaz de controlar la expresión en un tejido apropiado en un tiempo apropiado o que posee una inserción, deleción o sustitución apropiada en la zona de traducción o en la zona que controla la expresión. En dicho animal, puede producirse un síndrome de envejecimiento y varias enfermedades, tal como la enfermedad de adulto basándose en envejecimiento y similares, en un punto apropiado y en un momento apropiado. Por lo tanto, el animal no humano sirve como modelo sumamente útil para tratar terapéuticamente o prevenir el envejecimiento de varias enfermedades tales como las enfermedades de adultos. En particular, el animal no humano es muy útil como modelo de evaluación de agentes terapéuticos y de sus agentes preventivos, alimentos funcionales, alimentos sanitarios y similares.

(vi): El polipéptido que suprime el envejecimiento de la presente invención es útil como reactivo para cribar y determinar un ligando que se une específicamente al polipéptido.

(vii): El polipéptido que suprime el envejecimiento de la presente invención se utiliza, junto con el ligando de la presente invención, para cribar e identificar un compuesto que inhibe la unión específica entre el polipéptido y el ligando.

(viii): Una molécula producida como consecuencia de la unión del polipéptido con el ligando puede cribarse e identificarse utilizando el polipéptido que suprime el envejecimiento de la presente invención y el ligando descrito en la presente memoria.

(ix): Se sugiere posiblemente que un compuesto que inhibe la unión específica entre el polipéptido que suprime el envejecimiento de la presente invención y el ligando descrito en la presente memoria así como la molécula producida como consecuencia de la unión entre el polipéptido y el ligando descrita en la presente memoria sirve como alternativa a las funciones supresoras de envejecimiento del polipéptido del gen que suprime el envejecimiento o suplemento a las funciones, y por consiguiente, los agentes farmacéuticos que contienen dichas moléculas son útiles como agentes terapéuticos de un síndrome que se asemeja al envejecimiento prematuro, agentes terapéuticos de enfermedades de adulto y agentes supresores de envejecimiento.

(x): Un compuesto que potencia la expresión del gen que suprime el envejecimiento que codifica el polipéptido que suprime el envejecimiento de la presente invención (compuesto que potencia la expresión), que sirve como agente terapéutico para un síndrome que se asemeja al envejecimiento prematuro, un agente terapéutico para enfermedades del adulto y un agente que suprime el envejecimiento, sirve para suprimir el envejecimiento y tratar o prevenir terapéuticamente las enfermedades del adulto, como el polipéptido que suprime el envejecimiento.

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Breve descripción de los dibujos

Se describen a continuación los símbolos utilizados en los dibujos

bp:: pares de bases

kb:: pares de kilobases

IFN-\gamma:: interferón-gen \gamma

Amp, Ap o Ap^{r}:: gen resistente a la ampicilina procedente del pBR322

rop^{+}:: gen rop

PletI:: activador letI

Ptrp:: activador trp

P_{SE}:: activador del gen precoz del virus de simio 40 (SV40)

P_{MO}:: activador del virus de la leucemia de ratón de Molony con repetición terminal larga (LTR)

Hyg:: gen resistente a la higromicina

G418^{r}:: gen resistente a G418

dhfr:: gen de ácido dihidrofólico reductasa

P1:: activador P1 procedente de pBR322

Ptk:: activador del gen de timidina cinasa (tk) del virus del herpes simple

Sp.\betaG:: señal de corte y empalme del gen de \beta-globina de conejo

A.\betaG:: señal de adición de poli(A) del gen de \beta-globina de conejo

A.SE:: señal de adición de poli(A) del gen precoz del virus de simio 40 (SV40)

Atk:: señal de adición de poli(A) del gen de timidina cinasa (tk) del virus del herpes simple(HSV)

Los dibujos se describen de manera sencilla a continuación.

La Fig. 1 es un modelo electroforético que describe los resultados de la hibridación cromosómica por transferencia Southern con toda la longitud de un gen de introducción como sonda; la banda 1 presenta los resultados de un homocigoto; la banda 2 presenta los resultados de un heterocigoto; y la banda 3 presenta los resultados de un ratón salvaje.

La Fig. 2 describe las cartografías de restricción del gen de introducción y los plásmidos rescatados en la práctica.

La Fig. 3 es un modelo electroforético que describe los resultados de la hibridación cromosómica por transferencia Southern con un fragmento cromosómico contenido en el plásmido rescatado como sonda; la banda 1 presenta los resultados de un homocigoto; la banda 2 presenta los resultados de un heterocigoto; y la banda 3 presenta los resultados de un ratón salvaje.

La Fig. 4 representa un mapa de restricción de un clon de fago con el ADN cromosómico en la proximidad el gen de introducción que va a insertarse.

La Fig. 5 es un modelo de electroforesis que representa los resultados de la hibridación por transferencia Northern en los poli(A)^{+} ARN de órganos individuales murinos y SacII 450 bp como sonda.

La Fig. 6 es un modelo de electroforesis que representa los resultados de la hibridación por transferencia Northern en poli(A)^{+} ARN preparado a partir del riñón de cada uno de los ratones salvajes, de un heterocigoto, de un homocigoto (ratón que presenta un síndrome que se asemeja al envejecimiento prematuro), y de los ratones salvajes en cada una de las etapas del nacimiento (0 semanas) a 7 semanas, junto con SacII de 450 bp como sonda.

La Fig. 7 representa esquemáticamente los ADNc de los polipéptidos que suprimen el envejecimiento completos de ser humano (parte superior), de tipo secretor humano (centro) y completos murinos (parte inferior) y las proteínas codificadas por los ADNc.

La Fig. 8 es una vista que representa el mapa de restricción del plásmido pNKM101; la flecha más larga representa el gen que suprime el envejecimiento procedente del ratón y la dirección de transferencia.

La Fig. 9 es una vista que representa el mapa de restricción del plásmido pNKM112; la flecha más larga representa el gen que suprime el envejecimiento procedente del ratón y la dirección de transferencia.

La Fig. 10 es un modelo de electroforesis que presenta los resultados de examinar la expresión del gen que suprime el envejecimiento secretor murino para con el poli(A)^{+} ARN de cada uno de los órganos del ratón por RT-PCR.

La Fig. 11 es una vista que representa el mapa de restricción del plásmido pNKM103; la flecha más larga representa el gen que suprime el envejecimiento humano y la dirección de transferencia.

La Fig. 12 es una vista que representa el mapa de restricción del plásmido pNKH106; la flecha más larga representa el gen que suprime el envejecimiento secretor humano y la dirección de transferencia.

La Fig. 13 es una vista que presenta el procedimiento de construcción del plásmido pSupex.

La Fig. 14 es una vista que presenta el procedimiento de construcción del plásmido pYT102.

La Fig. 15 es un modelo de electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida para confirmar la presencia de un fragmento de polipéptido que suprime el envejecimiento producido en Escherichia coli que contiene el pYT102; la banda 1 representa la producción de un fragmento de polipéptido que suprime el envejecimiento en NY49 de Escherichia coli que contiene el pYT102, sin adición de IAA, y la banda 2 representa la producción del mismo con adición
de IAA.

La Fig. 16 es un modelo de electroforesis que confirma la expresión de un fragmento de polipéptido que suprime el envejecimiento en Escherichia coli que utiliza un anticuerpo policlonal contra el fragmento de polipéptido que suprime el envejecimiento por transferencia Western.

La Fig. 17 es una vista que presenta el procedimiento de construcción de pAGE210.

La Fig. 18 es una vista que presenta el procedimiento de construcción de pYT103.

La Fig. 19 es un modelo de electroforesis que confirma la expresión del polipéptido completo que suprime el envejecimiento en células de animal utilizando un anticuerpo policlonal contra el fragmento de polipéptido que suprime el envejecimiento por transferencia Western; la banda 1 representa los resultados utilizando células CHO dhfr^{-} (como referencia de un hospedador solo); y la banda 2 representa los resultados utilizando células CHO dhfr^{-}/pYT103 ampliadas por MTX.

La Fig. 20 es una vista que presenta el procedimiento de construcción de pAS104.

La Fig. 21 es un modelo de electroforesis en SDS-poliacrilamida que confirma la expresión del polipéptido que suprime el envejecimiento completo en células de insecto; la banda 1 representa los resultados utilizando marcadores de peso molecular; la banda 2 representa los resultados utilizando células Sf9; y la banda 3 representa los resultados utilizando células Sf9 infectadas con un virus que expresa el polipéptido que suprime el envejecimiento.

La Fig. 22 es un modelo de electroforesis con SDS-poliacrilamida que confirma la expresión del polipéptido que suprime el envejecimiento completo en células de insecto utilizando un anticuerpo policlonal contra el fragmento de polipéptido que suprime el envejecimiento por tranferencia Western; la banda 1 representa los resultados utilizando células Sf9; la banda 2 representa los resultados utilizando células Sf9 infectadas con un virus que expresa el polipéptido que suprime el envejecimiento.

La Fig. 23 es una vista que presenta el procedimiento de construcción de pYS110.

La Fig. 24 es un modelo de electroforesis que confirma la expresión de la longitud total del polipéptido que suprime el envejecimiento en células CHO (CHO dhfr^{-}) utilizando el anticuerpo monoclonal KM1902 contra el fragmento de polipéptido que suprime el envejecimiento por transferencia Western; la banda 1 representa los resultados de la reacción Western utilizando células CHO; la banda 2 representa los resultados de la reacción Western utilizando células CHO (CHO dhfr^{-}/pYS110) que expresan el polipéptido que suprime el envejecimiento humano; y la banda 3 representa los resultados utilizando células CHO (CHO dhfr^{-}/pYT103) que expresan el polipéptido que suprime el envejecimiento murino.

La Fig. 25 es una vista que presenta el procedimiento de construcción de pYS111.

La Fig. 26 es un modelo de electroforesis que confirma la expresión de la longitud total del polipéptido que suprime el envejecimiento secretor humano en células CHO (CHO dhfr^{-}) utilizando el anticuerpo monoclonal KM1902 contra el fragmento de polipéptido que suprime el envejecimiento por transferencia Western; la banda 1 representa los resultados de la reacción Western utilizando células CHO (CHO dhfr^{-}); y la banda 2 representa los resultados de la reacción Western utilizando células CHO (CHO dhfr^{-}/pYS111) que expresan el polipéptido que suprime el envejecimiento humano; y la banda 3 representa los resultados utilizando células CHO (CHO dhfr^{-}/pYT103) que expresan el polipéptido que suprime el envejecimiento secretor humano.

La Fig. 27 es una vista que presenta el procedimiento de construcción de pYS150.

La Fig. 28 es un modelo de electroforesis que confirma la expresión de la longitud total del polipéptido que suprime el envejecimiento secretor humano en células de insecto utilizando el anticuerpo monoclonal KM1902 contra el fragmento de polipéptido que suprime el envejecimiento por transferencia Western. Se muestran los resultados en los que se han utilizado células Sf21 infectadas con un virus que expresa el polipéptido que suprime el envejecimiento secretor humano.

La Fig. 29 es una vista que presenta el procedimiento de construcción del plásmido pYS112.

La Fig. 30 es un modelo de electroforesis que confirma la expresión de la longitud total del polipéptido que suprime el envejecimiento secretor humano en células CHO (CHO dhfr^{-}) utilizando el anticuerpo monoclonal KM1902 contra el fragmento de polipéptido que suprime el envejecimiento por inmunoprecipitación; la banda 1 representa los resultados de la reacción Western utilizando células CHO; y la banda 2 representa los resultados de la reacción Western utilizando células CHO (CHO dhfr^{-}/pYS112) que expresan el polipéptido que suprime el envejecimiento humano; y la banda 3 representa los resultados utilizando células CHO (CHO dhfr^{-}/pYT103) que expresan el polipéptido que suprime el envejecimiento secretor de ratón.

La Fig. 31 es una vista que presenta el procedimiento de construcción del plásmido pYS151.

La Fig. 32 es un modelo de electroforesis que confirma la expresión de la longitud total del polipéptido que suprime el envejecimiento secretor de ratón en células de insecto utilizando el anticuerpo monoclonal KM1902 contra el fragmento de polipéptido que suprime el envejecimiento por inmunoprecipitación; la banda 1 representa los resultados utilizando células Sf21; y la banda 2 representa los resultados utilizando células Sf21 infectadas con un virus que expresa el polipéptido que suprime el envejecimiento secretor de ratón.

La Fig. 33 es una vista que presenta el análisis de la reactividad de un anticuerpo KM1902 monoclonal con un citómetro de flujo; (A) representa los resultados de la comparación entre la adición del anticuerpo monoclonal KM1902 y sin adición del anticuerpo en células CHO (CHO dhfr^{-}); (B) representa los resultados de la comparación entre la adición del anticuerpo monoclonal KM1902 y sin adición del anticuerpo en células CHO (CHO dhfr^{-}/pYT103) que expresan el polipéptido que suprime el envejecimiento.

La Fig. 34 representa un modelo de transferencia Western que muestra los resultados de la inmunoprecipitación con el anticuerpo KM1902 monoclonal utilizando el polipéptido que suprime el envejecimiento que expresa células CHO (CHO dhfr^{-}/pYT103); en la banda 1, los resultados de la inmunoprecipitación con el anticuerpo KM1902 monoclonal utilizando el polipéptido que suprime el envejecimiento que expresa células CHO (CHO dhfr^{-}/pYT103); y en la banda 2, los resultados de la inmunoprecipitación sin adición del anticuerpo 1902 monoclonal utilizando el polipéptido que suprime el envejecimiento que expresa células CHO (CHO dhfr^{-}/pYT103).

La Fig. 35 es una vista que presenta el procedimiento de construcción del plásmido pEFSA.

La Fig. 36 es una vista que presenta el procedimiento de construcción del plásmido pRES.

La Fig. 37 representa los resultados de la administración de un adenovirus recombinante que contiene el gen que suprime el envejecimiento murino; A, natural sin administración; B, natural con administración de virus; C, homocigoto (ratón que presenta un síndrome que se asemeja al envejecimiento prematuro) con administración de virus; D, homocigoto (ratón que presenta un síndrome que se asemeja al envejecimiento prematuro) sin administración.

La Fig. 38 es una vista que presenta el procedimiento de construcción del plásmido pYS201.

La Fig. 39 es un modelo de electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida de la zona N-terminal (péptido SUHN) del polipéptido que suprime el envejecimiento humano producido en Escherichia coli que contiene el pYT201.

La Fig. 40 es una vista que presenta el procedimiento de construcción del plásmido pYS202.

La Fig. 41 es un modelo de electroforesis en SDS-poliacrilamida de la zona terminal C (péptido SUHC) del polipéptido que suprime el envejecimiento humano producido en Escherichia coli que contiene pYS202.

La Fig. 42 es un modelo de electroforesis que representa los resultados de la hibridación por transferencia Western de tejidos murinos. La solución del extracto de células CHO que expresan la longitud completa del tipo membrana murina; riñón murino, la fracción de la membrana y la fracción citoplásmica del hígado, y la solución de extracto de células CHO que expresan la longitud completa de tipo membrana murina se separaron por electroforesis en SDS-poliacrilamida, se realizó la transferencia Western utilizando KM2076, y se realizó la detección por exposición a una película de rayos X con un agente quimioluminiscente.

La Fig. 43 es un modelo de electroforesis que representa los resultados de la hibridación por transferencia Western de un tejido murino y la solución del extracto de las células CHO que expresan la longitud completa del tipo de membrana murina utilizando KM2119 y KM2116; fracciones de la membrana y fracciones citoplásmica del riñón y del hígado murinos, y la solución de extracto de células CHO que expresan la longitud completa de tipo membrana murina se separaron por electroforesis en SDS-poliacrilamida, se realizó la transferencia Western utilizando KM2076 o KM2116, para la detección por exposición a una película de rayos X con un agente quimioluminiscente.

La Fig. 44 es un modelo de electroforesis que presenta los resultados de la hibridación por transferencia Western, que comprende la preparación de una solución de extracto celular de células CHO que expresan la longitud completa de tipo membrana murina, realizando inmunoprecipitación que utiliza KM2076, KM2119 y proteína G-Sepharose 4FF para la separación por electroforesis en SDS-poliacrilamida y realizando la transferencia Western.

La Fig. 45 representa un modelo de electroforesis que presenta los resultados de la hibridación por transferencia Western, que comprende la precipitación inmunitaria de un sobrenadante de cultivo de células CHO que expresan el secretor humano utilizando KM2076 y proteína G-Sepharose 4FF, realizando la electroforesis en SDS-poliacrilamida para la separación, y realizando la transferencia Western utilizando KM2076; la banda 1 representa los resultados de la inmunoprecipitación del sobrenadante del cultivo de las células CHO secretoras humanas utilizando KM2076 y proteína G-Sepharose 4FF; la banda 2 representa los resultados de la inmunoprecipitación de un medio exento de suero utilizando KM2076; y la banda 3 representa los resultados de la inmunoprecipitación del sobrenadante del cultivo de las células CHO que expresan el secretor humano utilizando NRIgG.

Mejor modo de poner en práctica la invención

Se muestran ejemplos a continuación. A menos que se indique de otro modo, la manipulación genética se realiza según el método conocido descrito en Molecular Cloning, 2ª ed.

Ejemplo 1 Clonación del ADN cromosómico murino adyacente al punto de introducción del gen (1) Detección del gen de introducción

Se produjo un ratón transgénico en el que se introdujo un gen extraño con un transmisor inverso Na^{+}/H^{+} ligado al activador del factor 1\alpha de elongación humano (activador EF-1\alpha) (solicitud de patente japonesa publicada no examinada nº 268856/1993), los heterocigotos resultantes se aparearon entre sí para obtener un homocigoto que presenta un síndrome que se asemeja al envejecimiento prematuro. A partir del homocigoto, un ratón que presenta un síndrome predominante que se asemeja al envejecimiento prematuro [18th Annual Meeting of The Molecular Biology Society of Japan (Nabeshima et al., 2K-02, 1995)], y un heterocigoto utilizado para obtener el homocigoto se utilizaron en los experimentos siguientes.

A partir de los hígados del ratón heterocigótico, homocigótico y salvaje, se prepararon los ADN cromosómicos. Cada 10 \mug de los ADN cromosómicos se digirieron completamente con EcoRV y XbaI.

Los fragmentos de ADN digeridos se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% y se transfirieron a un filtro Hybond N^{+} (fabricado por Amersham Co.).

El plásmido pEFNaH marcado (solicitud de patente japonesa publicada no examinada nº 268856/1993), que se utilizó para preparar el ratón transgénico con el kit de marcado de ADN Megaprime que utiliza \alpha-[^{32}P]-dCTP (fabricado por Amersham Co.), se utilizó también como sonda para la hibridación con el filtro Hybond N^{+} transferido según el manual adjunto del filtro Hybond N^{+}.

Los resultados se presentan en la Fig. 1. Debido a que únicamente se detectó una sola banda de aproximadamente 150 kb en el homocigoto y heterocigoto, esto indicaba que el gen de introducción estaba insertado solamente en un punto en el cromosoma murino. Los resultados también fueron confirmados por FISH utilizando el gen de introducción como sonda. Más específicamente, se detectó una sola señal en el telómero del brazo largo del 6º cromosoma
(6G2-3).

(2) Clonación del ADN cromosómico murino adyacente al punto de introducción del gen (1)

Diez \mug del ADN cromosómico del homocigoto descrito en (1) se digirieron completamente con EcoRI o KpnI, y se realizó la reacción de ligadura a una concentración de 10 ng/ml a 16ºC durante 30 minutos utilizando un kit de ligadura de ADN (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.).

XL1-Blue MRF' de Escherichia coli (Epicurian Coli, fabricado por STRATAGENE Co.) se transformó utilizando 10 \mul de la solución de reacción, y a continuación se cultivó a 37ºC durante 18 horas, y se recuperaron los plásmidos de las colonias resultantes.

Cuando el cromosoma se digirió con EcoRI, se recuperaron dos tipos de plásmidos, a saber E50 y E70, como plásmidos que contienen un fragmento del ADN genómico murino. Cuando el cromosoma se digirió con KpnI, se recuperó el plásmido K8 como tal plásmido.

La Fig. 2 representa las cartografías de restricción del gen de introducción y los plásmidos realmente recuperados. Los tres tipos de plásmidos contienen fragmentos de ADN diferentes del gen de introducción, y se indicó que estos fragmentos de ADN pueden ser posiblemente fragmentos cromosómicos adyacentes al gen de introducción.

Una vez preparado un fragmento EcoRI-PvuII de la zona del ADN cromosómico murino contenido en el plásmido E50 recuperado y marcando posteriormente el fragmento con un radioisótopo por un método similar al de (1), se realizó la transferencia Southern utilizando el filtro utilizado en (1) después de la hibridación y el producto marcado como sonda.

Los resultados se presentan en la Fig. 3. Se observó una sola banda procedente solamente del alelo natural en el ratón salvaje; se observó una sola banda de solamente el alelo mutante en el homocigótico; se observaron bandas de ambos alelos en el heterocigótico, por lo cual se confirmó que el fragmento de ADN procedente del cromosoma contenido en el plásmido rescatado era una zona adyacente al gen de introducción.

Ejemplo 2 Clonación del gen que suprime el envejecimiento murino

Se cribó el banco genómico de un ratón salvaje (banco genómico murino, \lambdaFIXII, preparado por STRATAGENE Co.) utilizando la sonda del Ejemplo 1(2) (según el manual adjunto) para obtener tres clones de fago independientes hibridables con la sonda (E8.5, E2.6, E11.1) (Fig. 4).

En comparación con el ADN genómico recuperado del homocigótico en el Ejemplo 1(2), la eliminación de más de aproximadamente 8 kb estaba presente en la zona dentro del gen que suprime el envejecimiento del homocigoto.

Para identificar un gen transcrito en la zona, se determinó sucesivamente la secuencia nucleotídica en el centro de la parte de la deleción con un secuenciador modelo 14000L fabricado por Li-Cor Co. (el mismo secuenciador utilizado a continuación). Se demostró que el islote CpG estaba presente aproximadamente 6 kb aparte de la parte de la
deleción.

Escindiendo un fragmento de 450 bp con SacII procedente de la parte de la deleción y marcando posteriormente el fragmento por un método similar al del Ejemplo 1(1), el producto marcado se utilizó como sonda para la hibridación Northern en las condiciones según el manual del filtro Hybond N^{+} utilizando un filtro poli(A)^{+} ARN del corazón, cerebro, bazo, pulmones, hígado, músculo esquelético, riñón y páncreas murinos [filtros para transferencias Northern de tejido múltiple de ratón; fabricados por Clontech Co.].

Los resultados se presentan en la Fig. 5. Se observó una banda de aproximadamente 5,3 kb en el riñón, y se confirmó que un exón estaba contenido en el fragmento de 450 bp digerido con SacII.

Se preparó poli(A)^{+} ARN por separado de los riñones murinos del homocigótico y heterocigótico natural utilizando el kit de purificación de ARNm QuickPrep (fabricado por Pharmacia Co.) y 5 \mug de cada ARN se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% y a continuación se transfirieron sobre un filtro Hybond N^{+} (fabricado por Amersham Co.).

De la misma manera descrita anteriormente, se realizó la hibridación Northern utilizando el fragmento de digestión con SacII de 450 bp como sonda.

Los resultados se muestran en la Fig. 6. Se observó una banda individualmente para el tipo natural y el heterocigótico, que demuestra la confirmación de que el gen que suprime el envejecimiento estaba expresado, mientras que no se detectó ninguna banda para el homocigótico, lo que indica aparentemente ninguna expresión en absoluto del gen.

Asimismo, se preparó poli(A)^{+} ARN procedente del riñón murino en cada etapa después del nacimiento para la hibridación Northern utilizando como sonda el fragmento de 450 bp digerido con SacII. Como se muestra en la Fig. 6, casi no se observó ninguna expresión del gen que suprime el envejecimiento hasta una a dos semanas después del nacimiento; pero el nivel de expresión se elevó gradualmente desde la etapa de recién nacido y fue probablemente más potente la semana 3 a 4 después del parto.

Ejemplo 3 Clonación del ADNc del gen que suprime el envejecimiento murino

Se preparó un banco de ADNc sintetizando ADNc procedente del poli(A)^{+} ARN del riñón de un ratón salvaje utilizando un sistema de síntesis de ADNc (cDNA Synthesis System, fabricado por GIBCO BRL, CO.), añadiendo un adaptador EcoRI-NotI-SalI (SuperScript Choice System for cDNA Synthesis; fabricado por GIBCO BRL, CO.) en ambos terminales, insertando a continuación el ADNc resultante en la secuencia EcoRI de un vector de clonación \lambdaZAP II (kit de clonación \lambdaZAP II; fabricado por STRATAGENE Co.) para una encapsulación in vitro (Gigapack II Gold fabricado por STRATAGENE Co.).

Se realizó la hibridación en placa de 5\times10^{5} clones del banco de ADNc utilizando el fragmento de 450 bp digerido con SacII en el Ejemplo 2 como sonda. Durante la hibridación, se lavó el filtro dos veces en condiciones en que el filtro estaba sumergido en un tampón que contenía 2\timesSSPE [1\timescomposición SSPE contiene cloruro sódico 180 mM, fosfato dibásico de sodio 10 mM y etilendiamintetraacetato (EDTA) 1 mM (pH 7,4)], se lavó dos veces en las condiciones en que el filtro estaba sumergido en un tampón que contenía SDS al 0,1% a 65ºC durante 10 minutos, se lavó una vez en las condiciones en las que el filtro estaba sumergido en un tampón de 1\timesSSPE y SDS al 0,1% a 65ºC durante 15 minutos, y se lavó dos veces en las condiciones en las que el filtro estaba sumergido en un tampón de 0,2\timesSSPE y SDS al 0,1% a 65ºC durante 10 minutos.

Durante la hibridación, se obtuvieron 40 clones hibridables independientes. A partir de los clones se recuperaron los plásmidos durante la escisión in vivo, y se analizaron con enzimas de restricción y secuenciado de nucleótidos.

A partir del secuenciado de nucleótidos se indicó que el plásmido pNKM101 contiene ADNc de aproximadamente 5 kb representado por la SEC. ID. nº:8, y que un marco de lectura abierto (denominado en adelante "ORF") de 3042 bp estaba presente en el ADN. En el ORF, se codificó una nueva proteína de 1014 restos de aminoácidos, que tenía una secuencia señal de 35 aminoácidos en el terminal N y una zona de transmembrana de 19 aminoácidos en el terminal C, como se muestra en la SEC. ID. nº: 3 (Fig. 7). En la Fig. 8 se muestra la estructura de pNKM101.

Ejemplo 4 Aislamiento del gen secretor que suprime el envejecimiento de ratón

A fin de aislar un clon que contiene la zona del genoma del gen que suprime el envejecimiento murino procedente del banco que contiene el ADN genómico murino (cromosoma bacteriano artificial, BAC), se llevó a cabo la PCR utilizando como cebadores las secuencias de dos zonas en el ADNc del gen que suprime el envejecimiento murino obtenido en el Ejemplo 3, zonas representadas por las SEC. ID. nº:11 y nº:12, junto con el ADN cromosómico murino como plantilla. Se confirmó que un fragmento de ADN de 127 bp estaba ampliado.

Utilizando el ciclador térmico de ADN 480 fabricado por Perkin Elmer Co., se llevó a cabo la PCR durante 30 ciclos, estando cada ciclo compuesto por un proceso de 94ºC durante un minuto, 56ºC durante un minuto y 72ºC durante un minuto.

A partir del banco de BAC que contiene el ADN cromosómico murino de 100 kb de promedio se seleccionó el clon BAC en el que se amplió un fragmento de ADN de 127 bp utilizando los cebadores y las condiciones de ampliación descritas anteriormente por PCR.

Después de añadir una muestra de 10 \mug del clon BAC resultante a 50 \mul del tampón B, se añadieron 3 unidades de Sau3AI a la muestra y se hizo reaccionar a 37ºC durante 10 minutos.

La extracción en fenol-cloroformo y la precipitación en etanol se realizaron utilizando la solución de reacción para recuperar aproximadamente 5 \mug del fragmento de ADN.

El vector cósmido pWE15 (preparado por Clontech Co.) de 5 \mug se añadió a 30 \mul de tampón C, y se añadieron 30 unidades de BamHI a éste para reaccionar a 37ºC durante 2 horas. La extracción en fenol-cloroformo y la precipitación en etanol se realizaron utilizando la solución de reacción para recuperar aproximadamente 2 \mug del fragmento de ADN.

El fragmento del clon BAC tratado con Sau3AI (1 \mug) y el fragmento 15 de pWE tratado con BamHI se disolvieron en tampón de T4-ADN ligasa (20 \mul) y se LE añadió a éste una unidad de T4 ADN ligasa para la ligadura a 16ºC durante 18 horas. La solución de reacción se trató para la encapsulación in vitro utilizando Gigapack II Gold Extract (fabricado por STRATAGENE CO.) para preparar un banco de cósmidos.

Se obtuvo un clon en el que se amplió el fragmento de 127 bp a partir del banco utilizando los cebadores y en las condiciones de ampliación para la selección del clon BAC por PCR.

La secuencia nucleotídica correspondiente al terminal C del polipéptido que suprime el envejecimiento secretor humano obtenido en el Ejemplo 5 a continuación se comparó con la secuencia de ADN de la correspondiente zona del gen que suprime el envejecimiento murino clonado en el cósmido, y como consecuencia, se descubrió una secuencia de ADN que codifica una secuencia con homología con la secuencia de polipéptidos desde el aminoácido 535º al aminoácido 549º del polipéptido que suprime el envejecimiento secretor humano representado por la SEC. ID. nº:2.

Se realizó la ampliación del gen por PCR utilizando un kit plantilla Mouse Kidney Maratón Ready cDNA (fabricado por Clontech Co.), después de añadir un cebador adaptador procedente del banco representado por la SEC. ID. nº:13 y un cebador correspondiente a la zona procedente del ratón homóloga con el terminal C del polipéptido que suprime el envejecimiento secretor humano representado por la SEC. ID. nº:14.

Utilizando el ciclador térmico de ADN 480 fabricado por Perkin Elmer Co., se llevó a cabo la PCR durante 30 ciclos, estando cada ciclo compuesto por un proceso de 94ºC durante un minuto, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante un minuto.

El producto de reacción resultante se analizó por electroforesis en gel de agarosa, se observó un fragmento ampliado de aproximadamente 2 kb, y el fragmento se incorporó en el vector pCR2.1 (preparado por Invitrogen Co.).

Se determinó la secuencia nucleotídica, y se obtuvo una secuencia representada por la SEC. ID. nº:9. Este resultado indica que el ADNc es un gen que suprime el envejecimiento secretor murino de 1650 bp que contiene un ORF que codifica restos de 550 aminoácidos.

El gen se continuó sometiendo a PCR utilizando el ADN sintético representado por las SEC. ID. nº:15 y nº:16, se añadieron las enzimas de digestión HindIII y BamHI en ambos terminales del gen, que se insertaron a continuación en las secuencias de escisión de HindIII y BamHI del vector plásmido pUC118, para preparar el pNKM112 (Fig. 9).

Para examinar la expresión del gen en tejidos murinos, se realizó la reacción de transcripción inversa con un cebador nonámero aleatorio utilizando el kit TaKaRa RNA LA PCR (AMV) Ver. 1.1 (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.) con un poli(A)^{+} ARNm plantilla (500 ng) preparado a partir de varios órganos utilizando los cebadores representados por las SEC. ID. nº:17 y nº: 18 y utilizando el kit de purificación de ARNm QuickPrep (fabricado por Pharmacia Co.), seguido de reacción por PCR utilizando LA-TaqADN polimerasa (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.).

Utilizando el ciclador térmico de ADN 480 fabricado por Perkin Elmer Co., se llevó a cabo la PCR durante 30 ciclos, estando cada ciclo compuesto por un proceso de 94ºC durante 20 segundos, 60ºC durante 30 segundos y 72ºC durante un minuto.

Se analizaron los productos de reacción resultantes por electroforesis en gel de agarosa, y los resultados se presentan en la Fig. 10. Se observó la expresión en riñón, cerebro, glándula pituitaria, ovario, testículos y páncreas.

Ejemplo 5 Clonación del ADNc para un gen humano que suprime el envejecimiento (1) Preparación del gen que suprime el envejecimiento procedente de riñón humano

Se construyó el banco de ADNc de riñón humano utilizando el poli(A)^{+} ARN de riñón humano (preparado por Clontech Co.) por un método similar al del Ejemplo 3. Se realizó la hibridación en placa de aproximadamente 1.000.000 de clones del banco utilizando un fragmento de 4,2 kb escindido con la secuencia NotI procedente del adaptador terminal 5' en el ADNc murino del Ejemplo 2 y la secuencia NotI presente en el ADNc.

Durante la hibridación se obtuvieron seis clones de hibridación muy independientes. A partir de los clones, se recuperaron los plásmidos por escisión in vivo, y se realizó el análisis de restricción y el secuenciado de nucleótidos.

A partir del secuenciado de nucleótidos se indicó que un plásmido obtenido a partir de dos clones contenidos ADNc de aproximadamente 3,2 kb con gran homología en toda la longitud de la secuencia murina representada por la SEC. ID. nº:6 y que un ORF de aproximadamente 3.036 bp estaba presente en el ADNc, el ORF que codifica los 1.012 restos de aminoácidos representados por la SEC. ID. nº:1.

Se dedujo que la secuencia de aminoácidos era un homólogo humano porque la secuencia tenía una homología hasta del 86% con la del ratón (Fig. 7).

En la Fig. 11 se presenta la estructura del plásmido pNKM103 que contiene el ADNc.

Se indicó que un plásmido obtenido a partir de los clones restantes contenía ADNc de aproximadamente 3,4 kb representado por la SEC. ID. nº:7 y que un ORF de aproximadamente 1.647 bp estaba presente en el ADNc, el ORF que codifica el polipéptido representado por la SEC. ID. nº:2.

Comparado con el polipéptido representado por la SEC. ID. nº:1, el polipéptido representado por la SEC. ID. nº:2 no contiene la zona transmembranaria en torno al terminal C, y por consiguiente, se indica que el polipéptido es una proteína secretora (Fig. 7).

En la Fig. 12 se presenta la estructura del plásmido pNKH106 que contiene el ADNc.

(2) Gen que suprime el envejecimiento procedente del páncreas humano

Utilizando una solución de fago (1 \mul; que contiene 1\times10^{8} fagos) del banco de ADNc de páncreas humano (fabricado por Clontech Co.) como plantilla, se mezclaron 1 \mul de cada cebador transcrito 10 \muM representado por la SEC. ID. nº:19 (RYHH-02-5') y del cebador complementario 10 \muM representado por la SEC. ID. nº:20 (RYHH-o2-3'-2), 4 \mul de 10 \times tampón PCR (utilizando el tampón unido a la enzima) y 3,2 \mul de dNTP 2,5 mM, y la mezcla resultante se introdujo en un ciclador térmico. Tras la reacción a 97ºC durante 5 minutos, se enfrió la mezcla rápidamente en hielo durante 5 minutos, y se mezclaron 0,5 \mul de Taq ADN polimerasa (preparada por Takara Shuzo Co., Ltd.; 5 unidades/\mul), seguido de PCR durante 30 ciclos, estando compuesto cada ciclo por un proceso de 95ºC durante 60 segundos, 65ºC durante un minuto y 72ºC durante un minuto. A continuación se confirmó por electroforesis en gel de agarosa que se amplió una banda de aproximadamente 400 bp.

El fragmento ampliado de 0,2 kb se purificó a partir del gel de agarosa, que se incorporó a continuación en el vector T pT7Blue (Novagen Co.), utilizando un kit de ligadura de ADN ver. 2 (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.). El método siguió las instrucciones del kit. El XL1-Blue de Escherichia coli se transformó en la solución para obtener una cepa resistente a ampicilina. A partir del transformante, se recuperó un plásmido utilizando un extrusor PI-100 de plásmidos (fabricado por Kurabo Co.), y la secuencia nucleotídica de dos clones se determinó utilizando un secuenciador de ADN 377 [fabricado por Perkin Elmer Co.], se detectó el pT7-02 con una secuencia homóloga a la del gen que suprime el envejecimiento.

Se marcó un fragmento de inserción del plásmido pT7-02 con digoxigenina (DIG) utilizando un kit de marcado de ADN con DIG (fabricado por Boehringer Mannheim Co.), y se utilizó como sonda. El método de marcado siguió las instrucciones del kit.

Se cultivó el banco de ADNc de páncreas humano en cinco placas cada una de un diámetro de 15 cm, de modo que aproximadamente 2\times10^{5} placas podían aparecer por cada placa, que se transfirió a un filtro de membrana de nilón Hybond N+ (fabricado por Amersham Co.). Según el protocolo de Boehringer Mannheim Co. (kit de detección luminiscente por DIG para ácidos nucleicos), se realizaron la desnaturalización e inmovilización del ADN y la hibridación de la sonda y el lavado del filtro. Como solución de hibridación, se utilizó una solución que contenía 5 \times SSC, 1% de solución de bloqueo [kit para detección luminiscente con DIG para ácidos nucleicos (Boehringer Mannheim Co.)], 0,1% de Sarcosil y 0,02% de SDS para la hibridación durante la noche a 68ºC. Se lavó la solución en agitación dos veces con 2 \times SSC que contiene 0,1% de SDS a temperatura ambiente durante 10 minutos, y dos veces en 1 \times SSC que contiene 0,1% de SDS a 68ºC durante 15 minutos, y a continuación, se detectó una placa positiva utilizando un kit de detección con DIG (fabricado por Boehringer Mannheim Co.) con anticuerpo antiDIG. Se sacó la placa a cucharadas junto con el medio de agar-agar y a continuación se colocó en 500 \mul de un tampón SM (NaCl 0,1 M, MgSO_{4}\cdot7 H_{2}O 0,008 M) para eluir el fago en la solución tampón a temperatura ambiente durante la noche. Utilizando 1 \mul del tampón como plantilla, se realizó la PCR de la misma manera descrita anteriormente. Se confirmó basándose en la ampliación de un fragmento de 0,4 kb que el ADNc objetivo estaba contenido en el clon positivo, y escindiendo posteriormente una secuencia de inserción de aproximadamente 3,5 kb con EcoRI del clon positivo, se subclonó la secuencia a continuación en la secuencia EcoRI de pBluescript II SK(+). Se recuperó el plásmido del transformante utilizando un extrusor PI-100 de plásmidos (fabricado por Kurabo Co.), y se determinó la secuencia nucleotídica del clon utilizando un secuenciador 377 de ADN [fabricado por Perkin Elmer Co.]. Se observó el plásmido pRYH02 que contiene la secuencia de nucleótidos representado por la SEC. ID. nº:10. Se demostró que un ORF capaz de codificar la proteína de 1.015 aminoácidos representado por la SEC. ID. nº:5 estaba presente en el gen. Debido a que la secuencia de aminoácidos deducida posiblemente de la secuencia de nucleótidos presentaba en toda la zona aproximadamente el 45% de homología con el
gen que suprime el envejecimiento, se demostró que el gen era el de la familia del gen que suprime el envejecimiento.

Los 100 aminoácidos del terminal N de la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº:10 se analizaron utilizando Signal P ver.2 [Protein Engineering, 10: 1 (1997)] y SPScan (Genetics Computer Group Inc.) como programa informático para la predicción de la zona de escisión de la secuencia señal. Por consiguiente, las zonas de escisión de la secuencia señal predichas por los dos tipos de programa informático coincidían entre sí, que estaban presentes entre el Gly 23º y el Phe 24º. Por consiguiente, se dedujo que el 1º y 23º aminoácidos de la secuencia de aminoácidos formaban una secuencia señal y los aminoácidos en la posición 24 y a continuación de ésta formaban un péptido de maduración.

Ejemplo 6 Construcción del plásmido pYT102 para expresar fragmentos parciales del polipéptido que suprime el envejecimiento murino en Escherichia coli

Se realizó la expresión de fragmentos parciales del polipéptido que suprime el envejecimiento murino en Escherichia coli insertando un fragmento de ADNc que contenía el ADNc que codifica un fragmento de polipéptido que suprime el envejecimiento murino en el vector de expresión pSupex para Escherichia coli, como se presenta a continuación, para preparar pYT102, e introducir pYT102 en Escherichia coli.

Se preparó pSupex mediante el siguiente procedimiento de 5 etapas combinando pGHA2 (solicitud de patente japonesa publicada no examinada nº 221091/1985), pTerm2 (solicitud de patente japonesa publicada no examinada nº 22979/1991) y pGKAA2 (solicitud de patente japonesa publicada no examinada nº 221091/1985) descrita anteriormente, como se muestra en la Fig. 13.

Procedimiento 1

Construcción del plásmido pTerm4

Después de añadir 3 \mug de plásmido pGHA2 en 30 \mul de un tampón que contiene Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), cloruro de magnesio 10 mM, cloruro sódico 50 mM y DTT 1 mM (denominado en adelante "tampón Tris A"), se añadieron 10 unidades de HindIII al tampón, para la reacción a 37ºC durante 4 horas.

Se realizó la extracción en fenol-cloroformo y precipitación en etanol utilizando una solución de reacción para recuperar los fragmentos de ADN. Después de añadir el ADN a 30 \mul de un tampón que contiene Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), cloruro de magnesio 10 mM, cloruro sódico 100 mM y DTT 1 mM (denominado en adelante "tampón Tris B"), se añadieron 10 unidades de PstI al tampón, para la reacción a 37ºC durante 4 horas.

Los fragmentos de ADN tratados en la solución de reacción se fraccionaron utilizando electroforesis en gel de agarosa para recuperar aproximadamente 0,3 \mug de un fragmento de pGHA2 tratado con PstI/HindIII de 0,94 kb que contenía el activador letI.

A 30 \mul de tampón Tris A, se le añadieron 3 \mug del plásmido pTerm2 y 10 unidades de HindIII al tampón para reaccionar a 37ºC durante 4 horas.

Se recuperaron a continuación los fragmentos de ADN por precipitación en etanol de la solución de reacción. El ADN se añadió a 30 \mul de tampón Tris B, y se añadieron 10 unidades de PstI al tampón para reaccionar a 37ºC durante 4 horas.

Los fragmentos de ADN tratados en la solución de reacción se fraccionaron utilizando electroforesis en gel de agarosa para recuperar un fragmento de 1,1 kb tratado con PstI/HindIII de pTerm con un rendimiento de aproximadamente 0,8 \mug, el fragmento que contenía el origen de la replicación y un codón de terminación de la traducción.

El fragmento tratado con PstI/HindIII (100 ng) del pGHA2 y el fragmento tratado con PstI/HindIII (50 ng) del pTerm2 se disolvieron en 20 \mul de un tampón de T4 ADN ligasa, se añadieron a la solución 100 unidades de T4 ADN ligasa (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.) y se realizó una ligadura a 16ºC durante 18 horas.

El JM109 de Escherichia coli se transformó utilizando el plásmido recombinante obtenido mediante la reacción para obtener el plásmido pTerm4 mostrado en la Fig. 13.

Procedimiento 2

Construcción del plásmido pGBZ2

A 30 \mul de un tampón que contenía Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), cloruro de magnesio 70 mM, cloruro de potasio 150 mM, albúmina de suero bovino al 0,01% y 2-mercaptoetanol 7 mM (en adelante abreviado como tampón Tris C), se añadieron 3 \mug de pGKA2 y 10 unidades de NruI se añadieron al tampón para reaccionar a 37ºC durante 4 horas.

Se realizó la extracción en fenol-etanol y precipitación en etanol utilizando la solución de reacción para recuperar los fragmentos tratados con NruI de pGKA2.

Se sintetizó el enlazador BglII (5'-pCAGATCTG-3'), y 50 ng de enlazador y los fragmentos tratados con NruI del pGKA2 se disolvieron en 20 \mul de un tampón de T4 ADN ligasa, 100 unidades de T4 ADN ligasa se añadieron a la solución y se realizó una ligadura a 16ºC durante 18 horas.

El JM109 de Escherichia coli se transformó utilizando el ADN recombinante obtenido de este modo mediante la reacción para obtener el plásmido pGBZ2 mostrado en la Fig. 13.

Procedimiento 3

Construcción del plásmido pTerm5

A 30 \mul de tampón Tris-B, se le añadieron 3 \mug del plásmido pTerm4 y se añadieron 10 unidades de PstI y 10 unidades de BglII al tampón para reaccionar a 37ºC durante 4 horas.

Los fragmentos de ADN tratados en la solución de reacción se fraccionaron utilizando electroforesis en gel de agarosa para recuperar un fragmento de 1,15 kb tratado con PstI/BglII del pTerm4 con un rendimiento de aproximadamente 0,8 \mug, el fragmento que contiene el activador letI y un codón de terminación de la traducción.

A 30 \mul de tampón Tris-B, se le añadieron 3 \mug del plásmido pGBZ2, se añadieron 10 unidades de PstI y 10 unidades de BglII al tampón para reaccionar a 37ºC durante 4 horas.

Los fragmentos de ADN tratados en la solución de reacción se fraccionaron utilizando electroforesis en gel de agarosa para recuperar un fragmento de 2,63 kb tratado con PstI/BglII del pGBZ2 con un rendimiento de aproximadamente 0,3 \mug, el fragmento que contiene el origen de la replicación, un gen resistente a la ampicilina y un gen rop.

En 20 \mul de un tampón T4 ADN ligasa, se disolvieron 100 ng del fragmento de pTerm tratado con PstI/BglII y 50 ng del fragmento tratado con PstI/BglII, se añadieron 100 unidades de T4 ADN ligasa a la solución y se realizó una ligadura a 16ºC durante 18 horas.

El JM109 de Escherichia coli se transformó utilizando el ADN recombinante obtenido mediante la reacción para obtener el plásmido pTerm5 mostrado en la Fig. 13.

Procedimiento 4

Construcción del plásmido pTerm6

A 30 \mul de tampón Tris C, se le añadieron 3 \mug del plásmido pTerm5 y se añadieron 10 unidades de PstI y 10 unidades de NruI para reaccionar a 37ºC durante 4 horas.

Se realizó la extracción en fenol/cloroformo y precipitación en etanol utilizando la solución de reacción para recuperar los fragmentos de ADN. El ADN se añadió a 30 \mul de tampón Tris A, y se añadieron 10 unidades de ClaI al tampón para reaccionar a 37ºC durante 4 horas.

Los fragmentos de ADN tratados en la solución de reacción se fraccionaron utilizando electroforesis en gel de agarosa para recuperar un fragmento de pTerm5 de aproximadamente 0,3 \mug tratado con Nru/ClaI de aproximadamente 3,7 kb con un rendimiento de aproximadamente 3 \mug, el fragmento que contiene el origen de la replicación, un gen resistente a la ampicilina, el activador letI y el gen rop.

Los ADN sintéticos que tienen las secuencias nucleotídicas representados por la SEC. ID. nº:21 y nº:22 se disolvieron en 1 \mug de cada uno en 10 \mug de agua destilada y se calentó a 95ºC durante 5 minutos, y la solución resultante se enfrió durante 30 minutos a temperatura ambiente para hibridación (denominado en adelante "ADN-1 sintético").

En 20 \mul de un tampón T4 ADN ligasa, se disolvieron 50 ng del fragmento de pTerm5 tratado con NruI/ClaII y se disolvieron 50 ng de ADN-1 sintético, se añadieron 100 unidades de T4 ADN ligasa y se realizó una ligadura a 16ºC durante 18 horas.

El JM109 de Escherichia coli se transformó utilizando el ADN plásmido recombinante obtenido mediante la reacción para obtener el plásmido pTerm6 mostrado en la Fig. 13.

Procedimiento 5

Construcción del plásmido pSupex

A 30 \mug de tampón que contenía fosfato potásico 50 mM, 3 \mug de plásmido pTerm6, Tris-ácido acético 20 mM (pH 7,9), acetato de magnesio 10 mM y DTT 1 mM, y 10 unidades de NslI se añadieron al tampón para reaccionar a 37ºC durante 4 horas.

Se realizó la extracción en fenol/cloroformo y precipitación en etanol utilizando la solución de reacción para recuperar los fragmentos de ADN. El ADN se añadió a 30 \mul de tampón Tris A, y se añadieron 10 unidades de HindIII al tampón para reaccionar a 37ºC durante 4 horas.

Los fragmentos de ADN tratados en la solución de reacción se fraccionaron utilizando electroforesis en gel de agarosa para recuperar un fragmento de pTerm6 de aproximadamente 0,3 \mug tratado con NslI/HindIII de aproximadamente 3,7 kb con un rendimiento de aproximadamente 3 \mug, el fragmento que contiene el origen de la replicación, un gen resistente a la ampicilina, el activador letI y el gen rop.

Los ADN sintéticos que tienen las secuencias nucleotídicas representados por la SEC. ID. nº:23 y nº:24 se disolvieron en 1 \mug de cada uno en 10 \mug de agua destilada y se calentó a 95ºC durante 5 minutos, y la solución resultante se enfrió durante 30 minutos a temperatura ambiente para hibridación (denominado en adelante "ADN-2 sintético").

\newpage

En 20 \mul de un tampón T4 ADN ligasa, se disolvieron 50 ng del fragmento de pTerm6 tratado con NslI/HindIII y se disolvieron 50 ng de ADN-2 sintético, se añadieron 100 unidades de T4 ADN ligasa a esto y se realizó una ligadura a 16ºC durante 18 horas.

El JM109 de Escherichia coli se transformó utilizando el ADN plásmido recombinante obtenido mediante la reacción para obtener el plásmido pSupex mostrado en la Fig. 13.

Procedimiento 6

Construcción del plásmido pYT102

A 30 \mug de tampón que contenía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), cloruro de magnesio 10 mM, cloruro sódico 100 mM y DTT 1 mM, se añadieron 3 \mug del plásmido pNKM101 obtenido en el Ejemplo 3 y se añadieron 10 unidades de Eco47III al tampón para reaccionar a 37ºC durante 4 horas.

Se realizó la extracción en fenol-cloroformo y precipitación en etanol utilizando la solución de reacción para recuperar los fragmentos de ADN. El ADN se añadió a 30 \mul de un tampón que contenía Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), cloruro de magnesio 10 mM y DTT 1 mM, y se añadieron 10 unidades de KpnI al tampón para reaccionar a 37ºC durante 4 horas.

Los fragmentos de ADN tratados en la solución de reacción se fraccionaron utilizando electroforesis en gel de agarosa para recuperar un fragmento de 0,7 kb tratado con Eco47III/KpnI (Fig. 14) de pNKM101 con un rendimiento de aproximadamente 0,3 \mug, el fragmento que contenía el ADN que codifica un fragmento que contenía los restos de aminoácidos desde Ala^{35} hasta Tyr^{267} del polipéptido que suprime el envejecimiento representado por la SEC. ID. nº:3.

A 30 \mul de tampón Tris A, se le añadieron 3 \mug del vector de expresión pSupex para Escherichia coli obtenido en el Procedimiento 5, y se añadieron 10 unidades de StuI al tampón para reaccionar a 37ºC durante 4 horas.

Se realizaron la extracción en fenol-cloroformo y la precipitación en etanol utilizando la solución de reacción para recuperar los fragmentos de ADN. Se añadió el ADN a 30 \mul de un tampón que contenía Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), cloruro de magnesio 10 mM y DTT 1 mM, y se añadieron 10 unidades de KpnI al tampón para reaccionar a 37ºC durante 4 horas.

Los fragmentos de ADN tratados en la solución de reacción se fraccionaron utilizando electroforesis en gel de agarosa para recuperar 0,3 \mug de un fragmento de 3,8 kb tratado con StuI/KpnI de pSupex.

En 20 \mul de un tampón T4 ADN ligasa, se disolvieron 50 ng del fragmento de pNKM101 tratado con Eco47III/KpnI y se disolvieron 100 ng del fragmento de pSupex tratado con StuI/KpnI, se añadieron 100 unidades de T4 ADN ligasa a esto y se realizó una ligadura a 16ºC durante 18 horas.

El JM109 de Escherichia coli se transformó utilizando el ADN plásmido recombinante obtenido de este modo mediante la reacción para obtener el plásmido pYT102 mostrado en la Fig. 14.

Ejemplo 7 Expresión del polipéptido con el fragmento parcial que suprime el envejecimiento en Escherichia coli

El pYT102 obtenido en el Ejemplo 6 se introdujo en NY49 de Escherichia coli. Se cultivó la Escherichia coli en 400 \mul de un medio mínimo M9 (medio descrito en Molecular Cloning, A Laboratory Manual) enriquecido con 75 \mug/ml de ampicilina y 2 mg/ml de ácido casaminoico a 37ºC durante 2 horas, y se añadieron 50 \mug/ml de ácido indolacrílico a éste, seguido de cultivo a 37ºC durante 18 horas.

Una fracción de 400 ml del cultivo se centrifugó a 3.000 \times g durante 15 minutos, a continuación se puso en suspensión el precipitado que contenía la Escherichia coli en 7 ml de Tampón 1 [tampón que contiene Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM y cloruro sódico 150 mM] y se descompuso la Escherichia coli por tratamiento ultrasónico.

La solución tratada se centrifugó a 10.000 \times g durante 30 minutos, y el precipitado resultante se disolvió en un tampón de muestra para electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida [tampón que contenía Tris-HCl 6 mM (pH 6,8), SDS al 2%, glicerol al 10% y 2-mercaptoetanol al 5%]. La solución se fraccionó por electroforesis en SDS-poliacrilamida, y el gel se tiñó con Coomassie Brilliant Blue. Los resultados se presentan en la Fig. 15. Se confirmó que se produjo el polipéptido con el fragmento parcial que suprime el envejecimiento de un peso molecular de aproximadamente 27 kDa. Durante la electroforesis, se utilizaron fosforilasa b (97.400), albúmina de suero bovino (66.200), ovoalbúmina (45.000), anhidrasa carbónica (31.000), inhibidor de tripsina de soja (21.500) y lisozima (14.400) como marcadores de peso molecular.

Ejemplo 8 Producción del anticuerpo contra el polipéptido que suprime el envejecimiento murino que reacciona con el polipéptido con fragmento parcial que suprime el envejecimiento murino

(1) El polipéptido con fragmento parcial que suprime el envejecimiento murino expresado en Escherichia coli como hospedador en el Ejemplo 7 se fraccionó por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida utilizando un gel de 2 mm de espesor en condiciones reductoras por un método convencional.

Se tiñó el gel con una solución acuosa de Coomassie Brilliant Blue al 0,1%, y se decoloreó en agua, y se cortó una banda de aproximadamente 27 kDa correspondiente al fragmento parcial que suprime el envejecimiento.

Se cultivó y se machacó el gel, el cual se utilizó a continuación para extraer y recuperar el fragmento parcial del polipéptido que suprime el envejecimiento a 4ºC durante la noche utilizando SDS-PBS al 0,1%. Se determinó la concentración de proteínas por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida utilizando BSA como patrón para analizar la concentración de proteínas.

(2) Se inmunizó una rata utilizando el polipéptido del fragmento parcial que suprime el envejecimiento obtenido en (1) por un método convencional.

Es decir, el polipéptido del fragmento parcial que suprime el envejecimiento con la adición de adyuvante (2 mg de hidróxido de aluminio y vacuna tosferinoide a 1\times10^{9} células/animal) para una primera dosis se administró por vía intraperitoneal a una concentración de 50 \mug/animal en una rata, y las semanas 2 y 3 desde la primera dosificación, solamente se administró por vía intraperitoneal el polipéptido con fragmento parcial que suprime el envejecimiento.

Tres días después de la inmunización final, se extrajo sangre localmente para analizar el título de anticuerpo en la sangre por ELISA descrito a continuación.

ELISA

El polipéptido con fragmento parcial que suprime el envejecimiento descrito anteriormente se preparó a una concentración de 10 \mug/ml en tampón PBS [tampón preparado disolviendo fosfato monobásico disódico (1,83 g), fosfato dibásico de potasio (0,21 g) y cloruro sódico (7,65 g) en agua destilada hasta un volumen final de un litro (pH 7,2)]. Se dividió la solución preparada en 50 \mul/pocillo en una placa EIA de 96 pocillos (fabricada por Gleiner Co.), y se dejó reposar a 4ºC durante la noche.

Después de lavar la placa en tampón PBS, un tampón PBS que contenía BSA al 1% (denominado en adelante "BSA-PBS") se dividió en 100 a 200 \mul/pocillo y la placa se dejó reposar a temperatura ambiente durante una a dos horas o a 4ºC durante una a dos noches. Después de dejar la placa reposar, se descartó el BSA-PBS y la placa resultante se lavó intensamente con tampón PBS.

El antisuero extraido se diluyó en BSA-PBS, que se añadió a continuación a 20 a 100 \mul/pocillo en la placa, y se dejó reposar la placa a temperatura ambiente durante 2 horas.

Después de dejar reposar la placa, se lavó la placa con un tampón PBS que contenía Tween 20 al 0,05% (denominado en adelante "PBS-Tween 0,05") y a continuación la inmunoglobulina antirrata marcada con peroxidasa o la inmunoglobulina antimurina marcada con peroxidasa (preparadas por DAKO CO.) se añadió a 50 a 100 \mul/pocillo en la placa, y se dejó reposar la placa a temperatura ambiente durante una hora.

Después de dejar la placa reposar sola, la placa se lavó con PBS-Tween 0,05, y a continuación, una solución de sustrato ABTS [solución preparada disolviendo 2,2-azinobis (ácido 3-etilbenzotiazol-6-sulfónico) amónico (550 mg) en un litro de tampón citrato 0,1 M (pH 4,2) y añadiendo 1 \mul/ml de peróxido de hidrógeno a la solución resultante justo antes de su utilización] se añadió a la placa para la reacción cromógena para determinar la absorbancia a D.O._{415} nm
(NJ2001; Nipón Intermed Co.).

(3) Por transferencia Western, se confirmó que el suero reaccionaba con el polipéptido con fragmento parcial que suprime el envejecimiento murino anterior.

Según el método descrito en el Ejemplo 7, la proteína bacteriana de Escherichia coli, en la que se confirmó la expresión del fragmento del polipéptido con fragmento parcial que suprime el envejecimiento, se fraccionó por electroforesis en gel de poliacrilamida.

La proteína fraccionada sobre el gel se transfirió a una membrana de transferencia (Immobilon Transfer Membranes, fabricada por Millipore Co.). La transferencia se continuó en condiciones de corriente continua de 2 mA/cm^{2} durante 2 horas utilizando una membrana de transferencia sumergida en metanol al 100% durante 20 segundos y a continuación se sumergió en una solución que contenía CAPS (ácido 3-ciclohexilaminopropano sulfónico), 10 mM, metanol al 10% y SDS al 0,03% (pH 11,0) durante 30 minutos.

La membrana de transferencia se agitó en 200 ml de BSA-PBS durante una hora, y a continuación se lavó una vez con un tampón PBS.

Se extrajo de una rata la membrana de transferencia y suero (2 ml), el cual se diluyó al principio 1/25.000 veces en un tampón PBS, se colocaron en una bolsa de vinilo y la bolsa se selló a continuación y se agitó suavemente a 4ºC durante la noche.

La membrana de transferencia se sumergió dos veces en PBS-Tween 0,05 durante 5 minutos, seguido de lavado, y a continuación la membrana resultante se sumergió en un tampón PBS durante 5 minutos y a continuación se lavó.

La membrana de transferencia y 3 ml de un anticuerpo IgG antirrata marcado con 0,5 mg/ml de peroxidasa (inmunoglobulina antirrata, fabricada por Amersham Co.) se colocaron en una bolsa de vinilo, se selló y se agitó a temperatura ambiente durante una hora.

Después de la agitación la membrana de transferencia se sumergió dos veces en PBS-Tween 0,05 durante 5 minutos y la membrana resultante se lavó y se sumergió en tampón PBS durante 5 minutos, seguido de lavado.

Por un método luminiscente (reactivos de detección de transferencia Western ECL, fabricados por Amersham Co.), se detectó la proteína presente en la membrana de transferencia y se observó que presentaba reactividad cruzada con el anticuerpo en el suero de rata.

Los resultados se presentan en la Fig. 16.

Se detectó una banda en la misma posición de la banda de aproximadamente 27 kDa obtenida en el Ejemplo 7, y se indicó que el anticuerpo en el suero de rata extraído en el Ejemplo 8(2) reconocía el fragmento con polipéptido que suprime el envejecimiento murino como el antígeno y el fragmento de polipéptido es utilizable para la transferencia Western.

Anticuerpo en el suero de rata se denomina en adelante "anticuerpo contra el polipéptido que suprime el envejecimiento".

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Ejemplo 9 Preparación del anticuerpo monoclonal contra el polipéptido que suprime el envejecimiento (1) Preparación de la célula productora del anticuerpo

Se extrajeron quirúrgicamente bazos de tres ratas que presentan títulos de anticuerpos de suero suficientes, obtenidos en el Ejemplo 8 (2).

Se cortaron los bazos en piezas en medio MEM (fabricado por Nissui Pharmaceutical Co.), y las piezas se liberaron con un par de pinzas, y se centrifugó a 1.200 rpm durante 5 minutos, y se descartó el sobrenadante resultante.

Los esplenocitos en la fracción de precipitado resultante se trataron con un tampón de Tris-cloruro amónico (pH 7,65) durante 1 a 2 minutos para eliminar los eritrocitos, y las células resultantes se lavaron tres veces con medio MEM. Los esplenocitos resultantes se utilizaron como células productoras de anticuerpos.

(2) Preparación de la célula de mieloma murino

Una estirpe celular P3-U1 de mieloma murino resistente a 8-azaguanina subcultivada en principio en un medio de 8-azaguanina se cultivó en un medio normal para su utilización como células de mieloma para la fusión celular. Durante la fusión celular, se utilizaron 2\times10^{7} células o más.

(3) Preparación del hibridoma

Las células productoras de anticuerpo obtenidas en (1) y las células de mieloma obtenidas en (2) se lavaron a fondo con medio MEM y a continuación se mezclaron, de modo que el número de células debería ser 10:1 como relación de células productoras de anticuerpo: células de mieloma y la mezcla resultante se centrifugó a 1.200 rpm durante 5 minutos para eliminar el sobrenadante.

La población celular en la fracción de precipitado resultante se liberó a fondo, y la población celular, 0,2 a 1 ml de solución mezcla de polietilenglicol-1000 (PEG-1000) 2 g, 2 ml de MEM y sulfóxido de dimetilo (DMSO) (0,7 ml) se añadieron por cada 10^{8} células productoras de anticuerpo, se le añadieron a esto 1 a 2 ml de medio MEM varias veces cada 1 a 2 minutos.

Tras la adición, el medio MEM se continuó añadiendo al cultivo para proporcionar un volumen total final de 50 ml.

La solución preparada se centrifugó a 900 rpm durante 5 minutos para descartar el sobrenadante.

Se liberaron las células en la fracción de precipitado resultante y a continuación se pusieron en suspensión suavemente en 100 ml de medio HAT en aspiración y expulsión utilizando una pipeta graduada.

La suspensión se dividió en 100 \mul/pocillo en una placa de cultivo de 96 pocillos, y a continuación se cultivó en un incubador con CO_{2} al 5% a 37ºC durante 7 a 14 días.

Tras el cultivo, se tomaron muestras de una parte del sobrenadante del cultivo, y aproximadamente 1.000 hibridomas que reaccionan específicamente con el polipéptido con fragmento parcial que suprime el envejecimiento producidas en Escherichia coli se identificaron según el inmunoanálisis enzimático descrito en el Ejemplo 8 (2).

Se realizó la clonación utilizando los hibridomas por dilución limitada, en primer lugar en medio HT y en segundo lugar en medio normal, para obtener el hibridoma KM1902 que produce anticuerpo contra el polipéptido que suprime el envejecimiento.

Se determinó por inmunoanálisis enzimático utilizando un kit de tipado del subtipo de modo que la clase de anticuerpo del anticuerpo monoclonal KM1902 producido por el hibridoma KM1902 fue IgG2a.

(4) Purificación del anticuerpo monoclonal

En un ratón lampiño hembra (Balb/c) tratado con Pristano de 8 semanas, se inyectó por vía intraperitoneal el hibridoma obtenido en (3) a razón de 5 a 20\times10^{6} células/animal y el hibridoma se volvió tumor ascítico en 10 a 20 días.

En el ratón que presenta tumor ascítico, se extrajo la ascitis (1 a 8 ml/animal) y a continuación se centrifugó a 3.000 rpm durante 5 minutos para eliminar los sólidos.

Se purificó el sobrenadante resultante por un método de precipitación en ácido caprílico [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)] y se obtuvo IgG y se utilizó como anticuerpo monoclonal purificado.

Ejemplo 10 Construcción del plásmido pYT103 para expresar el polipéptido que suprime el envejecimiento murino en células de animales

Procedimiento 1

Construcción del vector de expresión pAGE210 para células de animales (Fig. 17)

Se construyeron pAGE207 (solicitud de patente japonesa publicada no examinada nº 46841/1994) y pAGE148 (solicitud de patente japonesa publicada no examinada nº 205694/1994), el vector de expresión pAGE210 para células de animales utilizando los vectores de expresión para células de animales de la forma siguiente.

En 30 \mul de tampón Tris A, se disolvieron 30 \mug de pAGE207 o pAGE148, se le añadieron 10 unidades de cada uno de ClaI y KpnI a la solución para reaccionar a 37ºC durante 4 horas.

Los fragmentos de ADN tratados en la solución de reacción se fraccionaron por electroforesis en gel de agarosa para recuperar un fragmento de aproximadamente 4,7 kb tratado con ClaI/KpnI de pAGE207 con un rendimiento de aproximadamente 0,5 \mug de pAGE207, el fragmento que contiene el activador precoz y el potenciador de SV40 (denominado en adelante "P_{SE}"), el gen resistente a la higromicina y el gen resistente a la ampicilina (denominado en adelante "Ap"), mientras que un fragmento de aproximadamente 4,3 kb tratado con ClaI/KpnI que contenía gen de ácido dehidrofólico reductasa (denominado en adelante "dhfr") se recuperó con un rendimiento de aproximadamente 0,5 \mug en pAGE148.

En 20 \mul de un tampón de T4 ADN ligasa, se disolvieron 50 ng del fragmento tratado con ClaI/KpnI mencionado anteriormente de pAGE207 y 50 ng del fragmento tratado con ClaI/KpnI mencionado anteriormente de pAGE148, se añadieron 200 unidades de T4 ADN ligasa y se realizó la ligadura a 12ºC durante 16 horas.

El JM109 de Escherichia coli se transformó utilizando el ADN recombinante obtenido mediante la reacción para obtener el plásmido pAGE210 mostrado en la Fig. 17.

Procedimiento 2

Ligando el fragmento XbaI de pAGE210 obtenido en el Procedimiento 1 anterior con el fragmento XbaI de pNKM101 descrito en el Ejemplo 6 (Procedimiento 6), el fragmento que contenía el ADN que codifica el polipéptido que suprime el envejecimiento, se construyó el vector de expresión pYT1103 para el polipéptido que suprime el envejecimiento murino de la manera siguiente (Fig. 18).

En 30 \mul de tampón Tris A, se disolvieron 3 \mug de pAGE210, se añadieron 10 unidades de XbaI al tampón para reaccionar a 37ºC durante 4 horas.

Se realizaron la extracción en fenol-cloroformo y la precipitación en etanol utilizando la solución de reacción para recuperar los fragmentos de ADN. Se solubilizó el ADN en 50 \mul de tampón Tris-HCl 1 M (pH 8,0) y se añadió una unidad de fosfatasa alcalina a la solución para reaccionar a 37ºC durante una hora.

La extracción en fenol-cloroformo y la precipitación en etanol se realizó utilizando la solución de reacción para recuperar aproximadamente 0,5 \mug del fragmento desfosforilado por XbaI de pAGE210 de la solución del extracto.

A 30 \mul de tampón Tris A que contenía BSA al 0,01%, se añadieron 3 \mug de pNKM101, se añadieron 10 unidades de XbaI al tampón para reaccionar a 37ºC durante 4 horas.

La solución de reacción se fraccionó por electroforesis en agarosa para recuperar aproximadamente 0,3 \mug de un fragmento de 3,2 kb tratado con XbaI de pNKM101.

En 20 \mul de un tampón de T4 ADN ligasa, se disolvieron 50 ng del fragmento tratado con XbaI mencionado anteriormente de pNKM101 y 300 ng del fragmento desfosforilado con XbaI de pAGE210, se añadió 1 unidad de T4 ADN ligasa a la solución y se realizó una ligadura a 16ºC durante 18 horas.

El JM109 de Escherichia coli se transformó utilizando el ADN plásmido recombinante obtenido mediante la reacción para obtener el plásmido pYT103 mostrado en la Fig. 18.

Ejemplo 11 Expresión del polipéptido que suprime el envejecimiento murino en células de animales

La introducción del plásmido en células de animales se realizó utilizando electroporación según el método de Miyaji et al. [Cytotechnology, 3: 133 (1990)].

El pYT103 obtenido en el Ejemplo 10 (Procedimiento 2) se introdujo en una proporción de 4 \mug por cada 4\times10^{6} células en células CHO eliminando el gen dhfr [Proc. Natl. Acad. Sci., 77: 4216 (1980)] y a continuación se puso en suspensión en 10 ml de MEM\alpha2000-dFCS (5) [medio MEM\alpha2000 (fabricado por GIBCO, CO.) que contenía dFCS al 5%, 7,5% de NaHCO_{3} en un volumen de 1/40, solución de L-glutamina 200 mM (fabricada por GIBCO, CO.) al 3%, y solución de penicilina-estreptomicina (fabricada por GIBCO, CO.; que contenía 5.000 unidades/ml de penicilina y 5.000 \mug/ml de estreptomicina) al 0,5%], y a continuación se colocaron en una placa de 10 cm (fabricada por Iwaki Glass Co.).

Tras 24 horas de cultivo en un incubador con CO_{2} al 5% a 37ºC, se añadió higromicina (fabricada por GIBCO, CO.) al cultivo hasta una concentración final de 0,3 mg/ml, seguido de cultivo durante 1 a 2 semanas.

Cuando el crecimiento del transformante en el cultivo alcanzó el estado confluente, se obtuvieron las células del transformante.

Después de poner en suspensión las células en medio MEM\alpha2000-dFCS (5) que contenía 0,3 mg/ml de higromicina y metotrexato 50 nM, (denominado en adelante "MTX") a una concentración final de 1 a 2\times10^{5} células/ml y dividiendo a continuación 2 ml de éste en un matraz F75 (fabricado por Gliner Co.), se cultivaron las células en un incubador con CO_{2} a 37ºC durante 1 a 2 semanas para producir el clon resistente a MTX 50 nM.

El clon se puso en suspensión en medio MEM\alpha2000-dFCS (5) que contenía 0,3 mg/ml de higromicina y MTX 100 nM a razón de 1 a 2\times10^{5} células/ml, de la suspensión resultante se dividió en un matraz F75, seguido de cultivo en un incubador con CO_{2} a 37ºC durante 1 a 2 semanas para producir el clon resistente a MTX 100 nM.

El clon se puso en suspensión en medio MEM\alpha2000-dFCS (5) que contenía 0,3 mg/ml de higromicina y MTX 500 nM a razón de 1 a 2\times10^{5} células/ml, y 2 ml de la suspensión resultante se dividieron en un matraz F75, seguido de cultivo en un incubador con CO_{2} a 37ºC durante 1 a 2 semanas para producir el clon resistente a MTX 500 nM.

El clon resistente a MTX 500 nM se puso en suspensión en medio MEM\alpha2000-dFCS (5) que contenía MTX 500 nM a razón de 1 a 2\times10^{5} células/ml, y 15 ml de la suspensión resultante se dividieron en un matraz F75, seguido de cultivo en un incubador con CO_{2} a 37ºC durante durante 5 a 7 días, hasta que el clon resistente alcanzó 80 a 100% de confluencia, y a continuación el medio se cambió a 15 ml de medio exento de suero para células CHO, es decir medio CHO-S-SFMII (fabricado por GIBCO, CO.), para continuar el cultivo durante 3 días.

Las células obtenidas por cultivo se trataron con tripsina y EDTA y las células resultantes se pusieron en suspensión en 10 ml de medio MEM\alpha2000.

La suspensión se centrifugó a 1.500 \times g durante 5 minutos para recoger las células.

Después de añadir 7 ml de tampón PBS en las células para lavar las células, se centrifugaron las células a 1.500 \times g durante 5 minutos para recoger las células.

Las células se pueden almacenar a -20ºC y descongelar para su utilización, si se necesitan.

Se realizó la transferencia Western utilizando la proteína completa de las células (1\times10^{5} por banda) por un método similar al del Ejemplo 8(3).

Los resultados se presentan en la Fig. 19. Se confirmó una banda que se cruza con el anticuerpo contra el polipéptido que suprime el envejecimiento, y se indicó que el polipéptido que suprime el envejecimiento se expresaba predominantemente utilizando células de animales.

Además, se determinó la secuencia de aminoácidos N-terminal del polipéptido murino que suprime el envejecimiento unido a la membrana por un método convencional.

Más específicamente, en las células CHO (CHO dhfr-/pYT103) que expresaron el polipéptido que suprime el envejecimiento y que se cultivaron hasta confluencia a un volumen de 20 placas Petri de un diámetro de 10 cm, como se describe en el Ejemplo 10, se purificó un polipéptido que suprime el envejecimiento de aproximadamente 140 kDa según la inmunoprecipitación descrita en el Ejemplo 25 a continuación, y se analizó la secuencia de 9 restos de aminoácidos en el terminal N del polipéptido utilizando un secuenciador de proteínas en fase gas (PPSQ-10, fabricado por Shimadzu Corporation) según el método recomendado por el fabricante.

Como resultado del análisis, la secuencia coincidió con la secuencia de 9 restos de aminoácidos partiendo del resto 36º del terminal N de la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº:3.

Ejemplo 12 Preparación del virus recombinante para expresar el polipéptido que suprime el envejecimiento en célula de insecto

Para producir proteínas en células de insecto, debe prepararse necesariamente un virus recombinante que incorpora un gen objetivo, y la preparación requiere (Procedimiento 1) un procedimiento de incorporación del ADN que codifica la proteína objetivo en un plásmido específico y (Procedimiento 2) un procedimiento de cotransfección de un virus natural y un vector de transferencia en células de insecto para obtener un virus recombinante por recombinación homóloga.

Para realizar los procesos, se llevaron a cabo los siguientes procedimientos según el manual del kit BaculoGold Starter fabricado por Pharmingen Co. (Producto nº PM-21001K).

Procedimiento 1

Preparación del vector de transferencia (Fig. 20)

A 30 \mul de tampón Tris B al que se había añadido albúmina de suero bovino al 0,01% y Triton X-100 al 0,01% (en adelante denominado "tampón Tris D"), se añadieron 3 \mug de pNKM101, se añadieron 10 unidades de NotI al tampón para reaccionar a 37ºC durante 4 horas.

Se realizó la extracción en fenol-cloroformo y precipitación en etanol utilizando la solución de reacción para recuperar los fragmentos de ADN. En el ADN se añadieron 30 \mul de un tampón que contenía Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), cloruro de magnesio 10 mM, albúmina de suero bovino al 0,01% y DTT 1 mM (denominado en adelante "tampón Tris E"), y 10 unidades de XbaI se añadieron al tampón para reaccionar a 37ºC durante 4 horas.

Los fragmentos de ADN tratados en la solución de reacción se fraccionaron utilizando electroforesis en gel de agarosa para recuperar aproximadamente 0,3 \mug de un fragmento de pNKM101 tratado con NotI-XbaI de aproximadamente 3,2 kb que contenía el ADN que codifica el fragmento del polipéptido que suprime el envejecimiento
murino.

Al tampón Tris D, se añadieron 3 \mug del plásmido pVL392 que contenía el kit BaculoGold Starter fabricado por Pharmingen Co. y se añadieron 10 unidades de NotI para reaccionar a 37ºC durante 4 horas.

Se realizaron la extracción en fenol-cloroformo y precipitación en etanol utilizando la solución de reacción para recuperar el ADN. Al ADN se añadieron 30 \mul de tampón Tris E, y 10 unidades de XbaI se añadieron al tampón para reaccionar a 37ºC durante 4 horas.

Los fragmentos de ADN tratados en la solución de reacción se fraccionaron utilizando electroforesis en gel de agarosa para recuperar aproximadamente 0,9 \mug de un fragmento de pVL1392 tratado con NotI-XbaI de aproximadamente 9,6 kb.

\newpage

En 20 \mul de un tampón de T4 ADN ligasa, se disolvieron 200 ng del fragmento tratado con NotI-XbaI del pVL1392 y 50 ng del fragmento tratado con NotI-XbaI del pNKM101, se añadió una unidad de T4 ADN ligasa a ésta, se realizó una ligadura a 16ºC durante 18 horas.

Se transformó JM109 de Escherichia coli utilizando el ADN plásmido recombinante obtenido mediante la reacción para obtener el plásmido pAS104 (Fig. 20).

Procedimiento 2

Preparación del virus recombinante

Introduciendo el ADN de baculovirus lineal [BaculoGold baculovirus DNA, fabricado por Pharmingen Co.] y el plásmido pAS104 en células Sf9 de insecto (preparadas por Pharmingen Co.) cultivadas utilizando medio de insecto TMN-FH (preparado por Pharmingen Co.) [Protein, Nucleic Acids and Enzymes, 37: 2701 (1992)], se preparó un baculovirus recombinante por el método siguiente.

En 12 \mul de agua destilada, se disolvieron 1 \mug de pAS104 y 20 ng de ADN de baculovirus lineal, se añadió a esto una mezcla íntima de 6 \mul de lipofectina y 6 \mul de agua destilada, y a continuación la mezcla resultante se dejó reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos.

En 2 ml de medio Sf900-II (fabricado por GIBCO, CO.), se pusieron en suspensión 1\times10^{6} células de Sf9, y la suspensión resultante se colocó en una placa Petri de plástico de un diámetro de 35 mm de cultivo celular, el volumen total de una solución de mezcla íntima del ADN plásmido, ADN de baculovirus lineal y lipofectina se añadieron, seguido de cultivo a 27ºC durante 3 días.

A partir del cultivo, se recogió 1 ml del sobrenadante de cultivo que contenía el virus recombinante. En la placa Petri de la que se recuperó el sobrenadante del cultivo se añadió medio Sf900-II reciente, seguido de cultivo a 27ºC durante 3 días, y de la misma manera, se obtuvo además en 1,5 ml el sobrenadante del cultivo que contenía el virus recombinante.

Ejemplo 13 Expresión del polipéptido que suprime el envejecimiento murino en células de insecto

Procedimiento 1

Proliferación de virus recombinante

En 10 ml de medio Sf900-II, se pusieron en suspensión 2\times10^{7} células de células Sf9, y la suspensión resultante se colocó en un matraz de 175 cm^{2} (fabricado por Gliner Co.) y se dejó reposar a temperatura ambiente durante una hora para unir las células en el matraz.

Después de dejar reposar las células, se eliminó el sobrenadante y se añadió al matraz 15 ml de medio de insecto TMN-FH y 1 ml del sobrenadante del cultivo que contiene el virus recombinante obtenido en el Ejemplo 12, seguido de cultivo a 27ºC durante 3 días.

Tras el cultivo, se centrifugó el sobrenadante a 1.500 \times g durante 10 minutos para obtener una solución de virus recombinante en el que se habían eliminado las células Sf9. Se calculó el título del virus del virus recombinante siguiendo el método [manual del kit BaculoGold Starter fabricado por Pharmingen Co.].

Se pusieron en suspensión 6\times10^{6} células Sf9 en 4 ml de medio Sf900-II, y la suspensión se colocó en una placa de Petri de plástico de un diámetro de 60 mm para cultivo celular, y a continuación se dejó en reposo a temperatura ambiente durante una hora para unir las células en la placa de Petri.

Después de dejar reposar la solución, se eliminó el sobrenadante, y a continuación se añadieron 400 \mul del medio Sf900-II y la solución de virus recombinante tras dilución por 10.000 veces con medio Sf900-II a la placa, y a continuación se dejó reposar a temperatura ambiente durante una hora.

Después de dejar reposar la solución, se eliminó el medio de la placa, 5 ml de un medio [preparado mezclando íntimamente 1 ml de una placa de Agar-agar al 5% acuoso más solución de agarosa y 4 ml de medio de insecto TMN-FH y manteniendo la solución resultante a 42ºC] que contiene agarosa de bajo punto de fusión al 1% [Agarplaque Agarose, fabricado por Pharmingen Co.] se vertió en la placa de Petri, y a continuación se dejó reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos.

Después de dejar reposar la placa de Petri, se envolvió cinta de vinilo alrededor de la placa de Petri, se colocó la placa de Petri en un recipiente de plástico que pudo sellarse, seguido de cultivo del virus recombinante en ésta a 27ºC durante 6 días.

Después de añadir 1 ml de tampón PBS que contenía Rojo Neutro al 0,01% en la placa de Petri, seguido de cultivo adicional durante un día, se hizo el recuento del número de placas desarrolladas.

Se indicó a partir de los procedimientos anteriores que la solución de virus recombinante contenía el virus a razón de aproximadamente 1\times10^{8} unidades formadoras de placa (PFU/ml de virus).

Procedimiento 2

Expresión del polipéptido que suprime el envejecimiento en células de insecto

Según el manual adjunto al kit BaculoGold Starter fabricado por Pharmingen Co., se expresó el polipéptido que suprime el envejecimiento murino por los siguientes procedimientos.

Se pusieron en suspensión 6\times10^{6} células de células Sf9en 45 ml de medio de insecto de Grace, preparado por GIBCO, CO., que contenía FCS al 10% en un matraz de 225 cm^{2} (fabricado por Gliner Co.), seguido de cultivo a 27ºC durante 3 a 4 días.

Tras el cultivo, se eliminó el sobrenadante del cultivo, y se añadieron recientes en el matraz 30 ml de medio de insecto de Grace que contiene FCS al 10% y 1 ml de una solución que contiene el virus recombinante del pAS104 a una concentración de aproximadamente 1\times10^{6} PFU/ml, seguido de cultivo a 27ºC durante un día.

Tras el cultivo, se eliminó el sobrenadante y se añadieron 45 ml de medio Sf900-II reciente al matraz, seguido de cultivo durante 2 a 3 días.

Tras el cultivo, se eliminó el sobrenadante después de la centrifugación a 1.500 \times g durante 5 minutos, y se despegaron las células resultantes con tratamiento con tripsina-EDTA.

La fracción celular resultante se puso en suspensión en 10 ml de medio Sf900-II y se centrifugó a 1.500 \times g durante 5 minutos para recoger las células.

A la fracción celular, se añadieron 7 ml de un tampón PBS para lavado, y se centrifugó a 1.500 \times g durante 5 minutos para recoger las células.

Se almacenaron las células a -20ºC y se utilizaron las células tras descongelación, si fuera necesario.

Procedimiento 3

Verificación de la expresión

Mediante un método similar al del Ejemplo 7, se realizó la SDS-PAGE utilizando la proteína total de las células obtenidas en el Procedimiento 2 anterior (1\times10^{5} células por banda).

En la Fig. 21 se presentan los resultados. Se confirmó una banda específica de aproximadamente 120 kDa.

Asimismo, mediante un método similar al del Ejemplo 8(3), se realizó la transferencia Western utilizando la proteína total de las células obtenidas en el Procedimiento 2 anterior (1\times10^{5} células por banda).

En la Fig. 22 se presentan los resultados. Por transferencia Western, se confirmó una banda específica que presenta reactividad cruzada con el anticuerpo contra el polipéptido que suprime el envejecimiento en la misma posición que por SDP-PAGE.

De este modo se indicó que puede expresarse un nivel notable de polipéptido que suprime el envejecimiento que presenta reactividad cruzada con el anticuerpo contra el polipéptido que suprime el envejecimiento utilizando la célula de insecto.

Además, a partir de células de insecto, se obtuvo el polipéptido que suprime el envejecimiento según el método del Ejemplo 8(1).

Ejemplo 14 Construcción del plásmido pYS110 para expresar el polipéptido que suprime el envejecimiento humano unido a la membrana en células de animales

Ligando el fragmento BamHI-(KpnI con extremos truncados) de pAGE210 obtenido en el Ejemplo 10 (Procedimiento 1) y el fragmento BamHI-HpaI de pNKM103 descrito en el Ejemplo 5, fragmento que contiene ADN que codifica el polipéptido que suprime el envejecimiento humano unido a la membrana, se construyó el vector pYS110 que expresa el polipéptido que suprime el envejecimiento humano unido a la membrana de la manera siguiente
(Fig. 23).

A 30 \mug de tampón que contenía Tris-HCl (pH 7,5), cloruro de magnesio 10 mM y DTT 1 mM, se añadieron 5 \mug del plásmido pAGE210 y se añadieron 20 unidades de KpnI al tampón para reaccionar a 37ºC durante 4 horas.

Se realizaron la extracción en fenol-cloroformo y precipitación en etanol utilizando la solución de reacción para recuperar aproximadamente 3 \mug de los fragmentos de ADN. Después de someter el ADN a tratamiento del extremo truncado utilizando un kit de truncamiento de ADN (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.), se realizaron la extracción en fenol-cloroformo y precipitación en etanol y a continuación se disolvió el precipitado en 50 \mul de un tampón que contenía Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), cloruro de magnesio 10 mM y DTT 1 mM y cloruro potásico 100 mM, y se añadieron 20 unidades de BamHI al tampón para reaccionar a 37ºC durante 4 horas.

La solución de reacción se fraccionó por electroforesis en gel de agarosa para cortar un fragmento de BamHI-(KpnI con extremos truncados) de 9,0 kb procedente del gel, y el fragmento se purificó por un método del polvo de vidrio [Gene Clean II, fabricado por Bio101 Co.] para recuperar aproximadamente 1 \mug.

A 50 \mul de un tampón que contenía Tris-HCl 20 mM (pH 8,5), cloruro de magnesio 10 mM, DTT 1 mM y cloruro de potasio 100 mM, se añadieron 10 \mug de pNKM103 y 30 unidades de BamHI y se añadieron 30 unidades de HpaI al tampón para reaccionar a 37ºC durante 2 horas.

Se fraccionó la solución de reacción por electroforesis en gel de agarosa para recuperar aproximadamente 0,5 \mug de un fragmento de BamHI-HpaI de 3,2 kb.

En 20 \mul de un tampón de T4 ADN ligasa, se disolvieron 100 ng del fragmento BamHI-HpaI del pNKM103 y 100 ng del fragmento BamHI-(KpnI con extremos truncados) del pAGE210, se añadió 1 unidad de T4 ADN ligasa, y se realizó una ligadura a 16ºC durante 18 horas.

Se transformó JM109 de Escherichia coli utilizando el ADN plásmido recombinante obtenido por la reacción para obtener el plásmido pYS110 mostrado en la Fig. 23.

Ejemplo 15 Expresión del polipéptido que suprime el envejecimiento humano unido a la membrana en células animales

Se realizó la introducción del plásmido en células animales utilizando electroporación según el método de Miyaji et al. [Cytotechnology, 3: 133 (1990)].

El pYS110 obtenido en el Ejemplo 14 se introdujo a una proporción de 4 \mug por cada 4\times10^{6} células en células CHO eliminando el gen dhfr [Proc. Natl. Acad. Sci., 77: 4216 (1980)], y a continuación se puso en suspensión en 10 ml de MEM\alpha2000-dFCS (5) [medio MEM\alpha2000 (fabricado por GIBCO, CO.) que contenía dFCS al 5%, NaHCO_{3} al 7,5% en un volumen de 1/40, solución de L-glutamina 200 mM (fabricado por GIBCO, CO.) al 3%, y solución de penicilina-estreptomicina (fabricada por GIBCO, CO.; que contiene 5.000 unidades/ml de penicilina y 5.000 \mug/ml de estreptomicina) al 0,5%] y se colocó en una placa de 10 cm (fabricada por Iwaki Glass Co.). Se realizaron los siguientes procedimientos por un método similar al del Ejemplo 11 para producir clon resistente a MTX 500 nM.

Después de poner en suspensión el clon resultante a MTX 500 nM en un medio MEM\alpha2000-dFCS (5) que contiene MTX de 500 nM a 1\times10^{5} a 2\times10^{5} células/ml y dividiendo a continuación 15 ml de la suspensión en un matraz F75, y cultivando el clon en un incubador de CO_{2} a 37ºC durante 5 a 7 días hasta que el clon resistente alcanzó 80 a 100% de confluencia, se terminó el cultivo para eliminar el cultivo y recuperar las células mediante tratamiento con tripsina-EDTA.

Las células resultantes se pusieron en suspensión en 10 ml de medio MEM\alpha2000, y la suspensión resultante se centrifugó a 1.500 \times g durante 5 minutos para recoger las células.

A las células, se añadieron 7 ml de tampón PBS para lavado, y se centrifugó la mezcla a 1.500 \times g durante 5 minutos para recoger las células.

Las células pueden almacenarse a -20ºC y pueden utilizarse después de descongelación si es necesario.

Mediante un método similar al del Ejemplo 8(3), se realizó la transferencia Western utilizando la proteína completa de las células (1\times10^{5} células por banda). En la presente memoria, el anticuerpo monoclonal KM1902 descrito en el Ejemplo 9 se utilizó como anticuerpo primario.

Los resultados se presentan en la Fig. 24. Se confirmó una banda que presenta reactividad cruzada con el anticuerpo contra el polipéptido que suprime el envejecimiento, y se indicó que el polipéptido secretor humano que suprime el envejecimiento estaba expresado a un nivel notable utilizando las células de animales.

Además, se determinó la secuencia de aminoácidos N-terminal del polipéptido que suprime el envejecimiento humano unido a la membrana por un método convencional en el campo de la química de proteínas.

Es decir, un polipéptido que suprime el envejecimiento humano unido a la membrana que tiene aproximadamente 140 kDa que se purificó según la inmunoprecipitación de células CHO (CHO dhfr^{-}/pYS110) cultivado hasta confluencia en un volumen de 20 placas Petri de diámetro 10 cm, como se describe en el Ejemplo 14, que expresó el polipéptido que suprime el envejecimiento humano unido a la membrana, se sometió a continuación a SDS-PAGE en condiciones de reducción con 2-mercaptoetanol para transferir el producto reducido de manera eléctrica en una membrana de PVDF (ProBlott, PERKIN ELMER Co.) según el método de P. Matsudaira et al. [J. B. C., 262: 10035 (1987)].

La membrana transferida se tiñó con azul Coomassie, y se cortó una banda de aproximadamente 140 kDa que resultó positiva por transferencia Western descrita en el presente ejemplo. El análisis de la secuencia de 10 restos de aminoácidos N-terminales se determinó utilizando un secuenciador de proteínas en fase gas (PPSQ-10, fabricado por Shimadzu) según el método recomendado por el fabricante.

Como resultado del análisis, la secuencia fue idéntica a la secuencia de 10 restos de aminoácidos partiendo del resto 34º del terminal N de la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº:1.

Además, se obtuvo el polipéptido que suprime el envejecimiento humano unido a la membrana de células animales por el método del Ejemplo 8(1).

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Ejemplo 16 Preparación del plásmido pYS111 para expresar el polipéptido secretor que suprime el envejecimiento humano en células de animales

Ligando el fragmento BamHI-(KpnI con extremos truncados) de pAGE210 obtenido en el Ejemplo 10 (Procedimiento 1) y el fragmento de BamHI-HpaI de pNKM106 descrito en el Ejemplo 5, fragmento que contiene ADN que codifica el polipéptido que suprime el envejecimiento humano unido a la membrana, se construyó el vector pYS111 que expresa el polipéptido que suprime el envejecimiento humano unido a la membrana de la manera siguiente
(Fig. 25).

A 30 \mug de tampón que contenía Tris-HCl (pH 7,5), cloruro de magnesio 10 mM y DTT 1 mM, se añadieron 5 \mug del plásmido pAGE210 y se añadieron 20 unidades de KpnI al tampón para reaccionar a 37ºC durante 2 horas.

Se realizaron la extracción en fenol-cloroformo y precipitación en etanol utilizando la solución de reacción para recuperar aproximadamente 3 \mug de un fragmento de ADN.

Después de someter el ADN a tratamiento del extremo truncado utilizando un kit de truncamiento de ADN (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.), se realizaron la extracción en fenol-cloroformo y precipitación en etanol y a continuación se disolvió el precipitado en 50 \mul de un tampón que contenía Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), cloruro de magnesio 10 mM y DTT 1 mM y cloruro potásico 100 mM, y se añadieron 20 unidades de BamHI al tampón para reaccionar a 37ºC durante 2 horas. La solución de reacción se fraccionó por electroforesis en gel de agarosa para cortar un fragmento de BamHI-(KpnI con extremos truncados) de 9,0 kb de pAGE210 procedente del gel, y el fragmento se purificó por un método del polvo de vidrio para recuperar aproximadamente 1 \mug.

A 50 \mul de un tampón que contenía Tris-HCl 20 mM (pH 8,5), cloruro de magnesio 10 mM, DTT 1 mM y cloruro de potasio 100 mM, se añadieron 10 \mug de pNKM106 y 30 unidades de BamHI se añadieron al tampón para reaccionar a 37ºC durante 2 horas.

Se realizaron la extracción en fenol-cloroformo y precipitación en etanol utilizando la solución de reacción, y el precipitado resultante se disolvió en 50 \mul de un tampón que contenía acetato de potasio 50 mM, Tris-ácido acético 20 mM (pH 7,9), acetato de magnesio 10 mM y DTT 1 mM, y se añadieron e éste 30 unidades de MscI para reaccionar a 37ºC durante 2 horas.

Se fraccionó la solución de reacción por electroforesis en agarosa para recuperar aproximadamente 0,5 \mug de un fragmento de pNKH106 tratado con BamHI-MscI de 1,9 kb.

En 20 \mul de un tampón de T4 ADN ligasa, se disolvieron 100 ng del fragmento del pNKM106 tratado con BamHI-MscI y 100 ng del fragmento BamHI-(KpnI con extremos truncados) del pAGE210, se añadió 1 unidad de T4 ADN ligasa a esto, y se realizó una ligadura a 16ºC durante 18 horas.

Se transformó JM109 de Escherichia coli utilizando el ADN plásmido recombinante obtenido por la reacción para obtener el plásmido pYS111 mostrado en la Fig. 25.

Ejemplo 17 Expresión del polipéptido supresor del envejecimiento secretor de membrana humano en células de animales

Se realizó la introducción del plásmido en células de animales utilizando electroporación según el método de Miyaji et al. [Cytotechnology, 3: 133 (1990)].

El pYS111 obtenido en el Ejemplo 16 se introdujo en una proporción de 4 \mug por cada 4\times10^{6} células en células CHO eliminando el gen dhfr [Proc. Natl. Acad. Sci., 77: 4216 (1980)], y a continuación se puso en suspensión en 10 ml de MEM\alpha2000-dFCS (5) [medio MEM\alpha2000 que contenía dFCS al 5%, NaHCO_{3} al 7,5% en un volumen de 1/40, solución de L-glutamina 200 mM (fabricado por GIBCO, CO.) al 3%, y solución de penicilina-estreptomicina (fabricada por GIBCO, CO.; que contiene 5.000 unidades/ml de penicilina y 5.000 \mug/ml de estreptomicina) al 0,5%] y se colocó en una placa de 10 cm (fabricada por Iwaki Glass Co.).

Se realizaron los siguientes procedimientos por un método similar al del Ejemplo 11 para producir clon resistente a MTX 500 nM.

Después de poner en suspensión el clon resultante a MTX 500 nM en un medio MEM\alpha2000-dFCS (5) que contiene MTX de 500 nM a una concentración final de 1\times10^{5} a 2\times10^{5} células/ml y dividiendo a continuación 15 ml de la suspensión en un matraz F75, y cultivando el clon en un incubador de CO_{2} a 37ºC durante 5 a 7 días hasta que el clon resistente alcanzó 80 a 100% de confluencia, el medio se intercambió con 15 ml de un medio exento de suero para células CHO, es decir medio CHO-S-SFMII (fabricado por GIBCO, CO.), seguido de cultivo adicional durante 3 días.

Tras la terminación del cultivo, se añadieron 1,5 ml de acetona al cultivo de 0,5 ml, y el cultivo resultante se dejó reposar a 20ºC durante 30 minutos. La muestra se centrifugó a -10ºC en condiciones de 15.000 \times g durante 10 minutos para obtener una fracción de precipitado, se añadió a ésta 70% de etanol, seguido de centrifugación a 4ºC durante 5 minutos.

El precipitado resultante se secó posteriormente para obtener una muestra concentrada en acetona del cultivo sobrenadante.

El sobrenadante del cultivo puede almacenarse a -20ºC y puede utilizarse tras descongelación, si es necesario.

Los productos se analizaron utilizando el ADN plásmido recombinante obtenido mediante la reacción por transferencia Western.

Los resultados se presentan en la Fig. 26.

Se confirmó una banda que presenta reactividad cruzada con el anticuerpo contra el polipéptido que suprime el envejecimiento, y se indicó que el polipéptido secretor humano que suprime el envejecimiento estaba expresado a un nivel notable utilizando las células de animales.

Según el método descrito en el Ejemplo 15, el polipéptido secretor humano que suprime el envejecimiento después de la concentración de 300 ml del sobrenadante del cultivo por inmunoprecipitación se determinó de la secuencia de aminoácidos N-terminal. La secuencia de aminoácidos resultante coincidió con la secuencia de 9 restos de aminoácidos del resto 34º del terminal N de la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº:2.

Además, se obtuvo el polipéptido secretor que suprime el envejecimiento humano a partir del cultivo de células animales según el método del Ejemplo 8(1).

Ejemplo 18 Preparación de virus recombinante para expresar el polipéptido secretor que suprime el envejecimiento humano en células de insecto

La preparación de un virus recombinante para expresar el polipéptido secretor que suprime el envejecimiento humano en células de insecto se realizó según el método descrito en el Ejemplo 12.

Más específicamente, se disolvieron 10 \mug de pNKH106 en 50 \mul de un tampón que contenía Tris-HCl 20 mM (pH 8,5), cloruro de magnesio 10 mM, DTT 1 mM y cloruro de potasio 100 mM y se añadieron 30 unidades de BamHI al tampón para reaccionar a 37ºC durante 2 horas. La solución de reacción se pasó a través de extracción en fenol-cloroformo y precipitación en etanol, y a continuación se disolvió en 50 \mul de un tampón que contenía acetato de potasio 50 mM, Tris-HCl 20 mM (pH 7,9), cloruro de magnesio 10 mM y DTT 1 mM y se añadieron 30 unidades de MscI para reaccionar a 37ºC durante 2 horas.

La solución de reacción se fraccionó por electroforesis en gel de agarosa, y un fragmento BamHI-MscI de 1,9 kb de pNKH106 se cortó del gel y a continuación se purificó por el método de polvo de cristal para recuperar aproximadamente 0,5 \mug.

A 50 \mul de tampón Tris B, se añadieron 5 \mug de pVL1393 contenido en el kit BaculoGold Starter fabricado por Pharmingen Co., y se añadieron 30 unidades de EcoRI para reaccionar a 37ºC durante 4 horas.

Se realizó la extracción en fenol-cloroformo y precipitación en etanol utilizando la solución de reacción para recuperar los fragmentos de ADN. El ADN se sometió a tratamiento del extremo truncado utilizando un kit de truncamiento de ADN (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.), seguido de extracción en fenol-cloroformo y precipitación en etanol. El ADN resultante se disolvió en 50 \mul de un tampón que contenía Tris-HCl 20 mM (pH 8,5), cloruro de magnesio 10 mM y DTT 1 mM y cloruro potásico 100 mM, y se añadieron 20 unidades de BamHI a la solución para reaccionar a 37ºC durante 2 horas.

La solución de reacción se fraccionó por electroforesis en gel de agarosa, y un fragmento (EcoRI con extremos trucados)-BamHI de 9,6 kb de pVL1393 se cortó del gel y a continuación se purificó por el método de polvo de cristal para recuperar aproximadamente 1 \mug.

En 20 \mul de un tampón de T4 ADN ligasa, se disolvieron 200 ng del fragmento (EcoRI con extremos trucados)-BamHI del pVL1393 y 50 ng del fragmento tratado con BamHI-MscI del pNKH106, se añadió una unidad de T4 ADN ligasa a éste, se realizó una ligadura a 16ºC durante 18 horas.

Se transformó JM109 de Escherichia coli utilizando el ADN plásmido recombinante obtenido mediante la reacción para obtener el plásmido pYS150 (Fig. 27).

El virus recombinante se preparó utilizando 1 \mug de pYS150, introduciendo el plásmido, junto con 20 ng de baculovirus linear, en células Sf21 por el método de lipofección y a continuación cultivando las células a 27ºC durante 3 días. El sobrenadante del cultivo que contenía el virus recombinante se recogió en un volumen de 1,0 ml de cultivo.

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Ejemplo 19 Expresión del polipéptido secretor que suprime el envejecimiento humano en células de insecto

Procedimiento 1

Proliferación de virus recombinante

En 10 ml de medio Sf900-II, se pusieron en suspensión 2\times10^{7} células de células Sf21, que se colocaron a continuación en un matraz de 175 cm^{2} (fabricado por Gliner Co.) y se dejaron reposar a temperatura ambiente durante una hora para unir las células en el matraz. Después de dejar reposar las células, se eliminó el sobrenadante y se añadieron a éste 15 ml de medio de insecto TMN-FH y 1 ml del sobrenadante del cultivo que contiene el virus recombinante obtenido en el Ejemplo 17, seguido de cultivo a 27ºC durante 3 días.

Tras el cultivo, se centrifugó el sobrenadante a 1.500 \times g durante 10 minutos para obtener una solución de virus recombinante en el que se habían eliminado las células Sf21.

Se calculó el título del virus de la solución del virus recombinante por el método descrito en el Ejemplo 13 y se indicó que la solución del virus recombinante contenía aproximadamente 2 x 10^{8} unidades formadoras de placa (PFU)/ml de virus.

Procedimiento 2

Se pusieron en suspensión 6\times10^{6} células de células Sf21 en 45 ml de medio de insecto de Grace, preparado por GIBCO, CO., que contenía FCS al 10% en un matraz de 225 cm^{2}, seguido de cultivo a 27ºC durante 3 a 4 días.

Tras el cultivo, se eliminó el sobrenadante del cultivo, y se añadieron además 30 ml de medio de insecto de Grace que contiene FCS al 10% y 0,5 ml de una solución que contiene el virus recombinante procedente del pSY150 a una concentración de aproximadamente 2\times10^{8} PFU/ml, seguido de cultivo a 27ºC durante un día.

Tras el cultivo, se eliminó el sobrenadante y se añadieron además 45 ml de medio Sf900-II, seguido de cultivo durante 2 a 3 días.

Tras el cultivo, se centrifugó éste a 1.500 \times g durante 5 minutos para obtener el sobrenadante del cultivo. El sobrenadante del cultivo se almacenó a -20ºC y se utilizó después de descongelar, en caso de necesidad.

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Procedimiento 3

Verificación de la expresión

Por un método similar al del Ejemplo 17, se utilizaron 0,5 ml de sobrenadante del cultivo, seguido de concentración en acetona, y el sobrenadante del cultivo resultante se electroforizó por SDS-PAGE y a continuación se transfirió por Western.

Los resultados se presentan en la Fig. 28. Por transferencia Western, se confirmó una banda específica que presenta reactividad cruzada con el anticuerpo contra el polipéptido que suprime el envejecimiento.

De este modo se indicó que puede expresarse una cantidad notable de polipéptido secretor que suprime el envejecimiento humano que presenta reactividad cruzada con el anticuerpo contra el polipéptido que suprime el envejecimiento utilizando células de insecto.

Además, se obtuvo el polipéptido secretor que suprime el envejecimiento humano del sobrenadante del cultivo de células de insecto por el método del Ejemplo 8(1).

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Ejemplo 20 Construcción del plásmido pYS112 para expresar el polipéptido secretorque suprime el envejecimiento murino en células de animales

Ligando el fragmento HindIII-BamHI de pAGE210 obtenido en el Ejemplo 10 (Procedimiento 1) y el fragmento HindIII-BamHI de pNKM112, fragmento que contiene ADN que codifica el polipéptido que suprime el envejecimiento, descrito en el Ejemplo 4, se construyó el vector pYS112 que expresa el polipéptido secretorque suprime el envejecimiento de la manera siguiente (Fig. 29).

A 30 \mug de un tampón que contenía Tris-HCl 20 mM (pH 8,5), cloruro de magnesio 10 mM, DTT 1 mM y fosfato de potasio 100 mM, se añadieron 5 \mug del plásmido pAGE210 y se añadieron 20 unidades de BamHI y 20 unidades de HindIII al tampón para reaccionar a 37ºC durante 2 horas.

La solución de reacción se fraccionó por electroforesis en gel de agarosa, y un fragmento HindIII-BamHI de 9,0 kb de pAGE206 se cortó del gel y a continuación se purificó por el método de polvo de cristal para recuperar aproximadamente 1 \mug.

A 50 \mug de un tampón que contenía Tris-HCl 20 mM (pH 8,5), cloruro de magnesio 10 mM, DTT 1 mM y cloruro de potasio 100 mM, se añadieron 10 \mug del pNKM112 y se añadieron 30 unidades de BamHI y 30 unidades de HindIII al tampón para reaccionar a 37ºC durante 2 horas.

Se fraccionó la solución de reacción por electroforesis en gel de agarosa para recuperar aproximadamente 0,5 \mug de un fragmento HindIII-BamHI de pNKM112 de 1,6 kb.

En 20 \mul de un tampón de T4 ADN ligasa, se disolvieron 100 ng del fragmento HindIII-BamHI del pNKM112 y 100 ng del fragmento HindIII-BamHI del pAGE210, se añadió una unidad de T4 ADN ligasa, y se realizó una ligadura a 16ºC durante 18 horas.

Se transformó JM109 de Escherichia coli utilizando el ADN plásmido recombinante obtenido por la reacción para obtener el plásmido pYS112 mostrado en la Fig. 29.

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Ejemplo 21 Expresión del polipéptido secretor que suprime el envejecimiento en células de animales

El pYS112 obtenido en el Ejemplo 20 se introdujo a una proporción de 4 \mug por cada 4\times10^{6} células en células CHO con eliminación del gen dhfr [Proc. Natl. Acad. Sci., 77: 4216 (1980)], y a continuación se puso en suspensión en 10 ml de MEM\alpha2000-dFCS (5) [medio MEM\alpha2000 (fabricado por GIBCO, CO.) que contenía dFCS al 5%, NaHCO_{3} al 7,5% en un volumen de 1/40, solución de L-glutamina 200 mM (fabricado por GIBCO, CO.) al 3%, y solución de penicilina-estreptomicina (fabricada por GIBCO, CO.; que contiene 5.000 unidades/ml de penicilina y 5.000 \mug/ml de estreptomicina) al 0,5%] y se colocó en una placa de 10 cm (fabricada por Iwaki Glass Co.).

Después de poner en suspensión el clon resultante a MTX 500 nM en un medio MEM\alpha2000-dFCS (5) que contiene MTX de 500 nM a 1\times10^{5} a 2\times10^{5} células/ml y dividiendo a continuación 15 ml de la suspensión en un matraz F75, y cultivando el clon en un incubador con CO_{2} a 37ºC durante 5 a 7 días, hasta que el clon resistente alcanzó 80 a 100% de confluencia, se cambió a continuación el medio nada más por 15 ml de medio exento de suero para células CHO, es decir medio CHO-S-SFMIII (fabricado por GIBCO CO.), seguido de cultivo durante 3 días.

El sobrenadante del cultivo puede almacenarse a -20ºC y el sobrenadante puede utilizarse después de descongelación, si fuera necesario.

Se concentró el producto utilizando 1 ml de sobrenadante de cultivo por inmunoprecipitación descrita a continuación en el Ejemplo 25, y se analizó por el método Western.

Los resultados se presentan en la Fig. 30. Se confirmó una banda que presenta reactividad cruzada con el anticuerpo contra el polipéptido que suprime el envejecimiento, y se indicó que la cantidad marcada de polipéptido secretor que suprime el envejecimiento murino se expresaba utilizando las células de animales.

Por el método descrito en el Ejemplo 15, se determinó por inmunoprecipitación la secuencia de aminoácidos N-terminal del polipéptido secretor que suprime el envejecimiento murino que se preparó por concentración de 45 ml de sobrenadante del cultivo de células animales. La secuencia de aminoácidos resultante correspondía con la secuencia de los 13 restos de aminoácidos que comienzan en el resto 36º N-terminal de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº:4.

Se obtuvo el polipéptido secretor que suprime el envejecimiento murino de células animales según el método del Ejemplo 8(1).

Ejemplo 22 Preparación de virus recombinante para expresar el polipéptido secretor murino que suprime el envejecimiento en células de insectos

La preparación del virus recombinante para expresar el polipéptido secretor murino que suprime el envejecimiento en células de insecto siguió el método descrito en el Ejemplo 12.

Más específicamente, se disolvieron 10 \mug del ADN que codifica el polipéptido que suprime el envejecimiento del pNKM112 en 50 \mul de un tampón que contenía Tris-HCl 20 mM (pH 8,5), cloruro de magnesio 10 mM, DTT 1 mM y cloruro de potasio 100 mM, se añadieron 30 unidades de HindIII para reaccionar a 37ºC durante 2 horas.

Se realizaron la extracción en fenol-cloroformo y precipitación en etanol utilizando la solución de reacción para recuperar los fragmentos de ADN. El ADN se sometió a tratamiento del extremo truncado utilizando un kit de truncamiento de ADN (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.), seguido de extracción en fenol-cloroformo y precipitación en etanol. Se disolvió el precipitado resultante se disolvió en 50 \mul de un tampón que contenía Tris-HCl 20 mM (pH 8,5), cloruro de magnesio 10 mM, DTT 1 mM y cloruro potásico 100 mM, y se añadieron 20 unidades de BamHI a la solución para reaccionar a 37ºC durante 2 horas.

La solución de reacción se fraccionó por electroforesis en gel de agarosa y se cortó un fragmento de (HindIII con extremos truncados)-BamHI de 1,6 kb procedente del gel y a continuación se purificó por el método del polvo de vidrio para recuperar aproximadamente 0,5 \mug.

A 50 \mul de tampón Tris B, se añadieron 5 \mug de pVL1392 contenido en el kit BaculoGold Starter fabricado por Pharmingen Co., y se añadieron 30 unidades de EcoRI para reaccionar a 37ºC durante 4 horas.

Se realizó la extracción en fenol-cloroformo y precipitación en etanol utilizando la solución de reacción para recuperar los fragmentos de ADN. El ADN se sometió a tratamiento del extremo truncado utilizando un kit de truncamiento de ADN, seguido de extracción en fenol-cloroformo y precipitación en etanol. El precipitado resultante se disolvió en 50 \mul de un tampón que contenía Tris-HCl 20 mM (pH 8,5), cloruro de magnesio 10 mM y DTT 1 mM y cloruro potásico 100 mM, y se añadieron 20 unidades de BamHI a la solución para reaccionar a 37ºC durante 2 horas.

La solución de reacción se fraccionó por electroforesis en gel de agarosa, y un fragmento (EcoRI con extremos trucados)-BamHI de 9,6 kb de pVL1393 se cortó del gel y a continuación se purificó por el método de polvo de cristal para obtener aproximadamente 1 \mug.

En 20 \mul de un tampón de T4 ADN ligasa, se disolvieron 100 ng del fragmento (EcoRI con extremos trucados)-BamHI del pVL1392 y 100 ng del fragmento (HindIII con extremos truncados)-BamHI del pNKM112, se añadió una unidad de T4 ADN ligasa a éste y se realizó una ligadura a 16ºC durante 18 horas.

Se transformó JM109 de Escherichia coli utilizando el ADN plásmido recombinante obtenido mediante la reacción para obtener el plásmido pYS151 (Fig. 31).

El virus recombinante se preparó utilizando 1 \mug de pYS151 e introduciendo el plásmido junto con 20 ng de baculovirus linear, en células Sf21 por el método de lipofección y a continuación cultivando las células a 27ºC durante 3 días. En el cultivo, se recogió el sobrenadante de 1,0 ml que contenía el virus recombinante.

Ejemplo 23 Expresión del polipéptido secretor murino que suprime el envejecimiento en células de insecto

Procedimiento 1

Proliferación de virus recombinante

En 10 ml de medio Sf900-II, se pusieron en suspensión 2\times10^{7} células de células Sf21, y la suspensión resultante se colocó en un matraz de 175 cm^{2} (fabricado por Gliner Co.) y se dejó reposar a temperatura ambiente para unir las células en el matraz.

Después de dejar reposar las células, se eliminó el sobrenadante y se añadieron al matraz 15 ml de medio de insecto TMN-FH y 1 ml del sobrenadante del cultivo que contiene el virus recombinante obtenido en el Ejemplo 12, seguido de cultivo a 27ºC durante 3 días.

Se calculó el título del virus del virus recombinante por el método descrito en el Ejemplo 13 y se indicó que la solución del virus recombinante contenía aproximadamente 1 x 10^{8} unidades formadoras de placa (PFU)/ml de virus.

Procedimiento 2

Expresión del polipéptido secretor murino que suprime el envejecimiento en células de insecto

Según el manual adjunto al kit BaculoGold Starter fabricado por Pharmingen Co., se expresó el polipéptido murino que suprime el envejecimiento por los siguientes procedimientos.

Se pusieron en suspensión 6\times10^{6} células de células Sf21 en 45 ml de medio de insecto de Grace (preparado por GIBCO, CO.) que contenía FCS al 10% en un matraz de 225 cm^{2}, seguido de cultivo a 27ºC durante 3 a 4 días.

Tras el cultivo, se eliminó el sobrenadante del cultivo, y se añadieron además en el matraz 30 ml de medio de insecto de Grace que contiene FCS al 10% y 1 ml de una solución que contiene el virus recombinante del pSY151 a una concentración de aproximadamente 1\times10^{8} PFU/ml, tal como se obtiene en el Procedimiento 1 anterior, seguido de cultivo a 27ºC durante un día.

Tras el cultivo, se centrifugó la mezcla a 1.500 \times g durante 5 minutos, y se obtuvo el sobrenadante del cultivo. El sobrenadante del cultivo se pudo almacenar a -20ºC y se utilizaron las células tras descongelación, si fuera necesario.

Procedimiento 3

Confirmación de la expresión

Por un método similar al del Ejemplo 21, se utilizó 1 ml de sobrenadante del cultivo para inmunoprecipitación, y el producto resultante fue analizado por el método Western.

Los resultados se presentan en la Fig. 32.

Se confirmó por el método Western una banda específica que presenta reactividad cruzada con el anticuerpo contra el polipéptido que suprime el envejecimiento.

Se indicó de este modo que el polipéptido secretor murino que suprime el envejecimiento que presenta reactividad cruzada con el anticuerpo contra el polipéptido que suprime el envejecimiento podía aplicarse a un nivel notable utilizando células de insecto.

El polipéptido secretor murino que suprime el envejecimiento se obtuvo del sobrenadante del cultivo de células de insecto según el método del Ejemplo 8(1).

Ejemplo 24 Tinción de inmunocitos utilizando anticuerpo monoclonal

Las células CHO que expresan el polipéptido que suprime el envejecimiento (CHO dhfr^{-}/pYT103) preparadas en el Ejemplo 11 se pusieron en suspensión en un tampón para tinción de inmunocitos a una concentración final de 5\times10^{6} células/ml, y la suspensión resultante se dividió en 100 \mul/pocillo en una placa de fondo redondo de 96 pocillos.

Como referencia, las células CHO utilizadas como hospedadores en el Ejemplo 11 se sometieron a los mismos procedimientos.

Se centrifugó la placa a 4ºC y 350 \times g durante un minuto para eliminar el sobrenadante.

Una fracción de 5 ml del sobrenadante del cultivo del anticuerpo monoclonal contra el polipéptido que suprime el envejecimiento que produce el hibridoma KM1902 obtenido en el Ejemplo 9(3) se concentró 20 veces utilizando MabTrapGII (preparado por Pharmacia Biotech Co.), y a continuación se añadió a razón de 50 \mul/pocillo a la placa, y la placa se dejó reposar a 4ºC durante 30 minutos.

Después de dejar reposar la placa, un tampón para tinción de inmunocitos se añadió a razón de 200 \mul/pocillo a la placa y a continuación se centrifugó a 4ºC y 350 \times g durante un minuto para eliminar el sobrenadante y se lavaron las células.

Una vez realizado además el procedimiento de enjuague dos veces, un tampón para tinción de inmunocitos que contenía anticuerpo contra inmunoglobulina de rata marcado con FITC (fabricado por Wako Pure Chemical Co.), después de dilución de 30 veces, se añadió a razón de 50 \mul/pocillo a la placa, y a continuación se dejó reposar a la oscuridad enfriando con hielo durante 30 minutos. Después de dejar reposar la placa y después de realizar el mismo procedimiento de enjuague tres veces, se realizó el análisis con el FLOR CYTOMETER (fabricado por Coulter Co.).

Los resultados se presentan en la Fig. 33.

El anticuerpo monoclonal KM1902 no reaccionó con las células CHO; sin embargo, se reconoció específicamente las células CHO que expresan el polipéptido que suprime el envejecimiento.

Ejemplo 25 Inmunoprecipitación del polipéptido que suprime el envejecimiento

Como muestra del polipéptido que suprime el envejecimiento para inmunoprecipitación, se utilizó el polipéptido que suprime el envejecimiento que expresa las células CHO (CHO dhfr^{-}/pYT103) descrito en el Ejemplo 11.

Se añadió PBS a una placa Petri de 6 cm en la que se cultivaron células CHO hasta confluencia, y las células CHO se lavaron una vez.

A la placa Petri, se le añadieron 360 \mul de Tampón 1 enfriado en hielo y se dejó reposar en hielo durante 30 minutos y a continuación la placa se agitó suavemente a un intervalo de 5 minutos para el tratamiento de solubilización.

La solución tratada se recuperó en un tubo de centrifugación de 1,5 ml, y se centrifugó a 14.000 rpm durante 30 minutos.

Al sobrenadante del cultivo, se le añadieron 25 \mul de proteína G-Sepharosa (v/v al 50%) equilibrada con Tampón 1 y se agitó a 4ºC durante una hora, y la mezcla se centrifugó a 50.000 rpm durante 2 minutos para recuperar el sobrenadante.

El anticuerpo monoclonal purificado obtenido en el Ejemplo 9(4) se añadió al sobrenadante a una concentración final de 10 \mug/ml, seguido de agitación a 4ºC durante una hora.

A la solución agitada, se le añadieron 25 \mul de proteína G-Sepharosa (v/v al 50%) seguido de agitación a 4ºC durante una hora, y la mezcla se centrifugó a 50.000 rpm durante 2 minutos.

A la fracción de precipitado resultante, se le añadieron 200 \mul de Tampón 1 para poner en suspensión el precipitado. Se repitió tres veces el mismo procedimiento para enjuagar la fracción del precipitado.

Al precipitado, se añadieron 15 \mul de un tampón de muestra para electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida [tampón que contiene Tris-HCl 6 mM (pH 6,8), SDS al 2%, glicerol al 10% y 2-mercaptoetanol al 5%) y la mezcla se calentó utilizando un bloque calefactor y se efectuó la electroforesis utilizando un gel con gradiente disponible en el mercado para SDS-PAGE (fabricado por Atoh Co.). Tras la electroforesis, se transfirió el polipéptido en el gel resultante a una membrana de PVDF (fabricada por Millipore Co.).

Según el método del Ejemplo 8, se realizó la transferencia Western utilizando una membrana de PVDF y el anticuerpo policlonal contra el péptido del fragmento parcial que suprime el envejecimiento para detectar un polipéptido que suprime el envejecimiento en la posición de aproximadamente 140 kDa.

Los resultados se presentan en la Fig. 34.

El anticuerpo monoclonal KM1902 precipitó inmunológicamente el polipéptido que suprime el envejecimiento.

Ejemplo 26 Producción de ratones que presentan síndrome mejorado que se asemeja a envejecimiento prematuro en ratones que presentan un síndrome que se asemeja al envejecimiento prematuro utilizando un gen que suprime el envejecimiento del ratón (1) Construcción del ADN que suprime el envejecimiento para su introducción

Como fragmento de ADN que contiene un activador, se utilizó un fragmento HindIII de pEF321CAT, que contenía el factor 1\alpha de elongación humano [Gene, 91: 217 (1990)]. En el fragmento HindIII de aproximadamente 2,5 kb, estaban presentes partes del primer exón y del segundo exón de la zona 5' sin traducción del factor 1\alpha de elongación humano, un activador, un enlazador HindIII en el terminal 5' y los enlazadores EcoRI y HindIII en el terminal 3'.

Ligando un fragmento NotI (4,2 kb) de pNKM101 que contenía el gen que suprime el envejecimiento y la casete de la zona SV40 de corte y empalme precoz y la señal de poliadenilación [nucleótido número 1551-2427 en el plásmido pMAMneo (Clontech Co.)] corriente abajo del fragmento HindIII, se utilizó el producto resultante como ADN que suprime el envejecimiento para introducción.

El método de construcción del ADN que suprime el envejecimiento para introducción se presenta en las Figs. 35 y 36.

Más específicamente, de la forma siguiente.

(i): Por escisión de pEF321CAT con HindIII, se truncaron los extremos del fragmento HindIII de 2,5 kb resultante utilizando un kit de truncado de ADN (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.). Se añadió un enlazador XbaI (4693P, fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.) al fragmento con extremo truncado utilizando un kit de ligadura de ADN (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.), y el fragmento se escindió con XbaI para obtener el enlazador escindido de XbaI.

(ii): Por escisión de pMAMneo (fabricado por Clontech Co.) con BamHI y SmaI, el fragmento BamHI/SmaI de 870 bp resultante que contenía la casete poli(A) se subclonó en la secuencia BamHI/EcoRV de pBluescript II SK(-) (fabricado por STRATAGENE Co.).

: Después de la subclonación, se escindió el producto con BamHI, se añadió un enlazador XhoI (de 4694 bp, fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.), y se escindió con XhoI y HindIII para cortar una casete poli(A) (tanto el trabajo de los terminales como los extremos de XhoI y HindIII).

(iii): La casete poli(A) obtenida en (ii) se subclonó en la secuencia HindIII/XhoI de pBluescript II SK(-) para obtener un plásmido que contenía la casete poli(A).

(iv): El fragmento de escisión XbaI obtenido en (i) se subclonó en la secuencia XbaI del plásmido obtenido en (iii). El plásmido resultante se denomina en adelante "pEFSA".

(v): Se escindió pNKM101 con NotI, y el fragmento NotI de 4,2 kb resultante se truncó en los extremos y a continuación se subclonó en la secuencia EcoRV de pBluescript II SK().

: Después de la subclonación, el producto se escindió con EcoRI y HindIII para cortar un fragmento EcoRI/ HindIII de 4,2 kb.

(vi): El fragmento obtenido en (v) se subclonó en la secuencia EcoRI/HindIII de pEFSA para obtener el plásmido pRES.

El pRES se escindió con NotI, se linealizó y se disolvió en PBS a una concentración final de 5,7 ng/ml (aproximadamente 500 copias/ml) para preparar una solución en ADN para microinyección.

(2) Producción de ratón transgénico

Se produjo un ratón transgénico por un método de microinyección corriente (Developmental Engineering Experimental Manual-Preparation of Transgenic Mouse, Tatsuji Nomura como editor responsable, Motoya Katsuki como editor, Kodansha Scientific, 1987).

Más específicamente, de la forma siguiente.

(i): En una hembra F1 (BCF1) (de 8 a 16 semanas) de C57BL/6 y C3H, se administraron por vía intraperitoneal 7 unidades de serotropina (fabricada por Teikoku Zoki Co.). Después de 48 horas de la administración, se administraron 7 unidades de gonadotropina (fabricada por Teikoku Hormone Mfg. Co., Ltd.) a la hembra, y se apareó con un macho C3H.

(ii): Al día siguiente, se extrajo un óvulo fertilizado de la ampolla de la trompa de Falopio de la hembra después de la cópula. La solución de ADN para microinyección preparada en (1) se inyectó en el pronúcleo masculino del óvulo fertilizado utilizando un micro manipulador bajo un microscopio vertical.

(iii): El día antes de la práctica de (i), el óvulo fertilizado preparado en (i) se trasplantó al interior de la trompa de Falopio de una hembra (ICR, de 8 a 16 semanas) que había sido apareada con un macho con ligadura de vasos (ICR) de modo que la hembra se encontraba en un falso embarazo.

(iv): Se cortó la cola de un ratón de la camada nacida el día 20º tras el trasplante a las 4 a 5 semanas de vida para extraer el ADN cromosómico, y se analizó el genotipo utilizando PCR según el método descrito en (3).

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(3) Análisis del genotipo

(i): A la cola del ratón obtenida anteriormente, se añadieron 2 ml de un tampón de lisis, y la mezcla resultante se dejó en reposo a 50ºC durante la noche.

(ii): Se añadió un volumen igual de fenol a la solución en reposo sola descrita en (i) para la extracción en fenol, y el sobrenadante resultante de 1 ml se utilizó como plantilla para PCR.

Como cebadores de PCR, se utilizaron 5 tipos de ADN, representados por la SEC. ID. nº:25 a nº:29.

Dado que los ADN con las SEC. ID. nº:25 y nº:26 se sintetizaron basándose en la secuencia nucleotídica del ADNc del pNKM101, puede ampliarse un fragmento de 339 bp si está presente el ADNc. Debido a que está presente un intrón entre ambos cebadores de ADN procedentes del cromosoma, no puede ampliarse ningún fragmento de ADN procedente del ADN cromosómico.

El ADN con la secuencia nucleotídica representada por la SEC. ID. nº:27 se sintetizó a partir de una zona presente en común con el alelo mutante (pg) y el alelo (+) natural; el ADN con la secuencia nucleotídica representada por la SEC. ID. nº:28 se sintetizó a partir de una zona presente en el alelo mutante solo; y el ADN con la secuencia nucleotídica representada por la SEC. ID. nº:29 se sintetizó a partir de una zona presente en el alelo natural solo.

Por consiguiente, un fragmento de 920 bp ampliado entre el ADN con la secuencia nucleotídica representada por la SEC. ID. nº:27 y el ADN con la secuencia nucleotídica representada por la SEC. ID. nº:28 se produjo a partir de pg/pg; y un fragmento ampliado de 468 bp entre el ADN con la secuencia nucleotídica representada por la SEC. ID. nº:27 y el ADN con la secuencia nucleotídica representada por la SEC. ID. nº:29 se produjo a partir de +/+; y ambos fragmentos se produjeron a partir de pg/+.

Se llevó a cabo la PCR en un sistema en un volumen total de 50 \mul [1 \times tampón II de LA PCR (Mg más), una solución mezcla de 400 mM de cada componente de dNTP, cada componente de los cebadores 0,2 mM, TaKaRa LATaq de 2,5 U] utilizando el kit LA PCR (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.) en las condiciones siguientes.

Es decir, se calentó el sistema a 94ºC durante 1,5 minutos, y a continuación, se sometió el sistema a 30 ciclos de calentamiento, consistiendo cada ciclo en calentamiento a 94ºC durante 30 segundos, 56ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1,5 minutos, seguido de calentamiento adicional a 72ºC durante 10 minutos.

(4) Apareamiento de ratón transgénico con ratón que presenta pg/+

Como resultado esta identificación se realizó según el método en (3) para 161 ratones de la camada obtenidos en (2), 37 animales eran ratones transgénicos con el gen que suprime el envejecimiento.

Un ratón transgénico del genotipo de pg/+ y con el gen que suprime el envejecimiento se obtuvo en F1 mediante apareamiento del ratón transgénico con un ratón que presenta pg/+.

El gen contra el envejecimiento para su introducción en el F1 pudo transmitirse por 31 líneas.

Por apareamiento entre ambos animales pg/+ con el gen que suprime el envejecimiento o apareamiento entre pg/+ y pg/+ con el gen que suprime el envejecimiento, se obtuvieron 3 líneas de animales pg/pg con el gen que suprime el envejecimiento en F2.

Los resultados se presentan en la Tabla 1.

TABLA 1

1

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TABLA 2

2

Se confirmó que el ratón pg/pg que presenta un síndrome que se asemeja al envejecimiento prematuro no presentaba el síndrome si el ratón obtenía el gen que suprime el envejecimiento.

Por consiguiente, se demostró que el gen es el gen patógeno del síndrome que se asemeja al envejecimiento prematuro en un ratón con envejecimiento prematuro, y se indicó de este modo que la expresión del gen en individuos que presentan un síndrome que se asemeja al envejecimiento prematuro podía suprimir el síndrome que se asemeja al envejecimiento prematuro.

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Ejemplo 27 Preparación de un ratón que presenta síndrome mejorado que se asemeja al envejecimiento prematuro en ratones que presentan un síndrome que se asemeja al envejecimiento prematuro utilizando adenovirus recombinante que contiene el gen que suprime el envejecimiento procedente del ratón

Se preparó un virus recombinante que contenía un gen que suprime el envejecimiento procedente de ratón según el método de Miyake et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 1320 (1996)].

Más específicamente, el plásmido pNKM101 que contiene un gen que suprime el envejecimiento procedente de ratón se escindió con NotI y XbaI para obtener un fragmento de 3,1 kb que contenía el gen, y el fragmento se truncó en los extremos utilizando un kit de truncamiento de ADN (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.).

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En 20 \mul de un tampón de T4 ADN ligasa, 3 \mug del fragmento y 1 \mug de un fragmento SwaI del cósmido pAxCAwt que contenía el genoma del adenovirus de tipo 5 del que se eliminaron E3, E1A y E1B, se disolvieron un potenciador de citomegalovirus y un activador híbrido de un activador de \beta-actina de pollo (activador CAG) [Kanegae et al., Nucl. Acids. Res., 23: 3816 (1995)], se añadió una unidad de T4 ADN ligasa a la solución, y se realizó una ligadura a 16ºC durante 18 horas.

Se realizó la encapsulación in vitro utilizando la solución de reacción de ligasa y Gigapack II XL. Se infectó el extracto de encapsulación (fabricado por Stratagene Co.) y a continuación el fago resultante en DH5\alpha de Escherichia coli para obtener un cósmido recombinante.

Se confirmó la orientación del gen que suprime el envejecimiento procedente de ratón con respecto al activador en el cósmido recombinante escindiendo el cósmido con BamHI para detectar un fragmento de 1,6 kb.

Se mezclaron una fracción de 8 \mug del cósmido obtenido de este modo y 1 \mug del ADN adenovirus Ad5dIX de tipo 5 [J. Virology, 54: 711 (1985)] en el que se eliminaron E3, E1A y E1B por escisión de EcoT22I, y la mezcla resultante se transfectó en células 293 en una placa de Petri de 6 cm por el método del fosfato de calcio utilizando el kit CellPhect Transfection (Pharmacia Biotech Co.).

Se realizaron los procedimientos siguientes para obtener un virus recombinante, según el método de Kanegae et al. [BioManual Series, 4: 43-58, Yodosha (1994)].

Se purificó dos veces el virus recombinante por un gradiente de densidad de cloruro de cesio, se puso en suspensión en PBS que contenía glicerol al 10% y se almacenó a -80ºC para su utilización apropiada según el método de Kanegae et al. [Jpn. J. Med. Sci. Biol., 47: 157 (1994)].

Se calculó el título del virus en la solución de virus recombinante según el método de Kanegae et al. [Jpn. J. Med. Sci. Biol., 47: 157 (1994)], y se observó que la solución contenía 1\times10^{10} pfu/ml de virus.

En la vena de la cola de un ratón de 4 semanas que presenta un síndrome que se asemeja al envejecimiento prematuro, se inocularon 5\times10^{8} pfu del virus recombinante obtenido de este modo y se observó el curso.

Los resultados se presentan en la Fig. 37.

El ratón al que se inoculó el virus tuvo una ganancia de peso corporal y se prolongaron sus expectativas de vida, y se observó que se suprime el síndrome que se asemeja al envejecimiento prematuro.

Ejemplo 28 Construcción del plásmido pYS201 para expresar la zona N-terminal del polipéptido que suprime el envejecimiento humano en Escherichia coli

Ligando el fragmento EcoRV-(KpnI con extremos truncados) de pSupex preparado en el Ejemplo 6 y un fragmento SacII de 623 bp que contiene el ADN que codifica al polipéptido que suprime el envejecimiento humano de pNKM103 obtenido en el Ejemplo 5, se construyó el vector pYS201 para expresar la zona N-terminal del polipéptido que suprime el envejecimiento humano de la forma siguiente (Fig. 38).

A 30 \mul de un tampón que contenía Tris-ácido acético 33 mM (pH 7,9), acetato de magnesio 10 mM, acetato de potasio 66 mM, BSA al 0,01% y DTT 0,5 mM, se añadieron 10 \mug del pNKM103 obtenido en el Ejemplo 5, y se añadieron 20 unidades de SacII al tampón para reaccionar a 37ºC durante 4 horas. Se realizaron la extracción en fenol-cloroformo y la precipitación en etanol utilizando la solución de reacción para recuperar los fragmentos de ADN, y los fragmentos de ADN se truncaron en los extremos utilizando un kit de truncamiento de ADN (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.).

Los fragmentos de ADN tratados en la solución de reacción se fraccionaron mediante electroforesis en gel de agarosa para recuperar aproximadamente 0,3 \mug de un fragmento SacII con extremos truncados de aproximadamente 0,6 kb que contenía el ADN que codifica un fragmento que contenía los restos de aminoácidos desde Gly^{55} hasta Pro^{261} en el polipéptido que suprime el envejecimiento representado por la SEC. ID. nº:1.

A 30 \mul de un tampón que contenía Tris-HCl (pH 7,5), cloruro de magnesio 10 mM y DTT 1 mM, se añadieron 3 \mug del vector de expresión pSupex para Escherichia coli obtenido en el Ejemplo 6, Procedimiento 5, y a esto se añadieron 10 unidades de KpnI a 37ºC durante 4 horas. Se realizaron la extracción en fenol-cloroformo y precipitación en etanol utilizando la solución de reacción para recuperar los fragmentos de ADN, y se sometieron a tratamiento de truncamiento del extremo utilizando un kit de truncamiento con ADN (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.).

Además, se realizó la extracción en fenol-cloroformo y precipitación con etanol, y se añadió ADN a 30 \mul de un tampón que contenía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), cloruro de magnesio 10 mM, cloruro sódico 100 mM y DTT 1 mM, y se añadieron 10 unidades de EcoRV al tampón para reaccionar a 37ºC durante 4 horas.

Los fragmentos de ADN tratados en la solución de reacción se fraccionaron mediante electroforesis en gel de agarosa para recuperar aproximadamente 2 \mug de un fragmento de aproximadamente 3,8 kb tratado con (KpnI con extremos truncados)-EcoRV de pSupex.

El fragmento resultante se disolvió en 44 \mul de H_{2}O, y a ésta se le añadieron, 5 \mul de una solución que contenía Tris-HCl 0,5 M (pH 8,5), EDTA 1 mM y una unidad de fosfatasa alcalina (fabricada por Boehringer Mannheim Co.) y se dejó reposar a 37ºC durante 30 minutos.

Se realizaron la extracción en fenol-cloroformo y la precipitación en etanol utilizando la solución de reacción para recuperar los fragmentos de ADN. En 20 \mul de un tampón de T4 ADN ligasa, se disolvieron 50 ng del fragmento SacII con extremos truncados de pNKM103 y 100 ng del fragmento de pSupex tratado con (KpnI con extremos truncados)-EcoRV después del tratamiento con fosfatasa alcalina, se le añadieron a esto 100 unidades de T4 ADN ligasa (fabricada por Takara Shuzo Co., Ltd.) y se realizó una ligadura a 16ºC durante 18 horas.

El JM109 de Escherichia coli se transformó para obtener el plásmido PYS201 (Fig. 38) utilizando el plásmido recombinante obtenido mediante la reacción.

Ejemplo 29 Expresión de la zona N-terminal del polipéptido que suprime el envejecimiento humano en Escherichia coli

El pYS201 obtenido en el Ejemplo 28 se introdujo en NY49 de Escherichia coli. La zona N-terminal del polipéptido que suprime el envejecimiento humano se expresó utilizando Escherichia coli por un método similar al del Ejemplo 7.

Es decir, se cultivó la Escherichia coli en 400 \mul de un medio mínimo M9 al que se añadieron 75 \mug/ml de ampicilina y 2 mg/ml de ácido casaminoico (medio descrito en Molecular Cloning, A Laboratory Manual) a 37ºC durante 2 horas, y a esto se le añadieron 50 \mug/ml de ácido indolacrílico, seguido de cultivo a 37ºC durante 18 horas.

Una fracción de 400 ml del cultivo resultante se centrifugó a 3.000 \times g durante 15 minutos, y el precipitado que contenía la Escherichia coli se puso en suspensión en 7 ml de Tampón 1 [tampón que contiene Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM y cloruro sódico 150 mM] y se descompuso la Escherichia coli por tratamiento ultrasónico.

La solución tratada se centrifugó a 10.000 \times g durante 30 minutos, y el precipitado resultante se disolvió en un tampón de muestra para electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida [tampón que contenía Tris-HCl 6 mM (pH 6,8), SDS al 2%, glicerol al 10% y 2-mercaptoetanol al 5%].

La solución se fraccionó por electroforesis en SDS-poliacrilamida, y el gel se tiñó con Coomassie Brilliant Blue.

Los resultados se presentan en la Fig. 39.

Se confirmó que se produjo la zona N-terminal del polipéptido que suprime el envejecimiento humano (en lo sucesivo denominada "péptido SUHN") que tiene un peso molecular de aproximadamente 26 kDa. En la electroforesis, se utilizaron fosforilasa b (94.400), albúmina de suero bovino (67.000), ovoalbúmina (45.000), anhidrasa carbónica (30.000), inhibidor de tripsina de soja (20.000) y lisozima (14.400) como marcadores moleculares.

Ejemplo 30 Construcción del vector pYS202 para expresar la zona C-terminal del polipéptido que suprime el envejecimiento humano

Ligando el fragmento EcoRV-(KpnI con extremos truncados) de pSupex preparado en el Ejemplo 28 y un fragmento KpnI-ApaI de 467 bp que contiene ADN que codifica el polipéptido que suprime el envejecimiento humano de pNKM103 descrito en el Ejemplo 5, se construyó el vector pYS202 para expresar la zona C-terminal del polipéptido que suprime el envejecimiento humano de la manera siguiente (Fig. 40).

A 30 \mul de un tampón que contenía Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), cloruro de magnesio 10 mM y DTT 1 mM, se añadieron 10 \mug del pNKM103 obtenido en el Ejemplo 5 y 20 unidades de cada uno de ApaI y KpnI se añadieron al tampón para reaccionar a 37ºC durante 4 horas.

Se realizaron la extracción en fenol-cloroformo y precipitación en etanol utilizando la solución de reacción para recuperar los fragmentos de ADN, y se sometieron a tratamiento del extremo truncado utilizando un kit de truncamiento de ADN (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.).

Los fragmentos de ADN tratados en la solución de reacción se fraccionaron mediante electroforesis en gel de agarosa para recuperar aproximadamente 0,3 \mug de un fragmento ApaI-KpnI con extremos truncados de aproximadamente 0,5 kb de pNKM103 que contenía el ADN que codifica un fragmento que contenía los restos de aminoácidos desde Phe^{801} hasta Pro^{864} en el polipéptido que suprime el envejecimiento representado por la SEC. ID. nº:1.

En 20 \mul de un tampón de T4 ADN ligasa, se disolvieron 50 ng del fragmento ApaI-KpnI con extremos truncados de pNKM103 y 100 ng de un fragmento tratado con (KpnI con extremos truncados)-EcoRV de pSupex después del tratamiento con fosfatasa alcalina descrito en el Ejemplo 28, se le añadieron a esto 100 unidades de T4 ADN ligasa (preparada por Takara Shuzo Co., Ltd.), y se realizó una ligadura a 16ºC durante 18 horas.

El JM109 de Escherichia coli se transformó utilizando el ADN plásmido recombinante obtenido mediante la reacción para obtener el plásmido pYS202 (Fig. 40).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 31 Expresión de la zona C-terminal del polipéptido humano que suprime el envejecimiento en Escherichia coli

El pYS202 obtenido en el Ejemplo 30 se introdujo en NY49 de Escherichia coli. La zona C-terminal del polipéptido humano que suprime el envejecimiento se expresó utilizando Escherichia coli por un método similar al del Ejemplo 7.

Es decir, se cultivó la Escherichia coli en 400 \mul de un medio mínimo M9 al que se le añadieron 75 \mug/ml de ampicilina y 2 mg/ml de ácido casaminoico a 37ºC durante 2 horas, y a esto se añadieron 50 \mug/ml de ácido indolacrílico, seguido de cultivo a 37ºC durante 18 horas.

Una fracción de 400 ml del cultivo resultante se centrifugó a 3.000 \times g durante 15 minutos, y el precipitado que contenía la Escherichia coli se puso en suspensión en 7 ml de Tampón 1 y se descompuso la Escherichia coli por tratamiento ultrasónico.

La solución tratada se centrifugó a 10.000 \times g durante 30 minutos, y el precipitado resultante se disolvió en un tampón de muestra para electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. La solución se fraccionó por electroforesis en SDS-poliacrilamida, y el gel se tiñó con Coomassie Brilliant Blue.

Los resultados se presentan en la Fig. 41.

Se confirmó que se produjo la zona C-terminal del polipéptido humano que suprime el envejecimiento (en lo sucesivo denominada "péptido SUHN") que tiene un peso molecular de aproximadamente 18 kDa. En la electroforesis, se utilizaron los mismos marcadores de peso molecular que en el Ejemplo 29.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 32 Generación del anticuerpo monoclonal que reacciona con parte del fragmento del polipéptido humano que suprime el envejecimiento

Los péptidos SUHN y SUHC producidos en el hospedador Escherichia coli en los Ejemplos 29 y 31, respectivamente, se purificaron por un método similar al del Ejemplo 8.

Los pesos moleculares de los péptidos purificados SUHN y SUHC fueron aproximadamente de 26 kDa y aproximadamente de 18 kDa, respectivamente.

Según el método descrito en el Ejemplo 8, se inmunizaron ratas, y se prepararon anticuerpos monoclonales por un método similar al del Ejemplo 9.

En la Tabla 3 se presenta una lista de los anticuerpos monoclonales producidos.

El hibridoma KM2070, el hibridoma KM2076, el hibridoma KM2105, el hibridoma KM2116 y el hibridoma KM2119 se depositaron como FERM BP-6196, FERM BP-6197, FERM BP-6198, FERM BP-6199 y FERM BP-6200, respectivamente, el 9 de diciembre de 1997 en el National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón
(código Zip 305).

TABLA 3

200

Ejemplo 33 Detección del polipéptido que suprime el envejecimiento utilizando anticuerpo monoclonal que reacciona con parte del fragmento del polipéptido humano que suprime el envejecimiento (1) Transferencia Western de la proteína murina completa expresada por CHO y tejido murino

El riñón y el hígado de un ratón ICR salvaje y el riñón y el hígado de un ratón ICR homocigótico (ratón viejo) se trituraron en un tampón de homogeneización [Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), sacarosa 0,25 M, EDTA 1 mM, EGTA 10 mM, 2-mercaptoetanol 10 mM] y se llevó a cabo la ultracentrifugación (100.000 \times g, 4ºC, una hora) para separar y recuperar la fracción de la membrana (precipitado) y la fracción del citoplasma (sobrenadante).

La fracción de la membrana resultante se disolvió en un tampón de disolución [Triton-X100 al 1%, Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM]. Además, las células CHO que expresan el tipo completo de membrana murinas descritas en el Ejemplo 11 se lavaron con PBS, y a continuación se disolvieron en un tampón de disolución. Se realizó la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida utilizando la fracción de la membrana y la fracción de citoplasma (20 \mug) de cada tejido y el lisado celular (2 \mug) de las células CHO que expresan el tipo completo de membrana murinas, y el sobrenadante del cultivo (15 \mul) de las células CHO que expresan el tipo completo de membrana murinas para transferir la proteína desde el gel a la membrana de PVDF.

Después de la transferencia, se realizó el bloqueo en PBS-Tween que contenía leche desnatada al 5% durante 20 minutos, y el sobrenadante del cultivo de cada hibridoma KM2076, hibridoma KM2116 e hibridoma KM2119 se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante una hora. Después de lavado en PBS-Tween durante una hora, se dejó reaccionar un anticuerpo contra inmunoglobulina de rata marcado con peroxidasa (Amersham Co., dilución de 4000 veces) como anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Después de la reacción, se lavó la membrana con PBS-Tween durante una hora, se dejó reaccionar un reactivo de detección para transferencia Western ECL (Amersham Co.), y la membrana se expuso a una película de rayos X para detectar las bandas.

Los resultados se presentan en las Figs. 42 y 43.

El KM2076 reconoció una banda de aproximadamente 130 kDa específicamente para el tipo salvaje en la fracción de la membrana de riñón. Debido a que la banda de aproximadamente 130 kDa es próxima al peso molecular estimado basándose en la secuencia de aminoácidos y es casi igual al tamaño de la proteína de tipo completo de la membrana murina expresada en las células CHO, la banda debería proceder de la proteína de tipo completo de la membrana. Además, el KM2076 reconoció una banda de aproximadamente 70 kDa en el sobrenadante del cultivo de las células CHO que expresan toda la longitud del tipo de membrana murina.

En la fracción de la membrana de riñón, el KM2119 reconoció una banda de aproximadamente 130 kDa de toda la longitud del tipo membrana y una banda de aproximadamente 60 kDa de manera específica para el tipo salvaje. Debido a que la banda de aproximadamente 60 kDa no fue detectada con el KM2076 (anticuerpo que reconoce el terminal N humano) sino detectado solamente con el KM2119 (anticuerpo que reconoce el terminal C humano), se sugiere que la banda podría ser un fragmento en el lado del terminal C de la proteína completa que queda después de la escisión del lado del terminal N. Entonces, la banda de aproximadamente 70 kDa en el sobrenadante del cultivo de las células CHO que expresan toda la longitud del tipo membrana murina reconocidas con el KM2076 sería un fragmento de escisión en el lado del terminal N. Además, el KM2119 reconoció una banda no específica de aproximadamente 66 kDa, que reaccionaba con las fracciones de citoplasma del riñón y del hígado del tipo salvaje y del homocigótico. Alternativamente, el KM2116 reconoció la proteína completa en la fracción de la membrana de riñón de manera específica para el tipo salvaje, y también detectó la banda no específica de aproximadamente 70 kDa.

(2) Inmunoprecipitación de la proteína murina completa expresada por CHO y de la proteína secretora humana expresada por CHO

Las células CHO que expresan la proteína completo de tipo membrana murina descritas en el Ejemplo 11 y las células CHO se disolvieron en un tampón de disolución [Triton-X100 al 1%, Tris-HCl 20 mM (pH 7,5) y NaCl 150 mM]. Se añadió un tampón de inmunoprecipitación [Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM] de 800 \mul a 200 \mul de la solución resultante hasta un volumen final total de 1 ml, se añadieron 25 \mul de proteína G-Sepharose 4FF (Pharmacia Co.) para reaccionar a 4ºC durante una hora. Se recuperó el sobrenadante del cultivo por centrifugación (1.000 \times g, 4ºC, 5 minutos), 1 \mug de cada uno de los anticuerpos KM2076 y KM2119 purificados se añadió a esto antes de la reacción a 4ºC durante una hora. Además todavía, 1 ml del sobrenadante del cultivo de las células CHO que expresan la proteína secretora humana se dejó reaccionar con KM2076 unido inicialmente a proteína G-Sepharose a 4ºC durante una hora de la misma manera que la descrita anteriormente. Después de lavar estos productos de reacción en un tampón para inmunoprecipitación, se recuperó el precipitado por centrifugación (10.000 \times g, 4ºC, 5 minutos) y a continuación se separaron por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida para transferir la proteína desde el gel sobre una membrana de PVDF. Se realizó el bloqueo en PBS-Tween que contenía leche descremada al 5% y se realizó la transferencia Western utilizando KM2076 y KM2119. Por consiguiente, como se muestra en la Fig. 44, la proteína de tipo completo de la membrana se recuperó por inmunoprecipitación utilizando KM2076, y la proteína de tipo completo de la membrana y la proteína del fragmento C-terminal se recuperaron por inmunoprecipitación utilizando KM2119. Como se muestra en la Fig. 45, asimismo, la proteína secretora humana se recuperó por inmunoprecipitación utilizando KM2076.

(3) Tinción del tejido inmunitario utilizando la sección del tejido humano

Los tejidos impregnados en formalina inmovilizada en parafina de dos muestras de riñón humano y dos muestras de hígado humano se cortaron finamente en 4 mm y se fijaron en un vidrio de portaobjetos. Se desparafinaron las secciones con xileno, se aumentó la hidrofilia de las secciones con alcohol-agua y se trataron las secciones con metanol que contenía una solución de peróxido de hidrógeno acuosa al 1% durante 15 minutos para bloquear la peroxidasa endógena. Se lavaron las secciones con PBS y se bloquearon con suero de caballo normal diluido durante 20 minutos y se dejaron reaccionar con KM2070 o KM2116 (10 mg/ml) a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de todo el lavado, un anticuerpo contra inmunoglobulina de rata marcado con biotina (Vector Co., dilución de 200 veces) se dejó reaccionar como el segundo anticuerpo a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después del lavado, el reactivo ABC (fabricado por Vector Co.) se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Tras el lavado con PBS, se llevó a cabo el desarrollo del color en una solución sustrato de diaminobencidina [producida disolviendo 50 mg de diaminobencidina en 150 ml de tampón Tris-HCl 0,1 M (pH 7,2), seguido de filtración, y 50 ml de peróxido de hidrógeno se añadió a ésta] durante aproximadamente un minuto, y a continuación se terminó la reacción enfriando con hielo. El núcleo se tiñó con hematoxileno, se deshidrataron las secciones con alcohol-agua y xileno y se sellaron con Enteran New para observación al microscopio. Como resultado, tal como se muestra en la Tabla 4, el KM2070 se dejó reaccionar con el túbulo urinífero renal y el músculo liso vascular del riñón humano, y el KM2116 se dejó reaccionar específicamente con el túbulo urinífero distal del riñón humano. Como para el hígado humano, tanto KM2070 como KM2116 se dejaron reaccionar con hepatocitos. Se demuestra que KM2116 es útil para el análisis de secciones patológicas humanas, además porque se detectó una banda en la fracción de la membrana del riñón del ratón ICR salvaje pero no se detectó en la fracción de la membrana del riñón del ratón homocigótico (ratón viejo) por transferencia Western con KM2116 (Fig. 43).

(4) Tinción de tejido inmunitario utilizando sección de tejido murino

Tejidos impregnados en formalina inmovilizada en parafina de dos muestras de riñón y de hígado de ratón ICR salvaje y dos muestras de riñón y de hígado de ratón ICR homocigótico (ratón viejo) se cortaron finamente en 4 mm y se fijaron en un vidrio de portaobjetos. De la misma manera que para KM2070 y KM2116 en (1), se tiñeron los tejidos inmunitarios con KM2070 y KM2105 (10 mg/ml). En consecuencia, como se muestra en la Tabla 4, tanto KM2070 como KM2105 se dejaron reaccionar con el túbulo urinífero renal de manera específica para el tipo salvaje. Sin embargo, KM2070 se dejó reaccionar con el músculo liso vascular tanto de tipo salvaje como homocigótico. Además, se dejaron reaccionar KM2070 y KM2105 con las células de hígado tanto de tipo salvaje como
homocigótico.

TABLA 4

3

Aplicabilidad industrial

La presente invención puede proporcionar un polipéptido con una actividad que suprime el envejecimiento; un agente terapéutico para un síndrome que se asemeja al envejecimiento prematuro, un agente terapéutico para enfermedades de adultos o un agente que suprime el envejecimiento, comprendiendo cada uno el polipéptido; el ADN que codifica el polipéptido; el agente terapéutico para un síndrome que se asemeja al envejecimiento prematuro, un agente terapéutico para enfermedades de adultos o un agente que suprime el envejecimiento, comprendiendo cada uno el ADN; un método para prolongar la vida de animales de granja no humanos que comprende expresar en exceso el ADN según la reivindicación 1 un ADN recombinante preparado incorporando el ADN en un vector; una célula huésped que contiene el vector recombinante; un método para producir el polipéptido de la presente invención que utiliza la célula huésped; un anticuerpo que reconoce el polipéptido; un método de análisis del polipéptido de la presente invención o un método para diagnosticar el envejecimiento, utilizando el anticuerpo; y un método para la identificación de un compuesto que potencia la expresión de un gen que suprime el envejecimiento que codifica el polipéptido que suprime el envejecimiento de la presente invención.

SEC. ID. nº: 1

LONGITUD DE LA SECUENCIA: 1.012

TIPO DE SECUENCIA: aminoácido

NÚMERO DE CADENAS: una

CONFIGURACIÓN: lineal

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

FUENTE ORIGINAL:

\hskip0,2cm Organismo: humano

\hskip0,2cm Organización: riñón

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA:

4

5

6

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID. nº: 2

LONGITUD DE LA SECUENCIA: 549

TIPO DE SECUENCIA: aminoácido

NÚMERO DE CADENAS: una

CONFIGURACIÓN: lineal

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

FUENTE ORIGINAL:

\hskip0,2cm Organismo: humano

\hskip0,2cm Organización: riñón

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

7

8

9

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID. nº: 3

LONGITUD DE LA SECUENCIA: 1.014

TIPO DE SECUENCIA: aminoácido

NÚMERO DE CADENAS: una

CONFIGURACIÓN: lineal

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

FUENTE ORIGINAL:

\hskip0,2cm Organismo: ratón

\hskip0,2cm Organización: riñón

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

10

11

12

SEC. ID. nº: 4

LONGITUD DE LA SECUENCIA: 550

TIPO DE SECUENCIA: aminoácido

NÚMERO DE CADENAS: una

CONFIGURACIÓN: lineal

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

FUENTE ORIGINAL:

\hskip0,2cm Organismo: ratón

\hskip0,2cm Organización: riñón

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

14

15

SEC. ID. nº: 5

LONGITUD DE LA SECUENCIA: 1.015

TIPO DE SECUENCIA: aminoácido

NÚMERO DE CADENAS: una

CONFIGURACIÓN: lineal

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

FUENTE ORIGINAL:

\hskip0,2cm Organismo: humano

\hskip0,2cm Organización: páncreas

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA:

16

17

18

19

SEC. ID. nº: 6

LONGITUD DE LA SECUENCIA: 3.163

TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico

NÚMERO DE CADENAS: dos

CONFIGURACIÓN: lineal

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

FUENTE ORIGINAL:

\hskip0,2cm Organismo: humano

\hskip0,2cm Organización: riñón

CARACTERÍSTICAS

DENOMINACIÓN/CLAVE: CDS

POSICIÓN: 9…3.047

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: E

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

20

21

22

23

24

SEC. ID. nº: 7

LONGITUD DE LA SECUENCIA: 3.435

TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico

NÚMERO DE CADENAS: dos

CONFIGURACIÓN: lineal

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

FUENTE ORIGINAL:

\hskip0,2cm Organismo: humano

\hskip0,2cm Organización: riñón

CARACTERÍSTICAS

DENOMINACIÓN/CLAVE: CDS

POSICIÓN: 9...1.655

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: E

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA:

25

26

27

28

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID. nº: 8

LONGITUD DE LA SECUENCIA: 5.032

TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico

NÚMERO DE CADENAS: dos

CONFIGURACIÓN: lineal

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

FUENTE ORIGINAL:

\hskip0,2cm Organismo: ratón

\hskip0,2cm Organización: riñón

CARACTERÍSTICAS

DENOMINACIÓN/CLAVE: CDS

POSICIÓN: 19...3.060

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: E

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

29

30

31

32

33

SEC. ID. nº: 9

LONGITUD DE LA SECUENCIA: 1.650

TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico

NÚMERO DE CADENAS: dos

CONFIGURACIÓN: lineal

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

FUENTE ORIGINAL:

\hskip0,2cm Organismo: ratón

\hskip0,2cm Organización: riñón

CARACTERÍSTICAS

DENOMINACIÓN/CLAVE: CDS

POSICIÓN: 1...1.650

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: E

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

35

36

37

SEC. ID. nº: 10

LONGITUD DE LA SECUENCIA: 3.460

TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico

NÚMERO DE CADENAS: dos

CONFIGURACIÓN: lineal

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

FUENTE ORIGINAL:

\hskip0,2cm Organismo: humano

\hskip0,2cm Organización: páncreas

CARACTERÍSTICAS

DENOMINACIÓN/CLAVE: CDS

POSICIÓN: 60...3.107

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: E

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA:

38

39

40

41

42

SEC. ID. nº: 11

LONGITUD DE LA SECUENCIA: 20

TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico

NÚMERO DE CADENAS: una

CONFIGURACIÓN: lineal

TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGCTCATCA GAGGAACTGC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID. nº: 12

LONGITUD DE LA SECUENCIA: 20

TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico

NÚMERO DE CADENAS: una

CONFIGURACIÓN: lineal

TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGACAGAAG CTGCCTCAGG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID. nº: 13

LONGITUD DE LA SECUENCIA: 27

TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico

NÚMERO DE CADENAS: una

CONFIGURACIÓN: lineal

DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID. nº: 14

LONGITUD DE LA SECUENCIA: 21

TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico

NÚMERO DE CADENAS: una

CONFIGURACIÓN: lineal

TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTAGTGAGGA AGCAAGAGGC C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID. nº: 15

LONGITUD DE LA SECUENCIA: 34

TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico

NÚMERO DE CADENAS: una

CONFIGURACIÓN: lineal

TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAAAGCTTCC ACAATGCTAG CCCGCGCCCC TCCT

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID. nº: 16

LONGITUD DE LA SECUENCIA: 34

TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico

NÚMERO DE CADENAS: una

CONFIGURACIÓN: lineal

TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGGATCCTT AGTGAGGAAG CAAGAGGCCG ACAC

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID. nº: 17

LONGITUD DE LA SECUENCIA: 21

TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico

NÚMERO DE CADENAS: una

CONFIGURACIÓN: lineal

TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\newpage

SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGTTTTGTC AAAGGACTTA C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID. nº: 18

LONGITUD DE LA SECUENCIA: 20

TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico

NÚMERO DE CADENAS: una

CONFIGURACIÓN: lineal

TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGCTCATCA GAGGAACTGC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID. nº: 19

LONGITUD DE LA SECUENCIA: 22

TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico

NÚMERO DE CADENAS: una

CONFIGURACIÓN: lineal

TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGCCAGGCTC TGGACGATGA CC

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID. nº: 20

LONGITUD DE LA SECUENCIA: 24

TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico

NÚMERO DE CADENAS: una

CONFIGURACIÓN: lineal

TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCTGACTGC ATCTAGAACT ACTG

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID. nº: 21

LONGITUD DE LA SECUENCIA: 43

TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico

NÚMERO DE CADENAS: una

CONFIGURACIÓN: lineal

TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGATAAGCTA TGAAAACTAC AGCCTTGGAG GAAGCTTAAA TGG

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID. nº: 22

LONGITUD DE LA SECUENCIA: 41

TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico

NÚMERO DE CADENAS: una

CONFIGURACIÓN: lineal

TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCATTTAAGC TTCCTCCAAG GCTGTAGTTT TCATAGCTTA T

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID. nº: 23

LONGITUD DE LA SECUENCIA: 44

TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico

NÚMERO DE CADENAS: una

CONFIGURACIÓN: lineal

TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCTTAAATG AGCTCGATAT CAAGGCCTAC CCGGGCGCCA TGCA

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID. nº: 24

LONGITUD DE LA SECUENCIA: 36

TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico

DE CADENAS: una

CONFIGURACIÓN: lineal

TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGCGCCCGG GTAGGCCTTG ATATCGAGCT CATTTA

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID. nº: 25

LONGITUD DE LA SECUENCIA: 18

TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico

NÚMERO DE CADENAS: una

CONFIGURACIÓN: lineal

TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTGGTCGAC CATTTCAG

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID. nº: 26

LONGITUD DE LA SECUENCIA: 25

TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico

NÚMERO DE CADENAS: una

CONFIGURACIÓN: lineal

TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\newpage

SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCACAAAGT CGACAGACTT CTGGC

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID. nº: 27

LONGITUD DE LA SECUENCIA: 19

TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico

NÚMERO DE CADENAS: una

CONFIGURACIÓN: lineal

TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGAGATTGG AAGTGGACG

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID. nº: 28

LONGITUD DE LA SECUENCIA: 20

TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico

NÚMERO DE CADENAS: una

CONFIGURACIÓN: lineal

TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAAGGACCAG TTCATCATCG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID. nº: 29

LONGITUD DE LA SECUENCIA: 20

TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico

NÚMERO DE CADENAS: una

CONFIGURACIÓN: lineal

TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTAAGGACTC CTGCATCTGC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

LISTADO DE SECUENCIAS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<110> Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> PROTEÍNA QUE PRESENTA UNA ACTIVIDAD DE SUPRESIÓN DEL ENVEJECIMIENTO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> D 1860 EP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140> EP 97 94 7918.5

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 1997-12-12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> JP 8/347871

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1996-12-26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> JP 9/205815

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1997-07-31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> PCT/JP97/04585

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1997-12-12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver 2.1.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1012

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Organización: riñón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

43

44

45

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 549

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

47

48

49

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1014

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ratón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Organización: páncreas

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

50

51

52

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 550

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ratón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Organización: riñón

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

54

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1015

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Organización: páncreas

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

56

57

58

59

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3163

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Organización: riñón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)..(3047)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Método de identificación: E

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

61

62

63

64

65

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3435

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Organización: riñón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)..(1655)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Método de identificación: E

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

66

67

68

69

70

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5032

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ratón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Organización: riñón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (19)..(3060)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Método de identificación: E

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

71

72

73

74

75

76

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1650

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ratón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Organización: riñón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(1650)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Método de identificación: E

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

77

78

79

80

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3460

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Organización: páncreas

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (60)..(3107)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Método de identificación: E

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

81

82

83

84

85

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggctcatca gaggaactgc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagacagaag ctgcctcagg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccatcctaat acgactcact atagggc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttagtgagga agcaagaggc c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caaagcttcc accatgctag cccgcgcccc tcct

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caggatcctt agtgaggaag caagaggccg acac

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggttttgtc aaaggactta c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggctcatca gaggaactgc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaccaggctc tggacgatga cc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtctgactgc atctagaact actg

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgataagcta tgaaaactac agccttggag gaagcttaaa tgg

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccatttaagc ttcctccaag gctgtagttt tcatagctta t

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agcttaaatg agctcgatat caaggcctac ccgggcgcca tgca

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggcgcccgg gtaggccttg atatcgagct cattta

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctggtcgac catttcag

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agcacaaagt cgacagactt ctggc

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggagattgg aagtggacg

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caaggaccag ttcatcatcg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttaaggactc ctgcatctgc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

LISTADO DE SECUENCIAS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<110> Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> NUEVO POLIPÉPTIDO, NUEVO ADN Y NUEVO ANTICUERPO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> D 1860 EP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140> EP 97 94 7918.5

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 1997-12-12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> JP 8/347871

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1996-12-26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> JP 9/205815

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1997-07-31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> PCT/JP97/04585

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1997-12-12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1012

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Organización: riñón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

86

87

88

89

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 549

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Organización: riñón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

90

91

92

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1014

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ratón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Organización: riñón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

93

94

95

96

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 550

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ratón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Organización: riñón

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

97

98

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1015

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Organización: páncreas

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

99

101

100

102

103

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3163

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Organización: riñón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)..(3047)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Método de identificación: E

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

104

105

106

107

108

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3435

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Organización: riñón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)..(1655)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Método de identificación: E

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

109

110

111

112

113

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5032

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ratón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Organización: riñón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (19)..(3060)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Método de identificación: E

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

114

115

116

117

118

119

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1650

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ratón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Organización: riñón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1650)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Método de identificación: E

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

120

121

122

123

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3460

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Organización: páncreas

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (60)..(3107)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Método de identificación: E

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

124

125

126

127

128

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggctcatca gaggaactgc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagacagaag ctgcctcagg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccatcctaat acgactcact atagggc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttagtgagga agcaagaggc c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

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<400> 15

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\hskip-.1em\dddseqskip

caaagcttcc accatgctag cccgcgcccc tcct

\hfill

34

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

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<211> 34

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

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<400> 16

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\hskip-.1em\dddseqskip

caggatcctt agtgaggaag caagaggccg acac

\hfill

34

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

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<400> 17

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\hskip-.1em\dddseqskip

gggttttgtc aaaggactta c

\hfill

21

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<210> 18

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

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<400> 18

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\hskip-.1em\dddseqskip

aggctcatca gaggaactgc

\hfill

20

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<210> 19

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

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<400> 19

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\hskip-.1em\dddseqskip

gaccaggctc tggacgatga cc

\hfill

22

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<210> 20

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

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<400> 20

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\hskip-.1em\dddseqskip

gtctgactgc atctagaact actg

\hfill

24

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<210> 21

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<211> 43

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

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<400> 21

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cgataagcta tgaaaactac agccttggag gaagcttaaa tgg

\hfill

43

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<210> 22

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<211> 41

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

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<400> 22

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ccatttaagc ttcctccaag gctgtagttt tcatagctta t

\hfill

41

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<210> 23

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<211> 44

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

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<400> 23

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\hskip-.1em\dddseqskip

agcttaaatg agctcgatat caaggcctac ccgggcgcca tgca

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44

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<210> 24

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<211> 36

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<400> 24

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tggcgcccgg gtaggccttg atatcgagct cattta

\hfill

36

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<210> 25

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<211> 18

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

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cctggtcgac catttcag

\hfill

18

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<210> 26

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<211> 25

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

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<400> 26

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agcacaaagt cgacagactt ctggc

\hfill

25

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<210> 27

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<211> 19

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<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

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\hskip-.1em\dddseqskip

tggagattgg aagtggacg

\hfill

19

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<210> 28

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

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<400> 28

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caaggaccag ttcatcatcg

\hfill

20

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<210> 29

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

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<400> 29

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ttaaggactc ctgcatctgc

\hfill

20

Claims

1. ADN que codifica un polipéptido que presenta una actividad de supresión del envejecimiento, seleccionándose dicho ADN de entre el grupo constituido por:

(a): ADN que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre las secuencias de aminoácidos representado por las SEC. ID. nº: 1, nº: 2 y nº: 3;

(b): ADN que comprende una secuencia de ADN seleccionada de entre las secuencias de ADN representadas por las SEC. ID. nº: 6, nº: 7 y nº: 8; y

(c): ADN que se hibrida con un ADN descrito en (a) o (b) en condiciones severas.

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2. Vector recombinante preparado insertando el ADN según la reivindicación 1 en un vector.

3. Célula huésped que contiene el vector recombinante según la reivindicación 2.

4. Célula huésped según la reivindicación 3, en la que la célula huésped es una célula huésped seleccionada de entre Escherichia coli ENKM101 (FERM BP-5765), Escherichia coli ENKM103 (FERM BP-5942) y Escherichia coli ENKH106 (FERM BP-5767).

5. Método para la preparación de un polipéptido que presenta una actividad de supresión del envejecimiento, que comprende cultivar la célula huésped según la reivindicación 3 ó 4 en un cultivo para producir y acumular el polipéptido codificado por el vector recombinante según la reivindicación 2 durante el cultivo y recuperar el polipéptido del cultivo.

6. Polipéptido que presenta una actividad de supresión del envejecimiento y que está codificado por el ADN según la reivindicación 1, o que puede obtenerse por el método según la reivindicación 5.

7. Anticuerpo que reconoce el polipéptido según la reivindicación 6.

8. Hibridoma que produce el anticuerpo según la reivindicación 7.

9. Hibridoma según la reivindicación 8, en el que el hibridoma es KM 1902 (FERM BP-5983).

10. Agente terapéutico que comprende el polipéptido según la reivindicación 6.

11. Método para detectar inmunológicamente el polipéptido según la reivindicación 6 in vitro, utilizando el anticuerpo según la reivindicación 7.

12. Método según la reivindicación 11, en el que la detección de una disminución en la expresión del polipéptido que suprime el envejecimiento en una muestra de un paciente indica la aparición de un síndrome que se asemeja al envejecimiento prematuro.

13. Método para prolongar la vida de animales de granja no humanos que comprende expresar en exceso el ADN según la reivindicación 1.

14. Método para el cribado de un compuesto que aumenta la expresión de un gen que codifica el polipéptido según la reivindicación 6, comprendiendo dicho método poner una célula que expresa el polipéptido según la reivindicación 6 en contacto con una muestra de ensayo, analizar el contenido del polipéptido según la reivindicación 6 expresado por la célula que utiliza el anticuerpo según la reivindicación 7, comparar el contenido del polipéptido con el de un sistema sin adición del compuesto e identificar el compuesto que aumenta el contenido del polipéptido.

15. Método para el cribado de un compuesto que aumenta la expresión de un gen que codifica el polipéptido según la reivindicación 6, comprendiendo dicho método poner una célula que expresa el polipéptido según la reivindicación 6 en contacto con una muestra de ensayo, analizar el contenido del producto de transcripción del gen que codifica el polipéptido según la reivindicación 6, comparar el contenido del producto de transcripción con el de un sistema sin adición del compuesto e identificar el compuesto que aumenta el contenido del producto de transcripción.

16. Método para el cribado de un compuesto que aumenta la expresión de un gen que codifica el polipéptido según la reivindicación 6, comprendiendo dicho método poner una muestra de ensayo en contacto con una célula transformada con un plásmido que contiene ADN al que se ha ligado un gen indicador corriente abajo de una zona de control de la transcripción de un gen que codifica el polipéptido según la reivindicación 6, analizar el nivel de expresión del polipéptido codificado por el gen indicador e identificar el compuesto que aumenta el nivel de
expresión.

17. Polipéptido constituido por una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por:

(a): la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 34º al 1012º representada por la SEC. ID. nº: 1;

(b): la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 34º al 549º representada por la SEC. ID. nº: 2; y

(c): la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 36º al 1014º representada por la SEC. ID. nº: 3.