HU221638B1

HU221638B1 - Heparinkötő fehérje alkalmazása szepszis kezelésére szolgáló gyógyszer előállítására

Info

Publication number: HU221638B1
Application number: HU9602895A
Authority: HU
Inventors: Hans Jakob Hem Flodgaard; Poul Baad Rasmussen
Original assignee: Leukotech A/S
Priority date: 1994-04-21
Filing date: 1995-03-17
Publication date: 2002-12-28
Also published as: NO964465L; HU9602895D0; CN1146724A; AU2303395A; PL316935A1; HUT75557A; JPH09512168A; AU703963B2; NZ284434A; ATE239494T1; CA2188395A1; DE69530689D1; WO1995028949A1; EP0762889A1; FI964227A; CZ289439B6; RU2200573C2; FI964227A0; DE69530689T2; EP0762889B1

Abstract

A találmány tárgya heparinkötő fehérje (HBP) – melynek látszólagosmolekulatömege glikozilezett alakban 28 kD (SD-PAGE-módszerrel,reduktív körülmények között meghatározva); a fehérje a polimorf magvúleukociták azurofil szemcséiben termelődik – felhasználása szepszis,Gram-negatív szepszis, szeptikus sokk vagy elszórt intravaszkuláriskoaguláció megelőzésére vagy kezelésére szolgáló gyógyszerkészítményelőállítása. ŕ

Description

A jelen találmány heparinkötő fehérjét tartalmazó gyógyszerkészítménnyel, valamint a készítménynek bakteriális endotoxin által kiváltott betegségek és állapotok kezelésére való felhasználásával foglalkozik.

A súlyos fertőzéssel összefüggő szisztémás válaszokból eredő szeptikus sokk növekvő előfordulása tapasztalható az utóbbi 50 évben. Jelenleg az intenzív osztályok legáltalánosabb haláloka az USA-ban. Úgy vélik, hogy a szeptikus sokk növekvő és magas előfordulása a behatoló eszközök, például intravaszkuláris katéterek növekvő alkalmazásának, a citotoxikus és immunszuppresszív hatóanyagok növekvő használatának, a szepszisnek kitett betegek hosszabbodó életének és az antibiotikumokkal szemben ellenálló mikroorganizmusok kiváltotta fertőzéseknek a következménye.

A szepszissel kapcsolatos bakteriémiának (vagy szeptikémiának) nevezett betegségeket pozitív vértenyészettel diagnosztizáljuk. A szepszist a fertőzésre adott, az egész szervezetre kiteijedő reakciók jellemzik, ami szapora légzésben, szapora szívverésben, lázban vagy alacsony testhőmérsékletben nyilvánul meg. A szepszisszindrómában a szepszis klinikai bizonyítékai és megváltozott szervperfuzió jelei jelennek meg abnormálisán megnövekedett laktátszint, oliguria vagy akutan megváltozott mentális állapot alakjában. Korai szeptikus sokkról beszélünk, amikor a szepszisszindróma klinikai jelei, valamint az alacsony testhőmérséklet egy óránál rövidebb ideig állnak fenn és a beteg reagál a szokásos terápiára; kitartó szeptikus sokkról beszélünk, ha a szepszisszindróma klinikai jelei és az alacsony testhőmérséklet a szokásos terápia alkalmazása ellenére egy óránál tovább fennáll.

A szepszis ismert mediátorai összetett módon alakítják ki a szepszist vagy a citokinkaszkádot a fertőzés vagy sérülés helyén (például a hasüregben). A citokinkaszkád iniciátora (Gram-negatív baktériumánál, ami a szepszis általános kiváltó oka) az endotoxin (más néven lipopoliszacharid, LPS). Az endotoxin a baktériumból szabadul fel és a fertőzés vagy gyulladás helyén indukálja a tumomekrózis-a-faktor (TNFa), az interleukin-1, az interleukin-6, az interleukin-8 és a vérlemezaktiváló faktor (PAF) felszabadulását a makrofágokból és más sejtekből. A TNFa, interleukin-1 és PAF felszabadulása után arachidonsav metabolizálódik, leukotriéneket, tromboxán A₂-t és prosztaglandinokat képezve. Az interleukin-1 és az interleukin-6 aktiválja a T-sejteket, hogy τ-interferont, interleukin-2-t, interleukin-4-et és granulocita-monocita telepképzést stimuláló faktort termeljenek. A legtöbb ilyen mediátor közvetlenül aktiválhatja a neutrofil leukocitákat. Neutrofilindukált károsodás történhet a degranuláció alatt a felszabaduló oxigén szabad gyökök és lizoszomális enzimek révén, az aggregáció alatt a fertőzés és gyulladás helyén.

Noha az endotoxin vagy más szepszismediátor a fertőzés vagy a gyulladás helyén potenciálisan képes a citokinkaszkád elindítására, a jelenlétük egymaga nem szükségszerűen vezet szepszishez, minthogy a citokinkaszkád rendelkezik bizonyos együtt járó biztosítékokkal, melyek ellene hatnak a citokinkaszkád ellenőrizetlen aktiválódásának. így, a prosztaglandin gátolhatja a citokinok makrofágokból való felszabadulását és a makrofágok képesek lehetnek elnyomni a T-sejteket. A szepszis klinikai tünetei akkor jelennek meg, ha túl sok endotoxin vagy más mediátor szabadul fel, vagy ha a citokinkaszkáddal interferálni képes mediátorok nincsenekjelen, például amikor az immunrendszer legyengült. A szeptikus betegségek kialakulásáról és a folyamatban részt vevő mediátorokról bővebb leírás található R. C. Boné „The Pathogenesis of Sepsis” című munkájában [Ann. Int Med., 115:457-469 (1991)].

A Gram-negatív szepszisnek tulajdonítható folytonosan magas mortalitás és a megbetegedések nagy gyakorisága intenzív kutatásra sarkall, hogy olyan hatóanyagokat találjunk, melyekkel hatásosan kivédhetjük a vérkeringésbe jutott bakteriális LPS okozta haláleseteket. Nagyszámú cikk számol be a nagy dózisban intravénásán beadott immunglobulin szignifikáns terápiás hatásáról. A kezelés azonban IgG-t kíván, ami olyan kiszűrt donorok plazmájából származik, akiknek természetes körülmények között is magas az LPS-molekulamaggal szembeni antitestszintje vagy pedig nagyszámú (> 1000) donort kell felhasználni. Az LPS-sel szembeni monoklonális antitestek (például WO 88/03200) nem, vagy csak kis hatást mutatnak, valószínűleg azért, mert nem gátolják az LPS indukálta citokinkaszkádot

Az emberi és a sertés perifériális neutorofil leukocitákból kinyert két szoros rokonságban lévő fehéije kovalens szerkezetét mostanában határozták meg [lásd: H.i Flodgaard és munkatársai, Eur. J. Biochem., 197:535-547 (1991); J. Pohl és munkatársai, FEBS Lett., 272:200 (1991)]. Mindkét fehérje nagy hasonlóságot mutat a neutrofil elasztázhoz, de a szerin-195 és a hisztidin-57 [kimotripszin-számozás, B. S. Harley, „Homologies in Serine Proteinases”, Phil. Trans. Roy. Soc. Series 257:77 (1970)] aktív helyeken történt szelektív mutációnak köszönhetően nincs proteázaktivitásuk. A fehérjéket humán heparinkötő fehérjének (hHBP), illetve sertésheparin-kötő fehérjének (pHBP) nevezik, minthogy nagy az affinitásuk a heparinhoz. Schafer és munkatársai [Infect. Immun., 53:651 (1986)] a kationos antimikrobiális fehéije (CAP37) elnevezést használják, az antimikrobiális tulajdonságra utalva. A fehérje monocitákkal szembeni hemotaktikus tulajdonságát is kimutatták 1,3 x lO-’-lO-⁸ M koncentrációnál [H. A. Pereira és munkatársai, J. Clin. Invest., 85:1468 (1990)], egybehangzóan Flodgaard és munkatársai (lásd fent) eredményeivel.

A HBP továbbá az endotéliális sejtek és a fibroblasztok leválását és összehúzódását eredményezik, ha a sejtek egyrétegű tenyészetéhez adjuk. A HBP stimulálja a monociták túlélését és a tromboszpondin elválasztását is [E. Ostergaard és H. Flodgaard, J. Leukocita Bioi., 51:316(1992)].

Az azurofil szemcsékből ugyancsak elkülönítettek egy fehérjét [J. E. Gabay és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:5610 (1989); C. G. Wilde és munkatársai, J. Bioi. Chem., 265:2038 (1990)], melynek az N-terminális első 20 aminosavja ugyanaz, mint a hHBP és a CAP37 fehérjénél. A fehérjét azurocidinnek nevez2

HU 221 638 Bl ték el. Leírták e fehéije antimikrobiális tulajdonságait [D. Campanelli és munkatársai, J. Clin. Invest., 85:904 (1990)].

A hHBP jelenléte a neutrofil leukocitákban és az a tény, hogy a CAP37 (ami azonos a hHBP-vel) 89%-a felszabadul, ha a leukociták Staph. aureust fagocitálnak (H. A. Pereira és munkatársai, lásd fent), azt jelzi, hogy a hHBP feladata lehet a gyulladásfolyamatokban való részvétel, minthogy a fehéije nyilvánvalóan felszabadul az aktivált neutrofilekből. Pereira és munkatársai (lásd fent) feltételezik, hogy a CAP37-nek a gyulladás helyén van szerepe, ahova specifikusan odavonzza a monocitákat, és ezáltal egyike azon faktoroknak, melyek a gyulladás második hullámában a monociták influxáért felelősek. Ostergaard és Flodgaard (lásd fent) feltételezik, hogy túl a monociták összegyűjtésén, a HBP kulcsszerepet játszhat a neutrofil és monocita sejtek kilépésének mechanizmusában.

A HBP szerkezete megtalálható a WO 89/08666 szabadalomban és H. Flodgaard és munkatársai idézett munkájában. A HBP-t másképpen CAP37-nek (lásd WO 91/00907) és azurocidinnek [C. G. Wilde és munkatársai, J. Bioi. Chem., 265:2038 (1991)] nevezik.

Eddig a HBP-ről nem volt ismert, hogy felhasználható a bakteriális endotoxinnak a fertőzés vagy sérülés helyein való jelenlétével kapcsolatos betegségek vagy állapotok kezelésére. A találmány olyan gyógyszerkészítménnyel foglalkozik, mely alkalmas a lipopoliszacharid (LPS) indukálta citokinkaszkáddal kapcsolatos betegségek vagy állapotok megelőzésére vagy kezelésére. A készítmény gyógyászati szempontból alkalmazható vivőanyag vagy hígító kíséretében egy heparinkötő fehéijét (HBP) tartalmaz, mely glikozilezett alakban van; látszólagos molekulatömege 28 kD (SDSPAGE-módszerrel redukáló körülmények között meghatározva). A fehéije a polimorf magvú leukociták azurofil granulumaiban termelődik.

A HBP-ről megállapították, hogy hozzákötődik az LPS-hez [H. A. Pereira és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:4733-4737 (1993)], amit a fehéije antibakteriális hatásával hoztak összefüggésbe. Leírták, hogy a HBP baktericid hatása pH=7 kémhatásnál (azaz fiziológiai kémhatásnál) csökken. Továbbá, a szeptikus állapotot nem a Gram-pozitív baktérium mint olyan okozza, hanem az elpusztult baktériumsejtekből kiszabaduló endotoxin aktiválja a monocitákon a CD14 receptort, és ezáltal indukálódik a citokinkaszkád. Ezért úgy tűnt, hogy a HBP antibakteriális hatásának semmi jelentősége nincs a szeptikus állapotok kezelése szempontjából. Ilyen összefüggésben megjegyzendő, hogy az LPS megkötése önmagában nem jelenti az endotoxin citokinkaszkádot indukáló hatásának a semlegesítését, amit az a tény bizonyít, hogy az LPS-sel szembeni antitesteknek nincs, vagy csak gyenge hatásuk van ilyen szempontból [E. Th. Rietschel és M. Schlaak, Immun Infect. 21:25-36 (1993)]. A szepsziszes állapotok elleni eddig közölt próbálkozások a beteg vérkeringésében lévő endotoxin semlegesítésére irányultak (például a WO 93/19087 szabadalom, melyben a CAP37ről - azaz a HBP-ről - feltételezik, hogy az endotoxémiával szemben alkalmazható azáltal, hogy hozzákötődik az LPS-hez és megtisztítja tőle a vérkeringést). Ezen próbálkozások legtöbbje hiábavaló volt, mert a szepszises betegekben nem általános a cirkuláló endotoxin megemelkedett szintje. A HBP azonban hatásos lehet a lokális gyulladásos vagy fertőzéses helyeken, miután a szeptikus jelenség maga már megnyilvánult, azaz a posztendotoxémiás esetekben. Jelenleg feltételezzük, hogy a HBP jótékony hatását nemcsak azáltal fejtheti ki, hogy specifikusan és nagy affinitással kötődik a Lipid-A-hoz (az LPS toxikus része), meggátolva ezáltal a citokinkaszkád indukálódását, hanem azáltal is, hogy megvédi a monocitákat az apoptózistól, amit a fagocitákból (például neutrofilek, monociták, makrofágok) felszabaduló oxigén szabad gyökök és citokinok okozta stressz-sérülés eredményez. Mindezek részét képezik a szervezet sérülésekkel és fertőzésekkel szembeni védekező mechanizmusának.

A monociták a sérülés vagy a fertőzés helyéhez vándorolnak, ahol fagocitálják a fertőző mikroorganizmusokat és a káros anyagokat, mint amilyen például az endotoxin. A HBP stimulálhatja a monociták fagocitáló hatását is. A HBP monocitákat mobilizáló képessége úgy tűnik azzal a tulajdonságával van összefüggésben, hogy képes egy, még nem tisztázott módon megkötni az LPS-t.

Továbbá, meglepő módon úgy találtuk, hogy a HBP irreverzíbilisen kötődik az LPS-hez 37-45 °C hőmér-< sékleten (azaz a hipertermiás testhőmérsékleten). Ez is hatással lehet a HBP-vei történt LPS semlegesítésére.

A találmány foglalkozik továbbá az LPS indukálta citokinkaszkáddal kapcsolatos betegségek és állapotok megelőzésére és kezelésére szolgáló eljárással. Az eljárás abból áll, hogy a kezelésre szoruló betegnek a heparinkötő protein hatásos mennyiségét adjuk be. A nevezett protein glikozilezett alakban van; látszólagos molekulatömege 28 kD (SDS-PAGE-módszerrel megállapítva reduktív körülmények között) és a polimorf magvú leukociták azurofil granulumaiban termelődik.

A találmány továbbá foglalkozik a heparinkötő proteinnek (HBP) - mely protein glikozilezett alakban van, látszólagos molekulatömege 28 kD (SDS-PAGEmódszerrel meghatározva reduktív körülmények között) és a polimorf magvú leukociták azurofil granulumaiban termelődik - az LPS indukálta citokinkaszkáddal kapcsolatos betegségek és állapotok megelőzésére és kezelésére szolgáló gyógyszer ipari előállításánál történő felhasználásával.

A HBP alkalmas forrása lehet különösen az ember vagy az emlősök, például a sertés. A SEQID No: 1-ben leírt aminosavszekvenciájú humán HBP, a SEQ ID No :2-ben leírt aminosavszekvenciájú sertés HBP, illetve ezek funkciós analógja vagy peptidffagmense képes az LPS lipid-A részéhez kötődni. Az ilyen funkciós analógok közé tartoznak például a natív fehéije azon származékai, melyekhez úgy jutunk, hogy a natív fehéije C- vagy N-tenninális végéhez vagy mindkét véghez egy vagy több aminosavat hozzáadunk; a natív fehéije egyik vagy mindkét végén egy vagy több aminosavat helyettesítünk; a natív fehérje egyik vagy mindkét vé3

HU 221 638 Β1 gén vagy az aminosavszekvencián belül egy vagy több helyen egy vagy több aminosavat kiejtünk; vagy a natív fehéije aminosavszekvenciáján belül egy vagy több helyen egy vagy több aminosavat beépítünk. A kifejezés kiteljed a HBP peptidfragmensekre, különösképpen 5 azokra a fragmensekre, melyek a natív HBP-hez hasonlóan képesek csökkentem a humán mononukleáris sejtekből eredő, LPS indukálta citokinkaszkádot. Az LPS lipid-A részéhez kötődni képes fragmens például a SEQID No: 1 20-53 aminosavszekvenciáját, de küld- 10 nősen a 26-42 aminosavszekvenciát vagy a SEQ ID No :2 20-53 aminosavszekvenciáját tartalmazó peptidfragmens.

A HBP-t kódoló DNS-szekvencia a szokásos módszerekkel szintetikusan előállítható. Ehhez használhat- 15 juk például S. L. Beaqcage és Μ. H: Caruthers [Tetrahedron Letters, 22:1859-1869 (1981)] foszfoamidites módszerét vagy Metthes és munkatársai által [EMBO Journal 3:801-805 (1984)] leírt módszert. A foszfoamidites módszer szerint oligonukleotidokat szinteti- 20 zálunk például automata DNS-szintetizátorban, azokat tisztítjuk, kettős szálúvá alakítjuk, ligáljuk és alkalmas vektorokba klónozzuk.

A DNS-szekvencia lehet genomiális vagy cDNSeredetű is, például a genomiális vagy a cDNS-könyvtár 25 elkészítésével nyerve. A HBP szekvenciájára vagy egy részére végezzük a szűrővizsgálatokat a szokásos technikák szerint, melyeknél a szintetikus oligonukleotidpróbákkal való hibridizációt alkalmazzuk [Sambrook és munkatársai, „Molecular Cloning: A Laboratory Ma- 30 nual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor, 1989]. A DNSszekvencia előállítható polimeráz-láncreakcióval is, melyhez speciális printereket használunk [lásd például : a 4 683 2002 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom vagy R. K. Saiki és munkatársai, 35 Science, 239:487-491 (1988)].

A DNS-szekvenciát ezután egy rekombináns expressziós vektorba építjük be, ami lehet bármelyik, a DNS-rekombinációs eljárások elvégzésére alkalmas vektor. A vektor lehet például egy önállóan szaporodó 40 vektor, mely extrakromoszomális egységként van a sejtben és szaporodása független a kromoszomális replikációtól; ilyen például egy plazmid. Ettől eltérő módon a vektor lehet olyan is, mely a gazdasejtbe való bejuttatás után integrálódik a gazdasejt genomjában, és azzal a 45 kromoszómá(k)val együtt replikálódik, amely(ek)be beépült.

A HBP-t kódoló DNS-szekvenciát a vektorban működőképesen kell csatlakoztatni egy alkalmas promoterszekvenciához. A promoter bármilyen DNS-szekven- 50 cia lehet, ami a választott gazdasejtben transzkripciós aktivitással rendelkezik, származhat a gazdasejtre nézve homológ vagy heterológ fehérjéket kódoló génekből. Emlőssejtben a HBP-t kódoló DNS átírásának irányítására alkalmas promoterek például: az SV 40 pro- 55 moter [Subramini és munkatársai, Mól. Cell. Bioi., 1:854-864 (1981)], az MT-1 (metallotionein gén) promoter [Palmiter és munkatársai, Science, 222:809-814 (1983)] vagy az adenovirus 2 fő késői promoter. A rovarsejtekben alkalmazható alkalmas pro- 60 moter például: a polihedrin promoter [Vasuvedan és munkatársai, FEBS Lett., 311:7-11 (1992)]. Ha a gazdasejt élesztősejt, alkalmas promoterek például: az élesztő glikolitikus génjeinek promoterei [Hitzeman és munkatársai, J. Bioi. Chem., 255: 12073-12080 (1980); Alber és Kawasaki, J. Mól. Appl. Gén.,

1:419-434 (1982)], az alkoholdehidrogenáz-gének promoterei [Young és munkatársai, „Genetic Engineerung of Microorganisms fór Chemicals”, szerk. Hollaender és munkatársai, Plenum Press, New York (1982)], a

TP11 promoter (4 599 311 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom) vagy az ADH2-4c promoter [Russel és munkatársai, Natúré, 304:652-654 (1983)].

Fonalas gomba gazdasejteknél alkalmas promoterek például: az ADH3 promoter [McKnight és munkatársai, The EMBO J., 4:2093-2099 (1985)] vagy a tpiA promoter.

A HBP-t kódoló DNS-szekvenciát működőképesen kapcsolhatjuk alkalmas tenninátorhoz is, ami lehet például a humán növekedési hormon terminátor (Palmiter és munkatársai, lásd fent), gomba gazdasejteknél a ΤΡΙ1 promoter (Alber és Kawasaki, lásd fent) vagy az ADH3 promoter (McKnight és munkatársai, lásd fent).

A vektor további elemeket is tartalmazhat, úgymint poliadenilációs szignált (például az SV40-bői vagy az adenovírus 5 Elb régiójából), transzkripciót gyorsító szekvenciát (például az SV40 enhancere) és transzlációt gyorsító szekvenciát (például az adenovirus VA RNSeket kódoló szekvenciák).

A rekombináns expressziós vektor ezenkívül tartalmazhat még egy DNS-szekvenciát, ami képessé teszi a vektort, hogy a kérdéses gazdasejtben szaporodjon.

Ilyen szekvencia például - ha a gazdasejt egy emlőssejt - az SV40 replikációs origója. A vektor tartalmazhat még szekciót lehetővé tevő markért, például egy olyan gént, melynek terméke a defektes gazdasejtet kiegészíti, például dihidroftalát-reduktázt (DHFR) kódoló gént, vagy rezisztenciát okoz egy hatóanyaggal - például neomicinnel vagy higromicinnel - szemben.

A szakemberek előtt jól ismertek azok az eljárások, melyekkel a HBP-t kódoló DNS-szekvenciát, a promotert és a terminátort ligálhatjuk és beépíthetjük a replikációhoz szükséges információkat hordozó alkalmas vektorba (lásd például Sambrook és munkatársai, lásd fent).

A gazdasejt, melybe az expressziós vektort bevisszük, bármilyen sejt lehet, amely képes HBP-t termelni. Előnyösek ilyen célra az eukarióta sejtek, például gerinctelen (rovar) vagy gerinces állatok sejtjei, mint amilyenek például a Xenopus laevis oociták vagy az emlőssejtek (különösen a rovar- és emlőssejtek). Az alkalmas emlőssejtvonalakra példaként említhető a COS (például ATCC CRL 1650), a BHK (például ATCC CRL 1632, ATCC CCL 10) vagy a CHO (például ATCC CCL 61) sejtvonal. Az emlőssejtek transzfektálására és a sejtekbe bevitt DNS-szekvenciák expresszálására módszereket írnak le például: fi

Kaufman és Sharp, J. Mól. Bioi., 159:601-621, (1982); Southern és Berg. J. Mól. Appl. Génét., ΤΙ :327-341 (1982); Loyter és munkatársai, Proc. Natl.

HU 221 638 BI

Acad. Sci. USA, 79:422-426 (1982); Wiegler és munkatársai, Cell. 4:725 (1978); Corsaro és Paerson, Somatic Cell Genetics, 7:603 (1981); Graham és van dér Eb, Virology, 52:456 (1973); és Neumann és munkatársai, EMBO J., 1:841-845 (1982). 5

Alternatív módon gombasejtek is (beleértve az élesztőgombákat) alkalmazhatók gazdasejtként. Alkalmas gombasejt például: a Saccharomyces spp. vagy Schizosaccharomyces spp. sejtek, különösen a Saccharomyces cerevisiae törzsek sejtjei. Alkalmazhatjuk to- 10 vábbá a fonalas gombák sejtjeit, például Aspergillus spp. vagy Neurospora spp. sejteket, különösen az Aspergillus oryzae vagy az Aspergillus niger törzsek sejtjeit. Fehérjék Aspergillus spp. sejtekkel való expresszálását írja le például az EP 238023 szabadalom. 15

A sejttenyészetek tápközege bármilyen szokásosan használt közeg lehet, melyben a sejtek növekednek, igy például emlőssejtek növekedéséhez alkalmas, szérumot tartalmazó vagy szérummentes, megfelelő kiegészítő alkotórészeket tartalmazó tápközeg, rovarsejtek, élesztő 20 vagy gombák tenyésztéséhez alkalmas táptalaj. Az alkalmas közegek kereskedelmi forgalomból beszerezhetőek vagy (például az American Type Culture Collection katalógusában leirt módon) előállíthatók.

A sejtek által termelt HBP a szokásos módszerekkel 25 kinyerhető a tenyészközegből. A sejteket centrifugálással vagy szűréssel elválasztjuk, a felülúszó vagy szűrlet fehérjetermészetű alkotórészeit sóval - például ammónium-szulfáttal - lecsapjuk, kromatográfiás eljárásokkal - például ioncserés kromatográfiával, affinitáskro- 30 matográfiával stb. - tisztítjuk.

Meglepő modem úgy találtuk, hogy különösen jó HBP-hozamot érünk el, ha a HBP-t, mint pro-HBP-t expresszáltatjuk. A jelen találmány egy speciális megvalósítási módja tehát HBP-termelő eljárással foglalkozik, ahol 35 egy gazdasejt olyan érett HBP-t kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz, melynek N-terminálisán egy kiegészítés van. A gazdasejteket a HBP expresszálását biztosító alkalmas tápközegben tenyésztjük, és az N-terminálison kiegészített HBP-t a tápközegből kinyeijük. 40

Az N-terminálison lévő kiegészítés 5-25 aminosavból állhat, előnyösen 8-15 aminosavból áll. Az N-terminális szekvencia aminosavainak jellege úgy tűnik nem kritikus.

A HBP-propeptid N-terminális nyúlványának alkal- 45 más szekvenciája lehet: Gly-Ser-Ser-Pro-Leu-Asp.

Az érett HBP termelésének meggyorsítására általában előnyös, ha az N-terminálison kiegészített HBPDNS-szekvencia olyan proteázhasító helyet kódoló szekvenciát tartalmaz, mely az N-terminális nyúlványt 50 és az érett HBP-t kódoló szekvenciák között helyezkedik el. Alkalmas proteázhasító hely lehet például az enterokináz hasítóhelye (Asp)₄-Lys vagy az Xa faktor hasítóhelye Ile-Glu-Gly-Arg aminosavszekvenciával.

A tenyészközegből való kinyerés után az N-termi- 55 nálison lévő nyúlványt alkalmas proteázzal lehasítva állítjuk elő az érett (és aktív) HBP-t. Erre alkalmas enzim például az enterokináz vagy az Xa faktor.

A HBP-termelésre előnyös gazdasejtek a rovarok például Lepidoptera vagy Drosophila - sejtjei. Ebben az 60 esetben a sejtek megfelelően transzfektálhatók egy bakulovírus-vektonal, amilyent például a 4 745 051 számú amerikai egyesült államokbeli vagy a WO 92/01801 szabadalmak imák le.

Úgy találtuk továbbá, hogy előnyös, ha HBP termelését heparin vagy más szulfátéit poliszacharid jelenlétében végezzük, hogy elkerülhessük a HBP-nek a tenyészközegben jelen lévő lipopoliszacharidhoz való hozzákötődését. Ezek szerint a találmány egyik specifikus kivitelezési módja olyan HBP-termelő eljárással foglalkozik, ahol a HBP-t kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó gazdasejteket szulfátéit poliszacharidot tartalmazó alkalmas tenyészközegben tenyésztjük olyan körülmények között, mely lehetővé teszi a HBP expresszálódásáj és a keletkezett HBP-t kinyeijük a tenyészközegből. A HBP hozzákötődik a jelen lévő szulfátéit poliszacharidhoz, majd ezt követően alkalmas körülmények között felszabadul a poliszacharid mellől, például azáltal, hogy a HBP-t sóval, például nátrium-kloriddal eluáljuk.

A szulfátéit poliszacharid előnyösen a heparin, bár más szulfátéit poliszacharid - például heparán-szulfáj dextrán-szulfót, dermatán-szulfát, pentozán-poliszulfát vagy protamin-szulfát - is alkalmazható. Hogy a poliszacharidhoz kötött HBP tenyészközegből való elválasztását meggyorsítsuk, a szulfátéit poliszachardidot előnyösen egy közömbös hordozón immobilizáljuk. A közömbös hordozó például agaróz (például Sepharose) lehet

Ennél a kivitelezési módnál is rendelkezhet az érett HBP-t kódoló DNS-szekvencia egy olyan N-terminális nyúlvánnyal, mint amilyet fentebb leírtunk.

A jelen találmány egy további megvalósítási módja olyan HBP-előállítási eljárással foglalkozik, ahol a gazdasejtben lévő, az érett HBP-t kódoló DNS-szekvenciához egy másik fehéijét kódoló DNS-szekvencia is van fuzionálva. A gazdasejtet olyan tenyészközegben tenyésztjük, mely lehetővé teszi, hogy a HBP-t és a másik fehérjét tartalmazó fuzionált fehérje kifejeződhessen, és ( a nyert fuzionált fehérjét kinyerhessük a tenyészkö- l zegből. A másik fehérje lehet például a VIII faktor könnyű lánca (a VIII foktor könnyű láncát kódoló DNS-szekvencia előállítását például az EP 232112 számú szabadalom úja le).

Ennél az eljárásnál szintén előnyös egy proteázhasító helyet kódoló DNS-szekvenciát bevinni az N-terminális nyúlvány és az érett HBP találkozási helyére, ahogyan azt már fentebb tárgyaltuk.

A HBP-gyógyszerkészítmény bármelyik szokásos eljárással elkészíthető, mely eljárásokat például a Remington’s Pharmaceutical Sciences (1985) ír le. V

A készítményt elkészíthetjük helyi alkalmazáshoz, szisztémás injektáláshoz vagy infúzióhoz, ehhez használhatunk steril vizet, izotóniás oldatot vagy glükózoldatot. A készítmények a jól ismert sterilizációs eszközökkel sterilizálhatok. A nyert vizes oldat felhasználásra készen csomagolható vagy aszeptikus körülmények között szűrjük és fagyasztva szárítjuk. A fagyasztva szá- 1 rított készítményt bevitel előtt steril vizes oldattal egye- 1‘i sítjük. A készítmény tartalmazhat gyógyászati szempontból alkalmazható, a megfelelő fiziológiai állapotokhoz szükséges adalék anyagokat, mint amilyenek a puf5

HU 221 638 Bl férek, ozmotikus viszonyokat beállító anyagok és hasonlók, ami lehet nátrium-acetát, nátrium-laktát, nátrium-klorid, kálium-klorid, kalcium-klorid stb. A HBP koncentrációja széles tartományban változhat, azaz kevesebb, mint 0,5 tömeg%-tól több, mint 15-20 tömeg%-ig. A készítmény egységnyi adagja általában 10 mg -1 g HBP-t tartalmazhat.

A találmány szerinti készítmény olyan betegségek kezelésére szolgálhat, mint a szepszis, aszeptikus sokk, a szétszórt intravaszkuláris koaguláció vagy a meningococcus meningitis. Amint fentebb már jeleztük, a jelen készítmény különösen alkalmas gyulladások vagy fertőzések (például a hasüregben) helyi kezelésére, minthogy lényeges tulajdonsága, hogy megvédi az e helyekre vándorló monocitákat és biztosítja, hogy azok képesek legyenek az endotoxint és a fertőző baktériumokat bekebelezni.

A HBP napi dózisa 0,1-100 mg/testsúlykilogramm lehet, a kezelendő beteg állapotától és a betegség súlyosságától függően.

A találmány szerinti készítmény egy további antimikrobiális hatóanyagot is tartalmazhat a kauzativ bakteriális fertőzés kezelésére. Ilyen antimikrobiális hatóanyag lehet például egy β-laktám-antibiotikum (például penicillin), amino-glikozid, tetraeiklin, bacitracin, polimixin, szulfonamid, nitrofiuán, nalidixinsav stb. A szisztémás alkalmazásnál a készítmény heparint vagy más szulfátéit glükóz-amino-glikánt is tartalmazhat antikoagulánsként, minthogy meglepő módon úgy találtuk, hogy a heparin nem akadályozza a HBP azon képességét, hogy az LPShez kötődik. Túl azon, hogy a heparin antikoagulánsként működik, jelenléte a HBP felezési idejének megnyújtásához is vezet a plazmában, minthogy megakadályozza, hogy a HBP a véredény endotéliumában lévő glükózamino-glikánokhoz kötődjön.

A találmány ábráinak értelmezése: az 1. ábra a pK.FN-1783 plazmid HBP-t kódoló

901 bázispárt EcoRI-Xbal fragmensének DNS-szekvenciája és az annak megfelelő aminosavszekvencia, a 2. ábra a pSX221 plazmidba beépített, a hHBP-t kódoló, 772 bázispárt BamHl-Hind III fragmens DNS-szekvenciája és az annak megfelelő aminosavszekvencia, a 3. ábra 10 pg/ml HSA-val vagy különböző koncentrációjú HBP-vel 10 ng/ml LPS jelenlétében kezelt vérmonociták citokintartalma grafikusan ábrázolva, a 4. ábra 10 pg/ml HSA-val vagy különböző koncentrációjú HBP-vel 100 ng/ml LPS jelenlétében kezelt vénnonociták sejtek citokintartalma grafikusan ábrázolva.

1. példa

Humán heparinkötófehérje termelése KFN-1775 élesztőtörzzsel

Általános módszerek

Az általános DNS-technikákat alkalmazzuk, ahogyan azok Sambrook J., Fritsch E. F. és Maniatis T. „Molecular Cloning: A Laboratory Manual” kézikönyvében [2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. (1989)] leírtak. A szintetikus oligonukleotidokat automata DNS-szintetizátoron (30B, Applied Biosystems) készítjük kereskedelmi forgalomból beszerezhető reagensekkel. A DNS-szekvencia meghatározása dideoxi-láncreakcióval történik [Sanger F., Micklen S. és Coulson A. R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467 (1977)}. A polimeráz-láncreakciót (PCR) egy DNA Thermal Cycler készülékben (Perkin Elmer Cetus) végezzük.

Az N-tenninális aminosavszekvenciát automatizált Edman-lebontással végezzük Applied Biosystems 477A gázfázisú szekvenátoron. Online fordított fázisú HPLC-analizist használunk az egyes szekvenális ciklusoknál felszabaduló PTH-aminosavak detektálására és mennyiségi mérésére.

pl (10⁶ pfu) humán csontvelő-cDNS-könyvtárt (Clontech, Palo Alto, CA, USA) használunk templátként a PCR-reakcióban, melyhez az alábbi primerek mindegyikéből 100-100 pmolt alkalmazunk: NOR-3176 primer [GTTGGAATTCAT(A/T/C)CA(A/G)AA(T/C)CA(A/G)GGN(A/C)G] és NOR-3174 primer [CA(T/C)TG(A/G)TC(T/C)TCNGGNGT|; ahol az N mind a négy nukleotid keverékét jelenti. Az előre irányuló NOR-3176 primer 5’ része egy EcoRI hasitóhelyet tartalmaz és a 3’ rész a 18-23 aminosavszekvenciának felel meg, a fordított NOR-2174 primer a hHBP 149-154 aminosavszekvenciának felel meg [Floodgard H., Ostergaard E., Bayne S., Svendsen A., Thomsen J., Engels M. és Wollmer A., Eur. J. Biochem., 197:535-547(1991)].

A PCR-reakciót 100 pl-es térfogatban végezzük a kereskedelmi készlet (Gene Amp, Perkin Elmer Cetus) felhasználásával és a következő ciklusokat alkalmazva: 94 °C 1 perc, 50 °C 2 perc, 72 °C 3 perc. A 35. ciklus után befejezőciklust végzünk, melyből a 72 °C-os lépés 10 percig tart. A 420 bázispárt PCR-terméket 1%-os agarózgélen végzett elektroforézissel különítjük el.

A fentiekben leírt PCR-reakciót ugyanezzel a cDNS-templáttal elvégezzük az alábbi primerekkel is: NOR-3173 primer [ACNCCNGA(A/G)GA(T/C)CA(A/G)TG] és NOR-3175 primer [GGTTTCTAGATTATCCCGG(A/G)TT(A/G)TTNA(A/G)NACNCC ]. Az előre irányuló NOR-3173 primer komplementer a NOR-2174 primerrel, a fordított NOR-3175 primer a HBP 215-221 aminosavszekvenciának felel meg, amit egy stopkodon és egy Xbal hasítóhely követ. A PCR-reakciót a fentiekben leírtak szerint hajtjuk végre, és a 232 bp-ú fragmensként nyert terméket agarózgélen végzett elektroforézissel különítjük el.

A fentiekben leírt két PCR-fragmenst az átfedő nyúlványoknál PCR-rel kapcsoljuk össze [Horton R. M., Hunt H. D., Ho S. N., Pulién J. K. és Pease L. R., Gene, 77:61-68 (1989)], melyhez NOR-3176 és NOR-3175 printereket használunk végprimerekként. A nyert 635 bp-ú fragmenst kinyeijük, EcoRI és Xbal enzimekkel hasítjuk, egy 621 bp-ú fragmenst nyerve, amit a pTZ19R [Mead, D. A., Szczesna-Skopura E. és Kemper B., Prot. Engin., 1:67-74 (1986)] plazmidból származó, 2,8 kb-ú EcoRI-Xbal fragmenshez Egálunk.

HU 221 638 Bl

A ligációs elegyet használjuk egy kompetens E. coli (r-, m⁺) törzs transzformálására, ampicillinrezisztenciát használva a szelektáláshoz. A DNS-szekvenciaanalízisek szerint a telepek egyikéből származó pKFN1726 plazmid kódolja a várt hHBP_lg_₂₂₁ aminosavszek- 5 venciát.

A pKFN-1726 plazmidot PstI és Xbal enzimekkel emésztjük, és a keletkezett 329 bp-ú fragmenst az alábbiakban leirt módon kinyerjük.

A HBP N-terminális részét 379 bp-ú fragmensként 10 izoláljuk, a PCR-hez a fent leírt cDNS-templátot és az alábbi primereket használva. MHJ-206 (GCTGAGAGATTGGAGAAGAGAATCGTTGGCGGCCGGA AGGCGAG) és MHJ 200 (CGGCTTCCACCGTGGCGTTCTG). Az MHJ-206 3’-végrésze azonos a 15 humán HBP-gén N-terminális részt kódoló részével, az MHJ 206 5’ része azonos a korábban leírt [Thim L., Norris K., Norris F., Nielsen P. F., Bjom S. E., Christensen és Petersen J.,FEBS Letter, 318:345-352 (1993)] hibrid élesztő leader gén C-terminálist kódoló 20 részével.

A hibrid leader gén és a HBP N-terminálist kódoló,

979 bp-ú PCR-fragmens framefuziós termékét az átfedéses nyúlványok PCR-összekapcsolásával kapjuk meg [Horton R. M., Hunt H. D., Ho S. N., Pulién J. K. 25 és Pease L. R., Gene 77:61-68 (1989)]. A terméket EcoRI és PstI enzimekkel emésztjük és 572 bp-ú fragmensként izoláljuk.

A fait leírt 572 bp-ú EcoRI-PsŰ fragmenst és a 329 bp-ú Pstl-Xbal fragmenst a pTZ19R plazmid 30 [Mead D. A., Szczesna-Skopura E. és Kemper B., Prot. Engin., 1:67-74 (1986)] 2,8 kh-ú EcoRI-Xbal fragmenséhez Egáljuk. A ligációs elegyet használjuk egy kompetens E. coli (r~, m⁺) törzs transzformálására, az ampicillinrezisztenciát felhasználva a szelektáláshoz. 35 A kapott telepek egyikéből származó pKFN1780 plazmidot szelektáljuk további felhasználásra.

A pKFN1780 plazmidot EcoRI és Xbal enzimekkel emésztjük. A kapott 901 bp-ú fragmenst a pMT636 plazmid 9,5 kb-ú Ncol-Xbal fragmenséhez és a 40 pMT636 plazmid 1,4 kb-ú NcoI-EcoRI fragmenséhez ligáljuk. A pMT636 plazmidot a WO 89/01968 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés írja le.

A pMT636 plazmid egy E. coli-S. cerevisiae shuttle vektor, ami Schizosaccharomyces pombe TPI 45 gént (PÓT) [Russell P. R., Gene, 40:125-130 (1985)],

S. cerevisiae triózfoszfát-izomeráz promotert és terminátort, TPIp és TPI_T-t [Albert T. és Kawasaki G., J.

Mól. Appl. Gén., 1:419-434 (1982)] tartalmaz.

A ligációs elegyet használjuk egy kompetens E. coli 50 (r~, m⁺) törzs transzformálására, ampicillinrezisztenciával szelektálva. A DNS-szekvenálás azt mutatja, hogy a kapott telepekből származó plazmidok a humán HBP helyes DNS-szekvenciáját tartalmazzák, megfelelően kapcsolva a szintetikus élesztő szignál-leader génhez. 55

Egy pKFN-1783 plazmidot kiválasztunk a további felhasználásra.

A pKFN-1783 plazmid expressziós kazettája az alábbi szekvenciákat tartalmazza.

TPIp - szignál-leader - HBP - TPI_T 60

A pKFN-1783 plazmid 901 bp-ú EcoRI-Xbal fragmensének DNS-szekvenciáját az 1. ábra mutatja be.

Élesztőtranszformáció

S. cerevisiae MT663 (E2-7BXE11-36 a/α, / tpi// tpi, pép 4-/pep 4-3) élesztőtörzset YPGaL táptalajon (1% Bacto élesztőkivonat, 2% Bacto pepton, 2% galaktóz, 1% laktóz) növesztjük 600 nm-en mért 0,6 O.

D. értékig.

100 ml tenyészetet lecentriftigálunk, 10 ml vízzel mossuk a sejteket, ismét centrifugálunk és a sejteket felszuszpendáljuk 10 ml 1,2 M szorbitol, 25 mM Na₂EDTA, pH=8,0 és 6,7 mg/ml ditiotreitol összetételű oldatban. A szuszpenziót 30 °C hőmérsékleten tartjuk 15 percen át, centrifúgáljuk és a sejteket 10 ml 1,2 M szorbitol, 10 mM Na₂EDTA, 0,1b M nátrium-citrát, pH=5,8 és 2 mg Novozym® 234 összetételű oldatban szuszpendáljuk. A szuszpenziót 30 °C hőmérsékleten tartjuk 30 pácén át, a sejteket centrifúgálással összegyűjtjük, 10 ml V M szorbitoldattal és 10 ml CAS-oldattal (1,2 M szorbit, 10 mM kalcium-klorid, mM Trisz-HCl, pH=7,5) mossuk és 2 ml CAS-oldatban szuszpendáljuk. A transzformációhoz 0,1 ml CAS-oldatos szuszpenziót 1 pg pKFn-1783 plazmiddal összekeverünk és szobahőmérsékleten hagyjuk állni 15 percen át. A szuszpenzióhoz hozzáadunk 1 ml 20% polietilénglikol 4000, 20 mM kalcium-klorid, 10 mM kalcium-klorid, 10 mM Trisz-HCl, pH=7,5 összetételű .

oldatot, és a keveréket szobahőmérsékleten hagyjuk áll- fni 30 percen át. A keveréket centrifúgáljuk, az üledéket i

0,1 ml SOS-oldatban (1,2 M szorbitol, 33% (térf.) f

YPD, 6,7 mM kalcium-klorid, 14 pg/ml leucin) szusz- t pendáljuk és 30 °C hőmérsékleten tartjuk 2 órán át. |

A szuszpenziót centrifúgáljuk, az üledéket 0,5 mC 1,2 M szorbitoldatban szuszpendáljuk. 52 °C hőmérsékleten hozzáadunk 6 ml fedőagart [SC közeg, Sherman és munkatársai, „Methods in Yeast Genetics”, Cold Spring Harbor Laboratory (1982); 1,2 M szorbit és *

2,5% agar], és a szuszpenziót ráöntjük egy lemez tetejére, ami szintén agart és szorbitot tartalmaz.

A transzformált telepeket 3 napon át 30 °C hőmérsékleten tartjuk, majd felszedegetjük és újra izoláljuk.

Ezeket a telepeket használjuk a folyékony tenyészetek beoltására. Egy ilyen KFN-1775 transzformánst elkülönítettünk a további vizsgálatokhoz.

Fermentálás

A KFN-1775 élesztőtörzset YPD közegben (1% élesztőkivonat, 2% pepton-Difco Laboratoriestől - és 3% glükóz) növesztünk. 1 literes tenyészetet rázatunk 30 °C hőmérsékleten 650 nm-en mért 24 O. D. értékig.

Centrifúgálás után a felülúszót izoláljuk.

A HBP-t a felülúszóból nyeljük ki, lényegében ahogyan az a WO 89/08666 szabadalomban leírt. Az 1-20 szekvencia aminosavszekvencia-analízis szerint megfelel a SEQ ID No:l szekvencia N-terminális részének.

2. példa

A HBP (mint proform) rovarsejtben való baculovírusos rendszerrel történő expresszáláshoz az alábbi primereket készítjük el.

•au;

HU 221 638 Bl

MHJ 2087: 5’-AAA AAG FAT CCA CCA TGA CCC

GGC TGA CAG TCC TGG CCC TGC TGG CTG

GTC TGC TGG CGT CCT CGA GGG CCG GCT

CCA GCC CCC TTT TGG ACA TCG TTG GCG

GCC GGA AGG C-3’

MHJ 2089: 5’-AAA AAA GCT TCC TAG GCT GGC

CCC GGT CCC GGA TTG TTT AAA ACG CCA

TC-3’

Az MHJ 2087 egy BamHI helyet, az iniciáló kodont és a humán cDNS preprorészét [Morgan J. G. és munka- 10 társai, J. Immun., 147:3210-3214 (1991)] kódolja, amit a pKFN1780 plazmádon lévő gén érett szakaszának kezdő 20 nukleotidja követ.

Az MHJ 2089 komplementer a pKFN1780 plazmádon lévő HBP-gén kódoló részétől számított utolsó 8 kodonnal, valamint a fent említett cDNS-szekvenciának megfelelő 2 további kodonnal. A primer egy Hindii! helyen végződik.

A PCR-reakciót a két primer és a pKFN1780 templát felhasználásával az alábbi rendszer szerint végezzük:

ciklus 95 °C 60 mp, 50 °C 120 mp, 72 °C 120 mp, ciklus 95 °C 30 mp, 65 °C 60 mp, 72 °C 90 mp.

A 760 bp-ú PCR-terméket 1%-os agarózgélen elektroforézissel nyeljük ki, BamHI és HindlII enzimekkel emésztjük és ugyanezekkel az enzimekkel hasi- 25 tott pSX221 plazmidba beépítjük. (A pSX221 a pUC19 plazmidnak egy származéka; Yannisk-Perron C. és munkatársai, Gene, 33:103-119 (1985)). A klónozott DNS-t szekvenálással igazoljuk, és a BamHIHindlII fragmenst (lásd 2. ábra) kivágjuk, izoláljuk és 30 rovarsejtben történő expresszálás céljából beépítjük egy pBlue Baclll plazmidba (Invitrogén Corporation).

A keletkezett plazmidot pSX556-nak neveztük el.

A HBP-t expresszáló rekombináns baculovírus elkészítéséhez a MAXBAC-készletet (Inritrogen Corp., San 35 Diegeo, CA, USA) használjuk, valamennyi eljárásnál követve a Baculovírus Expression System Manual (1.5.5 változat) előírásait. Röviden, 1 pg linearizált

AcMNPV DNS-t és 3 pg pSX556-ot SF9 rovarsejtekbe (2x1ο⁶ sejt 60 mm-es csészékben) kotranszfektálunk. Hét nap múlva a tenyészet felülúszóját összegyűjtjük. 100 mm-es csészékben lévő SF9 sejtek egyrétegű, friss 5 tenyészetét különbözőképpen hígított virusfelülúszóban fertőzzük be, majd 1,5%-os agarózt rétegezőnk rá, ami a teljes TNM-FH közeget tartalmazza 150 pg/ml X-gallal. 8 nap múlva 6 feltételezett rekombináns plakkot azonosítottunk a kék színű gyűrű alapján. Ezekkel befertőztünk egy 6 lyukú lemezt, ami SF9 sejteket tartalmaz. 5 nap múlva a megfelelő virus-DNS-t tisztítjuk és egy PCR-reakciónak vetjük alá előre irányuló és fordított primerekkel, melyek a rekombináns helyet szegélyezik a vírus-DNS-ben. A PCR-termékek agarózgélen való kiér15 tékelése után a legtisztább rekombináns vírust egy ismételt plakktisztításnak vetjük alá, hogy biztosak legyünk afelől, hogy a végső vírusállomány már nem tartalmaz vad típusú vírust. A rekombináns HBP-termelését rovarsejtekben (SF9 és SF21) hajtjuk végre, melyeket a szé20 rummentes SF900-n tápközegben (Gibco BRL/LifeTechnologies) való növekedéshez adaptáltak.

Általában 5 literes forgatott tenyészetet vagy 10 literes fermentort fertőzünk be 1 MOI (multiplicity of infection) értékű vírussal és a tenyészlevet a fertőzés utáni 3. napon feldolgozzuk. A HBP tisztítása a WO 89/08666 szabadalomban leírtak szerint történik.

3. példa

Prorégió nélküli HBP

Egy oligonukleotidlinkert (lásd alább) készítünk, mely lefedi a 2. ábrán bemutatott szekvencia első 99 bp-ját (BamHI-től Eagl-ig) kizárva a prorégiót lefedő részt (73-87) és ezzel pótoljuk a pSX556 eredeti BamHI-EagI régióját, a pSX559-hez jutva. Ettől a struktúrától azt várjuk, hogy érett HBP-t termel, ha baculovírus-rendszeiben expresszáltatjuk.

A linker négy anealált oligonukleotidot tartalmaz az alábbi két duplexet adva:

f

MHJ2568/LWN5746:

5’-GATCCACCATGACCCGGCTGACAGTCCTGGCCC- 3 ’

3’-GTGGTACTGGGCCGACTGTCAGGACCGGGACGACC - P - 5 ’

LWN5745/MHJ 2566:

5’-P-TGCTGGCTGGTCTGCTGGCGTCCTCGAGGGCCATCGTTGGC- 3 ’

3’-GACCAGACGACCGCAGGAGCTCCCGGTAGCAACCGCCGG- 5 ’

4. példa

A propeptid és az érett HBP között egy szarvasmarhaenterokináz hasítóhelyet tartalmazó HBP-származék expresszálása 50

A HBP-t kódoló baculovírus-vektorral (szignálpropeptid-érett HBP) fertőzött rovarsejt nem képes lehasítani a propeptidet. A propeptid nélküli HBP-t kódoló vírussal (szignálpeptid közvetlenül az érett HBP szekvenciájához kapcsolódik) fertőzött rovarsejtek ugyan érett alakban termelik a fehérjét, de nagyon kis mennyiségben. Hogy növeljük az érett HBP termelését, egy olyan HBP-származékot kódoló baculovírusvektort készítünk, ahol a propeptid és az érett HBP között egy szarvasmarha-enterokináz hasítóhely (Asp₄- 60

Lys) van, lehetővé téve ezáltal, hogy a megnyújtott alakban lévő HBP-ből in vitro eljárással hozzájussunk az érett HBP-hez.

A szignál-Gly-Ser-Ser-Pro-Leu-Leu-Asp-Asp₃Lys-érett HBP-struktúrát kódoló cDNS-fragmenst PCR-rel állítjuk elő Pfu polimeráz, PBRa 241 (CCGGGGATCCGATGACCCGGCTGACAGTCCT GGCCCTGCTGGCTGGTCTAGCTGGCGTCCT 55 CGAGGGCCGGCTCCAGCCCCTTTTGGACGACG ACGACAAGATCGTTGGCGGC) és PBRa 246 (CCGGGGATCCAACTAGGCTGGCCCCGGTCCC GG) primerek felhasználásával. A PCR-terméket BamHI enzimmel hasítjuk, és pVL1393 transzfervektorba (Invitrogén, San Diego, CA. USA) klónozzuk.

HU 221 638 Bl

A rekombináns baculovirus előállítását és a fehéijetermelést a 2. példában leírtak szerint végezzük (ebben az esetben azonban a feltételezett rekombináns plakkokat a felvétel-negatív fenotípusok alapján azonosítjuk).

Azért, hogy hozzájussunk az N-terminálison túlnyúló alakban lévő HBP-hez, SF900II szérummentes tápközegben (Gibco) nőtt 4 χ 10* SF9 sejteket centrifugálunk le és felszuszpendáljuk 1 MOI (multipicity of infection) értéket adó vírusoldatban. A sejteket és vírusokat tartalmazó szuszpenziót 0,5 literes Bellco forgatott edénybe (# 1865-00500) visszük és SF900II közeggel 400 ml végtérfogatra egészítjük ki. 1,5 g heparin-Sepharose-t (CL-6B, Pharmacia) 25 ml steril 0,9%-os nátrium-klorid-oldatban autoklávozunk és hozzáadjuk a tenyészethez. A tenyészetet 27 °C hőmérsékleten inkubáljuk 3 napon át.

A heparin-Sepharose-gyöngyök elválasztására a 400 ml rovarsejttenyészetet 8 darab 50 ml-es csőbe osztjuk szét, és Sorvall Instruments TECHNOSPIN R centrifugában centrifugáljuk 3 percen át percenként 300-as fordulatszámnál. A sejteket tartalmazó felülúszót leszívjuk, a heparin-Sepharose-gyöngyök üledékéből a még ott maradt sejteket eltávolítjuk, az üledéket ismét szuszpendálva 30-30 ml steril nátrium-klorid-oldatban és centrifugálva 300 fordulatszám/perc értéken. A teljes eljárást kétszer megismételjük. A gyöngyöket végűi a csövekben 20 ml steril 0,5 M nátriumklorid-oldattal mossuk. A gyöngyöket egy 50 ml-es csőbe gyűjtjük össze, kis térfogatú nátrium-klorid-oldatban szuszpendálva őket (össztérfogat 20-30 ml), és innen átvisszük egy steril üvegszűrős tölcsérbe. Hagyjuk, hogy a gyöngyökről a folyadék lefolyjon, és végűi a gyöngyökről 300 ml steril 3 M nátrium-klorid-oldattal leeluáljuk az rHBP-t. A HBP-t a 3 M nátrium-kloridos eluátumból a WO 89/08666 szabadalomban leirt módszerrel tisztítjuk.

200 pg tisztított HBP-t, mely egy enterokináz hasítóhelyet tartalmaz a proszekvencia és az érett protein szekvenciája között, feloldunk 25 mM kalcium-klorid, 50 mM nátrium-acetát, pH=5,l pufferben. 1,2 pl oldathoz hozzáadunk 400 egység enterokinázt (Biozyme Laboratories Limited GB Batch 18x2 Code EK2), és az oldatot 37 °C hőmérsékleten tartjuk 1 órán át. A HBP-t fordított fázisú HPLC-vel tisztítjuk a WO 89/08666 szabadalomban leírtak szerint. 1 nmol tisztított HBP-én Nterminális szekvenciaanalízist végzünk, mely szerint az megfelel az érett HBP pontos szekvenciájának, Ile aminosavval kezdődve, ami azt jelzi, hogy a hasítás sikeres volt.

5. példa

A propeptid és az érett HBP között egy Xa faktor hasítóhellyel rendelkező HBP-származék expresszálása

Az érett HBP előállításának egy alternatív útja, amikor a termék in vitro hasításához Xa faktort használunk. Az Xa faktor felismerő/hasító helye: Ile-GluGly-Arg. T. J. Gardella és munkatársai [J. Bioi. Chem., 26:15854-15859 (1990)] leírják, hogy ha az Xa faktor felismerési helyénél, rögtön az N-terminálisnál három kis aminosavval helyettesítünk (Gly-Gly-Ser), valószínűleg csökken a térbeli gátoltság és ezáltal megnő az Xa faktor hasítóképessége. A szignál-propeptid-IleGlu-Gly-Arg-érett HBP, illetve a szignál-propeptidGly-Gly-Ser-Ile-Glu-Gly-Arg-érett HBP előállításához két prímért szintetizálunk: a PBRa 249 prímért (CCGGGGATCCGATGACCCGGCTGACAGTCCT GGCCCTGCTGGCTGGTCTGCTGGCGTCCT CGAGGGCCGGCTCCAGCCCCTTTTGGACATCG AGGGTAGGATCGTTGGCGGC) és a PBRa 250 prímért (CCGGGGATCCGATGACCCGGCTGACAGTCCTGGCCCTGCTGGCTGGTCTGCTGGCGTCCT CGAGGGCCGGCTCCAGCCCCTTTTGGACGGTG GTTCCATCGAGGGTAGGATCGTTGGCGGC). A PBRa 246 priemerrel (4. példa) együtt, ezt a két prímért használjuk Pfu polimerázzal a PCR-reakciókhoz. A két fragmenst BamHl enzimmel emésztjük és pVL1393 plazmidba inszertáljuk. A rekombináns baculovirus elkészítését és a proteinek előállítását a 4. példában leírtak szerint hajtjuk végre.

6. példa

Perifériás mononukleáris vérsejteket (BMNC) preparálunk egészséges felnőtt véradóktól (Blood Bank, Rigshospitalet) a citráttal alvadásgátolt vérömlenybevonat Lymphoprep®-en (Nycomed, Oslo, Norvégia) történő centrifugálásával. Néhány vizsgálatnál a BMNC-sejteket PTX-szel (pentoxifillén) 1 órán át előinkubáljuk, mielőtt lipopoliszacharidot (LPS) ‘ (E. coli 055 :B5; Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) - végkoncentráció 1 pg/ml -, PHA-t (Difco) végkoncentráció 20 pg/ml - vagy tuberkulin tisztított fehérjeszármazékát (PPD) (State Serum Institute, Copenhagen, Dánia) - végkoncentráció 25 pg/ml adunk hozzá. Az inkubációt 3% normál humán szérumot (NHS) - amit 56 °C hőmérsékleten 30 percen át inaktiváltunk - tartalmazó, 0,8 mM glutaminnal, 20 1E penicillin/20 IE sztreptomicinnel (BRL-Gibco, Dánia) kiegészített RPMI-1640 tápközegben (BRL-Gibco, Raskilde, Dánia) végezzük. Az inkubáció után a sejteket összegyűjtjük, a felülúszót azonnal lefogyasztjuk -20 °C hőmérsékleten. Az üledéket gyorsan lefogyasztjuk folyékony nitrogénben, és -80 °C hőmérsékleten tartjuk az RNS extrahálásáig. Az ily módon történő tárolás nem tarthat tovább 1 hétnél.

Az IL-la, IL-Ιβ, IL-2, IL-6, IFNt, TNFa és ΤΝΡβ citokinokat kettős szendvics ELISA-eljárással mérjük, tisztított rekombináns citokinokkal szembeni monospecifikus, poliklonális nyúlantitesteket használva [Μ. B. Hansen és munkatársai, Immunoi. Lett., 30:156 (1991)]. Immuno-Maxorp lemezeket (Nunc, Roskilde, Dánia) protein-A-affinitással tisztított IgG-vel borítunk. A nem bevont helyeket foszfátpufferes sóoldatban (PBS) lévő 5%-os humán szérumalbuminnal blokkoljuk. A mintákat 2% normál nyúlszérummal (Dako, Glostrup, Dánia), 10 mM EDTA-val, 2000 KIE/ml aprotininnel és 5 mM DL-ditiotreitollal kiegészített PBSben hígítjuk. A vizsgálatokat az egyes citokinok nemzetközi standardjaival (National Institute fór Biological Standards and Controls, Potters Bar, Hertforshire, UK)

HU 221 638 Bl kalibráljuk. Az antitestek detektálására biotinezett poliklonális nyúlantitesteket használunk sztreptavidinperoxidázzal (Kirkegaard and Perry La., Gaitherburg, MD) együtt. A kifejlesztést 1,2-fenilén-diamin-dihidrokloriddal hajtjuk végre, és 492 nm-en mérünk. A vizsgálatok közti variációs koefficiens 8 pg/ml és 1 ng/ml közötti koncentrációtartományban kevesebb, mint 15%-os. Az ELISA-vizsgálat érzékenységi határa 8-10 pg/ml.

A BMNC-sejteket felolvasztjuk, 10 pg/ml és 100 pg/ml humán szérumalbuminnal, valamint 0,2 pg/ml, 1 pg/ml és 20 pg/ml HBP-vel kezeljük 10 ng/ml, illetve 100 ng/ml LPS jelenlétében.

Az eredményeket a 3. és 4. ábrán mutatjuk be. Az ábrákból kitűnik, hogy a BMNC-ből való citokinfelszabadulás szignifikánsan csökken HBP jelenlétében.

A HBP hatásával kapcsolatosan állatmodelleken végzett preklinikai tanulmányok

Intakt rekombináns HBP és származékainak (HBPpeptidek) preklinikai vizsgálatai emberi fertőzéses megbetegedések különböző modelleken végzett kezelések esetén.

1. Peritonitis (intraabdominális fertőzés)

CLP-modellje

A CLP (Cecal Ligation Puncture - vakbélelkötéses beszúrás) komoly emberi intraabdominális fertőzés modellje.

A modellben előnyösen egereket használunk. A modellben a vakbelet elkötjük és ezáltal egy kis „zsák” keletkezik. A bélmozgások és a vérellátás változatlan marad. Az elkötés után a zsákba 1 vagy 2 alkalommal kisméretű tűvel beszúrunk és kis mennyiségű faecest nyomunk az abdominális üregbe, ezután a hasat bezárjuk. Az eljárás többszörös mikrobiális intraabdominális fertőzést (peritonitis) okoz, ezt főleg Gram-negatív baktériumok és esetleg minimális mennyiségű Gram-pozitív baktériumok okozzák, amelyet szepszis követ. A fertőzés veszélyességét elsősorban a beszúrás mérete és a szúrások száma határozza meg. Nagy tűvel (18G) végzett kétszeri beszúrás 48 órán belül halált okoz, ugyanakkor egy 18G-s tűvel történő egyszeri beszúrás esetén a mortalitás 7 napon belül közel 100%-os. Ez az eljárás például a bélruptúra által okozott emberi intraabdominális fertőzést jól modellálja.

IC HBP-vel végzett kísérletek

Az első kísérletekben a HBP-nek a CLP-modellen fellépő hatását a Price Institute of Surgical Research, Department of Surgery, University of Louisville School of Medicine, Kentucky, USA mutatta be (monitor: dr. Hans Flodgaard; vezető vizsgáló: prof. Bili Cheadle).

Minta: A kísérletet rekombináns HBP-tömeggel végezték, amelyet rovarsejtvonal segítségével állítottak elő.

A vizsgálatokat különböző módon, így intraperitoneálisan (ip.), intravénásán (iv.) és szubkután (se.) végeztük különböző dózisokban; az adagolás időzítésével; egyszeri, ismételt és folyamatos adagolással; továbbá más dózisszinteken.

Beavatkozás: A korábbi kísérletekben a CLP-eljárást 2xl8G-s beszúrással végezték. Az állatokat csak HBP-vel kezeltük. Később a CLP-eljárást egy kivétellel minden alkalommal lxl8G-vel végeztük. Az összes kísérletben egy kivétellel a leghatékonyabb antibiotikumot (Mefoxin 60 mg/kg se. naponta háromszor) önállóan (kontroll) vagy HBP-vel kombinálva (kezelés) alkalmaztuk.

Mérések: A fő hatásossági paraméter a túlélési ráta volt.

Eredmények: A kísérletek azt mutatták, hogy 10-100 pg HBP-t adva ip. 48-24 órával a CLP előtt, szignifikáns a túlélés. Ha A HBP-t legalább 24 órával a CLP előtt adtuk be, akkor a halálozás relatív rizikója 0,41-0,28 közé csökkent a kontrollal összehasonlítva. Ez azt mutatja, hogy a HBP növelte a túlélést, ha azt a CLP előtt alkalmaztuk.

A második kísérletsorozat IC HBP-vel történt. Ez a kísérlet abban különbözött az elsőktől, hogy (i) 1 x 18G-s beszúrást alkahnaztímk a 2 χ 18G helyett és (ü) Mefoxinnal (Cefbxitin 60 mg/kg se. napi háromszor) történt hatékony antibiotikus kezelést végeztünk alapkezelésként mind a kontroll, mind a HBP-vel kezelt állatoknál. A változtatások a túlélést a kontrolinál 48 óránál kevesebbről 7 napra növelik.

Egy másik kísérlet statisztikailag szignifikáns hatást mutatott 50 pg HBP ip. beadásakor CLP-t követően folyamat*» se. adagolásnál 12 pg/nap 7 napon át A relatív rizikó 0,390 [95% 0,173 és 0,877 közötti intervallumban; p=0,02; n=20 (kontrollok) és 19 HBP kezelés}.

A CLP-kísérletek azt mutatták, hogy a HBP-t 48-24 óra alatt a CLP előtt ip. vagy a CLP-t követően se. alkalmazva 7 napon át szignifikáns hatás mutatkozik.

1.2. A CLP-s IC HBP-vel végzett kísérletek következtetései

- 10 és 100 pg HBP-t ip. adva legalább 24 órával a CLP előtt szignifikánsan csökkenti a mortalitást.

- 50 pg HBP-t adva ip. a CLP-nél, majd ezt követően 12 pg/nap HBP-t 7 napon át adva szignifikánsan csökkenti a mortalitást.

- 50 pg HBP-t önállóan adva, vagy naponta ismételve 10 pg/nap se. dózisban 5 napon át, vagy folyamatosan adagolva 12 pg/nap se. dózisban 3 napon át kismértékű, de az egyedi kísérletekben a mortalitás statisztikailag szignifikáns csökkenést mutat.

SZEKVENCIALISTA (1) Általános adatok:

(i) A szabadalmaztató:

(A) név: Novo Nordisk A/S (B) utca: Novo Allé (C) város: Bagsvaerd

HU 221 638 Bl (E) ország: Dánia (F) postai kód: 2880 (G) telefon: + 45 4444 8888 (H) telefax: +45 4449 3256 (I) telex: 37304 (ii) A találmány címe: Heparinkötó fehérje szepszis kezelésére (iii) Szekvenciák száma: 2 (iv) A komputer olvasható formája:

(A) médiumtípus: floppy disk (B) komputer: IBM PC kompatibilis (C) operatív rendszer: PC-DOS/MS-DOS (D) Software; Patent In Release # 1.0, Versin # 1.25 (EPO) (2) SEQ ID No: 1 adatai:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossza: 221 aminosav (B) típusa: aminosav (C) száltípusa: egyszálú (D) topológiája: lineáris (ii) A molekula típusa: fehétje (vi) Eredet:

(A) szervezet: ember (xi) A szekvencia leírása: SEQ ID No: 1

lle 1

Val

Gly

Arg 5

Lys

Alá

Arg

Pro

Arg 10

Gin

Phe

Pro

Phe

Leu 15

Al a

Ser

lle

Gin

Asn 20

Gin

Gly

Arg

His

Phe 25

Cys

Gly

Al a

Leu 30

lle

His

Al a

Arg

Phe 35

Val

Me t

Thr

Alá

Al a 40

Ser

Cys

Phe

Gin

Ser 45

Gin

Asn

Pro

Gly

Val 50

Ser

Thr

Val

Leu 55

Gly

Alá

Tyr

Asp

Leu 60

Arg

Glu

Arg 65

Gin

Ser

Arg

Gin

Thr 70

Phe

Ser

lle

Ser

Ser 75

Met

Ser

Glu

Asn

Gly 80

Tyr

Asp

Pro

Gin

Gin 85

Asn

Leu

Asn

Asp

Leu 90

Me t

Leu

Gin

Leu 95

Asp

Arg

Glu

Al a

Asx 100

Leu

Thr

Ser

As x

Val 105

Thr

lle

Leu

Pro

Leu 110

Pro

Leu

Gin

Asx

Al a 115

Thr

Val

Glu

Al a

Gly 120

Thr

Arg

Cys

Gin

Val 125

Al a

Gly

Trp

Gly

Ser 130

Gin

Arg

Ser

Gly

Gly 135

Arg

Leu

Ser

Arg

Phe 140

Pro

Arg

Phe

Val

Asx 145

Val

Thr

Val

Thr

Pro 150

Glu

Asp

Gin

Cys

Arg 155

Pro

Asn

Val

Cys 160

Thr

Gly

Val

Leu

Thr 165

Arg

Gly

lle 170

Cys

Asn

Gly

Asp

Gly 175

Gly

Thr

Pro

Leu

Val 180

Cys

Glu

Gly

Leu

Al a 185

His

Gly

Val

Al a

Ser 190

Phe

Ser

Leu

Gly

Pro 195

Cys

Gly

Arg

Gly

Pr o 200

Asp

Phe

Thr

Arg 205

Val

Alá

Leu

HU 221 638 Bl

Phe Arg Asp Trp Ile Asp Gly Val Leu Asn Asn Pro Gly 210 215 220 (2) SEQ ED No:2 adatai:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossza: 219 aminosav (B) típusa: aminosav (C) száltípusa: egyszálú (D) topológiája: lineáris (ii) A molekula típusa: fehéije (vi) Eredet:

(A) szervezet: ember (vi) A szekvencia leírása: SEQ ID No: 2

Ile Val 1

Gly

Arg 5

Arg Alá Gin

Pro Gin Glu 10

Phe

Pro

Phe

Leu 15

Al a

Ser

Ile

Gin

Lys

Gin

Gly

Arg

Pro

Phe

Cys

Al a

Gly

Al a

Leu

Val

His

20

25

30

Pro

Arg

Phe

Val

Leu

Thr

Alá

Al a

Ser

Cys

Phe

Arg

Gly

Lys

Asn

Ser

35

40

45

Gly

Ser

Al a

Ser

Val

Leu

Gly

Al a

Tyr

Asp

Leu

Arg

Gin

Glu

50

55

60

Gin

Ser

Arg

Gin

Thr

Phe

Ser

Ile

Arg

Se r

Ile

Ser

Gin

Asn

Gly

Tyr

65

70

75

80

Asp

Pro

Arg

Gin

Asn

Leu

Asn

Asp

Val

Leu

Gin

Leu

Asp

Arg

85

90

95

Glu

Alá

Arg

Leu

Thr

Pro

Ser

Val

Al a

Leu

Val

Pro

Leu

Pro

Gin

100

105

110

Asx

Al a

Thr

Val

Glu

Alá

Gly

Thr

Asn

Cys

Gin

Val

Al a

Gly

Trp

Gly

115

120

125

Thr

Gin

Arg

Leu

Arg

Leu

Phe

Ser

Arg

Phe

Pro

Arg

Val

Leu

Asx

130

135

140

Val

Thr

Val

Thr

Ser

Asn

Pro

Cys

Leu

Pr o

Arg

Asp

Me t

Cys

Ile

Gly

145

150

155

160

Val

Phe

Ser

Arg

Gly

Arg

Ile

Ser

Gin

Gly

Asp

Arg

Gly

Thr

Pro

165

170

175

Leu

Val

Cys

Asn

Gly

Leu

Al a

Gin

Gly

Val

Al a

Ser

Phe

Leu

Arg

180

185

190

Arg

Phe

Arg

Ser

Gly

Phe

Thr

Arg

Val

Al a

Leu

Phe

Arg

195

200

205

Asn

Trp

Ile

Asp

Ser

Val

Leu

Asn

Pro

210

215

ff

HU 221 638 Bl

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Heparinkötő fehéije (HBP), egy analógja vagy egy peptidfragmense - (i) amelynek hiányzik a proteázaktivitása; (ii) amely jelen van a perifériás neutrofil leukocitákban, és (iii) amely kemotaktikus a monocitákra - alkalmazása szepszis, Gram-negatív szepszis, szeptikus sokk vagy elszórt intravaszkuláris koaguláció megelőzésére vagy kezelésére szolgáló gyógyszer előállítására.
2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a HBPnek, analógjának vagy peptidfragmensének látszólagos molekulatömege glikozilezett alakban 28 kD, SDSPAGE-módszerrel reduktív körülmények között meghatározva.
3. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer lokális vagy szisztémás injekció vagy infúzió formájában készül.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer a gyulladás vagy a fertőzés helyál való lokális alkalmazásra készül.
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a heparinkötő fehéije a humán HBP.
6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a HBP aminosavszekvenciája a szekvencialistán SEQ ID No: 1 jelű; vagy ennek analógja vagy olyan peptidfragmense, amely képes az LPS lipid-A részét megkötni.
7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az LPS lipid-A részét megkötni képes peptidfragmens a SEQ ID No; 1 jelű szekvencia legalább 20-53., különösen 26-42. aminosavait tartalmazza.
8. Az 1., 2., 4., 6. vagy 7. igénypontok szerinti alkalmazás, ahol a heparinkötő fehéije a sertés-HBP.
9. Az előző igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a HBP aminosavszekvenciája a szekvencialistán SEQ DD No: 2 jelű; vagy ennek analógja vagy olyan peptidfragmense, amely képes az LPS lipid-A részét megkötni.
10. Az előző igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az LPS lipid-A részét megkötni képes peptidfragmens a SEQ ID No:2 jelű szekvencia legalább 20-53. aminosavait tartalmazza.
11. Az előző igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer a HBP-t 10 mg és 1 g közötti mennyiségben tartalmazza dózisegységenként.
12. Az előző igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer a HBP-t 0,1-100, előnyösen 0,5-50, még előnyösebben 1-25 mg/testtömeg-kg arányban tartalmazza.