KR100337383B1 - 로타바이러스에 대한 난황항체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 로타바이러스에 대한 난황항체에 관한 것으로, 동물에 주입하여 면역시킨 다음 상기 동물에서 배출되어지는 것을 특징으로 하는 난과 난으로부터 분리한 난황항체를 제공한다. 본 발명의 로타바이러스 난황항체는 로타바이러스에 작용하여 감염성을 저해할 뿐만 아니라 동물에 대해 독성을 가지지 않는다. 따라서, 본 발명의 로타바이러스 난황항체는 로타바이러스 예방 및 치료보조제로 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 로타바이러스에 대한 난황항체에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 사람에 작용하여 설사증을 유발하는 로타바이러스를 동물에 주입하여 면역시켜 제조하는 로타바이러스의 난황항체에 관한 것이다.
전세계적으로 사람의 로타바이러스(Rotavirus)는 어린아이에게 급성장염을 일으키는 주요한 원인체로 알려져 있다.(Bryden A. S., H. A. Davies, R. E. Hadley, and T. H. Flewett(1975)Lancet. 2:241-243 ; O'Ryan M. L., D. O. Matson, M. K. Estes, A. V. Bartlett, and L. K. Pickering(1990)J. Infect. Dis.162:810-816 ; Rasool N. B. G., K. Y. Green, and A. Z. Kapikian(1993)J. Clin. Microbiol.31:1815-1819 ; Fang Z. Y., R. I. Glass, M. Penaranda, H. Dong, S. S. Monroe, L. Wen, M. K. Estes, J. Eiden, R. H. Yolken, and L. J. Saif(1989)J. Virol. 63:2191-2197 ; Matsumoto K., M. Hatano, K. Kobayashi, A. Hasegawa, S. Yamazaki, S. Nakada, S. Chiba, and Y. Kimura(1989)J. Infect. Dis. 160:611-615) 사람 로타바이러스는 5세까지 감수성이 있으며, 주로 생후 6개월에서 3세까지의 어린이에 발병하고, 계절적으로는 겨울철에 발생한다.(Davidson G. P., R. F. Bishop, R. R. Townley, and I. H. Holmes(1975)Lancet. 1:242-246) Woode 등은 사람에서 분리된 로타바이러스는 다른 포유동물에서 분리된 로타바이러스와 내측 캡시드층(inner capsid layer)에 공통항원을 가지고 있어 항원적으로 밀접한 관련이 있으며, 이들은 모두 로타바이러스에 속한다고 하였다.(Woode G. N., J. C. Bridger, J. M. Jones, T. H. Flewette, H. A. Davis, and G. B. White (1976)Infect. Immun. 14:804-810)
로타바이러스의 유전자는 6개의 구조단백(VP1, VP2, VP3, VP4, VP6, VP7)과 5개의 비구조단백(NSP1, NSP2, NSP3, NSP4, NSP5)을 암호하고 있다.(Bernstein D.I., and R. L. Ward (1998) Rotaviruses : textbook of pediatric infectious diseases. 4th ed. Philadelphia :WB Saunders. 1901-1922) VP1과 VP3은 내부핵(inner core) 단백으로 각각 RNA 중합효소와 구아닌전달효소(guanyl transferase)이며, VP2는 내측 캡시드 단백으로 RNA 결합과 루신지퍼(leucine zipper)의 기능을 가지고 있다. VP4는 외측 캡시드 단백으로 혈구응집, 중화항체형성, 수용체결합 및 푸소제닉(fusogenic) 단백질의 기능을 가지고 있다. VP6는 중앙에 위치하는 캡시드(intermediate capsid) 단백으로 군(group) 및 하위군 (subgroup) 항원성을 가지고 있으며, VP7은 외부 캡시드 단백으로 중화항체형성의 기능을 가지고 있다. NSP1은 비구조단백으로 징크핑거(zinc fingers)를 함유하고 있고, NSP2와 NSP3는 RNA와 결합한다. NSP4는 비구조당단백으로 트랜스멤브레인 (transmembrane)이며 NSP5는 인산화되어 있다.(Estes M. K., and J. Cohen(1989)Microbiol. Rev. 53:410-4490)
11개의 분절로 된 로타바이러스 dsRNA는 2.2 ×106내지 0.2 ×106의 분자량을 가지는데 분자량에 따라 4개의 군으로 나뉘어진다. 혈청군(serogroup)A에 속하는 로타바이러스는 단편 1에서 4는 Ⅰ군, 단편 5와 6은 Ⅱ군, 단편 7에서 9는 Ⅲ군, 그리고 단편 10과 11은 Ⅳ군으로 나뉘어지며, 4:2:3:2의 RNA 이동 양상을 나타낸다.(Estes M. K., and J. Cohen. (1989)Microbiol. Rev. 53:410-449) 혈청군 B에 속하는 로타바이러스는 4:2:2:3의 RNA 이동양상을 나타내며, 혈청군 C는 4:3:2:2의 RNA 이동양상을 나타낸다.(Bridger J. C.(1987)Ciba Found Symp.128:5-23 ; Pedley S., J. C. Bridger, J. F. Brown, and M. A. McCrae(1983)J. Gen. Virol. 64:2093-2101) 이들 dsRNA 단편은 아가로즈와 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동에서 전개시켰을 때 바이러스의 종류에 따라 특이적인 이동 양상을 나타내므로 바이러스의 혈청군을 구별하는데 유용하게 쓰이며 이것을 이용하여 로타바이러스의 역학적인 조사가 가능하다.(Holmes I. H. (1996)Arch. Virol. Suppl.12:8-91)
로타바이러스는 항원분석에 따라 혈청군, 하위군(subgroup) 그리고 혈청형(serotype)으로 구분된다. 혈청군은 공통항원인 VP6와 RNA 게놈의 일렉트로페로타입(electrophero형)의 차이에 따라 A부터 G까지 7개의 혈청군으로 구분되며, 사람 로타바이러스에는 3종류의 혈청군(A, B, C)이 존재하고 있는 것으로 알려져 있고, 이중 혈청군 A가 사람과 동물에서 위장염을 일으키는 주요한 원인체이다.(Tsunemitsu H, B. M. Jiang, and L. J. Saif(1992)J. Clin. Microbiol. 30:2129-2134 ; Tsunemitsu H, B. M. Jiang, Y. Yamashita, M. Oseto, H. Ushijima, and L. J. Saif(1992)J. Clin. Microbiol.30:3009-3012 ; Jiang B. M., Y. Qian, H. Tsunemitsu, K. Y. Green, and L. J. Saif. (1991)Virology. 184:433-436) 그러나 혈청군 B 로타바이러스는 중국에서 1982년에 유행한 적이 있으며, 일본에서는 혈청군 C에 속하는 로타바이러스에 의한 대규모의 설사증이 발생된 바 있다. 혈청군 A에 속하는 사람 로타바이러스는 VP6의 항원적인 변화에 따라 구분되는 두 개의 하위군(Ⅰ 과 Ⅱ)이 존재하는데 10번째와 11번째 유전자의 전기영동상 이동 양상에 따라 느린 것은 S형, 그리고 빠른 것은 L형으로 표시하는데 S형은 하위군Ⅰ에 속하며 L형은 하위군Ⅱ에 속한다.(Kutsuzawa T., T. Konno, H. Suzuki, A. Z. Kapikian, T. Ebina, and N. Ishida. (1982)J. Clin. Microbiol. 16:727-730)
로타바이러스는 단백질항원의 특이성에 따라 각각 P 형(protease sensitive protein 형)과 G 형(glycoprotein 형)으로 분류되어진다. 외층의 캡시드 당단백질(capsid glycoprotein)인 VP7에 의해 구분되는 혈청형을 G 혈청형이라 하며 지금까지 혈청군 A에는 14개의 G 형 혈청형이 보고되었으며,(Santos N., M. Riepenhoff-talty, H. F. Clark, P. Offit, and V. Gouvea. (1990)J. Clin. Microbiol. 32:205-208) 주로 G1∼G4가 사람에서 질병을 일으키는 것으로 보고되었다.(Parwani A. V., B. I. Rosen, J. Flores, M. A. McCrae, M. Gorziglia, and L. J. Saif. (1992)J. Vet. Diagn. Invest. 4:148-158 ; Shaw R. D., D. L. Stoner-Ma, M. K. Estes, and H. B. Greenberg. (1985)J. Clin. Microbiol.22:286-291) 현재 P 형과 G 형을 구분하는 방법으로는 플라그 감소 중화법(plaque reduction neutralization)과 형광 초점 중화법(fluorescence focus neutralization ; FFN), 그리고 각각의 혈청형에 특이적인 단크론항체를 이용한 ELISA, 혈청형에 특이적인 프로브를 이용한 하이브리디제이션, RT-PCR, 그리고 염기서열분석 등이 있다.(Flores J., J. Sears, I. Perez-Schael, L. White, D. Garcia C. Lanata, and A. Z. Kapikian. (1990)J. Virol.64:4021-4024 ; Hussein H. A., A. V. Parwani, B. I. Rosen, A. Lucchelli, and L. J. Saif. (1993)J. Clin. Microbiol. 31:2491-2496 ; Rosen B. I., A. V. Parwani, S. Lopez, J. Flores andL. J. Saif.(1994)J. Clin. Microbiol.32:311-317 ; Gouvea V., N. Santos, and M.C. Timenetsky. (1994)J. Clin. Microbiol.32:1338-1340.)
로타바이러스의 분리를 위하여 1943년 Light와 Hode는 신생아의 설사변으로부터 분리한 여과성 병원체를 송아지의 비강에 접종하여 위장염을 유발시켰고, 이 설사변을 여과하여 동결건조한 샘플을 전자현미경으로 관찰한 결과 로타바이러스 입자를 확인할 수 있었다.(Saif L. J., B. I. Rosen, S. Y. Kang, and K. L. Miller. (1988)J. Tissue Culture. Meth.11:147-156) 이후에 여러 종류의 동물에서 로타바이러스가 확인되었는데 마우스에서 분리한 영아마우스의 가축유행성 디아헤라(epizootic diarrhea of infant mice. EDIM, Adams W. R., and L. M. Kraft. (1963)Science. 141:359-360), 원숭이에서 분리한 SA11(Malherbe H. H., and M. Strickland-Chomley. (1967)Arch. Gesamte. Virusforche.22:235-245)과 O agent(Lecatsas G. (1972)J. Vet. Res.39:133-137), 송아지로부터 분리한 네브라스카 송아지 디아헤라 바이러스(Nebraska calf diarrhea virus; NCDV, Fernelius A. L., A. E. Ritchie, L. J. Classick, J. O. Norman, and C. A. Mebus. (1972)Arch. ges. Virusfosch. 37:114-130)등이 있다.
로타바이러스를 세포에 적응시키기 위한 전 단계로 노토바이오틱 동물(gnotobiotic animal)을 이용하여 바이러스의 계대배양을 시도하였는데 Mebus 등은 최초로 송아지에 여과된 병원체를 접종하여 시험적인 감염을 일으켰으며 로타바이러스의 계대를 할 수 있었다.(Mebus C. A., M. Kono, and N. R. Underdahl.(1971)Can. Vet. J. 12:69-72) 로타바이러스를 세포에 적응시키기 위한 시도가 초대 배양한 여러 동물의 신장세포를 이용하여 이루어졌으며 Malherbe 등은 1967년 처음으로 원숭이 신장세포(primary velvet monkey kidney; VMK cell)에서 SA11을 분리하였다. 1977년 트립신의 단백분해에 의한 바이러스 활성화의 발견과 MA104를 비롯한 여러 동물유래 신장세포주의 이용은 로타바이러스의 분리와 배양에 큰 촉진제가 되었다.
사람 로타바이러스는 세포배양법을 이용하여 분리하는 것이 어려운 것으로 알려져 왔으나 1980년 Wyatt 등(Wyatt R. G., W. D. James, E. H. Bohl, K. W. Theil, L. J. Saif, A. R. Kalica, H. B. Greenberg, A. Z. Kapikian, and R. M. Chanock. (1980)Science.207:189-191)은 사람 로타바이러스(Wa strain)의 배양을 위하여 신생 노토바이오틱 돼지에 바이러스를 11차례 계대시킨 후 AGMK(African green monkey kidney) 세포에 초대배양하여 바이러스를 분리하였다. 사람 로타바이러스의 분리를 위하여 1981년 Sato(Sato K., Y. Inaba, T. Shinozaki, R. Fujii, and M. Matumoto. (1981)Arch. Virol.69:155-160)과 Urasawa(Urasawa T., S. Urasawa, and K. Taniguchi. (1981)Microbiol. Immunol.25:1025-1035)은 분변재료의 트립신 처리와 MA104 세포의 회전배양으로 분변으로부터 로타바이러스를 직접 분리하는데 성공하였으며, 이후 분변 중에서 검출되는 대부분의 군에 속하는 사람 로타바이러스가 세포배양을 통해 분리되었다.(Konno T., T. Kutsuzawa, and H. Suzuki. (1983)Nestle Vevey.31-37)
사람에서의 로타바이러스 감염증은 우리 나라에서도 많이 발생되어 우리나라실정에 맞는 백신주에 대한 항원개발이 요구되어진다.
따라서, 본 발명은 한국사람에게서 많이 발생되는 로타바이러스를 분리하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 로타바이러스의 항원을 이용하여 특이난황 항체(Specific IgY)를 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1은 분변재료에서 분리한 RNA를 전기영동하여 밴드의 이동양상을 확인한 것으로, 밴드가 4:2:3:2의 이동양상을 나타낸 것이고,
도 2는 본 발명의 분변샘플에서 분리한 로타바이러스의 세포변성효과를 확인한 사진으로, a는 감염되지 않은 MA104세포를 관찰한 것이고, b는 로타바이러스 감염 후 24시간 지난 다음 MA104세포를 관찰한 것이고,
도 3은 본 발명의 분변샘플에서 분리한 로타바이러스를 간접형광항체법으로 확인한 사진으로, a는 로타바이러스에 감염되지 않은 MA104 세포를 로타바이러스 항체로 반응시킨 것이고, b는 로타바이러스에 감염된 MA104 세포를 로타바이러스 항체로 반응시킨 것이고,
도 4는 본 발명의 분변세포에서 분리한 로타바이러스를 전자현미경으로 관찰한 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은(a) CBNU/HR-1(KCTC 0908BP), CBNU/HR-2(KCTC 0909BP), CBNU/HR-3(KCTC 0910BP) 및 CBNU/HR-4(KCTC 0911BP)로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 로타바이러스를 숙주세포에 감염시켜 배양하고;(b) 상기 숙주세포의 세포변성효과(cytopathogenic effect)를 유도하고;(c) 상기 세포변성된 배양액 상청액을 원심분리로 수득하고;(d) 상기 상청액에 포르말린을 첨가하여 37 ℃에서 반응시키고;(e) 상기 반응액을 투석하고;(f) 상기 투석액을 열처리하고;(g) 상기 열처리된 반응물을 여과하여 항원액을 준비하고; 및(h) 상기 항원액을 산란계에 주입하여 면역시켜 상기 산란계에서 배출되는 것을 특징으로 하는 난을 제공한다.
또한 본 발명은(a) CBNU/HR-1(KCTC 0908BP), CBNU/HR-2(KCTC 0909BP), CBNU/HR-3(KCTC 0910BP) 및 CBNU/HR-4(KCTC 0911BP)로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 로타바이러스를 숙주세포에 감염시켜 배양하고;(b) 상기 숙주세포의 세포변성효과(cytopathogenic effect)를 유도하고;(c) 상기 세포변성된 배양액 상청액을 원심분리로 수득하고;(d) 상기 상청액에 포르말린을 첨가하여 37 ℃에서 반응시키고;(e) 상기 반응액을 투석하고;(f) 상기 투석액을 열처리하고;(g) 상기 열처리된 반응물을 여과하여 항원액을 준비하고;(h) 상기 항원액을 산란계에 주입하여 면역시키고; 및(i) 상기 산란계의 난으로부터 항체를 분리하는 것을 특징으로 하는 로타바이러스 난황항체 제공한다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 한국사람에게서 발병율이 높은 로타바이러스를 제공한다. 상기 로타바이러스는 급성장염의 증세를 나타내는 어린아이들의 분변에서 분리하여 수득하였고, 로타바이러스의 혈청형에 특이적인 단크론항체를 사용한 ELISA 방법으로 G 형 혈청형을 분석한 결과 G1, G2, G3, G4 형인 로타바이러스 4종이었다.
본 발명의 로타바이러스는 기탁기관에 기탁하였고, 각각을 CBNU/HR-1(KCTC 0908BP), CBNU/HR-2(KCTC 0909BP), CBNU/HR-3(KCTC 0910BP), CBNU/HR-4(KCTC 0911BP)로 명명하였다. 상기 CBNU/HR-1(KCTC 0908BP)은 G1 혈청형, CBNU/HR-2(KCTC 0909BP)은 G2 혈청형, CBNU/HR-3(KCTC 0910BP)은 G3 혈청형, CBNU/HR-4(KCTC 0911BP)은 G4 혈청형을 가진다.
또한 본 발명은 상기 로타바이러스에 대한 항체를 포함하는 난을 제공한다. 상기 난은 로타바이러스를 동물에 주입하여 면역시킨 다음 면역화된 동물의 난이 바람직하다. 상기 동물은 난을 생산하는 동물이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 닭이다. 상기 난은 인간이 식품 또는 식품 첨가제로 이용하여 섭취할 수 있어, 쉽게 로타바이러스에 대한 예방제로 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 난에서 분리한 항체를 제공한다. 항체는 특히 난의 난황에서 분리되는 것이 바람직하다. 본 발명의 로타바이러스 항체는 동물 또는 동물세포에 대하여 독성을 가지지 않고, 로타바이러스에 대하여 특이적인 반응력을 가진다. 따라서 본 발명의 로타바이러스 항체는 로타바이러스 검출 또는 예방용으로 사용할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 로타바이러스 분리
1. 분변재료
연세대학교 의과대학 소아과와 충북대학교 의과대학 소아과에서 진료한 2세 이하의 환자 중 급성장염의 증세를 나타내는 어린아이로부터 총 150개의 분변을 수집하여 로타바이러스 감염여부를 조사하였다. 분변재료는 EMEM(Eagle's minimumessential medium)에 10 %(w/v)가 되도록 섞어서 5,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 상층액을 -20 ℃에 보관하며 사용하였다.
2. RNA 추출 및 전기영동
분변재료의 로타바이러스 감염여부는 RNA 전기영동형(electrophero typing)법으로 확인하였다. 로타바이러스의 핵산추출은 Rosen 등(Rosen B. I., A. V. Parwani, S. Lopez, J. Flores and L. J. Saif.(1994)J. Clin. Microbiol.32:311-317)의 방법을 이용하였다. 분변을 Tris-CaCl2완충용액(0.1 M Tris, 10 mM CaCl2, pH 7.4)으로 10 % 희석한 다음 원심분리하여 상층액에 10 % SDS(sodium dodecylsulfate)와 2 M 소듐아세테이트를 넣고 동량의 페놀을 넣어 잘 섞은 다음 원심분리하였다. 페놀과 클로로포름 순으로 추출하고, 상층액에 2 M 소듐아세테이트와 이소프로필알콜으로 침전물을 형성시켰다. 70 % 에탄올로 침전물을 세척하여 원심진공농축기(Spivac, Hanil Co.)로 건조시켰다. 그 후 DEPC(diethyl pyrocarbonate, Sigma)가 처리된 증류수로 핵산을 부유시켰다. 추출한 dsRNA는 12 % 폴리아크릴아마이드 슬랩젤(polyacryl amide slab gel)과 3.5 % 스텍킹젤(stacking gel)에서 20 ㎃의 전류로 6시간 전기영동하였고 은염색키트(silver staining kit, Bio-rad)로 염색하여 로타바이러스에 특이적인 밴드를 확인하였다.
도 1은 분변재료에서 분리한 RNA를 전기영동하여 밴드의 이동양상을 확인한 것으로, 밴드가 4:2:3:2의 이동양상을 나타내어 혈청군 A임을 확인할 수 있었다.또한 RNA 분절의 10번째와 11번째에서 이동양상이 짧게 나타난 S 형(D, E, K, N)과 길게 나타난 L 형(A, B, C, F, G, I, M)의 2가지로 나타났다.
3. ELISA
설사 분변의 로타바이러스 G 형 혈청형은 Serotec(Japan)의 로타바이러스 혈청형키트를 사용하여 결정하였다. 사람 로타바이러스의 혈청형(G1∼G4)에 특이적으로 반응하는 단크론항체를 코팅완충용액(pH 9.6)으로 희석하여 96-웰 마이크로플레이트에 100 ㎕씩 넣은 후 4 ℃에서 하룻밤 동안 정치하여 코팅하였다. 코팅된 웰은 포스페이트 완충액(phosphate buffered saline: PBS)으로 2회 세척한 후 2 % BSA(bovine serum albumin)가 첨가된 PBS-T(0.05% Tween 20)에서 37 ℃, 2시간동안 반응시켰다. PBS-T로 2회 세척 후 10 %의 분변 상층액을 10 % 스킴밀크(skim milk)가 첨가된 PBS-T와 3:1로 희석한 용액 100 ㎕를 넣고 4 ℃에서 하룻밤 동안 정치하였다. 다시 PBS-T로 3회 세척한 후 사람 로타바이러스에 대한 토끼 고도면역혈청을 3,000배 희석하여 100 ㎕씩 넣고 37 ℃에서 1시간 동안 배양하였다. 페록시데이즈(peroxidase)가 융합된 고트 항-토끼 IgG 혈청(goat anti-rabbit IgG serum)을 10,000배 희석하여 각 웰에 100 ㎕씩 넣고 37 ℃에서 1시간 동안 배양하였다. 4회 세척 후 기질(0.1 M citrate-phosphate buffer, pH 5.0, 25 ㎖, o-phenylen- diamine·2HCl 10 mg, 30 % H2O210 ㎕)을 각 웰에 100 ㎕씩 넣어 빛을 차단하고 실온에서 30분간 정치하였다. 각 웰에 20 %의 H2SO4를 가하고 ELISA 리더로 492 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정하여 흡광도가 0.2 이상인 것을 양성으로 판정하였다. 분변에서 분리한 바이러스는 G1, G2, G3, G4 혈청형을 가짐을 확인하였다.
4. 바이러스 분리
전기영동양상과 ELISA로 확인된 로타바이러스를 계대배양하여 세포변성실험을 실시하였다. MA104 세포(레서스 원숭이(Rhesus monkey) 태아의 신장세포)를 소 태아혈청이 10 % 첨가된 EMEM에서 배양하였고, 단층이 형성된 MA104세포는 배양액을 제거한 다음 EMEM으로 세척하였다. 샘플분변은 EMEM으로 10 %(w/v)로 희석하여 원심분리(5,000 rpm, 30분) 후 여과하고, 트립신(trypsin TypeⅢ, Sigma)을 최종농도 10 ㎍/㎖로 처리하여 37 ℃에서 30분 반응시켰다. 그 후 분변재료를 상기 MA104 세포에 접종하고 37 ℃에서 1시간 동안 흡착시킨 다음 접종액을 제거하고 EMEM으로 세척하였다. 세척 후 감염된 MA104 세포에 1.0 ㎍/㎖의 트립신이 함유된 EMEM을 첨가하여 37 ℃에서 회전배양하였다. 감염 5일 동안 세포변성효과 (cytopathic effect ; CPE)가 나타나는지를 관찰하여 세포변성효과가 나타나지 않은 경우에는 배양상층액을 3회 얼리고 녹이는 과정을 거쳐 10회까지 계대 배양하였다.
도 2는 본 발명의 분변에서 분리한 로타바이러스의 세포변성효과를 확인한 사진으로, a는 감염되지 않은 MA104세포를 관찰한 것이고, b는 로타바이러스 감염 후 24시간 지난 다음 MA104세포를 관찰한 것이다. 그 결과 총 4개의 로타바이러스를 분리할 수 있었으며 세포변성을 가지는 로타바이러스의 역가는 3.0 ×104내지 2.0 ×106ffu/㎖(fluorescence focus unit/ml)로 확인되었다.
5. 로타바이러스 확인
상기에서 분리된 바이러스는 간접형광항체법, 전기영동형법 및 전자현미경으로 바이러스입자를 관찰하여 로타바이러스임을 확인하였다.
간접형광항체법 : 96-웰 마이크로플레이트에 MA104 세포를 배양한 다음 세포변성효과 양성으로 나타난 배양상층액을 감염시켰다. 감염된 마이크로플레이트는 37 ℃에 정치 배양하여 세포변성효과가 나타나면 PBS로 3회 세척하고 80 % 아세톤으로 고정하였다. 고정된 감염세포에 로타바이러스 VP6에 특이적인 단크론항체를 넣고 37 ℃에 60분 동안 반응시켰다. PBS로 세척한 다음 FITC-컨쥬게이티드 항-마우스 IgG(FITC-conjugated anti-mouse IgG, Kirkegaard ＆ Perry Laboratories)를 넣고 37 ℃에 60분 동안 반응시켰다. PBS로 세척한 다음 글리세롤 완충액을 첨가하여 형광현미경으로 검경하였다.
도 3은 본 발명의 분변세포에서 분리한 로타바이러스를 간접형광항체법으로 확인한 사진으로, a는 로타바이러스에 감염되지 않은 MA104 세포를 로타바이러스 항체로 반응시킨 것이고, b는 로타바이러스에 감염된 MA104 세포를 로타바이러스 항체로 반응시킨 것이다. 분변에서 분리한 바이러스가 로타바이러스임을 확인할 수 있었다.
전기영동형확인(Electropherotyping) : 세포변성효과 양성으로 나타난 조직배양 상층액을 이용하여 분변재료로부터 바이러스 RNA를 추출한 것과 동일한 방법으로 핵산을 추출하여 전기영동하였다. 추출된 dsRNA는 12 % 폴리아크릴아마이드 슬랩 젤(polyacrylamide slab gel)과 3.5 % 스텍킹젤(stacking gel)에서 15∼20 ㎃의 전류로 6시간 전기영동하였으며 전기영동이 끝난 젤은 은염색법으로 염색하여 밴드를 확인하였다.
전자현미경 관찰 : 세포변성효과 양성으로 확인된 바이러스에 감염된 조직배양액을 4 ℃에서 3,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하였다. 상층액을 다시 4 ℃에서 25,000 rpm(Beckman, OptimaTMLE-80K)으로 2시간 동안 원심분리하였다. 형성된 펠렛은 증류수에 부유시켜 카본-포르바(carbon-formvar)가 코팅된 구리 그리드(copper grid)에 도말하고 2 % 포스포텅스텐산(phosphotungstic acid, pH 7.2)로 염색하여 전자현미경으로 80kV에서 관찰하였다.
도 4는 본 발명의 분리한 로타바이러스를 전자현미경으로 관찰한 것으로, 배양액 중 바이러스입자는 두층의 캡시드를 가진 전형적인 로타바이러스형태를 나타내었다. 또한 전자현미경으로 관찰되는 로타바이러스의 내측 캡시드는 스포크(spoke) 같은 모양을 나타내었고, 이것은 외층으로 둘러싸인 이중의 막으로 관찰되었다. 일부 바이러스들은 외측 캡시드가 탈락된 모습을 보였는데 이중 막으로 둘러싸인 바이러스 입자들은 지름이 약 80 nm 였고, 외측 캡시드가 없는 바이러스 입자들은 지름이 55 nm 였다.
6. 로타바이러스 기탁
상기의 방법으로 수득한 로타바이러스 4종은 각각 G1, G2, G3, G4의 혈청형을 가지며, G1 로타바이러스는 CBNU/HR-1으로, G2 로타바이러스는 CBNU/HR-2, G3 로타바이러스는 CBNU/HR-3, G4 로타바이러스는 CBNU/HR-4으로 명명하였다. 각 로타바이러스는 기탁기관에 CBNU/HR-1(KCTC 0908BP), CBNU/HR-2(KCTC 909BP), CBNU/HR-3(KCTC 0910BP) 및 CBNU/HR-4(KCTC 0911BP)으로 기탁하였다.
[실시예 2] 로타바이러스 난황항체제조
로타바이러스 항원준비
MA104세포를 단일층으로 배양하여 배양액을 제거한 다음 EMEM으로 3회 세척하였다. 상기 실시예 1에서 분리한 로타바이러스 CBNU/HR-1(KCTC 0908BP), CBNU/HR-2(KCTC 909BP), CBNU/HR-3(KCTC 0910BP), CBNU/HR-4(KCTC 0911BP) 각각에 트립신을 최종농도 10 ug/ml으로 처리하여 37 ℃에서 30분 반응시켰다. 그 후 바이러스 각각을 MA104세포에 접종하고 37 ℃에서 1시간 반응시킨 다음 세척 후 1.0 ug/ml의 트립신이 함유된 EMEM을 첨가하여 37 ℃에서 5일간 회전배양 하였다. 배양된 세포의 상청을 5000 rpm에서 1시간 원심분리하여 상층액을 수득한 다음 포르말린(Formalin)을 0.01 %로 가하고 37 ℃ 10시간 반응시켰다. 반응액은 투석하여 잔유 포르말린을 제거하고 60 ℃에서 10시간 열처리하여 불활성화 시킨 다음 0.22 um의 여과지로 여과하여 항원액을 준비하였다. 상기에서 준비한 항원액에 오일을 40 % 내지 50 %되도록 첨가하여 접종액을 준비하였다. 이때 완전체 프레준드 보강제(Complete Freund’s adjuvant)나 불완전체 프레준드 보강체(Incomplete Freund’s adjuvant)를 사용할 수 있다.
동물에 면역반응 형성
상기에서 준비한 접종액을 각각 양계용 백색 레그혼에 마리당 0.5 ml 씩 1차 피내접종하고 처음 접종일로부터 2주 간격으로 2회, 4주 간격 1회 추가 접종하여면역반응을 유도하였다.
접종 일주일 후부터 매주 닭이 생산한 난황을 취하여 중화항체가를 측정하였다. 난은 난황과 난백으로 분리한 다음 난황만을 믹서로 혼합하여 Depth 필터로 여과하는 방법으로 균질화시키고 감마카라기난 수용액과 1:9로 혼합하여 실온에서 30분 반응 후 5000 rpm에서 10분 원심분리하였다. 상층액을 pH 7.4의 인산완충액(Phosphate buffered solution)으로 2배 희석한 것을 검체로 사용하였다.
미리 준비한 100 pfu의 로타바이러스와 희석된 검체를 반응시킨 후 MA104세포에 접종하여 바이러스가 중화되었는지 여부를 100 pfu의 바이러스만 접종한 대조군과 비교 관찰하였다. 항체가는 시료 10 개에 대한 평균값으로 환산하였으며, 희석배수에서 50 %의 로타바이러스를 중화시키는 정도를 나타낸 것이다.
[표 1]
| 기간 | 1 주 | 2 주 | 3 주 | 4 주 | 5 주 | 6 주 | 7 주 | 8 주 | 9 주 | 10 주 |
| CBNU/HR-1 | <10 | <10 | 26 | 92 | 120 | 1052 | 2048 | 4092 | 3162 | 3028 |
| CBNU/HR-2 | <10 | <10 | 20 | 88 | 124 | 1048 | 2204 | 4604 | 3326 | 3116 |
| CBNU/HR-3 | <10 | <10 | 16 | 96 | 128 | 966 | 2000 | 4120 | 3228 | 3048 |
| CBNU/HR-4 | <10 | <10 | 13 | 72 | 114 | 982 | 2012 | 4028 | 3080 | 2996 |
| 대조군 | <10 | <10 | <10 | <10 | <10 | <10 | <10 | <10 | <10 | <10 |
상기 표 1에 나타난 바와 같이, 로타바이러스로 감염된 닭은 감염 5주 내지 6주 경과 후 면역반응이 형성되어 항체가 생성되기 시작하여 8주 되었을 때 최고의 항체가를 나타내었다.
난황에서 항체분리
감마카라키난 수용액과 반응하고 원심분리한 상층액에 라이신을 최종 0.2 부피% 되도록 첨가한 다음 동결건조 하였다. 동결건조는 -40 ℃에서 2시간 급속동결 후 -20 ℃에서 72시간 건조하고 시간당 2 ℃씩 온도를 상승시켜 20 ℃에서 건조를 완료하는 방법으로 실시하였다. 건조하여 수득한 난황항체는 건조물 1 g당 증류수 50 mL로 용해하여 항체가를 측정하였다.
[표 2]
| 항 목 | 동결건조 전 | 동결건조 후 | 회수율 |
| CBNU/HR-1 | 4092 | 2864 | 69.9% |
| CBNU/HR-2 | 4604 | 3012 | 65.4% |
| CBNU/HR-3 | 4120 | 2948 | 71.5% |
| CBNU/HR-4 | 4028 | 3008 | 74.6% |
[실험예 2]
실시예 2에서 수득한 난황항체에 대한 독성 검사를 실시하였다.
실시예 2의 동결건조된 파우더 1 g당 증류수 50 ml로 녹여 생후 4일째의 영아마우스에 마리당 0.03 ml씩 10마리에 뇌 내 접종하고 사망여부를 관찰하였다.
하기 표 3은 본 발명의 로타바이러스(CBNU/HR-1, CBNU/HR-2, CBNU/HR-3, CBNU/HR-4)난황 항체를 영아마우스의 뇌에 접종하여 독성여부를 영아마우스 생존수로 확인하여 나타낸 것으로, 실험한 영아마우스 10 마리 모두 난황 항체에 대한 영향을 받지 않았다.
[표 3]
| 기간 | 1 일 | 2 일 | 3 일 | 4 일 | 5 일 | 6 일 | 7 일 | 8 일 | 9 일 | 10 일 |
| CBNU/HR-1 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| CBNU/HR-2 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| CBNU/HR-3 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| CBNU/HR-4 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 대조군 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
또한 실시예 2의 동결건조된 파우더를 증류수에 녹여 4주령의 수컷마우스에 마리 당 1 ml씩 10마리에 복강 접종하고 접종하지 않은 마우스와 체중변화 여부를 24시간 후 비교관찰 하였다. 그 결과는 하기 표 4에 나타내었으나 난황항체 접종으로 인한 체중감소는 나타나지 않았다.
[표 4]
| 항 목 | 접종 전(g) | 접종 후(g) | 체중감소여부 |
| CBNU/HR-1 | 12.6 | 12.8 | X |
| CBNU/HR-2 | 11.7 | 12.0 | X |
| CBNU/HR-3 | 12.4 | 12.8 | X |
| CBNU/HR-4 | 12.8 | 13.1 | X |
| 대조군 | 12.5 | 12.8 | X |
세포접종실험
MRC-5세포와 MA104세포에 로타바이러스 난황항체를 첨가(0.5 ml/T175플라스크)하여 6일간 배양하여 동물세포에 대한 독성발현 여부를 세포변성시험으로 관찰하였다. 그 결과는 하기 표 5와 같았으며, 바이러스 감염에 의한 세포변성은 관찰되지 않았다.
[표 5]
| 항 목 | MRC-5 | MA104 | CPE 여부 |
| CBNU/HR-1 | 0 | 0 | X |
| CBNU/HR-2 | 0 | 0 | X |
| CBNU/HR-3 | 0 | 0 | X |
| CBNU/HR-4 | 0 | 0 | X |
| 대조군 | 0 | 0 | X |
상기에 언급한 바와 같이, 본 발명에서는 한국사람에게서 흔히 발병하는 로타바이러스를 분리하였다. 본 발명의 로타바이러스 난황항체는 로타바이러스에 작용하여 감염성을 저해할 뿐만 아니라 동물에 대해 독성을 가지지 않는다. 따라서,본 발명의 로타바이러스 난황항체는 로타바이러스 예방 및 치료제로 사용할 수 있다.
Claims (7)
- (a) CBNU/HR-1(KCTC 0908BP), CBNU/HR-2(KCTC 0909BP), CBNU/HR-3(KCTC 0910BP) 및 CBNU/HR-4(KCTC 0911BP)로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 로타바이러스를 숙주세포에 감염시켜 배양하고;(b) 상기 숙주세포의 세포변성효과(cytopathogenic effect)를 유도하고;(c) 상기 세포변성된 배양액 상청액을 원심분리로 수득하고;(d) 상기 상청액에 포르말린을 첨가하여 37 ℃에서 반응시키고;(e) 상기 반응액을 투석하고;(f) 상기 투석액을 열처리하고;(g) 상기 열처리된 반응물을 여과하여 항원액을 준비하고; 및(h) 상기 항원액을 산란계에 주입하여 면역시켜 상기 산란계에서 배출되는 것을 특징으로 하는 난.
- 제 1항에 있어서, 상기 난은 로타바이러스에 대한 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 난.
- (삭 제)
- (삭 제)
- (a) CBNU/HR-1(KCTC 0908BP), CBNU/HR-2(KCTC 0909BP), CBNU/HR-3(KCTC 0910BP) 및 CBNU/HR-4(KCTC 0911BP)로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 로타바이러스를 숙주세포에 감염시켜 배양하고;(b) 상기 숙주세포의 세포변성효과(cytopathogenic effect)를 유도하고;(c) 상기 세포변성된 배양액 상청액을 원심분리로 수득하고;(d) 상기 상청액에 포르말린을 첨가하여 37 ℃에서 반응시키고;(e) 상기 반응액을 투석하고;(f) 상기 투석액을 열처리하고;(g) 상기 열처리된 반응물을 여과하여 항원액을 준비하고;(h) 상기 항원액을 산란계에 주입하여 면역시키고; 및(i) 상기 산란계의 난으로부터 항체를 분리하는 것을 특징으로 하는 로타바이러스 난황항체.
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