KR102502044B1 - 동물에서 엔테로코커스 종의 성장을 억제하거나 지연시키는 바실러스 기반의 성분 - Google Patents
동물에서 엔테로코커스 종의 성장을 억제하거나 지연시키는 바실러스 기반의 성분 Download PDFInfo
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Abstract
적어도 1종의 바실러스 기반 성분을 이용하여 동물에서 엔테로코커스 종의 성장을 억제하거나 지연시키는 방법이 본 설명에 개시된다.
Description
기술분야는 동물에서 엔테로코커스 종의 성장을 억제하거나 지연시키는 바실러스 기반 성분의 사용에 관한 것이다.
엔테로코커스(Enterococcus)는 피루미쿠테스(Firmicutes) 문의 락트산 박테리아의 큰 속이다. 엔테로코커스는 종종 쌍으로 존재하거나(쌍구균) 짧은 사슬로 존재하는 그람 양성 구균으로, 물리적 특징만으로는 스트렙토코커스와 구별하기가 어렵다. 엔테로코커스는 조건 혐기성 유기체이다. 즉, 엔테로코커스는 산소가 풍부한 환경과 산소가 부족한 환경 둘 다에서 세포 호흡을 할 수 있다. 엔테로코커스는 포자를 형성할 수는 없지만, 광범위한 환경적 조건: 극한 기온(10 내지 45°C), pH (4.5 내지 10.0), 및 높은 염화나트륨 농도에 강하다. 엔테로코커스 속의 구성원은 1984년 게놈 DNA 분석에서 별도의 속 분류가 적당하다고 밝혀지기 전까지 스트렙토코커스 D군으로 분류되었다. 엔테로코커스 종 중에서도 일부는 소화관 외부에 있을 때 기회감염성 병원체인 것으로 알려져 있다. 이는 E. 아비움, E. 갈리나룸 및 E. 세코룸과 관련하여 그러한데, 이때, E. 세코룸은 육계 생산 체인의 가금류 농가가 당하는 경제적 손실의 관점에서 중요하다.
엔테로코커스 세코룸은 말, 소, 돼지, 개, 고양이, 카나리아, 비둘기, 칠면조 및 머스코비 오리와 같은 조류 및 기타 척추동물의 창자의 정상적인 서식체이다. 엔테로코커스 세코룸은 가금류 및 기타 조류 종의 신종 병원체로 간주된다. 대퇴 골두 괴사 및 척추염은 감염된 닭에서 주요한 병리학적 변화로 기술되었다.
정상적인 장내 균총의 일부이지만, 정상적인 장 기능에 대한 교란 또는 손상은 엔테로코커스 세코룸의 조류 척추로의 이동을 초래할 수 있다. 척추의 엔테로코커스 세코룸 감염증은 엔테로코커스 척추전방전위증 또는 "척추기형증(kinky back)"으로 알려져 있는 병태에서 척추 및 관절염 병변, 파행 및 치사를 초래한다.
가금류 생산업자가 "척추기형증"이라 지칭하는 척추염은 수 년 동안 상업적인 생산으로 알려졌으며, 전형적으로 육중하고, 빠르게 자라는 조류, 특히 수컷 및 육계 사육업에서 볼 수 있다(Aziz, T. & Barnes, H.J. (2009). Spondylitis is emerging in broilers. World Poultry, 25, 19).
병원성이 매우 높고 항생제 내성을 나타내는 엔테로코커스 세코룸 균주는 지속적으로 육계 산업에 경제적인 손실을 초래한다. 따라서, 통상적인 농장 위생 절차 및 항미생물 요법은 병원성 엔테로코커스 종, 특히 엔테로코커스 세코룸의 발생을 제어하기에 불충분한 것으로 밝혀졌다.
따라서, 이 중요한 신종 병원체를 제어하기 위하여 안전하고 효과적인 대안이 필요하다.
일 구현예에서, 동물에서 병원성 엔테로코커스 종의 성장 전부 또는 일부를 억제하거나 지연시키는 방법이 개시되며, 이때, 이 방법은 1종 이상의 바실러스 박테리아 균주를 포함하는 바실러스 기반의 직접 섭취 미생물, 바실러스 배양물로부터 수득된 상청액 또는 이의 조합물로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 바실러스 기반 성분 유효량을 동물에 투여하는 단계를 포함한다.
제2의 구현예에서, 바실러스 기반의 직접 섭취 미생물은 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 푸밀리스(Bacillus pumilis) 및 바실러스 서브틸리스(Baccillus subtilis)로 구성되는 군으로부터 선택된다.
제3의 구현예에서, 바실러스 기반의 직접 섭취 미생물은 다음 균주 중 1종 이상으로부터 선택된다: 바실러스 균주 2084 접근 번호 NRRl B-50013, 바실러스 균주 LSSAO1 접근 번호 NRRL B-50104 및 바실러스 균주 15A-P4 ATCC 접근 번호 PTA-6507.
제4의 구현예에서, 동물은 단위(monogastric) 동물일 수 있고, 바람직하게는 가금류일 수 있다.
제5의 구현예에서, 동물은 다위(multigastric) 동물일 수 있다.
제6의 구현예에서, 적어도 하나의 바실러스 기반 성분은 사료 내 또는 사료 위 또는 물과 같은 액체 중이든, 동물 사료를 통해 동물에 직접적으로 투여될 수 있다.
제7의 구현예에서, 바실러스 기반 성분은 사료물, 사료 첨가제 조성물, 프리믹스로 구성되는 군으로부터 선택된 형태 또는 물과 같은 액체로 동물에 투여될 수 있다.
도 1은 엔비바(Enviva®) PRO 균주에 의한 미국 및 유럽 가금류 생산품으로부터 수집된 E. 세코룸 균주에 대한 억제 평균을 보여준다.
도 2는 바실러스 BS8 유무에 따른 E. 세코룸 균주 G84-68 성장 동역학에 대한 데이터를 도시한 것이다.
도 3은 바실러스 BS8 유무에 따른 E. 세코룸 균주 D45-08 성장 동역학에 대한 데이터를 도시한 것이다.
도 4는 바실러스 BS8, 바실러스 15AP4 또는 바실러스 2084의 무세포 상청액(CFS)과 함께 또는 이들 없이 인큐베이션시킨 엔테로코커스 세코룸 균주 11976-2의 성장 억제 프로파일을 도시한 것이다.
도 5는 대조군 병원체 곡선이 OD 0.4에 이를 때인 정확한 종점에서 억제(%)로 나타낸 엔테로코커스 갈리나룸 VTT E-97776T에 대한 B. 아밀로리퀘파시엔스 아종 플란타룸(plantarum) 15AP4, BS8 및 2084의 CFS의 항미생물 활성을 보여준다.
도 6은 바실러스 2084의 CFS와 함께 또는 이것 없이 인큐베이션 시킨 엔테로코커스 아비움 E 84197의 성장 프로파일을 보여준다.
도 7은 대조군 병원체 곡선이 OD 0.4에 이를 때인 정확한 종점에서 억제(%)로 나타낸 10종의 임상 분리주 엔테로코커스 세코룸에 대한 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 DSM7T, B. 서브틸리스 DSM10T 및 B. 리케니포르미스 DSM13T의 CFS의 항미생물 활성을 보여준다.
도 2는 바실러스 BS8 유무에 따른 E. 세코룸 균주 G84-68 성장 동역학에 대한 데이터를 도시한 것이다.
도 3은 바실러스 BS8 유무에 따른 E. 세코룸 균주 D45-08 성장 동역학에 대한 데이터를 도시한 것이다.
도 4는 바실러스 BS8, 바실러스 15AP4 또는 바실러스 2084의 무세포 상청액(CFS)과 함께 또는 이들 없이 인큐베이션시킨 엔테로코커스 세코룸 균주 11976-2의 성장 억제 프로파일을 도시한 것이다.
도 5는 대조군 병원체 곡선이 OD 0.4에 이를 때인 정확한 종점에서 억제(%)로 나타낸 엔테로코커스 갈리나룸 VTT E-97776T에 대한 B. 아밀로리퀘파시엔스 아종 플란타룸(plantarum) 15AP4, BS8 및 2084의 CFS의 항미생물 활성을 보여준다.
도 6은 바실러스 2084의 CFS와 함께 또는 이것 없이 인큐베이션 시킨 엔테로코커스 아비움 E 84197의 성장 프로파일을 보여준다.
도 7은 대조군 병원체 곡선이 OD 0.4에 이를 때인 정확한 종점에서 억제(%)로 나타낸 10종의 임상 분리주 엔테로코커스 세코룸에 대한 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 DSM7T, B. 서브틸리스 DSM10T 및 B. 리케니포르미스 DSM13T의 CFS의 항미생물 활성을 보여준다.
인용된 모든 특허, 특허 출원, 및 공보는 이의 전문이 본 설명에 참조로 포함된다.
본 개시에서, 다수의 용어 및 약어가 사용된다. 구체적으로 달리 언급되지 않는 한, 다음 정의가 적용된다.
요소 또는 성분 앞의 관사("a", "an" 및 "the")는 요소 또는 성분의 경우(즉, 발생)의 수에 관해 비제한적인 것이다. 따라서, 단수형("a", "an" 및 "the")은 하나 또는 적어도 하나를 포함하는 것으로 파악되어야 하며, 요소 또는 성분의 단수형은 그 수가 명백히 단수임을 의미하지 않는 한 복수형도 포함한다.
용어 "포함하는"은 청구범위에서 지칭된 바와 같은 언급된 특징, 정수, 단계, 또는 성분의 존재를 의미하지만, 하나 이상의 다른 특징, 정수, 단계, 성분 또는 이의 그룹의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다. 용어 "포함하는"은 용어 "본질적으로 구성되는" 및 "구성되는"에 의해 포괄되는 구현예를 포함하려는 것이다. 유사하게, 용어 "본질적으로 구성되는"은 용어 "구성되는"에 의해 포괄되는 구현예를 포함하려는 것이다.
존재하는 경우, 모든 범위는 포괄적이며 조합 가능하다. 예를 들어, "1 내지 5"의 범위가 언급된 경우, 언급된 범위는 "1 내지 4", "1 내지 3", "1~2", "1~2 및 4~5", "1~3 및 5" 등의 범위를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
수치 값과 관련하여 본 설명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약"은 이 용어가 달리 구체적으로 문맥에서 정의되어 있지 않는 한, 그 수치 값의 +/- 0.5의 범위를 나타낸다. 예를 들어, 어구 "약 6의 pH 값"은 이 pH 값이 달리 구체적으로 정의되지 않는 한, 5.5 내지 6.5의 pH 값을 나타낸다.
본 명세서 전체에 걸쳐 주어진 모든 최대 수치 제한은, 모든 하한 수치 제한이 본 설명에 명백하게 기재된 것처럼, 이러한 하한 수치 제한을 포함하려는 것이다. 본 명세서 전체에 걸쳐 주어진 모든 최소 수치 제한은, 더 큰 모든 수치 제한이 본 설명에 명백하게 기재된 것처럼, 이러한 더 큰 수치 제한을 포함할 것이다. 본 명세서 전체에 걸쳐 주어진 모든 수치 범위는, 더 좁은 모든 수치 범위 전부가 본 설명에 명백하게 기재된 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내에 있는 이러한 더 좁은 수치 범위를 포함할 것이다.
용어 "엔테로코커스" 및 "엔테로코커스 종(spp.)"은 상호 교환적으로 사용되고, 본 설명에 사용되는 바와 같이, 피르미쿠테스 문의 락트산 박테리아의 큰 속을 지칭한다. 엔테로코커스는 종종 쌍으로 존재하거나(쌍구균) 짧은 사슬로 존재하는 그람 양성 구균으로, 물리적 특징만으로는 스트렙토코커스와 구별하기가 어렵다. 엔테로코커스는 조건 혐기성 유기체이다. 즉, 엔테로코커스는 산소가 풍부한 환경과 산소가 부족한 환경 둘 다에서 세포 호흡을 할 수 있다. 엔테로코커스는 포자를 형성할 수는 없지만, 광범위한 환경적 조건: 극한 기온(10 내지 45℃), pH (4.5 내지 10.0), 및 높은 염화나트륨 농도에 강하다. 엔테로코커스 속의 구성원은 1984년 게놈 DNA 분석에서 별도의 속 분류가 적당하다고 밝혀지기 전까지 스트렙토코커스 D군으로 분류되었다.
용어 "엔테로코커스 세코룸" 및 "E. 세코룸"은 본 설명에서 상호 교환적으로 사용된다. E. 세코룸은 엔테로코커스의 종으로, 많은 가축의 장관 박테리아이다.
용어 "동물" 및 "대상체"는 본 설명에서 상호 교환적으로 사용된다. 동물은 모든 비-반추(인간 포함) 및 반추 동물을 포함한다. 특정한 구현예에서, 동물은 비-반추 동물, 예컨대 말 및 단일-위(단위) 동물이다. 단위 동물의 예에는 돼지 및 멧돼지, 예컨대 새끼돼지, 사육 돼지, 암퇘지; 가금, 예컨대 칠면조, 오리, 닭, 육계, 산란계; 어류, 예컨대 연어, 송어, 틸라피아, 메기 및 잉어; 및 갑각류, 예컨대 새우 및 대하가 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 추가적인 구현예에서, 동물은 예컨대, 소, 어린 송아지, 염소, 양, 기린, 유럽들소, 무스, 엘크, 야크, 물소, 사슴, 낙타, 알파카, 라마, 영양, 가지뿔영양 및 닐가이를 포함하나 이에 한정되지 않는 반추 동물과 같은 다위 동물일 수 있다.
본 설명에 사용되는 용어 "반추 동물"은 식물 기반 먹이를 소화시키기 전에, 주로, 미생물 작용을 통해, 특수화된 위에서 발효시켜, 식물 기반 먹이로부터 영양분을 얻을 수 있는 포유동물을 지칭한다. 이 절차는 전형적으로 (되새김질 거리라고 알려져 있는) 발효 섭취물이 역류되어 되새겨질 것을 요구한다. 되새김질을 하여 식물성 물질을 더 분해하고 소화를 자극하는 이 절차를 반추라 한다. 대략 150종의 반추 동물은 사육종 및 야생종을 모두 포함한다. 반추 동물은 소, 암소, 염소, 양, 기린, 야크, 사슴, 엘크, 영양, 물소 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 설명에서 사용되는 용어 "CFU"는 "콜로니 형성 단위"를 의미하며 생활성 세포의 척도이고, 여기서 콜로니는 단일 선조 세포로부터 유래되는 세포의 응집물을 나타낸다.
본 설명에서 사용되는 용어 "직접 섭취 미생물"("DFM")은 살아 있는(생활성) 자연 발생 미생물의 원천이다. DFM은 하나 이상의 이러한 자연 발생 미생물, 예컨대 박테리아 균주를 포함할 수 있다. DFM의 카테고리에는 바실러스 및 클로스트리듐과 같은 포자 형성 박테리아뿐만 아니라, 락트산 박테리아와 같은 비-포자 형성 박테리아, 효모 및 진균도 포함된다. 따라서, 용어 DFM은 다음 중 1종 이상을 포괄한다: 직접 섭취 박테리아, 직접 섭취 효모, 직접 섭취 효모 또는 진균 및 이의 조합.
바실러스 및 클로스트리듐은 포자를 형성하는 독특한, 그람 양성 간균이다. 이들 포자는 매우 안정적이며, 열, 수분 및 다양한 pH와 같은 환경 조건을 견딜 수 있다. 이들 포자는 동물에 의해 소화되면 활성 영양 세포로 발아하며, 밀(meal) 및 펠렛화된 식이에서 사용될 수 있다. 락트산 박테리아는 병원체에 길항성인 락트산을 생산하는 그람 양성 구균이다. 락트산 박테리아는 다소 열-민감성으로 나타나므로, 통상적인 의미의 펠렛화된 식이에서는 사용되지 않고 보호(코팅)될 필요가 있다. 락트산 박테리아의 종류에는 비피도박테리움, 락토바실러스 및 엔테로코커스가 포함된다.
용어 "바실러스 기반의 직접 섭취 미생물"은 1종 이상의 바실러스 박테리아 균주를 포함하는 직접 섭취 미생물을 의미한다.
본 설명에 사용되는 용어 "바실러스 기반 성분"은 (i) 1종 이상의 바실러스 박테리아 균주를 포함하는 바실러스 기반의 직접 섭취 미생물, (ii) 바실러스 배양물로부터 얻은 상청액 또는 (iii) (i) 및 (ii)의 조합물을 지칭한다.
"사료" 및 "식품"은 각각 비-인간 동물 및 인간 각각이 먹고, 섭취하고, 소화시키기 위한 또는 이에 적합한 임의의 천연 또는 인공 식이, 음식 등이나 이러한 음식의 성분을 의미한다.
본 설명에서 사용되는 용어 "식품"은 광의의 개념으로 사용되며, 인간을 위한 식품 및 식료품뿐만 아니라 비-인간 동물을 위한 식품(즉, 사료)을 포괄한다.
용어 "사료"는 가축의 사육에서 동물에게 섭취시키는 제품에 대해 사용된다. 용어 "사료" 및 "동물 사료"는 상호 교환적으로 사용된다. 바람직한 구현예에서, 식품 또는 사료는 비-반추동물 및 반추동물에 의한 소비를 위한 것이다.
본 설명에서 사용되는 용어 "프로바이오틱"은, 예를 들어, 충분한 수로 섭취되거나 국소 적용될 때, 숙주 유기체에 유익하게 영향을 주는, 즉, 하나 이상의 증명할 수 있는 건강상의 이익을 숙주 유기체에 부여함으로써 유익하게 영향을 주는 살아 있는 미생물(예를 들어 박테리아 또는 효모를 포함함)로 정의된다. 프로바이오틱스는 하나 이상의 점막 표면에서 미생물 균형을 개선할 수 있다. 예를 들어, 점막 표면은 장, 요로, 기도 또는 피부일 수 있다. 본 설명에서 사용되는 용어 "프로바이오틱"은 면역계의 유익한 분지(branch)를 자극할 수 있고 이와 동시에 점막 표면, 예를 들어 소화관에서의 염증 반응을 감소시킬 수 있는 살아 있는 미생물 또한 포함한다. 프로바이오틱 섭취의 하한치 또는 상한치는 없지만, 1일 용량으로서 적어도 106 내지 1012, 바람직하게는 적어도 106 내지 1010, 바람직하게는 108 내지 109 cfu가 대상체에서 유익한 건강상의 효과를 달성하기에 유효할 것으로 제안되었다.
용어 "프리바이오틱"은 1종의 또는 제한된 수의 유익한 박테리아의 성장 및/또는 활성을 선택적으로 자극함으로써 숙주에 유익하게 영향을 주는 비-소화성 식품 구성성분을 의미한다.
본 설명에서 사용되는 용어 "병원체"는 임의의 질병 원인 인자를 의미한다. 이러한 원인 인자에는 박테리아, 바이러스, 진균 원인 인자 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
용어 "에서 유래된" 및 "에서 수득된"은 해당 유기체 균주에 의해 생산되거나 생산 가능한 단백질뿐만 아니라 이러한 균주에서 단리된 DNA 서열에 의해 암호화되고 이러한 DNA 서열을 함유하는 숙주 유기체에서 생산되는 단백질도 나타낸다. 추가적으로, 이 용어는 합성 및/또는 cDNA 기원의 DNA 서열에 의해 암호화되며 해당 단백질을 확인시키는 특징을 갖는 단백질을 나타낸다.
용어 "유효량"은 소정 성분의 충분한 양을 의미한다.
위에 언급된 바와 같이, 엔테로코커스 세코롬은 가금류의 신종 병원체로 여겨지며, 육계 및 육계 사육장에서 상당한 손실을 초래할 수 있다. E. 세코룸은 닭에서 이전에 EVOA(enterococcal vertebral osteoarthritis, 엔테로코커스성 척추 골관절염)라 지칭되던 엔테로코커스성 척추염의 원인으로 점차 인식되어 왔다. 질병 발생은 집약적인 생산 체계 하에서 사육된 육계 무리에서 주로 진단되었다. 임상적으로 영향 받은 조류는 E. 세코룸에 의해 유발된 골수염으로 인한 흉추 척수의 압박 및 대퇴 골두 괴사로 말미암은 운동 문제를 겪었다. 질병 발생은 높은 이환율, 치사율, 도태, 사체 폐기를 초래할 수 있으며, 단기간 내에 극심한 경제적 손실을 야기할 수 있다. 나아가, E. 세코룸의 분리주는 증가된 병원성뿐만 아니라, 증가된 항생제 내성도 증명해왔다.
따라서, 항생제 내성이 주요한 전 세계적인 건강상의 위협이 되고 있으므로, 본 설명에 기술된 방법은 항생제 사용에 대한 대안을 제공한다.
일 구현예에서, 동물에서 병원성 엔테로코커스 종의 성장 전부 또는 일부를 억제하거나 지연시키는 방법이 본 설명에 기술되며, 이때, 이 방법은 1종 이상의 바실러스 박테리아 균주를 포함하는 바실러스 기반의 직접 섭취 미생물, 바실러스 배양물로부터 수득된 상청액 또는 이의 조합물로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 바실러스 기반 성분 유효량을 동물에 투여하는 단계를 포함한다.
본 설명에 기술된 DFM은 적어도 하나의 생활성 미생물, 예컨대 생활성 박테리아 균주 또는 생활성 효모 또는 생활성 진균을 포함한다. 바람직하게는, DFM은 적어도 하나의 생활성 박테리아를 포함한다.
하나의 구현예에서, DFM은 포자 형성 박테리아 균주일 수 있고 이에 따라 용어 DFM은 포자, 예컨대 박테리아 포자로 이루어지거나 이를 함유할 수 있다. 따라서, 본 설명에서 사용되는 용어 "생활성 미생물"은 미생물 포자, 예컨대 내생포자 또는 분생포자를 포함할 수 있다. 대안적으로, 본 설명에 기재되는 사료 첨가제 조성물에서의 DFM은 미생물 포자, 예컨대 내생포자 또는 분생포자로 이루어지지 않을 수 있거나 이를 함유하지 않을 수 있다.
미생물은 자연 발생 미생물일 수도 있고 또는 형질전환된 미생물일 수도 있다. 바람직하게는, 미생물은 단리될 수 있는 적어도 3종의 적합한 미생물, 예컨대 박테리아의 조합이다.
본 설명에 기재되는 DFM은 다음 속 중 1종 이상으로부터의 미생물을 포함할 수 있다: 락토바실러스, 락토코커스, 스트렙토코커스, 바실러스, 페디오코커스, 엔테로코커스, 류코노스톡, 카르노박테리움, 프로피오니박테리움, 비피도박테리움, 클로스트리듐, 파에니바실러스 및 메가스패라, 그리고 이의 조합.
바람직하게는, DFM은 다음 바실러스 종으로부터 선택된 1종 이상의 박테리아 균주를 포함한다: 바실러스 서브틸리스, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 및 바실러스 리케니포르미스.
본 설명에서 사용되는 "바실러스" 속은 B. 서브틸리스, B. 리케니포르미스, B. 렌투스(lentus), B. 브레비스(brevis), B. 스테아로써모필러스(stearothermophilus), B. 알칼로필러스(alkalophilus), B. 아밀로리퀘파시엔스, B. 클라우시이(clausii), B. 할로두란스(halodurans), B. 메가테리움(megaterium), B. 코아굴란스(coagulans), B. 써쿨란스(circulans), B. 깁소니이(gibsonii), B. 푸밀리스 및 B. 투링기엔시스(thuringiensis)를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당업자에게 공지된 바와 같은 "바실러스" 속 내의 모든 종을 포함한다. 바실러스 속은 분류학적 재편성을 계속 겪고 있음이 인정된다. 따라서, 이 속은 현재 "지오바실러스 스테아로서모필루스(Geobacillus stearothermophilus)"로 명명된 바실러스 스테아로서모필루스, 또는 현재 "파에니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa)인 바실러스 폴리믹사와 같은 유기체를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 재분류된 종을 포함하는 것으로 본다. 스트레스가 많은 환경적 조건 하에서의 저항성 내생포자의 생성은 바실러스 속의 정의적 특징으로 간주되지만, 이러한 특성은 현재 명명된 알리시클로바실러스(Alicyclobacillus), 암피바실러스(Amphibacillus), 아네우리니바실러스(Aneurinibacillus), 아녹시바실러스(Anoxybacillus), 브레비바실러스(Brevibacillus), 필로바실러스(Filobacillus), 그라실리바실러스(Gracilibacillus), 할로바실러스(Halobacillus), 파에니바실러스(Paenibacillus), 살리바실러스(Salibacillus), 서모바실러스(Thermobacillus), 우레이바실러스(Ureibacillus), 및 비르기바실러스(Virgibacillus)에도 적용된다.
바람직하게는, DFM은 Danisco A/S로부터 상업적으로 이용 가능한 엔비바(Enviva®) PRO에서 발견된 박테리아 균주 중 1종 이상일 수 있다. 엔비바(Enviva®) PRO는 바실러스 균주 2084 접근 번호 NRRl B-50013, 바실러스 균주 LSSAO1 접근 번호 NRRL B-50104 및 바실러스 균주 15A-P4 ATCC 접근 번호 PTA-6507의 조합이다(본 설명에 참조로 포함된 US 7,754,469 B에 교시된 바와 같음).
또 다른 양태에서, DFM은 다음의 락토코커스 종과 추가적으로 조합될 수 있다: 락토코커스 크레모리스(Lactococcus cremoris) 및 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 그리고 이의 조합.
DFM은 다음의 락토바실러스 종과 추가적으로 조합될 수 있다: 락토바실러스 부흐네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 케피리(Lactobacillus kefiri), 락토바실러스 비피두스(Lactobacillus bifidus), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 페르멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 파르시미니스(Lactobacillus farciminis), 락토바실러스 락티스(Lactobacillus lactis), 락토바실러스 델브레욱키이(Lactobacillus delbreuckii), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 파라플란타룸(Lactobacillus paraplantarum), 락토바실러스 파르시미니스(Lactobacillus farciminis), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 존소니이(Lactobacillus johnsonii) 및 락토바실러스 젠세니이(Lactobacillus jensenii), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 아밀로리티쿠스(Lactobacillus amylolyticus), 락토바실러스 아밀로보루스(Lactobacillus amylovorus), 락토바실러스 알리멘타리우스(Lactobacillus alimentarius), 락토바실러스 아비아리에스(Lactobacillus aviaries), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 부흐네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus), 락토바실러스 델브루엑키이(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 파르시미니스(Lactobacillus farciminis), 락토바실러스 페르멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 갈리나룸(Lactobacillus gallinarum), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 힐가르디이(Lactobacillus hilgardii), 락토바실러스 존소니이(Lactobacillus johnsonii), 락토바실러스 케피라노파시엔스(Lactobacillus kefiranofaciens), 락토바실러스 케피리(Lactobacillus kefiri), 락토바실러스 무코사에(Lactobacillus mucosae), 락토바실러스 파니스(Lactobacillus panis), 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 파라플란타룸(Lactobacillus paraplantarum), 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 폰티스(Lactobacillus pontis), 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실러스 샌프란시센시스(Lactobacillus sanfranciscensis), 락토바실러스 제아에(Lactobacillus zeae) 및 임의의 이의 조합.
또 다른 양태에서, DFM은 다음의 비피도박테리아 종과 추가적으로 조합될 수 있다: 비피도박테리움 락티스, 비피도박테리움 비피덤, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 애니말리스(Bifidobacterium animalis), 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 카테눌라텀(Bifidobacterium catenulatum), 비피도박테리움 슈도카테눌라텀(Bifidobacterium pseudocatenulatum), 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) 및 비피도박테리움 앵굴라텀(Bifidobacterium angulatum) 및 임의의 이의 조합.
다음 종의 박테리아가 언급될 수 있다: 바실러스 서브틸리스, 바실러스 리케니포르미스, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스, 바실러스 푸밀리스, 엔테로코커스, 엔테로코커스 종, 및 페디오코커스 종, 락토바실러스 종, 비피도박테리움 종, 락토바실러스 애시도필러스, 페디오코커스 애시디락티시(Pediococsus acidilactici), 락토코커스 락티스, 비피도박테리움 비피덤, 바실러스 서브틸리스, 프로피오니박테리움 토에니이(Propionibacterium thoenii), 락토바실러스 파르시미니스, 락토바실러스 람노수스, 메가스패라 엘스데니이(Megasphaera elsdenii), 클로스트리듐 부티리컴(Clostridium butyricum), 비피도박테리움 애니말리스 종 애니말리스, 락토바실러스 류테리, 바실러스 세레우스, 락토바실러스 살리바리우스 종 살리바리우스, 프로피오니박테리아 종 및 이의 조합.
1종 이상의 박테리아 균주를 포함하는 본 설명에 기재되는 직접 섭취 미생물은 동일한 유형(속, 종 및 균주)일 수 있거나 속, 종 및/또는 균주의 혼합물을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 설명에 기재되는 1종 이상의 박테리아 균주를 포함하는 직접 섭취 미생물은 바실러스 속이다.
적합하게는 본 개시에 따른 조성물은 WO2012110778에 개시되고, 아래와 같이 요약되는 하나 이상의 제품 또는 이들 제품에 함유되는 미생물과 조합될 수 있다: 바실러스 서브틸리스 균주 2084 접근 번호 NRRl B-50013, 바실러스 서브틸리스 균주 LSSAO1 접근 번호 NRRL B-50104 및 바실러스 서브틸리스 균주 15A-P4 ATCC 접근 번호 PTA-6507(이전에 Avicorr®로 알려져 있던 Enviva® PRO®); 바실러스 서브틸리스 균주 C3102(Calsporin®); 바실러스 서브틸리스 균주 PB6(Clostat®); 바실러스 푸밀리스(8G-134); 엔테로코커스 NCIMB 10415(SF68)(Cylactin®); 바실러스 서브틸리스 균주 C3102(Gallipro® & GalliproMax®); 바실러스 리케니포르미스(Gallipro®Tect®); 엔테로코커스 파에시울(Enterococcus faeciul), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), L. 류테리(reuteri), 비피도박테리움 애니말리스 및 페디오코커스 아시딜락티시(Pediococcus acidilactici)(Poultry Star®); 락토바실러스, 비피도박테리움 및/또는 엔테로코커스(Protexin®); 바실러스 서브틸리스 균주 QST 713(Proflora®); 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 CECT-5940(Ecobiol® & Ecobiol® Plus); 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium) SF68(Fortiflora®); 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 리케니포르미스(BioPlus2B®); 락트산 박테리아 7 엔테로코커스 파에시움(Lactiferm®); 바실러스 균주(CSI®); 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)(Yea-Sacc®); 엔테로코커스(Biomin IMB52®); 페디오코커스 아시딜락티시, 엔테로코커스, 비피도박테리움 애니말리스 종 애니말리스, 락토바실러스 류테리, 락토바실러스 살리바리우스 종 살리바리우스(Biomin C5®); 락토바실러스 파르시미니스(Biacton®); 엔테로코커스(Oralin E1707®); 엔테로코커스(2개 균주), 락토코커스 락티스 DSM 1103(Probios-pioneer PDFM®); 락토바실러스 람노수스 및 락토바실러스 파르시미니스(Sorbiflore®); 바실러스 서브틸리스(Animavit®); 엔테로코커스(Bonvital®); 사카로마이세스 세레비시애(Levucell SB 20®); 사카로마이세스 세레비시애(Levucell SC 0 & SC10® ME); 페디오코커스 아시딜락티(Bactocell); 사카로마이세스 세레비시애(ActiSaf®(이전 BioSaf®)); 사카로마이세스 세레비시애 NCYC Sc47(Actisaf® SC47); 클로스트리듐 부티리컴(Miya-Gold®); 엔테로코커스(Fecinor 및 Fecinor Plus®); 사카로마이세스 세레비시애 NCYC R-625(InteSwine®); 사카로마이세스 세레비시애(BioSprint®); 엔테로코커스 및 락토바실러스 람노수스(Provita®); 바실러스 서브틸리스 및 아스퍼길러스 오리재(Aspergillus oryzae)(PepSoyGen-C®); 바실러스 세레우스(Toyocerin®); 바실러스 세레우스 변종 토요이(toyoi) NCIMB 40112/CNCM I-1012(TOYOCERIN®), 락토바실러스 플란타룸(LactoPlan®) 또는 다른 DFM, 예컨대 바실러스 리케니포르미스 및 바실러스 서브틸리스(BioPlus® YC) 및 바실러스 서브틸리스(GalliPro®).
또한, 본 설명에 기재되는 DFM은 다음 속 및 종으로부터의 효모와 조합할 수 있다: 데바리오마이세스 한세니(Debaryomyces hansenii), 한세니아스포라 우바룸(Hanseniaspora uvarum), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 마르크시아누스(Kluyveromyces marxianus), 피키아 앙구스타(Pichia angusta), 피키아 아노말라(Pichia anomala), 사카로마이세스 바이아누스(Saccharomyces bayanus), 사카로마이세스 세레비시애, 사카로마이세스 파스토리아누스(Saccharomyces pastorianus)(사카로마이세스 칼스베르겐시스(Saccharomyces carlsbergensis)의 동의어) 및 아스퍼길러스 속의 사상 진균.
바람직하게는, 본 설명에 기재되는 DFM은 일반적으로 안전한 것으로 인식된(GRAS) 미생물, 바람직하게는 GRAS-승인 및/또는 유럽 식품안전청(EFSA)의 안전성 추정 인증(Qualified Presumption of Safety) 미생물을 포함한다.
일부 구현예에서, DFM은 내열성이 있는, 즉, 열 견딤성이 있는 것이 중요하다. 이는 특히 사료가 펠렛화되는 경우 해당된다. 따라서, DFM은 열 견딤성 미생물, 가령, 열 견딤성 박테리아, 예를 들어, 바실러스 종을 포함한 예컨대, 포자 형성 박테리아일 수 있다. 바실러스는 성장 조건이 적합하지 않을 때 안정적인 내생포자를 형성할 수 있고, 열, pH, 수분 및 소독제에 매우 저항적이다. 박테리아/DFM이 포자 형성자가 아닌 경우, 아래에서 기술되는 바와 같이 사료 가공처리를 견디도록 보호되어야 한다.
본 설명에 기재되는 바실러스 기반 DFM은 엔테로코커스 종, 예컨대, E. 세코룸의 성장 전부 또는 일부를 억제하거나 지연시킬 수 있다. 환언하면, 본 설명에 기재되는 바실러스 기반 DFM은 항병원성이다. 본 설명에서 사용되는 용어 "항병원성"은 DFM이 병원체, 이 경우, 병원성 엔테로코커스 종, 예컨대, E. 세코룸의 영향(부정적 영향)에 대항함을 의미한다.
예를 들어, 다음의 검정 "DFM 검정"이 DFM 또는 본 구현예에서는, 본 설명에 기재되는 바실러스 기반의 DFM이 될 미생물의 적합성을 결정하기 위하여 사용될 수 있다. 이러한 DFM은 다음과 같이 제공될 수 있다:
바실러스 균주를 완전히 성장시킨 배양액을 원심분리하고, 여과 살균(0.2 μm)하여 멸균 무세포 상청액(CFS)을 수득하였다. 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰을 180 μl의 병원체/BHI(또는 적당한 성장 배지) 현탁액(1%)으로 채운다. 양성 대조군 웰은 추가의 20 μl의 동일한 브로스 배지로 채우고, 시험 웰은 20 μl의 시험 CFS로 채운다. 음성 대조군은 브로스 배지만을, 또는 20μl의 CFS가 첨가된 브로스 배지를 함유한다. 그런 다음, 96-웰 마이크로타이터 플레이트를 흡광도를 기록하기 위한 플렉스 스테이션(Flex station) 기기에서 14시간 동안 37℃에서 호기적으로 인큐베이션시키고, 분석용 컴퓨터로 데이터를 바로 전송하여 동역학 성장 곡선을 생성한다. 측정은 15분마다 이루어졌다. 결과를 OD = 0.4(병원체 단독)에서의 대조군과 처리군(바실러스 CFS와 인큐베이션된 병원체)을 비교하여 억제 %로 제공한다. 성장 지연은 대조군 및 CFS 첨가된 웰 사이에서 OD 0.4에 이르는 시간의 차이로 계산된다. 모든 검정은 2회 반복하여 수행된다. JMP 11에서 터키의 HSD를 이용하여 평균치 검정을 수행하였다; 차이는 P<0.05에서 유의미한 것으로 간주되었다.
항병원성 DFM은 1종 이상의 다음 박테리아를 포함하며, WO2013029013에 기재되어 있다:
바실러스 서브틸리스 균주 3BP5 접근 번호 NRRL B-50510,
바실러스 서브틸리스 균주 918 ATCC 접근 번호 NRRL B-50508, 및
바실러스 서브틸리스 균주 1013 ATCC 접근 번호 NRRL B-50509.
본 설명에 기재되는 바실러스 기반 성분은 배양물(들) 및 (사용되는 경우) 담체(들)로 제조될 수 있고, 리본 또는 패들 혼합장치에 첨가되어 약 15분 동안 혼합될 수 있지만, 시간은 증가되거나 감소될 수 있다. 성분은 배양물 및 담체의 균일한 혼합물이 생성되도록 배합된다. 최종 제품은 바람직하게는 건조한, 유동성 분말이다. 따라서, 바실러스 기반 성분은 1종 이상의 바실러스 박테리아 균주를 포함하는 바실러스 기반의 직접 섭취 미생물, 바실러스 배양물로부터 얻은 상청액 또는 조합물을 포함할 수 있다. 그런 다음, 이러한 바실러스 기반 성분은 동물 사료 또는 사료 프리믹스에 첨가될 수 있다. 바실러스 기반 성분은 동물 사료의 위에 첨가될 수 있거나("상부 급이") 동물의 음용수와 같은 액체에 첨가될 수 있다.
본 설명에 기재되는 바실러스 기반 DFM에서 개별 균주의 혼입 비는 1% 내지 99%, 바람직하게는, 25% 내지 75%로 변할 수 있다.
동물 사료에서 본 설명에 기재되는 바실러스 기반 성분의 적합한 투여량은 약 1x103 CFU/사료 g 내지 약 1x1010 CFU/사료 g, 적합하게는 약 1x104 CFU/사료 g 내지 약 1x108 CFU/사료 g, 적합하게는 약 7.5x104 CFU/사료 g 내지 약 1x107 CFU/사료 g의 범위일 수 있다.
당업자라면 식품 및/또는 농업 산업에서 사용되고 일반적으로 동물 소비에 적합한 것으로 간주되는, 본 설명에 기재된 속으로부터의 미생물의 특정 종 및/또는 균주를 쉽게 인식할 것이다. 동물 사료에는 가금, 돼지, 반추, 수산 및 애완 동물용 식물 물질, 예컨대 옥수수, 밀, 수수, 대두, 유채, 해바라기 또는 임의의 이러한 식물 물질의 혼합물 또는 식물 단백질원이 포함될 수 있다.
용어 "동물 사료", "사료", 및 "사료물"은 상호 교환적으로 사용되며, a) 곡물, 예컨대 소형 낟알(예컨대, 밀, 보리, 호밀, 귀리 및 이의 조합) 및/또는 대형 낟알, 예컨대 옥수수 또는 수수; b) 곡물로부터의 부산물, 예컨대 옥수수 글루텐 밀(meal), 가용분 함유 증류 건조 낟알(DDGS)(특히 옥수수계 가용분 함유 증류 건조 낟알(cDDGS), 밀겨, 밀 미들링(wheat middling), 밀 쇼트(short), 쌀겨, 쌀 왕겨, 귀리 왕겨, 야자핵, 및 시트러스 펄프; c) 대두, 해바라기, 땅콩, 루핀, 완두, 누에콩, 면실, 유채, 어분(fish meal), 건조 혈장 단백질, 육골분, 감자 단백질, 유장, 코프라, 참깨와 같은 원천에서 수득된 단백질; d) 식물 및 동물 원천에서 수득된 오일 및 지방; 및/또는 e) 미네랄 및 비타민을 포함하는 군으로부터 선택된 1종 이상의 사료 물질을 포함할 수 있다.
기능성 사료와 같은 사료로서 또는 이의 제조에 사용될 때, 본 설명에 기재되는 바실러스 기반의 성분은 다음 중 하나 이상과 함께 사용될 수 있다: 영양적으로 허용 가능한 담체, 영양적으로 허용 가능한 희석제, 영양적으로 허용 가능한 부형제, 영양적으로 허용 가능한 애주번트, 영양적 활성 성분. 예를 들어, 단백질, 펩티드, 수크로스, 락토스, 소르비톨, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 염화나트륨, 황산나트륨, 아세트산 나트륨, 시트르산 나트륨, 포름산 나트륨, 소르브산 나트륨, 염화칼륨, 황산칼륨, 아세트산 칼륨, 시트르산 칼륨, 포름산 칼륨, 아세트산 칼륨, 소르브산 칼륨, 염화마그네슘, 황산마그네슘, 아세트산 마그네슘, 시트르산 마그네슘, 포름산 마그네슘, 소르브산 마그네슘, 메타중아황산 나트륨, 메틸 파라벤 및 프로필 파라벤으로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 성분이 언급될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 설명에 기재되는 바실러스 기반의 성분은 사료 성분과 혼합되어 사료물을 형성할 수 있다. 본 설명에서 사용되는 용어 "사료 성분"은 사료물의 전부 또는 일부를 의미한다. 사료물의 일부는 사료물의 하나의 구성분 또는 사료물의 하나를 초과하는, 예컨대 2 또는 3 또는 4개 이상의 구성분을 의미할 수 있다. 하나의 구현예에서, 용어 "사료 성분"은 프리믹스 또는 프리믹스 구성분을 포괄한다. 바람직하게는, 사료는 마초, 또는 이의 프리믹스, 화합물 사료, 또는 이의 프리믹스일 수 있다. 본 설명에 기재되는 바실러스 기반 성분을 포함하는 사료 첨가제 조성물은 화합물 사료와 혼합될 수 있거나, 화합물 사료의 프리믹스 또는 마초, 마초 성분, 또는 마초의 프리믹스에 혼합될 수 있다.
본 설명에서 사용되는 용어 "마초"는 동물(스스로 이를 채집해야 하는 동물이 아님)에 제공되는 임의의 식품을 의미한다. 마초는 절단된 식물을 포괄한다.
용어 마초는 건초, 짚, 저장 목초, 압축 및 펠렛화 사료, 오일 및 혼합 배급사료를 포함하고, 발아 곡물 및 콩류도 포함한다.
마초는 다음으로부터 선택된 1종 이상의 식물로부터 수득될 수 있다: 알팔파(자주개자리), 보리, 벌노랑이, 십자화과 식물, 차우 모엘리어(Chau moellier), 케일, 평지씨(유채), 루타바가(스웨덴 순무), 순무, 토끼풀, 앨사이크 클로버, 붉은 토끼풀, 지하 토끼풀, 흰 토끼풀, 풀, 가짜 귀리 잡초, 김의털, 버뮤다 풀, 참새귀리, 히스 풀(heath grass), (자연 혼합 초지의) 왕포아풀(meadow grass), 과수원 풀, 호밀 풀, 티모시-풀(Timothy-grass), 옥수수, 기장, 귀리, 수수, 대두, 나무(나무-건초를 위한 전지 나무(pollard tree)의 어린 가지), 밀, 및 콩류.
용어 "화합물 사료"는 밀(meal), 펠렛, 너트, 케이크 또는 크럼블 형태의 상업적 사료를 의미한다. 화합물 사료는 다양한 원료 및 첨가제로부터 배합될 수 있다. 이들 배합물은 대상이 되는 동물의 구체적 요건에 따라 제형화된다.
화합물 사료는 모든 1일 요구 영양소를 제공하는 완전 사료, 배급사료(단백질, 에너지)의 일부를 제공하는 농축물 또는 추가적인 미량 영양소, 예컨대 미네랄 및 비타민만을 제공하는 보충물질일 수 있다.
화합물 사료에서 사용되는 주요 구성성분은 사료 곡물이며, 이는 옥수수, 대두, 수수, 귀리, 및 보리를 포함한다.
적합하게는 본 설명에서 언급되는 프리믹스는 미량 구성성분, 예컨대 비타민, 미네랄, 화학 보존제, 항생제, 발효 산물, 및 다른 필수 성분으로 이루어진 조성물일 수 있다. 프리믹스는 보통 상업적 배급사료로 배합하기 적합한 조성물이다.
본 설명에 기재되는 임의의 사료물은 a) 곡물, 예컨대 소형 낟알(예컨대, 밀, 보리, 호밀, 귀리 및 이의 조합) 및/또는 대형 낟알, 예컨대 옥수수 또는 수수; b) 곡물로부터의 부산물, 예컨대 옥수수 글루텐 밀(meal), 가용분 함유 증류 건조 낟알(DDGS), 밀겨, 밀 미들링(wheat middling), 밀 쇼트(short), 쌀겨, 쌀 왕겨, 귀리 왕겨, 야자핵, 및 시트러스 펄프; c) 대두, 해바라기, 땅콩, 루핀, 완두, 누에콩, 면실, 유채, 어분(fish meal), 건조 혈장 단백질, 육골분, 감자 단백질, 유장, 코프라, 참깨와 같은 원천에서 수득된 단백질; d) 식물 및 동물 원천에서 수득된 오일 및 지방; e) 미네랄 및 비타민을 포함하는 군으로부터 선택된 1종 이상의 사료 물질을 포함할 수 있다.
또한, 이러한 사료물은 적어도 30중량%, 적어도 40중량%, 적어도 50중량% 또는 적어도 60중량%의 옥수수 및 대두분 또는 옥수수 및 전지(full fat) 콩, 또는 밀분(wheat meal) 또는 해바라기분을 함유할 수 있다.
부가적으로 또는 대안적으로, 사료물은 고섬유질 사료물을 제공하기 위하여 적어도 1종의 고섬유질 사료 물질 및/또는 적어도 1종의 고섬유질 사료 물질의 적어도 1종의 부산물을 포함할 수 있다. 고섬유질 사료 물질의 예는 밀, 보리, 호밀, 귀리, 곡류로부터의 부산물, 예컨대 옥수수 글루텐 밀(meal), 가용분 함유 증류 건조 낟알(DDGS), 밀겨, 밀 미들링, 밀 쇼트, 쌀겨, 쌀 왕겨, 귀리 왕겨, 야자핵, 및 시트러스 펄프를 포함한다. 일부 단백질원: 해바라기, 루핀, 누에콩 및 목화와 같은 원천에서 수득된 단백질도 고섬유질로 간주될 수 있다.
본 설명에 기재되는 바와 같이, 사료는 다음 중 하나 이상일 수 있다: 펠렛, 너트 또는 (소) 케이크를 포함한 화합물 사료 및 프리믹스; 작물 또는 작물 잔사; 옥수수, 대두, 수수, 귀리, 보리, 옥수숫대, 코프라, 짚, 검불, 사탕무 폐기물; 어분; 갓 깎은 풀 및 기타 사료 작물; 육골분; 당밀; 오일 케이크 및 프레스 케이크; 올리고당; 보존된 사료 작물; 건초 및 저장 목초; 해초; 전 종자류 또는 전곡류, 또는 파쇄, 분쇄 등에 의해 제조된 종자류 및 곡류; 발아 곡물 및 콩류; 효모 추출물.
본 설명에서 사용되는 용어 사료는 또한, 일부 구현예에서 애완동물 먹이를 포괄한다. 애완동물 먹이는 애완동물에 의한 소비를 위한 식물성 또는 동물성 물질, 예컨대 개 먹이 또는 고양이 먹이이다. 애완동물 먹이, 예컨대 개 및 고양이 먹이는 건조 형태, 예컨대 알갱이형 개 먹이(kibble), 또는 습식의 통조림 형태일 수 있다. 고양이 먹이는 아미노산 타우린을 함유할 수 있다.
용어 사료는 또한, 일부 구현예에서 어류 먹이를 포괄할 수 있다. 어류 먹이는 보통 포획 어류의 건강을 양호하게 유지하는 데 필요한 다량 영양소, 미량 원소 및 비타민을 함유한다. 어류 먹이는 플레이크, 펠렛 또는 정제 형태일 수 있다. 일부가 빠르게 가라앉는 펠렛화된 형태는 종종 대형 어류를 위해 또는 바닥에서 먹이를 찾는 어종을 위해 사용된다. 일부 어류 먹이는 또한, 관상용 어류의 색상을 인위적으로 증강시키기 위해 첨가제, 예컨대 베타 카로틴 또는 성 호르몬을 함유한다.
조류 사육처에서 그리고 애완 조류를 먹이기 위해 사용되는 먹이를 포함한 조류 먹이도 용어 "사료" 내에 포괄된다. 전형적으로, 조류 먹이는 다양한 종자를 포함하지만, 지방(소 또는 양고기 지방)도 포괄할 수 있다.
본 설명에서 사용되는 용어 "접촉되는"은 제품(예컨대 사료)에 대한 사료 첨가제 조성물의 간접적 또는 직접적 적용을 나타낸다. 사용될 수 있는 적용 방법의 예는 사료 첨가제 조성물을 포함하는 물질 중 제품의 처리, 사료 첨가제 조성물과 제품의 혼합에 의한 직접 적용, 제품 표면 상으로의 사료 첨가제 조성물의 분무 또는 사료 첨가제 조성물의 제조물 내로의 제품 침지를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
바실러스 기반 성분은 바람직하게는 제품(예컨대, 사료물)과 혼합될 수 있다. 대안적으로, 바실러스 기반 성분은 사료물의 에멀젼 또는 미가공 성분에 포함될 수 있다.
일부 응용을 위하여, 영향 받는/처리되는 제품의 표면 상에서 이용될 수 있거나 이러한 표면에 대하여 바실러스 기반 성분이 이용될 수 있도록 하는 것이 중요하다.
바실러스 기반 성분은, 제어된 양의 바실러스 기반 성분으로 제품(예컨대, 사료물 또는 사료물의 미가공 성분)을 점재, 코팅 및/또는 함침시키기 위하여 적용될 수 있다.
적어도 1종의 박테리아 균주를 포함하는 DFM은 적합한 농도로, 예를 들어 최종 사료 제품에서 약 2x103 CFU/사료 g 내지 약 2x1011 CFU/사료 g, 적합하게는 약 2x106 내지 약 1x1010, 적합하게는 약 3.75x107 CFU/사료 g 내지 약 1x1010 CFU/사료 g의 1일 용량을 제공하는 농도로 첨가될 수 있다.
바람직하게는, 바실러스 기반 성분은 최대 약 70℃; 최대 약 85℃; 또는 최대 약 95℃의 열 처리에 열적으로 안정적일 것이다. 열 처리는 약 30초 내지 수 분까지 수행될 수 있다. 용어 "열적으로 안정적인"은 명시된 온도까지의 가열 전에 존재했던/활성이었던 바실러스 기반 성분의 적어도 약 50%가, 실온으로 냉각된 후 여전히 존재함/활성임을 의미한다. 특히 바람직한 구현예에서, 바실러스 기반 성분은 균질화되어 분말을 생성한다.
대안적으로, 바실러스 기반 성분은 본 설명에 참조로 포함되는 WO2007/044968에 기재된 바와 같은 과립(TPT 과립으로 지칭됨)으로 제형화된다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 사료 첨가제 조성물이 과립으로 제형화되는 경우, 과립은 단백질 코어 상에 코팅된 수화된 배리어 염을 포함한다. 이러한 염 코팅의 장점은 개선된 열 견딤성, 개선된 저장 안정성 및 다른 경우 적어도 하나의 프로테아제 및/또는 1종 이상의 박테리아 균주를 포함하는 DFM에 대한 유해한 효과를 갖는 다른 사료 첨가제에 대한 보호이다. 바람직하게는, 염 코팅을 위해 사용되는 염은 20℃에서 0.25 초과의 수분 활성도 또는 60% 초과의 일정한 습도를 갖는다. 바람직하게는, 염 코팅은 Na2SO4를 포함한다.
바실러스 기반 성분을 함유하는 사료는 사료 펠렛화 공정을 이용하여 생산될 수 있다. 선택적으로, 펠렛화 단계는 펠렛의 형성 전에, 증기 처리, 또는 컨디셔닝 단계를 포함할 수 있다. 분말을 포함하는 혼합물은 컨디셔너, 예컨대 증기 주입을 포함하는 혼합장치에 배치될 수 있다. 혼합물은 컨디셔너에서 명시된 온도까지, 예컨대 60 내지 100℃로 가열되며, 전형적인 온도는 70℃, 80℃, 85℃, 90℃ 또는 95℃일 것이다. 체류 시간은 수 초 내지 수 분 및 심지어 수 시간, 예컨대 5초, 10초, 15초, 30초, 1분, 2분, 5분, 10분, 15분, 30분 및 1시간으로 가변적일 수 있다.
과립에 대해 적어도 하나의 코팅은 과립의 적어도 55% w/w를 구성하는 수분 수화 물질을 포함할 수 있고/있거나; 적어도 하나의 코팅은 2개의 코팅을 포함할 수 있다. 2개의 코팅은 수분 수화 코팅 및 수분 배리어 코팅일 수 있다. 일부 구현예에서, 수분 수화 코팅은 과립의 25% 내지 60% w/w일 수 있고 수분 배리어 코팅은 과립의 2% 내지 15% w/w일 수 있다. 수분 수화 코팅은 무기 염, 수크로스, 전분, 및 말토덱스트린으로부터 선택될 수 있고, 수분 배리어 코팅은 중합체, 고무, 유장 및 전분으로부터 선택될 수 있다.
과립은 사료 펠렛화 공정을 이용해서 생산될 수 있고 사료 전처리 공정은 최대 수 분 동안 70℃ 내지 95℃, 예컨대 85℃ 내지 95℃에서 수행될 수 있다.
바실러스 기반 성분은 코어; 활성 제제로서, 과립이 하나의 성분인 경우 저장 후 및 증기-가열 펠렛화 공정 후 과립의 활성 제제가 적어도 80% 활성을 보전하는 활성 제제; 수분 배리어 코팅; 및 과립의 적어도 25% w/w인 수분 수화 코팅으로서, 과립이 증기-가열 펠렛화 공정 전 0.5 미만의 수분 활성도를 갖는 수분 수화 코팅을 포함하는 동물 사료용 과립으로 제형화될 수 있다.
과립은 중합체 및 고무로부터 선택되는 수분 배리어 코팅을 가질 수 있고 수분 수화 물질은 무기 염일 수 있다. 수분 수화 코팅은 과립의 25% 내지 45% w/w일 수 있고 수분 배리어 코팅은 과립의 2% 내지 10% w/w일 수 있다.
과립은 최대 수 분 동안 85℃ 내지 95℃에서 수행될 수 있는 증기-가열 펠렛화 공정을 이용해서 생산될 수 있다.
대안적으로, 조성물은 소비에 적합한 액체 제형이며, 바람직하게는 이러한 소비 액체는 완충액, 염, 소르비톨 및/또는 글리세롤 중 1종 이상을 함유한다.
또한, 사료 첨가제 조성물은 담체 기재, 예컨대 분쇄 밀 상으로 바실러스 기반 성분을 적용하여, 예컨대 분무하여 제형화될 수 있다.
한 구현예에서, 본 설명에 기재되는 바실러스 기반 성분을 포함하는 이러한 사료 첨가제 조성물은 프리믹스로 제형화될 수 있다. 단지 예로서, 프리믹스는 1종 이상의 사료 성분, 예컨대 1종 이상의 미네랄 및/또는 1종 이상의 비타민을 포함할 수 있다.
대안적으로, 조성물은 소비에 적합한 액체 제형이며, 바람직하게는 이러한 소비 액체는 완충액, 염, 소르비톨 및/또는 글리세롤 중 1종 이상을 함유한다.
또한, 사료 첨가제 조성물은 담체 기재, 예컨대 분쇄 밀 상으로 바실러스 기반 성분을 적용하여, 예컨대 분무하여 제형화될 수 있다.
한 구현예에서, 본 설명에 기재되는 이러한 바실러스 기반 성분은 프리믹스로 제형화될 수 있다. 단지 예로서, 프리믹스는 1종 이상의 사료 성분, 예컨대 1종 이상의 미네랄 및/또는 1종 이상의 비타민을 포함할 수 있다.
본 설명에 개시되는 바실러스 기반 성분은 임의의 적절한 사료 물질에 첨가하기에 적합한 것으로 이해될 것이다.
본 설명에서 사용되는 용어 사료 물질은 동물에 의해 소비될 기본 사료 물질을 나타낸다. 이는, 예를 들어, 적어도 1종 이상의 미가공 곡물, 및/또는 가공된 식물 및/또는 동물 물질, 예컨대 대두분 또는 골분을 포함할 수 있음이 추가로 이해될 것이다.
당업자는, 상이한 동물이 상이한 사료물을 필요로 하며, 동물의 사육 목적에 따라, 심지어 동일한 동물도 상이한 사료물을 필요로 할 수 있음을 이해할 것이다.
바람직하게는, 사료물은 옥수수, 밀, 보리, 라이밀, 호밀, 쌀, 타피오카, 수수, 및/또는 임의의 부산물뿐만 아니라 단백질 풍부 성분, 예컨대 대두분, 평지씨분, 유채분, 목화씨분, 해바라기씨분, 동물 부산물분 및 이의 혼합물도 포함하는 사료 물질을 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는, 사료물은 동물성 지방 및/또는 식물성 오일을 포함할 수 있다.
선택적으로, 사료물은 또한, 추가적인 미네랄, 예컨대 칼슘 및/또는 추가적인 비타민을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 사료물은 옥수수 대두분 믹스이다.
또 다른 양태에서 사료물의 생산 방법이 제공된다. 사료물은 전형적으로 원료가 먼저 적합한 입자 크기로 분쇄된 후, 적절한 첨가제와 혼합되는 사료 밀(mill)로 생산된다. 이어서 사료물은 매시 또는 펠렛으로 생산될 수 있다; 후자에는 전형적으로 온도를 목표 수준까지 상승시킨 후, 사료가 다이를 통과하도록 하여 특정한 크기의 펠렛을 생산하는 방법이 관여된다. 펠렛은 냉각되도록 허용된다. 이후 액체 첨가제, 예컨대 지방 및 효소가 첨가될 수 있다. 사료물의 생산에는 또한, 펠렛화 전에, 특히 적어도 증기의 사용을 포함할 수 있는 적합한 기법에 의한, 압출 또는 팽창을 포함하는 추가적인 단계가 포함될 수 있다.
사료물은 단위 동물, 예컨대 가금류(예를 들어, 육계, 산란계, 육용종계, 칠면조, 오리, 거위, 물새), 돼지(모든 연령 범주), 애완동물(예를 들어 개, 고양이) 또는 어류를 위한 사료물일 수 있으며, 바람직하게는 사료물은 가금류를 위한 것이다.
본 설명에 기재되는 바실러스 기반 성분은 동물 사료의 상부에 위치될 수 있다. 즉, 상부 급이될 수 있다. 대안적으로, 본 설명에 기재되는 바실러스 기반 성분은 동물의 음용수 중과 같이, 액체에 첨가될 수 있다.
본 설명에서 사용되는 용어 "접촉되는"은 제품(예컨대 사료)에 대한 본 설명에 기재되는 바실러스 기반 성분의 간접적 또는 직접적 적용을 나타낸다.
사용될 수 있는 적용 방법의 예는 바실러스 기반 성분을 포함하는 물질 중 제품의 처리, 사료 첨가제 조성물의 본 설명에 기재되는 바실러스 기반 성분과 제품의 혼합에 의한 직접 적용, 제품 표면 상으로의 이러한 사료 첨가제 조성물의 분무 또는 사료 첨가제 조성물의 제조물 내로의 제품 침지를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 하나의 구현예에서, 사료 첨가제 조성물의 본 설명에 기재되는 바실러스 기반 성분은 바람직하게는 제품(예컨대 사료물)과 혼합된다. 대안적으로, 사료 첨가제 조성물은 사료물의 에멀젼 또는 미가공 성분에 포함될 수 있다. 이는 조성물이 효율 이익을 전할 수 있도록 한다.
본 설명에 기재되는 바실러스 기반 성분의 제조 방법 또한, 분말을 펠렛화하는 추가적인 단계를 포함할 수 있다. 분말은 당해 분야에 공지된 다른 성분과 혼합될 수 있다. 분말, 또는 분말을 포함하는 혼합물은 다이를 통해 밀려나갈 수 있고, 생성 가닥은 다양한 길이의 적합한 펠렛으로 절단된다.
선택적으로, 펠렛화 단계는 펠렛의 형성 전에, 증기 처리, 또는 컨디셔닝 단계를 포함할 수 있다. 분말을 포함하는 혼합물은 컨디셔너, 예컨대 증기 주입을 포함하는 혼합장치에 배치될 수 있다. 혼합물은 명시된 온도, 예컨대 60 내지 100℃까지 컨디셔너에서 가열되며, 전형적 온도는 70℃, 80℃, 85℃, 90℃ 또는 95℃일 것이다. 잔류 시간은 수 초 내지 수 분, 심지어 수 시간, 예컨대 5초, 10초, 15초, 30초, 1분, 2분, 5분, 10분, 15분, 30분 및 1시간으로 변할 수 있다.
당업자는, 상이한 동물이 상이한 사료물을 필요로 하며, 동물의 사육 목적에 따라, 심지어 동일한 동물도 상이한 사료물을 필요로 할 수 있음을 이해할 것이다.
선택적으로, 사료물은 또한, 추가적인 미네랄, 예컨대 칼슘 및/또는 추가적인 비타민을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 사료물은 옥수수 대두분 믹스이다.
사료물은 전형적으로 원료가 먼저 적합한 입자 크기로 분쇄된 후, 적절한 첨가제와 혼합되는 사료 밀(mill)로 생산된다. 이어서 사료물은 매시 또는 펠렛으로 생산될 수 있다; 후자에는 전형적으로 온도를 목표 수준까지 상승시킨 후, 사료가 다이를 통과하도록 하여 특정한 크기의 펠렛을 생산하는 방법이 관여된다. 펠렛은 냉각되도록 허용된다. 이후 액체 첨가제, 예컨대 지방 및 효소가 첨가될 수 있다. 사료물의 생산에는 또한, 펠렛화 전에, 특히 적어도 증기의 사용을 포함할 수 있는 적합한 기법에 의한, 압출 또는 팽창을 포함하는 추가적인 단계가 포함될 수 있다.
위에 언급된 바와 같이, 바실러스 기반 성분 및/또는 이를 포함하는 사료물은 임의의 적합한 형태로 이용될 수 있다. 바실러스 기반 성분 및/또는 이를 포함하는 사료물은 고체 또는 액체 제조물 또는 이의 대안물의 형태로 사용될 수 있다. 고체 제조물의 예는 습윤 가능, 분무 건조, 또는 동결 건조될 수 있는 분말, 페이스트, 볼루스, 캡슐, 펠렛, 정제, 분진, 및 과립을 포함한다. 액체 제조물의 예는 수성, 유기 또는 수성-유기 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 적용에서, 사료 첨가제 조성물은 사료와 혼합되거나 음용수에 투여될 수 있다.
본 설명에 기재되는 바실러스 기반 성분을 사료에 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 혼합하는 단계, 및 (선택적으로) 포장하는 단계를 포함하는, 바실러스 기반 성분.
사료물 및/또는 바실러스 기반 성분은 적어도 1종의 미네랄 및/또는 적어도 1종의 비타민과 조합될 수 있다. 이렇게 유도된 조성물은 본 설명에서 프리믹스로 지칭될 수 있다. 사료물은 적어도 0.0001중량%의 바실러스 기반 성분을 포함할 수 있다. 적합하게는, 사료물은 적어도 0.0005중량%; 적어도 0.0010중량%; 적어도 0.0020중량%; 적어도 0.0025중량%; 적어도 0.0050중량%; 적어도 0.0100중량%; 적어도 0.020중량%; 적어도 0.100중량% 적어도 0.200중량%; 적어도 0.250중량%; 적어도 0.500중량%의 바실러스 기반 성분을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 식품 또는 바실러스 기반 성분은 적어도 1종의 생리적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 생리적으로 허용 가능한 담체는 바람직하게는 말토덱스트린, 석회석(탄산칼슘), 사이클로덱스트린, 밀 또는 밀 성분, 수크로스, 전분, Na[2]S0[4], 활석, PVA 및 이의 혼합물 중 적어도 1종으로부터 선택된다. 추가 구현예에서, 식품 또는 사료는 금속 이온 킬레이터를 추가로 포함할 수 있다. 금속 이온 킬레이터는 EDTA 또는 시트르산으로부터 선택될 수 있다.
하나의 구현예에서, (캡슐화되었든 아니든) 본 설명에 기재되는 바실러스 기반 성분은 말토덱스트린, 석회암(탄산칼슘), 사이클로덱스트린, 밀 또는 밀 성분, 수크로스, 전분, Na2SO4, 활석, PVA, 소르비톨, 벤조산염, 소르브산염, 글리세롤, 수크로스, 프로필렌 글리콜, 1,3-프로판 디올, 글루코스, 파라벤, 염화나트륨, 시트르산염, 아세트산염, 인산염, 칼슘, 메타중아황산염, 포름산염 및 이의 혼합물 중 적어도 1종으로부터 선택되는 적어도 1종의 생리적으로 허용 가능한 담체와 제형화될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 설명에 기재되는 바실러스 기반 성분은 생리적으로 허용 가능한 담체 중에 존재할 것이다. 적합한 담체는 크고 느리게 대사되는 거대분자, 예컨대 단백질, 폴리펩타이드, 리포좀, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체성 아미노산, 아미노산 공중합체 및 불활성 바이러스 입자일 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염, 예를 들어 미네랄 산 염, 예컨대 염산염, 브롬화수소산염, 인산염 및 황산염, 또는 유기산의 염, 예컨대 아세트산염, 프로피온산염, 말론산염 및 벤조산염이 이용될 수 있다. 치료 조성물 중 약학적으로 허용 가능한 담체는 추가로 액체, 예컨대 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올을 함유할 수 있다. 추가로, 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충 물질이 이러한 조성물에 존재할 수 있다. 이러한 담체는 약학적 조성물이 환자 섭취용 정제, 환제, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리 및 현탁액으로 제형화될 수 있도록 한다. 일단 제형화되면, 조성물은 대상체에 직접 투여될 수 있다. 치료될 대상체는 동물일 수 있다.
본 설명에 개시된 조성물 및 방법의 비제한적 예는 다음을 포함한다:
1. 1종 이상의 바실러스 박테리아 균주를 포함하는 바실러스 기반의 직접 섭취 미생물, 바실러스 배양물로부터 수득된 상청액 또는 이의 조합물로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 바실러스 기반 성분 유효량을 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 동물에서 병원성 엔테로코커스 종의 성장 전부 또는 일부를 억제하거나 지연시키는 방법.
2. 구현예 1에 있어서, 바실러스 기반의 직접 섭취 미생물은 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 푸밀리스(Bacillus pumilis) 및 바실러스 서브틸리스(Baccillus subtilis)로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
3. 구현예 1 또는 2에 있어서, 바실러스 기반의 직접 섭취 미생물은 다음 균주 중 1종 이상으로부터 선택되는 것인, 방법: 바실러스 균주 2084 접근 번호 NRRl B-50013, 바실러스 균주 LSSAO1 접근 번호 NRRL B-50104 및 바실러스 균주 15A-P4 ATCC 접근 번호 PTA-6507.
4. 구현예 1, 2 또는 3에 있어서, 동물은 단위 동물인, 방법.
5. 구현예 1, 2 또는 3에 있어서, 동물은 다위 동물인, 방법.
6. 구현예 1, 2, 3 또는 4에 있어서, 단위 동물은 가금류인, 방법.
7. 위의 구현예 1 내지 6 중 임의의 구현예에 있어서, 적어도 하나의 바실러스 기반 성분은 사료 내 또는 사료 위 또는 물과 같은 액체 중이든, 동물 사료를 통해 동물에 직접적으로 투여되는 것인, 방법.
8. 구현예 1 내지 7 중 임의의 구현예에 있어서, 적어도 하나의 바실러스 기반 성분은 사료물, 사료 첨가제 조성물, 프리믹스로 구성되는 군으로부터 선택된 형태 또는 물과 같은 액체로 동물에 투여되는 것인, 방법.
실시예
본 설명에서 달리 정의되지 않은 한, 본 설명에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시가 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 문헌[Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., John Wiley and Sons, New York (1994), 및 Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N.Y. (1991)]은 본 개시와 함께 사용되는 여러 용어의 일반 사전을 당업자에게 제공한다.
본 개시는 다음 실시예에서 추가로 정의된다. 실시예는 일부 구현예를 나타내지만, 단지 예로서 주어짐이 이해되어야 한다. 위에서의 논의 및 실시예로부터, 당업자는 본 개시의 본질적 특징을 확인할 수 있고, 이의 정신 및 범위에서 벗어나지 않고, 다양한 용도 및 조건에 맞게 다양한 변화 및 변형을 가할 수 있다.
실시예 1
엔테로코커스 세코룸
및
바실러스
균주
아래 표 1에 요약된 바와 같이, 52종의 엔테로코커스 세코룸 균주를 북미와 유럽의 균주 은행으로부터 수집하였다. 수집 중, 장외 병변으로부터 분리된 엔테로코커스 세코룸 균주를 공급받는 데 중점을 두었고 척추염 발병을 확인하여, 시험한 균주가 독성이 있고 질병을 유발할 수 있다는 확신을 가능하게 했다.
총 11종의 바실러스 균주의 억제 가능성을 시험하였다. 여기에는 표 2에 요약된 바와 같이 듀폰의 독자적인 DFM 균주와 경쟁사 DFM 제품으로부터 분리된 바실러스가 포함되었다. 시험한 바실러스 균주 모두는 가금류 생산용으로 상업화되어 있다. 다니스코(Danisco) A/S로부터 상업적으로 이용 가능한 엔비바(Enviva®) PRO는 바실러스 균주 2084 접근 번호 NRRl B-50013, 바실러스 균주 LSSAO1 접근 번호 NRRL B-50104 및 바실러스 균주 15A-P4 ATCC 접근 번호 PTA-6507의 조합이다(본 설명에 참조로 포함된 US 7,754,469 B에 교시된 바와 같음).
|
내부 균주
명칭 |
균주 상업
명칭 |
종(표시 내용) | 상품명 | 생산업체 |
| BS8 | NRRL B-50104 | 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 | Enviva® PRO | 듀폰 |
| 2084 | NRRL B-50013 | 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 | Enviva® PRO | 듀폰 |
| 15A-P4 | PTA-6507 | 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 | Enviva® PRO | 듀폰 |
| CS1 | C-3102 DSM15544 |
바실러스 서브틸리스 | Calsporin | Calpis |
| 2B1 | DSM5750 | 바실러스 서브틸리스 | BioPlus 2B | Chr Hansen |
| 2B2 | DSM5749 | 바실러스 리케니포르미스 | BioPlus 2B | Chr Hansen |
| #11/1 | DSM17299 | 바실러스 서브틸리스 | Gallipro | Chr Hansen |
| #12/1 | DSM17236 | 바실러스 리케니포르미스 | Gallipro Tect | Chr Hansen |
| #10/4 | 바실러스 서브틸리스 | Sporulin | Novus | |
| #10B/1 | 바실러스 서브틸리스 | Sporulin | Novus | |
| #10B/4 | 바실러스 서브틸리스 | Sporulin | Novus |
모든 비-듀폰 바실러스 제품을 구입하여, 3개의 개별적인 생산 배치로부터 3반복으로 분리하였다. 회수된 균주가 제품 라벨의 균주 표시 사항과 일치함을 확실히 하기 위하여 모든 균주를 확인하였다. 위의 표 2에 나타낸 바와 같이, 전체 엔테로코커스 세코룸 컬렉션으로부터 9종의 분리주의 부분 집합에 대해 비-듀폰 제품을 시험하였다.
실시예 2
무세포 상청액(CFS) 제조 및
엔테로코커스 세코룸
,
엔테로코커스 아비움
및
엔테로코커스 갈리나룸
균주의 성장
동결된 바실러스 보존액으로부터의 10 ml TSB(tryptic soy broth)가 들어 있는 30 ml 쉐이커 튜브에 접종 루프를 이용하여 접종한다. 24시간 동안 32℃ 인큐베이터에 튜브를 인큐베이션 시키고, 130으로 진탕하여 바실러스를 성장시킨다.
18시간 동안 플라스크를 인큐베이션 시킨 후, 분광광도계로 광학 밀도(OD)를 체크하였다(파장 600 nm, 흡광도 0). 2 ml의 멸균 TSB를 큐벳으로 피펫팅하여 빈 대조군을 생성하였다. 1.8 ml 멸균 TSB 및 0.2 ml의 18시간 성장물을 각 큐벳에 피펫팅하여 바실러스의 10x 희석물을 생성하였다. 큐벳을 덮고 뒤집어서 완전히 혼합되게 하였다. 바실러스 희석액의 흡광도가 0.25 내지 0.3임을 확인하였다(0.25 미만의 흡광도 판독치를 나타내는 샘플은 흡광도가 허용 가능한 수준에 이를 때까지 다시 인큐베이션 시켰다).
바실러스 성장물을 각각의 플라스크로부터 멸균 250 ml 원심분리 보틀로 옮겨 10,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후, 각각의 바실러스 타입의 상청액을 Nalgene 보틀 탑 필터로 옮겨 50 ml 원추형 튜브 안으로 펌핑하였다.
이 절차는 모든 바실러스 균주에서 수행되었다. 그런 다음, 무세포 상청액(CFS)을 필요할 때까지 -80℃에서 동결시켰다.
E. 세코룸 균주를 급속 냉동된 보존 배양물로부터 BHI(뇌 및 심장 주입) 브로스 및 BHI 아가 플레이트(순도 확인을 위해)에 접종하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션 시켰다. 성장 배지에 대한 적응을 확실히 하기 위하여 분석에 포함시키기 전에 모든 균주는 적어도 2회 계대배양하였다.
위의 표 2에서 확인한 각각의 바실러스 기반 DFM에 대하여 모든 분석을 2회 반복하여 수행하였다.
엔테로코커스 세코룸 세포에 대한 열적 충격을 피하기 위하여 분석 전 1시간 동안 20 ml의 BHI 브로스를 인큐베이션 시켰다.
평판 웰이 있는 96-웰 UV 처리 마이크로타이터 플레이트에, 배지(BHI 브로스) 및 CFS 및 표적 미생물을 다음과 같이 첨가하였다:
플레이트를 흡광도를 기록하기 위한 플렉스 스테이션(Flex station) 기기에서 14시간 동안 37℃에서 인큐베이션 시키고, 분석용 컴퓨터로 데이터를 바로 전송하였다. 측정은 15분마다 이루어졌다.
결과를 OD = 0.4(E. 세코룸 단독)에서의 대조군과 처리군(바실러스 CFS와 인큐베이션된 E. 세코룸)을 비교하여 억제 %로 제공한다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 42종의 개별적인 균주에 걸쳐, 3종의 Enviva® PRO 균주 각각(바실러스 기반 성분)에 의한 억제 평균은 >85%이었다. >50% 억제는 허용 가능하다고 간주하고, ≥75% 억제는 우수하다고 간주하기로 결정하였다. 100% 이상의 억제는 단순히 억제된다기 보다는 병원체 분리주가 바실러스에 의해 분해되었음을 나타낸다.
표 3은 Enviva® PRO 균주에 의한 51종의 엔테로코커스 세코룸 균주의 성장 억제 평균을 보여준다. 바실러스 CFS 없이 인큐베이션된 엔테로코커스 세코룸과 비교하여 모든 균주가 E. 세코룸의 성장을 유의미하게 억제할 수 있었다. 가장 효과적인 균주는 15AP4(바실러스 기반 성분)로 억제 평균이 88.79%였으나, 균주들 사이에 차이는 통계적으로 유의미하지 않았다.
| 유럽 균주 | 미국 균주 | 전체 균주 | ||||
| 평균 억제, % |
SEM | 평균 억제, % |
SEM | 평균 억제, % |
SEM | |
| 15AP4 | 88.27 | 2.887 | 89.03 | 3.086 | 88.79 | 2.30 |
| BS2084 | 89.87 | 2.887 | 88.08 | 2.955 | 88.60 | 2.233 |
| BS8 | 86.80 | 2.887 | 84.24 | 2.955 | 84.99 | 2.233 |
| P 값 | 0.7552 | 0.4898 | 0.4054 | |||
표 4는 12종의 바실러스 균주에 의한 9종의 엔테로코커스 세코룸 균주의 부분 집합의 성장 억제 평균을 보여준다. 가장 효과적인 균주는 BS2084(바실러스 기반 성분)로 억제 평균이 85.33%였다. 가장 효과가 없었던 바실러스 균주는 2B2로, 억제 평균이 -80.17%여서, 바실러스 CFS(바실러스 기반 성분)이 부존재할 때보다 존재할 때 엔테로코커스 세코룸이 더 빨리 성장하였음을 나타내었다. 바실러스 균주들 사이에서는 효능의 유의미한 차이가 있었다.
표 5의 데이터는 엔테로코커스 갈리나룸 VTT E-97776T에 대한 B. 아밀로리퀘파시엔스 아종 플란타룸 15AP4, BS8 및 2084의 CFS(바실러스 기반 성분)의 항미생물 활성을 보여준다.
| 엔테로코커스 갈리나룸 VTT E-97776T | ||||||||||
| 대조군 | 처리군 | 성장 지연 | ||||||||
| T0에서 ODc | ODc 0.4 (최근접) |
Tc (OD 0.4에서의 시간) |
T0에서 ODt | Tc에서 OD | Tt (OD 0.4에서의 시간) |
ODt 0.4 (최근접) |
||||
| 15AP4 | 0.10965 | 0.42265 | 06:45:00 | 405 | 0.11045 | 0.18645 | 08:15:00 | 495 | 0.39695 | 01:30:00 |
| BS8 | 0.11355 | 0.4004 | 06:45:00 | 405 | 0.11055 | 0.15675 | 10:00:00 | 600 | 0.4215 | 03:15:00 |
| 2084 | 0.10985 | 0.40595 | 06:15:00 | 375 | 0.10735 | 0.1471 | 09:30:00 | 570 | 0.3838 | 03:15:00 |
도 1 및 도 2는 각각 미국 및 유럽 가금류 생산품으로부터 수집된 E. 세코룸 균주에 대한 억제 평균을 보여준다.
도 3은 Enviva® PRO 균주 유무에 따른 E. 세코룸 성장 동역학에 대한 데이터를 도시한 것이다. 일부 E. 세코룸은 바실러스 상청액, 즉, 바실러스 기반 성분에 의해 완전히 억제되지 않는다. 14시간 인큐베이션 시간 종료 시, 병원체의 농도는 대조 플레이트 및 처리 플레이트에 대해 동일하지만, 지연기가 길어지고, 지수적 성장이 지연된다. 가금류의 장 통과 시간을 고려할 때, 이러한 종류의 결과는 (전체적인 억제의 결여에도 불구하고) 바실러스 기반 성분이 장을 통과하는 동안 병원체의 증식을 막아, 부착 및 이동의 위험을 감소시킬 수 있음을 의미한다. 도 4에서 증명되는 바와 같이, 다른 균주들은 14시간의 시점에서 지연되고 억제된다.
도 5는 대조군 병원체 곡선이 OD 0.4에 이를 때인 정확한 종점에서 억제(%)로 나타낸 엔테로코커스 갈리나룸 VTT E-97776T에 대한 B. 아밀로리퀘파시엔스 아종 플란타룸(plantarum) 15AP4, BS8 및 2084의 CFS(바실러스 기반 성분)의 항미생물 활성을 보여준다.
도 6은 바실러스 2084의 CFS(바실러스 기반 성분)와 함께 또는 이것 없이 인큐베이션 시킨 엔테로코커스 아비움 E 84197의 성장 프로파일을 보여준다.
도 7은 대조군 병원체 곡선이 OD 0.4에 이를 때인 정확한 종점에서 억제(%)로 나타낸, 미국 및 벨기에의 가금류 생산 시스템으로부터 분리된 10종의 임상 분리주 엔테로코커스 세코룸에 대한 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 DSM7T, B. 서브틸리스 DSM10T 및 B. 리케니포르미스 DSM13T의 CFS의 항미생물 활성을 보여준다(검은색 막대는 억제 평균(%)에 해당한다).
이전의 연구는 지수적 성장기에 이르는 E. 세코룸의 완전한 억제 및 지연에서 나타나는 바와 같이, 육계는 생산 1 내지 3주 사이에 패혈증이 생김을 보여주었다. 본 설명에 기재되는 바실러스 기반 DFM으로의 가금류 사류 보충은 장 콜로니화, 부착 및 후속 침습을 지연시킬 수 있으며, 이는 임상 증상의 발생률이 감소된 채로 조류를 도축할 수 있음을 의미한다.
이러한 데이터는 시험했던 다른 병원체들의 억제 범위와 비교하여 상당히 주목할 만하다. 또한, 바실러스 효능의 자연적인 변화에도 불구하고, 시험한 E. 세코룸 분리주의 범위에 걸쳐 이 효과는 상당히 일관된 것으로 보인다.
본 설명에 제시된 시험관 내 결과는, 본 설명에 기재되는 바실러스 기반 성분으로의 가금류 사료의 보충이 (도 5에서 증명된 바와 같이) 동물에서 엔테로코커스 종의 성장을 억제 또는 지연시키는 것뿐만 아니라, 신종 병원체인 E. 세코룸의 성장 전부 또는 일부를 억제 또는 지연시키는 데에도 매우 효과적일 수 있음을 증명한다.
실시예 3
동물에서
엔테로코커스
종의 성장을 억제하거나 지연시키는
바실러스
기반의 성분
기준 균주는 "국제 미생물 명명 코드(International Code of Nomenclature of Bacteria)"에서 "종의 명명 기준형"으로 정의되고, 모든 다른 균주를 비교하여 그것들이 그 종에 속하는지를 결정하는 "기준점"이다. 이 연구에 포함된 박테리아 종 각각의 기준 균주(아래 표 6 참조)를 포함시킴으로써 동일한 종에 속하지만 "프로바이오틱"으로 특징 지어지지 않는 균주에 대하여 "프로바이오틱"으로 특징 지어지는 균주들의 억제 가능성을 비교할 수 있다. 여기서의 가설은 프로바이오틱 특성은 특정 균주에 고유하고, 그러한 특성은 동일한 종에 속하는 임의의 다른 균주들로 전달될 수 없다는 점이다. 철저히 특성이 규명되고 평가된 균주들만 "프로바이오틱"으로 지정될 수 있다. 이 실험에 포함된 기준 균주들은 여기서 연구된 균주들과 관련된 3종의 구별되는 바실러스 종을 대표한다. 그것들의 출처 및 다른 균주 은행에서 이용 가능한 균등한 균주의 불완전한 목록을 표 6에 제시하였다.
| 박테리아 종 | 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 | 바실러스 서브틸리스 | 바실러스 리케니포르미스 |
| 본 연구에 사용된 기준 균주 | B. 아밀로리퀘파시엔스 DSM7T | B. 서브틸리스 DSM10T | B. 리케니포르미스 DSM13T |
| 본 연구에 사용된 기준 균주의 출처 | 독일생물자원센터(DSMZ) | 독일생물자원센터(DSMZ) | 독일생물자원센터(DSMZ) |
| 미국 ATCC(American Type Culture Collection) | ATCC 6051T | ATCC 14580T | |
| 타이완 BCRC(Bioresource Collection and Research Center) | BCRC 11601T | BCRC 10255T | BCRC 11702T |
| 핀란드 VTT Culture Collection | VTT E-80124T | VTT E-97009T | VTT E-95571T |
| 일본 NBRC Biological Resource Center | NBRC 15535T | NBRC 12210T NBRC 13719T; NBRC 16412T | NBRC 12200T |
| 영국 NCIMB(National Collections of Industrial Food and Marine Bacteria) | NCIMB 12077T | NCIMB 3610T | NCIMB 50016T; NCIMB 9375T |
| 미국 NRRL Agricultural Research Service Culture Collection | NRRL B-14393T | NRRL B-4219T | NRRL NRS-1264T |
| LMG Belgian Coordinated Collections of Microorganisms/ LMG Bacteria Collection | LMG 12234T | LMG 7135T | LMG 12363T; LMG 12407T; LMG 6933T |
| 스웨덴 CCUG(Culture Collection, University of Goteborg) | CUCG 163BT | CCUG 7422T | |
| 프랑스 CIP(Collection de L’Institut Pasteur) | CIP 52.65T; CIP 5265T | CIP 52.71T | |
| 대한민국 KCTC(Korean Collection for Type Cultures) | KCTC 3555T | KCTC 1753T |
이러한 3종의 기준 균주의 항미생물 활성을 이전에 기술된 바와 같이 엔테로코커스 세코룸의 10종의 분리주 세트(표 7)에 대해 평가하였다.
3종의 별개의 기준 균주들로부터 수득된 CFS 각각에 의한 10종의 병원성 엔테로코커스 세코룸 분리주의 성장 억제(%)를 도 7에 나타내었다. Enviva Pro의 3종의 B. 아밀로리퀘파시엔스 균주(15AP4; BS8 및 2084)(위의 표 4 참조)와는 달리, 기준 균주 B. 아밀로리퀘파시엔스 DSM7T는 시험한 병원체에 대해 어떠한 항미생물 활성도 나타내지 않았다(도 7). 이 실험에서, B. 아밀로리퀘파시엔스 기준 균주(DSM7T)로부터의 CFS는 병원체의 성장을 촉진하였고, 시험한 병원체 중 어떠한 것도 억제할 수 없었다. 이 발견은 항미생물 특성의 균주 특이성을 뒷받침한다. 특정 균주에 대한 프로바이오틱 클레임은 그 균주 또는 수천 종의 균주 중 독창성을 나타내어 경제적 가치뿐만 아니라 숙주에 이익을 제공할 수 있는 균주를 확인하려는 목적의 과학적인 스크리닝 접근법으로부터 기인한다.
따라서, B. 리케니포르미스 DSM13T가 상업적 프로바이오틱 B. 리케니포르미스 균주인 ___ 및 #10/4(각각 1.36% 및 -12.41%)(표 4)와 비교하여 E. 세코룸 병원성 분리주에 대해 더 큰 항미생물 활성(평균 68.58%)을 나타냈다는 점은 놀라웠다. 기준 균주 B. 서브틸리스 DSM10T는 평균 26%의 억제(%)를 나타냈는데, 이는 상업적인 프로바이오틱 B. 서브틸리스 균주 #11/1에 의해 나타난 평균 %(-21%)와 비교할 때 훨씬 더 컸다(도 7 및 표 4).
Claims (13)
- 동물에서 병원성 엔테로코커스 세코룸의 성장 전부 또는 일부를 억제하거나 지연시키는 방법에 사용하기 위한 바실러스 기반의 직접 섭취 미생물로서,
바실러스 균주 2084 접근 번호 NRRl B-50013 및 바실러스 균주 15A-P4 ATCC 접근 번호 PTA-6507 로부터 선택되는, 바실러스 기반의 직접 섭취 미생물. - 제1항에 있어서, 동물은 단위 동물인, 바실러스 기반의 직접 섭취 미생물.
- 제1항에 있어서, 동물은 다위 동물인, 바실러스 기반의 직접 섭취 미생물.
- 제2항에 있어서, 단위 동물은 가금류인, 바실러스 기반의 직접 섭취 미생물.
- 제1항에 있어서, 사료 내에 첨가되거나, 또는 사료 위에 첨가되거나, 또는 액체 중에 첨가되어,
동물 사료를 통해 동물에 직접적으로 투여되는 것인, 바실러스 기반의 직접 섭취 미생물. - 제5항에 있어서, 사료물의 형태로 동물에 투여되거나, 사료 첨가제 조성물의 형태로 동물에 투여되거나, 프리믹스의 형태로 동물에 투여되거나, 또는 액체 중에동물에 투여되는 것인, 바실러스 기반의 직접 섭취 미생물.
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