CN1312858A - 杀菌/透性增加蛋白缺失类似物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供新的BPI缺失类似物,其由成熟的人BPI(10到193位)氨基酸残基所组成,其中位于氨基酸位置(132)的半胱氨酸残基由另一种氨基酸所替代。同时提供了包括这些类似物的融合蛋白、编码这些产物的多核苷酸、用于其重组制备的材料与方法、这些产物的组合物及药剂以及这些产物的治疗用途。

Description

杀菌/透性增加蛋白缺失类似物
发明背景
本发明提供新的具有生物活性的杀菌/透性增加蛋白(BPI)缺失类似物的制剂和含有这些制剂的药物组合物，其中的新类似物特征在于具有更好的稳定性与均一性以及增强的体内活性。
BPI是一种从对抵御入侵微生物至关重要的哺乳动物血细胞，称为多形核白细胞(PMN或噬中性的细胞)颗粒中分离的蛋白。已知BPI结合脂多糖，一种刺激可导致脓毒性休克(septic shock)强大免疫反应的格兰氏阴性细菌外膜蛋白的主要组分。通过酸提取结合离子交换层析[Elsbach，生物化学杂志，254:11000(1979)]或大肠杆菌[E.coli]亲和层析[Weiss等，血液，69:652(1987)]，人BPI蛋白从PMNs中得到分离。用这种方式获得的BPI在此称为天然BPI并且已显示其对广谱格兰氏阴性细菌具有强大的杀菌活性。人BPI的分子量大约55,000道尔顿(55kD)。完整的人BPI蛋白序列和编码该蛋白的DNA核酸序列报导于Gray等，生物化学杂志，264:9505(1989)的图1中，在此掺入该文献供参考。Gray等的氨基酸序列示于这里的SEQIDNO:1中。美国专利No.5,198,541(在此公开仅供参考)公开了编码BPI蛋白，包括重组BPI全蛋白(称为rBPI)和BPI重组片段的基因和用于表达这些蛋白的方法。
具有大约25kD分子量的蛋白水解性BPI N-末端具有双亲性特性，含有交替的疏水及亲水区。人BPI的此N-末端拥有天然55kD人BPI全蛋白的抗菌活性[Ooi等，生物化学杂志，262:14891-14894(1987)]。与N-末端部分相反，分离的人BPI蛋白C-末端区域对格兰氏阴性生物仅仅显示出略微可检测到的抗菌活性[Ooi等，实验医学杂志(J.Exp.Med),174:649(1991)]。一种大约23kD的N-末端BPI片段，称为“rBPI23”已由重组方法得到制备并且也维持对格兰氏阴性生物的抗菌活性[Gazzano-Santoro等，感染。免疫(Infect.Immun.)60:4754-4761(1992)]。一种BPI的N-末端类似物，rBPI21，已按照Horwitz等在蛋白表达纯化，8:28-40(1996)中所述得到了制备。
BPI的杀菌效应报导为对格兰氏阴性菌种类是高度特异性的，例如，在Elsbach与Weiss，发炎：基本原理与临床相关性，Gallin等编，第30章，Raven出版有限公司(1992)中所述。此报导的靶细胞特异性认为是BPI对脂多糖(LPS)，格兰氏阴性生物外膜(或包被)特异性成分的强烈吸收的结果。虽然BPI通常认为对其它微生物，包括酵母和更高等的真核细胞是无毒的，但是最近发现，如下文所讨论的，BPI蛋白产物也对格兰氏阳性细胞、支原体、分枝杆菌、真菌、原生动物和衣原体表现出活性。
虽然BPI杀死格兰氏阴性细菌的确切机制尚未完全阐明，但认为BPI必须首先通过带正电的BPI蛋白和LPS上带负电的位点之间的静电及疏水性相互作用而结合到该细菌的表面上。由于其刺激的强大炎症反应，即由宿主炎症细胞释放(炎症)介质，这可最终导致不可逆的内毒性休克，故LPS又称为“内毒素”。BPI与报导为LPS最具毒性的并且生物活性最强的部分，脂质A结合。
在易感的格兰氏阴性细菌中，BPI结合认为打断了LPS结构，导致降解磷脂和肽聚糖的细菌酶的活化，从而改变细胞外膜的透性，并且启动最终导致细胞死亡的事件。[Elsbach与Weiss(1992)，见上文]。BPI认为在两个时期起作用。第一个称为亚致死时期，其特征为立即生长停止，穿透外膜并且选择性活化水解磷脂与肽聚糖的细菌酶类。此时期的细菌可培养于补充血清蛋白的培养基中而得到挽救[Mannion等，临床研究杂志(J.Clin.Invest.,)85:853-860(1990)]。在长时间将细菌暴露于BPI之后，定义为不能够由血清蛋白所逆转的生长抑制的第二个时期发生，其特征在于广泛的生理与结构改变，包括对内膜的明显损伤。
BPI与LPS的最初结合导致组织的变化，这可能是源于通过结合Mg++和Ca++而结合LPS的阴离子基团，该结合通常稳定外膜。BPI附着到格兰氏阴性细菌外膜导致疏水性药物如放线菌素D迅速穿透外膜。BPI的结合以及随后格兰氏阴性细菌的杀死至少部分依赖于LPS多糖链的长度，其中具有较长O-链的“光滑型”生物较具有短O-链的“粗糙型”生物对BPI的杀菌效应具有更强的抗性[Weiss等，临床研究杂志，65:619-628(1980)]。此BPI作用的第一个时期，格兰氏阴性菌外包被的穿透在BPI解离(一种需要高浓度二价阳离子和新LPS合成的过程)时是可逆转的[Weiss等，免疫学杂志，132:3109-3115(1984)]。然而，通过恢复包被的完整性，格兰氏-阴性细菌的存活的丧失没有得到逆转，表明该杀菌作用由在靶生物中诱导的其它损伤所介导的，并且该损伤可能位于质膜上(Mannion等，临床，研究杂志，86:631-641(1990))。对该可能性的特定研究已显示在摩尔基础上，BPI至少与多粘菌素B具有相同的质膜载体抑制功能(In′tVeld等，感染与免疫，56:1203-1208(1988))，但是确切的机制以及该载体与完整生物研究间的相关性还未得到阐明。
已经表明BPI蛋白产物(包括天然和重组制备的BPI蛋白；天然、合成和重组的具有生物学活性的BPI蛋白多肽片段；具有生物学活性的BPI蛋白或其片段的多肽变异体，包括杂交融合蛋白和二聚体；具有生物学活性的BPI蛋白或其片段或变异体的类似物，包括半胱氨酸替代的类似物；和BPI衍生肽)具有多种有利的活性。已知BPI蛋白产物对格兰氏阴性细菌具有杀菌效应，如在美国专利Nos.5,198,541和5,523,288中所述，在此掺入二者供参考。同时已知BPI蛋白产物增强在格兰氏阴性细菌感染中抗生素的效应，如在美国专利No.5,523,288和相应的国际公开No.WO 95/08344(PCT/US 94/11225)中所述，在此掺入供参考。同时已知BPI蛋白产物对格兰氏阳性细菌和支原体具有杀菌效应，并且增强抗生素在格兰氏阳性菌感染中的效应，如在美国专利No.5,578,572和相应的国际公开No.WO 95/19180(PCT/US95/00656)中所述，在此引用供参考。还进一步已知BPI蛋白产物显示出抗真菌活性和增强其它抗真菌剂的活性，如在美国专利No.5,627,153和相应的国际公开No.WO 95/19179(PCT/US 95/00498)中所述，并且在共同拥有、共同未决的提交于1996年3月21日的美国申请系列No.08/621,259(其反过来又是提交于1994年7月20日的美国申请系列No.08/504,841的部分继续)和相应的国际公开Nos.WO 96/08509(PCT/US 95/09262)和WO 97/04008(PCT/US 96/03845)中进一步描述为抗真菌肽，引入所有文献供参考。还进一步已知BPI蛋白产物显示出抗原生动物活性，如在美国专利No.5,646,144和相应的国际公开No.WO 96/01647(PCT/US 95/08624)中所述，在此引入文献供参考。已知BPI蛋白产物显示出抗-衣原体活性,如在共同拥有的、共同未决的提交于1996年8月9日的美国申请系列No.08/694,843和相应的国际公开No.WO 98/06415(PCT/US 97/13810)中所述，在此引入的所有文献供参考。最后，已知BPI蛋白产物显示出抗分支杆菌活性，如在共同拥有、共同未决的提交于1996年4月1日的美国申请系列No.08/626,646(其反过来又是提交于1994年8月14日的美国申请系列No.08/285,803的部分继续，后者又成为1993年3月12日提交的美国申请系列No.08/031,145的部分继续)和相应的国际公开No.WO 94/20129(PCT/US 94/02463)中所述，所有引入的文献供参考。
BPI蛋白产物在人类中对循环中内毒素的效应，包括对TNF、IL-6和内毒素的效应描述于美国专利Nos.5,643,875和5,753,620以及相应的国际公开No.WO 95/19784(PCT/US 95/01151)中，引入所有文献供参考。
同时已知BPI蛋白对于治疗以下特异性病情中是有用的，例如人脑膜炎球菌血症(meningococcemia)(如在共同拥有、共同未决的提交于1996年5月10日的美国申请系列No.08/644,287和相应的国际公开No.WO 97/42966(PCT/US 97/08016)中所述，在此引入供参考)，人创伤性出血(如在共同拥有、共同未决的美国申请系列No.08/862,785，提交于1996年5月23日的美国系列No.08/652,292的部分延续，现在的美国专利No.5,756,464和相应的国际公开No.WO 97/44056(PCT/US 97/08941)中所述，在此引用所有文献供参考)，烧伤(如在美国专利No.5,494,896和相应的国际公开No.WO 96/30037(PCT/US 96/02349)中所述，在此引入该二篇文献供参考)，局部缺血/再灌注(reperfusion)损伤(如在美国专利No.5,578,568中所述，在此引入供参考)和肝脏切除(如在共同拥有、共有未决的提交于1998年3月16日的美国申请序列No.08/582,230中所述，该申请是对提交于1996年1月3日的相同系列号的延续申请，其反过来又是提交于1994年10月5日的美国申请系列No.08/318,357的延续，后者又是提交于1993年10月5日的美国申请系列No.08/132,510的部分延续，以及相应的国际公开No.WO 95/10297(PCT/US 94/11404)，所有引入文献供参考)。
同时已知BPI蛋白产物中和外源性肝素的抗凝剂活性，如在美国专利No.5,348,942中所述，在此引入供参考，以及对治疗慢性炎症疾病如类风湿和反应性关节炎是有用的，如在美国专利No.5,639,727中所述，在此引用供参考，并且用于抑制血管生成和治疗血管生成有关的疾病包括恶性瘤，目镜视网膜病(ocular retinopathy)和子宫内膜异位(endometriosis)，如在共同拥有的、共同未决的美国申请系列Nos.08/435,855,08/466,624和08/466,826和相应的国际公开No.WO94/20128(PCT/US 94/02401)中所述，所有引入文献在此供参考。
同时已知BPI蛋白用于抗血栓形成的方法中，如在美国专利No.5,741,799和相应的国际公开No.WO 97/42967(PCT/US 97/08017)中所述，在此引入供参考。
美国专利Nos.5,420,019和5,674,834和相应的国际公开No.WO94/18323(PCT/US 94/01235)(所有引入文献供参考)公开了在氨基酸位置132或135的半胱氨酸用其它氨基酸代替使得到的BPI多肽对二聚化和半胱氨酸加合化合物的形成具有抗性。其同时公开了在BPI氨基酸位置193终止N-末端BPI片段导致具有减少的羧基末端不均一性的表达产物。
令人感兴趣的是Capodici和Weiss在免疫学，156:4789-4796(1996)中的报导，即编码成熟BPI氨基酸残基1到193(BPI1-193)和残基13到193(BPI13-193)的DNA的体外转录/翻译产物表现出对固定LPS类似的LPS-依赖性结合。
在本领域中仍然存在着这样的必要，即(制备)具有更高生物学活性的BPI蛋白产物制剂，特别是那些具有增强的稳定性、均一性和/或体内生物学活性的制剂。
发明概述
本发明提供新的具有生物学活性的BPI缺失类似物及其制品，其特征在于增强的稳定性与均一性，包括例如对二聚化和半胱氨酸加合物形成的抗性和重组产物降低的氨基末端和羧基末端不均一性以及增强的生物学活性，这些特性使其高度适用于治疗与诊断使用。新的BPI缺失类似物为编码成熟人BPI(SEQ ID NO:2)氨基酸残基10到193DNA的表达产物，其中的位置132的半胱氨酸由不同的氨基酸所代替，优选为非极性氨基酸如丝氨酸或丙氨酸。在优选的实施方案，命名为“rBPI(10-193)C132A”或“rBPI(10-193)ala132”中，132位的半胱氨酸为丙氨酸所替代。
本发明进一步提供了编码这些BPI蛋白产物的新的纯化且分离的多核苷酸序列(例如，DNA或RNA)；用于其重组制备的材料与方法，包括载体及包括该DNA的宿主细胞；包括这些BPI蛋白产物的更为稳定的药物组合物；单独使用这些组合物或同时与其它治疗剂施用的改进的治疗方法。同时涉及的还有本发明BPI缺失类似物在制备用于治疗将从施用BPI蛋白产物中获益患者的药剂中的使用。
本发明众多的其它方面和优势在考虑到下面本发明详述时对本领域中的技术人员将是显而易见的，该详述描述了目前其优选的实施方案。
附图简述
图1描述了在施用rBPI(10-193)C132A或rBPI21后发生的测定为曲线面积(area under curve(AUC))的血压升高。
发明详述
本发明提供由成熟人BPI氨基酸残基10到193(列于SEQ ID NO:2)所组成的新的BPI缺失类似物，其中的BPI氨基酸位置132的半胱氨酸残基由别的氨基酸，优选为非极性氨酸如丝氨酸或丙氨酸所替代。其中的132位置半胱氨酸由丙氨酸所替代的优选实施方案命名为rBPI(10-193)C132A或rBPI(10-193)ala1a132。
BPI蛋白产物rBPI21为编码成熟人BPI氨基酸残基1至193 DNA的表达产物，其中的132位残基半胱氨酸由丙氨酸所替代，如在美国专利No.5,420,019中所述。用于通过达到更高细胞密度和更高rBPI21滴度重组方法制备rBPI21的发酵方法中的变化也导致了纯化产物氨酸末端不均一性的明显增加。在有些发酵循环中，观察到高达大约20％的纯化产物为具有BPI氨基酸10-193的种类，而不是编码的1-193个氨基酸。500升发酵样品在发酵循环过程中的SDS-PAGE凝胶显示该10-193种类出现在该循环的最后2-3天，其中最大量出现于收获当天。进一步研究表明rBPI21与CHO-K1细胞匀浆温育产生消化产物，提示与该细胞有关的蛋白酶活性参与(该过程)。为了以控制的方式模拟蛋白酶活性，rBPI21与氨肽酶M和弹性蛋白酶温育。rBPI21对氨肽酶M消化具有抗性，但弹性蛋白酶迅速将rBPI21转换成40％的BPI(8-193)和60％的BPI(10-193)。
如这里所描述的，稳定均一的rBPI(10-193)C132A制剂通过蛋白水解和重组方法得到制备。纯化和测试该蛋白的生物学活性。在数个体外生物学测定、2个不同的动物效率模型和药物动力学及毒理学研究中进行实验以比较rBPI(10-193)C132A与rBPI21。如在实施例5-7中所述，rBPI(10-193)C132A和rBPI21在下面的比较中具有类似的体外活性，包括用大肠杆菌J5的径向扩散和培养基微稀释(microdilution)杀菌测定，用L-形金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的径向扩散测定，用大肠杆菌J5 LPS的竞争结合测定，和用RAW与THP1细胞的LPS中和测定。描述于实施例5中的其它实验显示rBPI(10-193)C132A似乎在用速度浊度测定法(nephelometry)的LPS结合测定中大约是rBPI21强度的两倍。如实施例8中所述，纯化的rBPI(10-193)C132A和rBPI21在剂量达120mg/kg/天三天的大鼠GLP毒理学研究中具有类似的毒性分布并且在剂量为2mg/kg大鼠中具有类似的药物动力学。实施例8中描述的实验也显示在小鼠内毒素接种模型中，rBPI(10-193)C132A在两个研究中似乎至少较rBPI21活性强两倍，而在小鼠致死菌血模型中，rBPI(10-193)C132A与rBPI21同样有效。除了在有意识大鼠的体内实验外，灌注rBPI21 40与50mg/kg的剂量与载体对照相比导致血压显著的暂时下降，而相同剂量的rBPI(10-193)C132A与对照相比没有导致血压统计上显著的暂时下降。因此，与灌注rBPI21相比，灌注rBPI(10-193)C132A似乎提供了血液中副作用的下降。
本发明进一步涉及rBPI(10-193)C132A与至少一种其它多肽的至少一部分的融合。这种杂交融合蛋白的实例描述于美国专利No.5,643,570和相应的国际公开No.WO 93/23434(PCT/US 93/04754)中(在此引入所有文献供参考)并且包括杂交融合蛋白，其氨基末端包括BPI蛋白或其生物活性片段并且其羧基末端包括至少免疫球蛋白重链的一个恒定区或其等位变异体。
本发明还涉及编码本发明新的BPI缺失类似物或融合蛋白的纯化及分离的多核苷酸序列(例如，DNA或RNA)；含有该多核苷酸的表达载体，其中的多核苷酸优选可操作地连接到内源或异源表达调控序列上；用本发明DNA或载体稳定转染或转化的原核或真核宿主细胞；和用于本发明新的缺失类似物BPI蛋白产物重组制备的方法，例如，将其中的宿主细胞培养于适当营养的培养基中并且从该细胞或培养基中分离缺失类似物BPI蛋白产物的方法。这些多核苷酸序列或载体可任选编码27-氨基酸BPI前导序列和小鼠轻链多腺苷酸化信号。
本发明重组制备的新BPI缺失类似物可根据描述于美国专利No.5,439,807和相应的国际公开No.WO 93/23540(PCT/US 93/04752)(在此引入供参考)中的方法加以制备。美国专利No.5,439,807公开了在培养物中纯化表达并分泌于遗传转染哺乳动物宿主细胞中的重组BPI蛋白产物的方法，并且公开了人们如何制备大量适用于掺入稳定、均一药物制剂中的重组BPI产物。
本发明进一步提供了包括新BPI缺失类似物的更为稳定的药物组合物和单独用这些组合物或与其它治疗剂同时施用的改进的治疗方法。预期这种组合物可用于已知BPI蛋白产物，包括上文所讨论的那些产物的任何一种治疗用途中。
一般地，施用BPI蛋白产物，包括BPI缺失类似物优选以药物组合物加以完成，该组合物包括BPI蛋白产物和药物上可接受的稀释剂、佐剂或载体。BPI蛋白产物可单独施用或与已知的表面活性剂、其它化疗剂或别的已知抗-衣原体的药物联合施用。含有BPI蛋白产物(例如，rBPI23)的稳定的药物组合物包括柠檬酸缓冲盐(5或20mM柠檬酸盐，150mM NaCl,pH5.0)中1mg/ml浓度的BPI蛋白产物，其中包括0.1％重量的poloxamer 188(Pluronic F-68,BASF,Parsippany,NJ)和0.002％重量的聚山梨醇酯(polysorbate)80(Tween 80,ICIAmericas有限公司，Wilmington,DE或JT Baker,Phillipsburg,NJ)。另一种含有BPI蛋白产物(例如rBPI21)的稳定药物组合物包括在5mM柠檬酸盐、150mM NaCl、0.2％poloxamer 188和0.002％聚山梨醇酯80中2mg/ml浓度的BPI蛋白产物。这种优选的组合描述于美国专利Nos.5,488,034和5,696,090以及相应的国际公开No.WO 94/17817(PCT/US 94/01239)中，在此引入所有文献供参考。如在1996年1月12日提交的美国申请序列No.08/586,133(其又是1995年9月19日提交的美国申请系列No.08/530,599的部分延续，后者又是1995年1月13日提交的美国申请系列No.08/372,104的部分延续)和相应的国际公开No.WO 96/21436(PCT/US 96/01095)(在此引入所有文献供参考)中所述，其它具有增强活性BPI蛋白产物的poloxamer制剂也可使用。
包括BPI蛋白产物的治疗组合物可系统或局部施用。系统施用途径包括口腔及肠道外施用，包括静脉内、肌肉内或皮下注射(包括进存贮室(depot)中供长期释放)、眼内及眼球后、鞘内、腹膜内(例如，腹膜内灌洗)、肺内(用粉状药物或雾化或喷雾化药物溶液)、或经皮施用。改进的雾化制剂描述于共同拥有、共同未决的1997年10月31日提交的美国申请系列No.08/962,217和相应的国际公开No.WO98/19694(PCT/US 97/19850)中，在此引入二文献供参考。
当肠道外给药时，BPI蛋白产物组合物一般以下面的剂量注射，包括每天1μg/kg至100mg/kg，优选每天0.1mg/kg至20mg/kg，更优选1到20mg/kg/天且最优选为2到10mg/kg/天。该治疗可通过以相同剂量或减少或增加剂量每天连续灌注或间歇性注射或灌注，例如1到3天，并且另外由治疗医生决定该剂量。当静脉内施用时，BPI蛋白产物优选通过开始的简单灌注后持续灌注而加以施用。优选的静脉内治疗方案为1到20mg/kg简单静脉内灌注BPI蛋白产物后以20mg/kg/天剂量持续静脉内灌注，持续达一周。尤为优选的静脉内剂量方案为1到4mg/kg起始简单的静脉内灌注后以1到4mg/kg/天的剂量持续静脉内灌注，持续达72小时。
局部途径包括以下面的形式施用，即软膏、乳膏(cream)、凝胶、眼滴液或软膏(如在共同拥有、共同未决的提交于1995年11月14日的美国申请系列No.08/557,289和美国专利No.5,686,414及相应的国际公开Nos.WO 97/17990(PCT/US 96/18632)及WO 97/17989(PCT/US 96/18416)中所述，所有引入文献供参考)、耳滴液、栓剂、洗液(例如，洗伤口)或药用香波。例如，对于液滴形式的局部施用，根据治疗医生的判定，可施用每天1次或多次大约10至200μL BPI蛋白产物组合物。
本领域技术人员根据良好的医疗实践和单个患者的临床病情可容易地优化包括BPI蛋白产物治疗组合物的有效剂量和施用方案。
通过下面的说明性实施例本发明其它方面和优势将会明了。实施例1描述编码rBPI(10-193)C132A表达载体pING 1742的构建。实施例2描述用pING 1742对CHO细胞的转化以及分泌rBPI(10-193)C132A最高产量克隆的筛选。实施例3描述在2-L和500-L发酵罐中rBPI(10-193)C132A的制备与纯化。实施例4描述了对rBPI(10-193)C132A和rBPI21的生化特征分析。实施例5、6和7分别描述与rBPI21相比在下面测定分析中体外LPS-结合活性，包括竞争结合测定分析和用速度浊度测定法、杀菌活性和rBPI(10-193)C132A的LPS中和活性测定复合物形成速率的分析。实施例8强调了rBPI(10-193)C132A的体内活性。
                     实施例1
              表达载体pING1742的构建
rBPI(10-193)C132A表达载体，pING 1742，按如下加以构建。首先通过连接以下片段构建表达载体pING 4115，包括含有pING 3174neo基因的BamHⅠ-BsaⅠ片段与含有CMV启动子的BsaⅠ-XhoⅠ片段和来自pING 4144的rBPI21基因以及含有来自pING 4537小鼠(卡巴)轻链3′非翻译区的XhoⅠ-BamHⅠ片段(pING 3174,pING 4144和pING4537描述于美国专利No.5,420,019中，在此引入供参考)。得到的pING4155载体含有融合到人IgG增强子、人CMV启动子和小鼠(卡巴)轻链3′非翻译区上的编码rBPI21的基因。其同时含有编码新霉素磷酸转移酶的neo基因用于筛选对抗生素遗传霉素(Geneticin)(G418)抗性的转化子。
通过删除含有人Ig增强子的pING4155 0.7kbp的HindⅢ-HindⅢ片段而制备载体pING 1732。然后，用下面的引物通过叠加PCR诱变从pING 1732中删除编码成熟rBPI21部分氨基酸1到9的27个核苷酸：引物1：5′-CTGCTCTAAAAGCTGCTGCAG-3′(SEQ ID NO:3)引物2：5′-CCAGGCCCTTCTGGGAGGCCGCTGTCACGGCGG-3′
  (SEQ ID NO:4)引物3：5′-GCCGTGACAGCGGCCTCCCAGAAGGGCCTGGAC-3′
  (SEQ ID NO:5)引物4：5′-CTGGGAACTGGGAAGCTG-3′(SEQ ID NO:6)叠加的互补引物2和3掺入编码氨基酸1到9的27bp核苷酸的缺失，而引物1和4分别编码位于pING 1732特有的SaⅡ和EcoRⅠ位点上游和下游的核苷酸。首先，用寡核苷酸引物1与3及2与4的组合通过PCR扩增获得这些片段。获得这些单独片段后，将其与引物1与4退火、延伸并再次扩增。此扩增的片段然后用SalⅠ和EcoRⅠ消化并克隆入SalⅠ-EcoRⅠ消化的pING 1732中从而得到质粒pING 1742。
为了证实PCR过程中无突变发生，测序pING 1742的SalⅠ-EcoRⅠ区域。在成熟的BPI编码区没有观察到变化。然而，在编码信号序列的DNA中发现两碱基对改变(ACC-＞GCT)，从而导致相对于成熟蛋白-6位置的氨基酸由Thr转换为Ala。
                   实施例2
          用pING 1742对CHO细胞的转化
按下述将CHO-K1细胞(美国典型培养物保藏中心(ATCC)许可号No.CCL 61)适应于无血清的Ex-Cell 301培养基中生长。将培养于Ham′s F12培养基中的CHO-K1细胞用胰蛋白酶消化、离心并重悬于Ex-Cell 301培养基中。将细胞培养于100rpm的125ml培养瓶中并用125ml或250ml培养瓶每两天到三天传代一次。
将这些Ex-Cell 301-适应的CHO细胞通过电穿孔用pING 1742加以转染。转染前，用线性化该质粒的NotⅠ消化pING 1742。回收后48小时将细胞以大约104个细胞/孔种植于含有补充0.6mg/mL G418(Life Technologies,Gaithersburg,MD)Ex-Cell 301培养基的96孔平板中。大约2周时，用抗-BPI单克隆抗体通过ELISA筛选含有单个集落的大约250孔上清液中BPI-反应性蛋白的存在。
将具有最高表达水平的15个克隆转移至含有Ex-Cell 301培养基的24孔平板中。为了筛选产率，将细胞培养于含有补充以2％FBS和40μL无菌S-Sepharose小珠Ex-Cell培养基的24孔平板中10天，然后取出小珠，以低盐缓冲液(10mM乙酸钠中0.1M NaCl,pH 4.0)冲洗，并在相同的缓冲液中用1.5M NaCl洗脱BPI。用ELISA测定分泌rBPI(10-193)C132A的水平。于12％非-还原性SDS凝胶中的洗脱物的Western印迹分析显示出迁移较rBPI21略快的明显条带。
将产量最高的前八个集落转移至无菌125mL三角瓶(Erlenmeyer)中并培养于Ex-Cell培养基中。通过将其培养于含有补充以2％FBS和1％(v/v)无菌S-Sepharose小珠Ex-Cell 301培养基的三角瓶中而再次评估其产率。从掺入培养基中的S-Sepharose小珠中洗脱rBPI(10-193)C132A并用HPLC测定rBPI(10-193)C132A的水平。挑选出位于最高产量中的克隆139用于进一步培养和产物制备。
                    实施例3
          rBPI(10-193)C132A的制备与纯化
通过在2或研究用发酵罐(Biolafitte,St.Germain en Laye,France)并且然后在500升ABEC发酵罐(ABEC,Allentown,PA)中培养克隆139细胞而制备大量的rBPI(10-193)C132A用于特征分析。获自2升发酵罐的蛋白产物用于下述的体外研究中，而获自500升发酵罐的产物用于动物毒理学及效率的研究。A．在2升发酵罐中的培养
将克隆139细胞于含有补充以1％FBS Ex-Cell培养基逐渐加大体积的旋转培养瓶中传代直到达到足够的体积与细胞浓度从而以大约2×105个细胞/mL接种2升的生物反应器。将细胞于37℃,150rpm培养于三个2升的发酵罐中，其中的培养基补充了1％的FBS,pH为7.2,溶解的氧维持于5-10％。以1.5％(V/V)加入大型的无菌SP-Sepharose小珠(Pharmacia与Upjohn,Piscataway,NJ)。最初的葡萄糖水平大约为3.5g/L并且每天在发酵过程中将葡萄糖脉冲式补至3g/L。于238小时时终止发酵，此时细胞的生存力为63％,80％和84％。
发酵后，收获每只发酵罐的小珠，使其沉积(settle)并用pH7.0的10mM磷酸钠/0.15M NaCl冲洗数次从而去除小珠的细胞组分和微弱结合的杂质。将冲洗的小珠装柱，用pH7.0的10mM磷酸钠，0.25mMNaCl冲洗，并用含有0.8M NaCl,5mM甘氨酸的相同缓冲液洗脱。洗脱物然后用3倍体积的无菌注射水(WFI)洗脱，装入CM-spherodex柱(Sepracor,Marlborough,MA)并用pH7.0的10mM磷酸钠、0.25MNaCl冲洗，然后用pH4.0 20mM的乙酸钠、0.2M NaCl冲洗，然后用pH4.0 20mM的乙酸钠、0.3M NaCl冲洗，并将样品于相同的缓冲液中加以洗脱。用10,000MW截断的Centricon膜(Amicon,Beverly,MA)浓缩后，将来自CM柱的洗脱物装入用pH5.0 5mM柠檬酸钠、0.15M NaCl平衡的Sephacryl S-100柱(Pharmacia与Upjohn)中。将含有通过280nm处吸收值鉴定的rBPI(10-193)C132A的部分合并，并且用Amicon滤膜浓缩至1.9mg/mL并用0.002％聚山梨醇脂80(JT Baker,Phillipsburg,NJ)、0.2％poloxamer 188(PluronicF-68,BSAF,Parsippany,NJ)加以配制。最终制剂用0.2μm滤膜过滤除菌。B．于500升发酵罐中的培养
将克隆139细胞于含有1％FBS的无胎球蛋白Ex-Cell培养基的一系列逐渐增加体积的旋转瓶中传代从而提供用于35升Bellco旋转瓶(Bellco Glass,Vineland,NJ)的接种物，后者反过来又为500L ABEC发酵罐提供接种物。将细胞培养于无胎球蛋白但补充以1％FBS、额外的葡萄糖(至10g/L)和谷氨酰胺(至10mM)的完整Ex-Cell培养基中。发酵罐以补料-分批的方式运行，在其中的运行中以一个0.5％Primatone RL补充脉冲和一个葡萄糖/谷氨酰胺脉冲进行。500升发酵罐接种后24小时加入5至6升大型的SP-Sepharose小珠。用10％的碳酸氢钠手工调节pH至7.0，氧气控制在5％且温度控制在37℃。用两个三-刃的浆状推进器维持25rpm的搅动。发酵运行于184小时时终止，此时细胞的生存力为90％。
如上述的2升发酵一样，发酵后让小珠沉积且然后用低盐(0.1M)磷酸缓冲液冲洗数次。除了在S-Sepharose小珠洗脱后包括进pH3.0的病毒失活步骤和第二个CM-spherodex柱被包括进作为浓缩步骤外，纯化步骤与上述用于2升样品的条件类似。对于第二个CM柱，用三倍体积的WFI稀释洗脱物，调节pH至5.0，用pH5.0的20mM乙酸钠、0.3M NaCl平衡并冲洗该柱并且于相同的缓冲液中以1.0MNaCl洗脱样品。用pH5.0的5mM柠檬酸钠、0.15M NaCl从SephacrylS-100柱上洗脱rBPI(10-193)C132A，调节至2mg/mL，并且经过0.2μm滤膜过滤。然后用0.002％聚山梨醇酯80,0.2％poloxamer 188配制rBPI(10-193)C132A，无菌过滤，并装入10mL Ⅰ型玻璃瓶中。
                    实施例4
          rBPI(10-193)C132A的生化特征分析A．来自2升发酵的蛋白
观察到实施例3中纯化的rBPI(10-193)C132A产物在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)为迁移较rBPI21条带稍快的单一条带，这与rBPI21N-末端9个氨基酸缺失相一致。序列分析表明rBPI(10-193)C132A含有预计的N-末端序列：SQKGLDYASQQGTAALQKEL。质谱分析(ESI-MS)时观察到两种组分，一个为20,470道尔顿的分子量，这与预计的rBPI(10-193)C132A的20,472道尔顿分子量相一致，并且第二个具有20,225道尔顿的分子量，这与预计的rBPI(10-191)的20,258道尔顿的分子量相一致。rBPI(10-193)C132A和rBPI21的离子-交换HPLC图形(HeWlett-Packard,Model 1050,Palo Alto,CA)均表现出单一的峰且具有相同的滞留时间。B．来自500升发酵的蛋白
进行SDS-PAGE时，rBPI(10-193)C132A为迁移较rBPI21条带稍快的单一条带。进行质谱(分析)时，有一个20,471道尔顿分子量的主要条带，其与rBPI(10-193)C132A的预计的20,474道尔顿分子量相一致，以及两个次要组分，一个分子量为20,668道尔顿，与添加N-乙酰己胺(预计分子量20,677道尔顿)相一致，并且另一个分子量为20,843道尔顿，与添加N-乙酰已胺加上己糖(预计分子量为20,839道尔顿)相一致。在制备rBPI21过程中，经常观察到一个具有添加N-乙酰己胺的类似组分。
进行反相HPLC(Shimadzu，京都，日本)时，rBPI(10-193)C132A和rBPI21均洗脱成一个主要的峰和一个次要的峰。然而，rBPI(10-193)C132A峰较对照中的相应rBPI21峰稍早洗脱出来。rBPI(10-193)C132A图形中的次要峰最有可能代表在质谱中鉴定出的糖基化形式。rBPI(10-193)C132A与rBPI21的离子-交换HPLC图形均表现出单一的峰且具有类似的滞留时间。
根据传统方法进行了胰蛋白酶作图分析。丙酮沉淀的rBPI21或rBPI(10-193)C132A首先用二硫苏糖醇(DTT)处理后用碘乙胺处理且然后用胰蛋白酶处理。胰蛋白酶处理的产物用C18柱(BeckmanUltrasphere)通过HPLC(Beckman Model 126)加以分析。在rBPI21中，有2条源自对前导序列不准确切割的N-末端胰蛋白酶片段(T1和Ala-T1)。如预计的，除了缺失N-末端片段外，rBPI(10-193)C132A的胰蛋白酶水解图与rBPI21的类似。
                   实施例5
       rBPI(10-193)C132A的体外LPS-结合活性A．竞争结合分析中(的活性)
在竞争结合分析中评估根据实施例3A制备的纯化rBPI(10-193)C132A和rBPI21与标记的rBPI21竞争结合LPS的能力。简言之，将固定浓度(0.5nM)的125I-标记的rBPI21与未标记的rBPI21或rBPI(10-193)C132A以DMEM中5μM到0.01nM的稀释范围混合，该DMEM中含有HEPES缓冲液和牛血清蛋白(BSA)[U.S.Biochemicals,Cleveland,OH]并且将100μL混合物加入到以2.5μg/mL大肠杆菌J5LPS预先包被的Immulon-Ⅱ平板孔(Calbiochem,San Diego,CA)中。将平板于4℃温育5小时并用DMEM培养基洗3次。加入75μL0.1N的NaOH并且移出结合的125I-rBPI21并计数。结果表明两种蛋白均类似地与放射性标记的rBPI21竞争。B．在测定复合物形成速率分析中的活性
用速度浊度测定法比较rBPI(10-193)C132A与rBPl21的LPS结合活性、评估rBPI21结合LPS的方法测定由于溶液中LPS-BPI蛋白产物复合物的形成所造成的光发散增加速率。所有实验用BeckmanArray 360速度浊度测定仪(Rate Nephelometer)进行，该仪器自动混合样品，测定光发散并进行速度计算。
用该方法的前面实验测定了最佳LPS种类和浓度、测定分析特异性、可重复性以及分析结果与杀菌测定的相关性。观察到大肠杆菌J5LPS和脂质A与rBPI21形成可在浊度测定仪中测定到的复合物，但是大肠杆菌O111:B4 LPS没有形成可测到的复合物。根据这些研究结果，依据LPS份额，挑选大肠杆菌J5 LPS以49.4到61.7μg/ml的浓度与5到30μg/ml的rBPI21浓度(细胞流中)联合使用。必须对每个LPS份额加以测定的最佳rBPI21浓度范围为大约15到25μg/ml，其代表该曲线的最线性的部分。聚集速率(RT)值的最佳范围为从700到2000。当制剂缓冲液变成包括PLURONIC P103或当NaCl浓度增加时，需要更低浓度的rBPI21以达到相同的聚集速率。加入结合LPS的重组脂多糖结合蛋白(rLBP50)或结合BPI蛋白产物的肝素抑制rBPI21-LPS聚集物的形成，表明该相互作用的特异性。通过测定多份额的BPI和测定相同份额的rBPI21多次证实分析测定的可重复性。通过45℃处理一周而部分失活的rBPI21样品的浊度测定分析与用大肠杆菌J5细胞的培养基微稀释杀菌测定分析结果很好地一致。
比较rBPI(10-193)C132A和rBPI21的浊度测定实验按如下进行。将超声处理的LPS[来自List Biochemicals的大肠杆菌J5 LPS Lot No.30119B]与rBPI(10-193)C132A或rBPI21[两者均用0.2％PLURONICF68(poloxamer 188)、0.002％TWEEN 80(聚山梨醇脂80)、5mMpH5.0的柠檬酸盐、150mM NaCl加以配制]直接稀释入由Beckman供应的PBS缓冲液(补充以PEG)中。固定LPS浓度但BPI蛋白产物浓度依每个实验而改变。测定两个浓度的LPS:24.7和49.4μg/mlLPS。通过加入60μl PBS-PEG缓冲液至细胞流后加入42μl BPI蛋白产物稀释液而开始每个反应。建立基线后，加入42μl的大肠杆菌J5LPS溶液。加入最后一种组分后，根据光扩散的范围浊度测定仪测定复合物形成的速率。通过用含有给定BPI蛋白产物浓度的每个测试样品的RT值除以标准相应的RT值以产生百分对照值而分析数据。对于每个测定的BPI蛋白产物浓度，测定最大聚集速率并建立曲线。仅仅位于最大值左边的数据点(等价数据点)用于比较分析不同的BPI蛋白产物样品。通过比较用于测定的RT值与曲线线性区域的标准份额而测定样品的相对活性。可使用点到点或曲线适合方法(curve fitapproach)。
除了测试纯化的rBPI(10-193)C132A和纯化的rBPI21[含有大约7.8％rBPI(10-193)C132A]，还对这些蛋白的相等混合物以及具有16％rBPI(10-193)C132A的rBPI21进行评估(仅在49.4μg/ml LPS时)。这些结果显示在49.4μg/ml LPS时，rBPI(10-193)C132A与大约25％更低浓度的rBPI21达到类似的聚集速率。rBPI(10-193)C132A在27.4和49.4μg/ml LPS时均较rBPI21达到更高的最大聚集速率。两种分子的等量混合物产生介于rBPI21与rBPI(10-193)之间的曲线而7.8％份额的rBPI21与16％份额的10-193彼此表现一致。此结果的点到点分析(49.4μg/ml LPS)表明rBPI(10-193)在该分析中大约是rBPI21活性的两倍。
                       实施例6
           rBPI(10-193)C132A的体外杀菌活性
该实施例中的所有分析测定均以实施例3A中的2升发酵罐中制备的rBPI(10-193)C132A进行。A．放射扩散分析中大肠杆菌的效应
该放射扩散分析比较纯化的rBPI(10-193)C132A和rBPI21对大肠杆菌J5的杀菌效应，该大肠杆菌为光滑型大肠杆菌菌株011B4的UDP-半乳糖-4-差向异构酶的“粗糙型”突变子。将大肠杆菌J5细胞(Mannion等，临床研究杂志，85:853-860(1990)；List BiologicalLaboratories,Campbell,CA)培养至指数时期，离心并用pH7.4的10mM磷酸钠冲洗两次并且以大约1×106CFU/ml的终浓度加入到补充以3％Trypticase Soy Broth(TSB,DIFCO Laboratories,Detroit,MI)、10mM磷酸钠的熔解琼脂糖中。在硬化的琼脂糖中制备3mm直径的小孔并将5μL序列稀释的rBPI21或rBPI(10-193)C132A加入到小孔中。将平板于37℃温育3小时从而使扩散发生，且然后加入含有6％TSB的熔解的琼脂糖覆盖层。将平板于37℃温育过夜并以抑制的净面积对浓度作图。结果表明在该分析中rBPI(10-193)C132A与rBPI21表现类似。B．在放射扩散分析中对金黄色葡萄球菌L-形式的效应
该放射扩散分析比较纯化的rBPI(10-193)C132A与rBPI21对培养成L-形而无细胞壁的格兰氏-阳性细菌金黄色萄萄球菌的杀菌效应。如在美国专利No.5,578,572(在此引入供参考)中所述，将金黄色葡萄球菌L-形细胞在补充以3.5％NaCl、10mM CaCl2和1000U/mL青霉素G的心脏灌注(HI)培养基中培养至对数期。将细胞在含有补充NaCl的HI培养基的熔解0.8％琼脂糖中稀释至大约5×104或5×105个细胞/mL，并且将8ml细胞-琼脂糖悬液倒入10cm平板中。制备3mm直径的小孔，并将5μL系列稀释的rBPI21或rBPI(10-193)C132A加入到该小孔中。将平板于37℃温育24小时并且以抑制的净面积对浓度作图。结果显示rBPI21和rBPI(10-193)C132A在该分析中均以类似的方式在细胞浓度约5×104和5×105时抑制金黄色萄萄球菌L-形式的生长。C．在培养基微稀释分析中对大肠杆菌J5的效应
该培养基微稀释分析比较纯化的rBPI(10-193)C132A与rBPI21对大肠杆菌J5的杀菌效应。按照以前Horwitz等在感染，免疫，63:522-527(1995)中所述将大肠杆菌J5细胞在胰化蛋白胨酵母提取物(TYE)培养基中培养过夜且然后在TEA培养基中培养至对数期。将细胞从大约1×104和1×105个细胞/mL接种于心脏灌注(HI)培养基中，并将95μL加入到96孔平板中。在配制缓冲液中制备的5μL rBPI(10-193)C132A或rBPI21的各种稀释液加入到每孔中并将平板于37℃温育24小时。结果显示rBPI(10-193)C132A和rBPI21在这些分析中具有类似的活性。
                     实施例7
        rBPI(10-193)C132A的体外LPS中和活性
该实施例A部分的分析用在实施例3A中2升发酵罐中制备的rBPI(10-193)C132A进行，而该实施例B中的分析用实施例3B中500升发酵罐中制备的rBPI(10-193)C132A进行。A．在RAW细胞增殖分析中的活性
RAW细胞增殖分析用于比较rBPI21与rBPI(10-193)C132A的体外LPS中和活性。在该分析中，LPS抑制RAW细胞的增殖，并且rBPI21中和LPS的该效应。
在分析前24小时首先将维持于RPMI 1640培养基(GIBCO)中的小鼠RAW 264.7细胞(ATCC许可号T1B71)通过在5U/mL重组小鼠γ-干扰素(Genzyme,Cambridge,MA)存在下的温育而加以诱导，其中的RPMI 1640培养基补充了10mM HEPES缓冲液(pH7.4)、2mML-谷氨酰胺、青霉素(100U/mL)、链霉素(100μg/mL)、0.075％碳酸氢钠、0.15M 2-巯基乙醇和10％胎牛血清(Hyclone，有限公司，Logan,UT)。然后机械收集诱导的细胞并于4℃500×g离心且然后重悬于50mL RPMI 1640培养基(无补充物)中，再次离心并再次重悬于RPMI 1640培养基(无补充物)中。计数细胞，将其浓度调整至2×105个细胞/mL并且加入100μL等份至96孔板的每个小孔中。
然后将这些细胞与大肠杆菌O113 LPS(Control Standard,Assoc.of Cape Code,Woods Hole,MA)温育大约15小时，该LPS以无血清RPMI 1640培养基中1ng/mL的浓度(该浓度为其中的LPS浓度为50Pg/mL到100ng/mL的滴定实验的结果)100μL/孔等份而加入。该温育在25ng/mL到50ng/mL浓度的rBPI21或rBPI(10-193)C132A存在或不存在的情况下进行。重组的人rBPI21，也称为rBPI21Δcys(为rBPI1-93，其中132位的丙氨酸为半胱氨酸所替代[见共同拥有的美国专利No.5,420,019])以1μg/mL的浓度用作对照。通过在分析开始后5小时加入1μCi/孔[3H]-胸腺嘧啶而定量测定细胞增殖。温育15小时后，用细胞收获器(cell harvesker)(Inotech Biosystems,INB-384，样品处理及滤膜计数系统，Lansing,MI.)将标记的细胞收获至玻璃纤维滤膜上。LPS-介导的对RAW 264.7细胞增殖的抑制依赖于作为血清成分或重组LBP(以1μg/mL的浓度)而加入到反应混合物中的LBP的存在。
在这些实验中，rBPI21和rBPI(10-193)C132A两者均类似地抑制LPS-介导的对RAW细胞增殖的抑制。B．在TNF抑制分析中的活性
肿瘤坏死因子(TNF)抑制分析用于比较rBPI21和rBPI(10-193)C132A的体外LPS中和活性。在该分析中，LPS与纯化的LBP(或含有LBP的血清)一起刺激THP-1细胞(人单核细胞系)的TNF合成，并且rBPI21中和LPS的该效应。
将THP.1细胞(ATCC许可号TIB-202)维持于具有10％FBS的RPMI(GibcoBRL,Gaithersburg,MD)中并且在用LPS处理前三天培养于具有10％FBS加50 ng/ml 1,25二羟基维生素D(BIOMOLResearch Laboratories有限公司，Plymouth Meeting,PA)的RPMI中从而诱导CD 14的表达。以LPS诱导前，将细胞用RPMI冲洗三次并悬于具有10％FBS的RPMI中或无血清的培养基[补充1％HB101的RPMI(Irvine Scientific,Santa Ana,CA)]中。在96孔平板中以大约5×104个细胞每孔用1ng/ml大肠杆菌0128 LPS(Sigma,St.Louis,MO)诱导TNF的表达。将平板于37℃,5％CO2下温育，然后取出上清液等分并且用CellTiter 96TM AQ(Promega公司，Madison,WI)通过WEHI 164毒性分析监测细胞生存力。重组人TNFα(GenzymeDiagnostics,Cambridge,MA)用作阳性标准。rBPI21和rBPI(10-193)C132A二者均类似地抑制LPS-诱导的对TNF合成的刺激。
                     实施例8
          rBPI(10-193)C132A的体内生物学活性
用在实施例3B中500升发酵罐中制备的纯化rBPI(10-193)C132A进行下述的体内分析。A．在大鼠中的毒性研究
比较在大鼠中rBPI21和rBPI(10-193)C132A的毒性分布，在该研究中，六只雄性和六只雌性Sprague-Dawley大鼠实验组接受或者载体对照(配制缓冲液)，低剂量(50mg/kg/天)或高剂量(120mg/kg/天)的rBPI21或rBPI(10-193)C132A。通过以4.2mL/lkg/小时(100mL/kg/天)的灌注速率连续三天的植入的femoral导管(indwelling femoralcatheter)连续静脉内灌注而施用这些剂量。临床观察结果每日至少记录两次并且每日记录体重。接近结束时收集血尿样品用于血液学、临床化学及尿分析测定。结束时，称量器官并收集组织用于组织病理学检查。没有死亡或显著测试文章(test article)有关的效应。该数据表明当施以连续灌注时rBPI21与rBPI(10-193)C132A具有类似的毒性分布。B．药物动力学
2mg/kg的rBPI21与rBPI(10-193)C132A的药物动力学在大鼠中进行了研究。rBPI21与rBPI(10-193)C132A的血浆清除通过三-指数药物动力学处理函数(tri-exponential pharmacokinetic dispositionfunction)得到很好描述。没有检测到rBPI产物药物动力学参数中的统计差异性(非参数Wicoxon rank检验，p＜0.05)。大多数施用的药物(＞96％)在0.2-0.4分钟的半寿期α期与3.9-4.3分钟的β半寿期得到清除，而其余部分在27-33分钟半寿期的γ期期间得到清除。中央部分(central compartment)分布的体积(Vc)为41-45mg/kg，并且清除速率(CL)为24-30mL/分钟/kg。该分布的稳定态体积为152-184mL/kg。C．在小鼠内毒素接种中的效率
基本上按照Ammons等，在“治疗脓毒病的新治疗策略”，Morrison和Ryan编，Marcel Dekker，纽约(1996),55-69页在小鼠致死内毒素血症(endotoxemia)模型中进行两次单独的研究从而测定rBPI21与rBPI(10-193)C132A的相对活力。在两个研究中，在每次处理及对照组中有14只小鼠。在第一个研究中，CD1小鼠静脉内接种25mg/kg的大肠杆菌O111∶B4的脂多糖(LPS)。接种后立即将小鼠以15、20、25和30mg/kg的剂量的rBPI21或rBPI(10-193)C132A或对照载体(仅仅配制缓冲液)静脉内处理。连续七天每日两次记录致死率。
示于下表1中的第一个研究结果表明用rBPI(10-193)C132A和rBPI21处理均较载体对照显著增加了存活。此外，rBPI(10-193)C132A较rBPI21至少效率高两倍，因为在较rBPI21低两倍剂量的rBPI(10-193)C132A中见到与此剂量rBPI21类似的存活效率。
                            表1
    15只中存活的数目
剂量(mg/kg)     对照     rBPI21     rBPI(10-193)C132A
    0(载体)     0     NA1     NA
    15     0     15**.##
    20     4     15**,#
    25     11**     15**
    30     13**     13**
1NA，不适用**，与对照比p＜0.01#，与rBPI21比p＜0.05##，与对照比p＜0.01
在第二个研究中，研究了更宽范围的rBPI(10-193)C132A的剂量(5、10、15、20、25、30mg/kg)。下表中所示的结果证实尽管与第一个研究一样，rBPI21与rBPI(10-193)C132A两者均较对照得到了明显的存活效应，但是rBPI(10-193)C132A至少效率高两倍，因为用低于2倍的剂量得到与rBPI21类似的效率。
                           表2
    15只中存活的数目
剂量(mg/kg)     对照     rBPI21     rBPI(10-193)C132A
    0(载体)     2     NA1     NA
    5     ND1     3
    10     ND     10*
    15     ND     14**
    20     7     14**,#
    25     13**     15**
    30     14**     15**
1NA，不适用；ND，没有进行**，与对照比p＜0.05**，与对照比p＜0.01#，与rBPI21比p＜0.05D．在致死菌血症鼠模型中的效率
进行了两个单独的研究从而测定rBPI21与rBPI(10-193)C132A在致死菌血症小鼠模型中的相对效率。在第一个研究中，CD 1小鼠通过静脉内施用而接种以6.8×107个大肠杆菌07∶K1的菌落形成单位(CFU)。接种后立即用10、20和30mg/kg剂量的rBPI21或rBPI(10-193)C132A或对照载体(仅仅配制缓冲液)通过静脉内处理小鼠。连续七天每日两次记录致死率。
示于下表3中的第一个研究结果表明用10和30mg/kg rBPI21处理的组别存活显著增加(p＜0.05，与对照相比)。尽管与对照相比rBPI(10-193)C132A没有观察到存活明显的增加，但在该研究中rBPI21与rBPI(10-193)C132A处理的组别间存活优势没有显著的差异。
                     表3
    20只中存活的数目
剂量(mg/kg)     对照     rBPI21     rBPI(10-193)C132A
    0(载体)     6     NA
    10     14*     12
    20     12     10
    30     14*     10
*，与对照相比p＜0.05
为了更为充分地对rBPI21与rBPI(10-193)C132A在该模型中的效应进行特征分析，用更为广泛的剂量范围进行第二个实验。在该研究中，CD 1小鼠通过静脉内施用而接种2.57×108个大肠杆菌07∶K1菌落形成单位(CFU)。接种后立即用1.0、3.0、10和30mg/kg rBPI21以及0.3、1.0、3.0、10和30mg/kg rBPI(10-193)C132A静脉内处理小鼠。示于下表4中的结果表明两者均提供保护，并且在任何剂量两种变异体之间的保护效应无明显差异。
                      表4
    20只中存活的数目
剂量(mg/kg)     对照     rBPI21     rBPI(10-193)C132A
    0(载体)     6
    0.3     ND1     6
    1.0     4     6
    3.0     9     10*
    10     13**     8
    30     11*     14**
1ND，没有测定*，与对照相比p＜0.05**，与对照相比p＜0.01E．在有意识大鼠中的心血管效应
进行一系列实验从而测定rBPI21与rBPI(10-193)C132A对大鼠血压的相对效应。用Ketamine(Fort Dodge Labs,Fort Dodge,IA)与Rompum(Bayer公司，Shawnee Mission,KS)的混合物麻醉每只大鼠。然后将一导管置于右carotid动脉中并与血压传导仅(pressuretransducer)连接以记录血压。将第二根导管置于右jugular静脉中以注射rBPI或载体。然后在实验开始前让大鼠恢复。当大鼠变得警觉、可活动并且血压稳定于正常范围内时开始实验。然后将rBPI21、rBPI(10-193)C132A或对照载体(配制缓冲液)作为bolus而经15秒注射并记录以后60分钟的平均动脉压(mmHg)。
在预实验中，测得20和30 mg/kg剂量的rBPI21较载体对血压没有明显的效应，但是40mg/kg的剂量在5分钟内得到血压的显著的下降。此低血压反应在注射后15分钟达到最大，此时血压降低48±12mmHg(平均值±SE；p＞0.05)。60分钟后，rBPI21-处理动物的血压恢复并且与载体处理动物的血压没有显著差异。
为了比较rBPI21与rBPI(10-193)C132A的效应，5只大鼠的实验组给以40mg/kg的每种药物物质或载体对照，并将血压反应分析为曲线下面积(AUC)。与以前观察到的一样，图1显示rBPI21导致血压显著的下降，表现为较对照载体升高的AUC。通过比较，与载体对照相比，rBPI(10-193)C132A对血压无明显影响。50mg/kg剂量的rBPI21(N=4只大鼠)较40mg/kg的剂量具有更大的低血压效应，表现为图1中AUC的进一步上升。在此更高的剂量时，虽然在施用rBPI(10-193)C132A的大鼠(N=3)中也出现一些血压的下降，但此效应与载体对照相比不明显。
对于本发明的技术人员来说对上述本发明的众多修饰和变异预计会发生。因此，仅仅那些如出现在附属权利要求中的限定才应置于其中。
                           序列表<110>XOMA技术公司
 Horwitz,Arnold(发明人)
 Carroll,Stephen F．(发明人)
 Burke,David(发明人)<120>杀菌/透性-增加蛋白(BPI)缺失类似物<130>29715/35765<140><141><150>09/099,725<151>1998-06-19<160>6<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>1813<212>DNA<213>人<220><221>CDS<222>(31)..(1491)<220><221>成熟肽<222>(124)..(1491)<220><223>rBPI<400>1caggccttga ggttttggca gctctggagg atg aga gag aac atg gcc agg ggc  54
                             Met Arg Glu Asn Met Ala Arg Gly
                                 -30                 -25cct tgc aac gcg ccg aga tgg gtg tcc ctg atg gtg ctc gtc gcc ata   102Pro Cys Asn Ala Pro Arg Trp Val Ser Leu Met Val Leu Val Ala Ile
        -20                 -15                 -10ggc acc gcc gtg aca gcg gcc gtc aac cct ggc gtc gtg gtc agg atc   150Gly Thr Ala Val Thr Ala Ala Val Asn Pro Gly Val Val Val Arg Ile
     -5              -1   1               5tcc cag aag ggc ctg gac tac gcc agc cag cag ggg acg gcc gct ctg   198Ser Gln Lys Gly Leu Asp Tyr Ala Ser Gln Gln Gly Thr Ala Ala Leu10                  15                  20                  25cag aag gag ctg aag agg atc aag att cct gac tac tca gac agc ttt   246Gln Lys Glu Leu Lys Arg Ile Lys Ile Pro Asp Tyr Ser Asp Ser Phe
             30                  35                  40aag atc aag cat ctt ggg aag ggg cat tat agc ttc tac agc atg gac   294Lys Ile Lys His Leu Gly Lys Gly His Tyr Ser Phe Tyr Ser Met Asp
         45                  50                  55atc cgt gaa ttc cag ctt ccc agt tcc cag ata agc atg gtg ccc aat   342Ile Arg Glu Phe Gln Leu Pro Ser Ser Gln Ile Set Met Val Pro Asn
     60                  65                  70gtg ggc ctt aag ttc tcc atc agc aac gcc aat atc aag atc agc ggg   390Val Gly Leu Lys Phe Ser Ile Ser Asn Ala Asn Ile Lys Ile Ser Gly
 75                  80                          85aaa tgg aag gca caa aag aga ttc tta aaa atg agc ggc aat ttt gac   438Lys Trp Lys Ala Gln Lys Arg Phe Leu Lys Met Ser Gly Asn Phe Asp90                  95                 100                 105ctg agc ata gaa ggc atg tcc att tcg gct gat ctg aag ctg ggc agt   486Leu Ser Ile Glu Gly Met Ser Ile Ser Ala Asp Leu Lys Leu Gly Ser
            110                 115                 120aac ccc acg tca ggc aag ccc acc atc acc tgc tcc agc tgc agc agc   534Asn Pro Thr Ser Gly Lys Pro Thr Ile Thr Cys Ser Ser Cys Ser Ser
        125                 130                 135cac atc aac agt gtc cac gtg cac atc tca aag agc aaa gtc ggg tgg   582His Ile Asn Ser Val His Val His Ile Ser Lys Ser Lys Val Gly Trp
    140                 145                 150ctg atc caa ctc ttc cac aaa aaa att gag tct gcg ctt cga aac aag   630Leu Ile Gln Leu Phe His Lys Lys Ile Glu Ser Ala Leu Arg Asn Lys
155                 160                 165atg aac agc cag gtc tgc gag aaa gtg acc aat tct gta tcc tcc aag   678Met Asn Ser Gln Val Cys Glu Lys Val Thr Asn Ser Val Ser Ser Lys170                 175                 180                 185ctg caa cct tat ttc cag act ctg cca gta atg acc aaa ata gat tct   726Leu Gln Pro Tyr Phe Gln Thr Leu Pro Val Met Thr Lys Ile Asp Ser
            190                 195                 200gtg gct gga atc aac tat ggt ctg gtg gca cct cca gca acc acg gct   774Val Ala Gly Ile Asn Tyr Gly Leu Val Ala Pro Pro Ala Thr Thr Ala
        205                 210                 215gag acc ctg gat gta cag atg aag ggg gag ttt tac agt gag aac cac   822Glu Thr Leu Asp Val Gln Met Lys Gly Glu Phe Tyr Ser Glu Asn His
    220                 225                 230cac aat cca cct ccc ttt gct cca cca gtg atg gag ttt ccc gct gcc   870His Asn Pro Pro Pro Phe Ala Pro Pro Val Met Glu Phe Pro Ala Ala
235                 240                 245cat gac cgc atg gta tac ctg ggc ctc tca gac tac ttc ttc aac aca   918His Asp Arg Met Val Tyr Leu Gly Leu Ser Asp Tyr Phe Phe Ash Thr250                 255                 260                 265gcc ggg ctt gta tac caa gag gct ggg gtc ttg aag atg acc ctt aga   966Ala Gly Leu Val Tyr Gln Glu Ala Gly Val Leu Lys Met Thr Leu Arg
            270                 275                 280gat gac atg att cca aag gag tcc aaa ttt cga ctg aca acc aag ttc   1014Asp Asp Met Ile Pro Lys Glu Ser Lys Phe Arg Leu Thr Thr Lys Phe
        285                 290                 295ttt gga acc ttc cta cct gag gtg gcc aag aag ttt ccc aac atg aag   1062Phe Gly Thr Phe Leu Pro Glu Val Ala Lys Lys Phe Pro Ash Met Lys
    300                 305                 310ata cag atc cat gtc tca gcc tcc acc ccg cca cac ctg tct gtg cag   1110Ile Gln Ile His Val Ser Ala Ser Thr Pro Pro His Leu Ser Val Gln
315                 320                 325ccc acc ggc ctt acc ttc tac cct gcc gtg gat gtc cag gcc ttt gcc   1158Pro Thr Gly Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Val Asp Val Gln Ala Phe Ala330                 335                 340                 345gtc ctc ccc aac tcc tcc ctg gct tcc ctc ttc ctg att ggc atg cac   1206Val Leu Pro Asn Ser Ser Leu Ala Ser Leu Phs Leu Ile Gly Met His
                350             355                 360aca act ggt tcc atg gag gtc agc gcc gag tcc aac agg ctt gtt gga   1254Thr Thr Gly Ser Met Glu Val Ser Ala Glu Ser Asn Arg Leu Val Gly
        365                 370                 375gag ctc aag ctg gat agg ctg ctc ctg gaa ctg aag cac tca aat att   1302Glu Leu Lys Leu Asp Arg Leu Leu Leu Glu Leu Lys His Ser Asn Ile
    380                     385             390ggc ccc ttc ccg gtt gaa ttg ctg cag gat atc atg aac tac att gta   1350Gly Pro Phe Pro Val Glu Leu Leu Gln Asp Ile Met Ash Tyr Ile Val
395                     400             405ccc att ctt gtg ctg ccc agg gtt aac gag aaa cta cag aaa ggc ttc   1398Pro Ile Leu Val Leu Pro Arg Val Asn Glu Lys Leu Gln Lys Gly Phe410                 415                 420                 425cct ctc ccg acg ccg gcc aga gtc cag ctc tac aac gta gtg ctt cag   1446Pro Leu Pro Thr Pro Ala Arg Val Gln Leu Tyr Asn Val Val Leu Gln
            430                 435                 440cct Gac Gag aac ttc ctg ctg ttc ggt gca gac gtt gtc tat aaa        1491Pro His Gln Asn Phe Leu Leu Phe Gly Ala Asp Val Val Tyr Lys
        445                 450                 455tgaaggcacc aggggtgccg ggggctgtca gccgcacctg ttcctgatgg gctgtggggc  1551accggctgcc tttccccagg gaatcctctc cagatcttaa ccaagagccc cttgcaaact  1611tcttcgactc agattcagaa atgatctaaa cacgaggaaa cattattcat tggaaaagtg 1671catggtgtgt attttaggga ttatgagctt ctttcaaggg ctaaggctgc agagatattt 1731cctccaggaa tcgtgtttca attgtaacca agaaatttcc atttgtgctt catgaaaaaa 1791aacttctggt ttttttcatg tg                                          1813<210>2<211>487<212>蛋白质<213>人<400>2Met Arg Glu Asn Met Ala Arg Gly Pro Cys Asn Ala Pro Arg Trp Val
 -30                 -25                 -20Ser Leu Met Val Leu Val Ala Ile Gly Thr Ala Val Thr Ala Ala Val-15                 -10                  -5              -1   1Asn Pro Gly Val Val Val Arg Ile-Ser Gln Lys Gly Leu Asp Tyr Ala
           5                  10                  15Ser Gln Gln Gly Thr Ala Ala Leu Gln Lys Glu Leu Lys Arg Ile Lys
      20                  25                  30Ile Pro Asp Tyr Ser Asp Ser Phe Lys Ile Lys His Leu Gly Lys Gly
  35                  40                  45His Tyr Ser Phe Tyr Ser Met Asp Ile Arg Glu Phe Gln Leu Pro Ser50                  55                  60                  65Ser Gln Ile Ser Met Val Pro Asn Val Gly Leu Lys Phe Ser Ile Ser
              70                  75                  80Asn Ala Asn Ile Lys Ile Ser Gly Lys Trp Lys Ala Gln Lys Arg Phe
          80                  90                  95Leu Lys Met Ser Gly Asn Phe Asp Leu Ser Ile Glu Gly Met Ser Ile
     100                 105                 110Ser Ala Asp Leu Lys Leu Gly Ser Asn Pro Thr Ser Gly Lys Pro Thr
 115                 120                 125Ile Thr Cys Ser Ser Cys Ser Ser His Ile Asn Ser Val His Val His130                 135                 140                 145Ile Ser Lys Ser Lys Val Gly Trp Leu Ile Gln Leu Phe His Lys Lys
             150                 155                 160Ile Glu Ser Ala Leu Arg Asn Lys Met Asn Ser Gln Val Cys Glu Lys
         165                 170                 175Val Thr Asn Ser Val Ser Ser Lys Leu Gln Pro Tyr Phe Gln Thr Leu
    180                 185                 190Pro Val Met Thr Lys Ile Asp Ser Val Ala Gly Ile Asn Tyr Gly Leu
195                 200                 205Val Ala Pro Pro Ala Thr Thr Ala Glu Thr Leu Asp Val Gln Met Lys210                 215                 220                 225Gly Glu Phe Tyr Ser Glu Asn His His Asn Pro Pro Pro Phe Ala Pro
            230                 235                 240Pro Val Met Glu Phe Pro Ala Ala His Asp Arg Met Val Tyr Leu Gly
        245                 250                 255Leu Ser Asp Tyr Phe Phe Asn Thr Ala Gly Leu Val Tyr Gln Glu Ala
    260                 265                 270Gly Val Leu Lys Mer Thr Leu Arg Asp Asp Met Ile Pro Lys Glu Ser
275                 280                 285Lys Phe Arg Leu Thr Thr Lys Phe Phe Gly Thr Phe Leu Pro Glu Val290                 295                 300                 305Ala Lys Lys Phe Pro Asn Met Lye Ile Gln Ile His Val Ser Ala Ser
            310                 315                 320Thr Pro Pro His Leu Ser Val Gln Pro Thr Gly Leu Thr Phe Tyr Pro
        325                 330                 335Ala Val Asp Val Gln Ala Phe Ala Val Leu Pro Asn Ser Ser Leu Ala
    340                 345                 350Ser Leu Phe Leu Ile Gly Met His Thr Thr Gly Ser Met Glu Val Ser
355                 360                 365Ala Glu Ser Asn Arg Leu Val Gly Glu Leu Lys Leu Asp Arg Leu Leu370                 375                 380                 385Leu Glu Leu Lys His Ser Ash Ile Gly Pro Phe Pro Val Glu Leu Leu
            390                 395                 400Gln Asp Ile Met Asn Tyr Ile Val Pro Ile Leu Val Leu Pro Arg Val
        405                 410                 415Asn Glu Lys Leu Gln Lys Gly Phe Pro Leu Pro Thr Pro Ala Arg Val
    420                 425                 430Gln Leu Tyr Asn Val Val Leu Gln Pro His Gln Asn Phe Leu Leu Phe
435                 440                 445Gly Ala Asp Val Val Tyr Lys450                 455<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>3ctgctctaaa agctgctgca g                                   21<210>4<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>4ccaggccctt ctgggaggcc gctgtcacgg cgg                      33<210>5<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>5gccgtgacag cggcctccca gaagggcctg gac                      33<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>6ctgggaactg ggaagctg                                       18

Claims (19)

1．一种由成熟人BPI氨基酸残基10到193所组成的杀菌/透性增加蛋白(BPI)缺失类似物，其中位置132的半脱氨酸残基由不同的氨基酸所替代。
2．权利要求1的BPI缺失类似物，其中代替所述半胱氨酸残基的氨基酸为选自丙氨酸或丝氨酸的非极性氨基酸。
3．权利要求1的BPI缺失类似物，其中的位置132的半胱氨酸残基由丙氨酸所替代。
4．编码权利要求1的BPI缺失类似物的多核苷酸。
5．编码权利要求3的BPI缺失类似物的多核苷酸。
6．权利要求4的多核苷酸，进一步包括BPI的27个氨基酸的前导序列。
7．权利要求4的多核苷酸，它为DNA。
8．包括权利要求7DNA的表达载体。
9．宿主细胞，它以允许所述多核苷酸缺失类似物在所述宿主细胞中表达的方式用权利要求7的DNA稳定转化或转染。
10．权利要求9的真核宿主细胞。
11．权利要求10的宿主细胞，它为CHO细胞。
12．制备BPI缺失类似物多肽的方法，包括在适当的培养基中培养权利要求9的宿主细胞和从所述的宿主细胞或所述的培养基中分离所述的多肽。
13．权利要求12方法的多肽产物。
14．一种包括权利要求1的BPI缺失类似物和药物上可接受稀释剂、佐剂或载体的组合物。
15．一种包括权利要求3的BPI缺失类似物和药学上可接受的稀释剂、佐剂或载体的组合物。
16．一种包括权利要求13的BPI缺失类似物和药学上可接受的稀释剂、佐剂或载体的组合物。
17．一种改进的施用BPI蛋白产物至受试者的方法，包括施用权利要求14的组合物至所述的受试者。
18．一种改进的施用BPI蛋白产物至受试者的方法，包括施用权利要求15的组合物至所述的受试者。
19．一种改进的施用BPI蛋白产物至受试者的方法，包括施用权利要求16的组合物至所述的受试者。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024066416A1 (zh) * 2022-09-28 2024-04-04 安君(北京)基因科技有限责任公司 Cxcl-bpi融合蛋白及其用途

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5198541A (en) * 1987-08-11 1993-03-30 New York University Dna encoding bactericidal/permeability-increasing proteins
US6013631A (en) * 1998-06-19 2000-01-11 Xoma Corporation Bactericidal/permeability-increasing protein (BPI) deletion analogs
WO2000071149A2 (en) * 1999-05-24 2000-11-30 Xoma (Us) Llc Therapeutic uses of bpi protein products in humans with otitis media with effusion
JP2004517865A (ja) * 2000-12-01 2004-06-17 ゾーマ テクノロジー リミテッド Ｂｐｉタンパク質産物またはｂｐｉインヒビターを使用する、周皮細胞増殖の調節
ATE496134T1 (de) 2002-03-29 2011-02-15 Xoma Technology Ltd Multigene vectoren und methoden für eine erhöhte expression von rekombinanten polypeptiden
EP1598074B1 (en) * 2003-02-28 2019-01-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Stabilized protein-containing formulations
AU2006254217A1 (en) * 2005-06-03 2006-12-07 Biovitrum Ab (Publ) Process for cultivating animal cells comprising the feeding of plant-derived peptones
EP1741440A1 (en) 2005-07-08 2007-01-10 Mellitus S.L. Use of BPI protein for the treatment of disorders of the metabolism and cardiovascular disorders
US8338376B2 (en) * 2006-10-20 2012-12-25 Biogen Idec Ma Inc. Compositions comprising variant LT-B-R-IG fusion proteins
CA2680792A1 (en) * 2007-03-15 2008-09-18 Biogen Idec Ma Inc. Treatment of autoimmune disorders
KR102030572B1 (ko) 2011-04-05 2019-10-10 다나-파버 캔서 인스티튜트 인크. 방사선 완화제 및 방사선 방호제로서의 ｂｐｉ 및 이의 동질체
GB201319620D0 (en) 2013-11-06 2013-12-18 Norwegian University Of Science And Technology Immunosuppressive agents and their use in therapy
GB201319621D0 (en) 2013-11-06 2013-12-18 Norwegian University Of Science And Technology Antimicrobial agents and their use in therapy
KR102270048B1 (ko) * 2020-07-10 2021-06-28 주식회사 녹십자 바리셀라 조스터 바이러스 표면 단백질 항원의 생산 방법

Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5576292A (en) * 1987-08-11 1996-11-19 New York University Biologically active bactericidal/permeability-increasing protein fragments
US5198541A (en) * 1987-08-11 1993-03-30 New York University Dna encoding bactericidal/permeability-increasing proteins
WO1994025476A1 (en) * 1993-04-30 1994-11-10 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Recombinant bpi-based and lbp-based proteins, nucleic acid molecules encoding same, methods of producing same, and uses thereof
US5308834A (en) * 1989-02-14 1994-05-03 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Treatment of endotoxin-associated shock and prevention thereof using a BPI protein
US5770694A (en) * 1990-08-13 1998-06-23 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Genetically engineered BPI variant proteins
US5171739A (en) * 1989-02-14 1992-12-15 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Treatment of endotoxin-associated shock and preventation thereof using a BPI protein
US5334584A (en) * 1989-02-14 1994-08-02 Incyte Pharamaceuticals, Inc. Recombinant, non-glycosylated bpi protein and uses thereof
US5234912A (en) * 1989-02-14 1993-08-10 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical compositions comprising recombinant BPI proteins and a lipid carrier and uses thereof
US5089274A (en) * 1989-02-14 1992-02-18 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Use of bactericidal/permeability increasing protein or biologically active analogs thereof to treat endotoxin-related disorders
DE69128968T2 (de) * 1990-12-03 1998-10-08 Univ New York Biologisch aktive bakterizide/permeabilitätserhöhende proteinbruchstücke
JPH07502642A (ja) * 1991-09-26 1995-03-23 インサイト　ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド 新規な形態のリポ糖結合性タンパク質（ｌｂｐ）
ATE178652T1 (de) * 1992-05-19 1999-04-15 Xoma Corp Verbessertes verfahren zur herstellung von endotoxinbindungsproteinen
US5643570A (en) * 1992-05-19 1997-07-01 Xoma Corporation BPI-immunoglobulin fusion proteins
CN1163264C (zh) * 1993-02-02 2004-08-25 爱克索马技术有限公司 改进的药物组合物
US5420019A (en) * 1993-02-02 1995-05-30 Xoma Corporation Stable bactericidal/permeability-increasing protein muteins
WO1994019323A1 (en) 1993-02-18 1994-09-01 Merck Sharp & Dohme Limited Azacyclic compounds, compositions containing them and their use as tachykinin antagonists
ES2157981T3 (es) * 1993-03-12 2001-09-01 Xoma Technology Ltd Usos terapeuticos de productos proteicos bactericidas/aumentadores de la permeabilidad.
ATE169304T1 (de) * 1993-03-12 1998-08-15 Xoma Corp Biologisch aktive peptide aus funktionellen domaenen des bakteriziden/ die permeabilitaet erhoehenden proteins und ihre verwendung
US5348942A (en) * 1993-03-12 1994-09-20 Xoma Corporation Therapeutic uses of bactericidal/permeability increasing protein products
US5733872A (en) * 1993-03-12 1998-03-31 Xoma Corporation Biologically active peptides from functional domains of bactericidal/permeability-increasing protein and uses thereof
US5652332A (en) * 1993-03-12 1997-07-29 Xoma Biologically active peptides from functional domains of bactericidal/permeability-increasing protein and uses thereof
ES2119185T3 (es) * 1993-03-12 1998-10-01 Xoma Corp Tratamiento de enfermedades micobacterianas por administracion de productos de la proteina bactericida/que aumenta la permeabilidad.
WO1994021280A1 (en) * 1993-03-22 1994-09-29 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Use of bactericidal/permeability increasing protein and lipopolysaccharide binding protein levels and ratios thereof in diagnosis
US5731415A (en) * 1993-06-17 1998-03-24 Xoma Corporation Lipopolysaccharide binding protein derivatives
EP0726944B1 (en) * 1993-07-02 2002-12-18 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Glycosylated and non-glycosylated bactericidal/permeability increasing proteins, and methods for producing same
US5770561A (en) * 1993-07-14 1998-06-23 Xoma Corporation Method for potentiating BPI protein product bactericidal activity by administration of LBP protein products
WO1995002414A1 (en) * 1993-07-14 1995-01-26 Xoma Corporation Method for potentiating bpi protein product bactericidal activity by administration of lbp protein products
CA2172245C (en) * 1993-09-22 2003-04-08 Jonathan Cohen Method of treating gram-negative bacterial infection by administration of bactericidal/permeability-increasing (bpi) protein
CN1133634A (zh) * 1993-09-22 1996-10-16 爱克斯欧玛公司 定量体液中的bpi的方法
US5466580A (en) * 1993-09-22 1995-11-14 Xoma Corporation Method for quantifying BPI in body fluids
EP0722333B1 (en) * 1993-10-05 2004-06-16 XOMA Technology Ltd. Bpi-protein-products for depressed reticuloendothelial system function
ATE219684T1 (de) * 1994-01-14 2002-07-15 Xoma Technology Ltd Anti gram positive bakterielle verfahren und mittel
DE69526216T2 (de) * 1994-01-14 2002-11-14 Xoma Technology Ltd., Berkeley Antifungaleverfahren und mitteln
US5643875A (en) * 1994-01-24 1997-07-01 Friedmann; Nadav Human therapeutic uses of bactericidal/permeability increasing (BPI) protein products
US5484705A (en) * 1994-01-24 1996-01-16 Xoma Corporation Method for quantifying lipopolysaccharide binding protein
US5447913A (en) * 1994-03-11 1995-09-05 Xoma Corporation Therapeutic uses of bactericidal/permeability-increasing protein dimer products
US5786324A (en) * 1994-03-24 1998-07-28 Regents Of The University Of Minnesota Synthetic peptides with bactericidal activity and endotoxin neutralizing activity for gram negative bacteria and methods for their use
US5578568A (en) * 1994-04-22 1996-11-26 Xoma Corporation Method of treating conditions associated with intestinal ischemia/reperfusion
US5532216A (en) * 1994-06-24 1996-07-02 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Neutralization of non-lipopolysaccharide compounds by bactericidal/permeability-increasing protein
US5646114A (en) * 1994-07-11 1997-07-08 Xoma Corporation Anti-protozoan methods
CA2200069C (en) * 1994-09-15 2000-09-26 Roger G. Ii Little Anti-fungal peptides
US5912228A (en) * 1995-01-13 1999-06-15 Xoma Corporation Therapeutic compositions comprising bactericidal/permeability-increasing (BPI) protein products
US5494896A (en) * 1995-03-31 1996-02-27 Xoma Corporation Method of treating conditions associated with burn injuries
WO1997004008A1 (en) * 1995-07-20 1997-02-06 Xoma Corporation Anti-fungal peptides
AU730307B2 (en) * 1995-11-14 2001-03-01 Xoma Corporation Bactericidal permeability increasing protein (BPI) for treating conditions associated with corneal injury
US5686414A (en) * 1995-11-14 1997-11-11 Xoma Corporation Methods of treating conditions associated with corneal transplantation
US5741779A (en) * 1996-05-10 1998-04-21 Xoma Corporation Antithrombotic materials and methods
NZ332720A (en) * 1996-05-10 2000-07-28 Xoma Corp Therapeutic uses of bactericidal/permeability increasing (BPI) protein to treat human meningococcemia
CN1155403C (zh) * 1996-05-23 2004-06-30 爱克索马技术有限公司 杀细菌／通透性增加蛋白在制备用于治疗创伤出血病人的药物中的应用
US5888973A (en) * 1996-08-09 1999-03-30 Xoma Corporation Anti-chlamydial uses of BPI protein products
EP1304118A3 (en) * 1996-11-01 2004-01-14 XOMA Technology Ltd. Therapeutic uses and formulations for BPI protein products.
US6013631A (en) * 1998-06-19 2000-01-11 Xoma Corporation Bactericidal/permeability-increasing protein (BPI) deletion analogs

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024066416A1 (zh) * 2022-09-28 2024-04-04 安君(北京)基因科技有限责任公司 Cxcl-bpi融合蛋白及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
EP1086230A1 (en) 2001-03-28
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US6087126A (en) 2000-07-11
NZ508816A (en) 2003-03-28
US20050130889A1 (en) 2005-06-16
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US6599880B1 (en) 2003-07-29
WO1999066044A1 (en) 1999-12-23
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JP2002518011A (ja) 2002-06-25
CA2331880A1 (en) 1999-12-23

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