MXPA00011398A - Analogo de remocion de proteina que incrementa la actividad bactericida/permeabilidad (bpi). - Google Patents

Analogo de remocion de proteina que incrementa la actividad bactericida/permeabilidad (bpi).

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MXPA00011398A
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Abstract

Se proporciona analogo de remocion de BPI, que consisten de residuos de aminoacidos (10 a 193) de BPI humana madura donde el residuo de cisteina en la posicion de aminoacido de BPI (132) es reemplazado por otro aminoacido. Se proporcionan tambien proteinas de fusion que comprenden estos analogos, como lo son polinucleotidos que codifican estos productos, materiales y metodos para su produccion recombinante, composiciones y farmacos de estos productos, asi como usos terapeuticos para estos productos.

Description

8 i <2> % ANÁLOGO DE REMOCIÓN DE PROTEINA QUE INCREMENTA LA ACTIVIDAD BACTERICIDA/PERME.ABILIDAD (BPl) ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La presente invención ofrece preparaciones de análogos de remoción biológicamente activos novedosos de proteína que incrementa la actividad bactericida/permeabilidad (BPl) caracterizados por una estabilidad y homogeneidad mejoradas así como por una actividad in vivo incrementada, y composiciones farmacéuticas que contienen dichos análogos. La BPl es una proteína aislada de granulos de leucocitos polimorfonucleares de mamífero (PMNs o neutrófilos), que son células sanguíneas esenciales en la defensa contra microorganismos invasores. Se sabe que BPl se une a lipopolisacárido, un componente mayor de la membrana externa de bacterias gram negativas que estimula una respuesta inflamatoria potente que puede provocar un choque séptico. Se ha aislado una proteína BPl humana a partir de PMNs mediante extracción con ácido combinada con cromatografía por intercambio de iones [Elsbach, J. Biol. Chem., 254:11000(1979)] o bien cromatografía de afinidad con E. coli [Weiss, et al., Blood, 69:652(1987)]. Se obtienen BPl de una manera mencionada aquí como BPl natural y se ha mostrado que tiene una actividad bactericida potente contra un amplio espectro de bacterias gram negativas. El peso molecular de la BPl humana es de aproximadamente 55,000 daltones (55 kD) . La secuencia de aminoácidos de la proteína BPl humana entera y la secuencia de ácido nucleico de .ADN que codifica la proteína aparecen en la figura 1 de Gray et al., J. Biol. Chem., 264:9505 (1989), que se incorpora aquí por referencia. La secuencia de aminoácidos de Gray et al se presenta en SEQ ID NO: 1. La patente norteamericana No. 5,198,541, cuya divulgación se incorpora aquí por referencia, divulga genes recombinantes que codifican proteína BPl y métodos de expresión de dichas proteínas incluyendo holoproteína BPl recombinante, conocida como rBPI, y fragmentos recombinantes de BPl. Un fragmento de terminal N proteolítico de BPl que tiene un peso molecular de aproximadamente 25 kD tiene un carácter antipático, conteniendo alternativamente regiones hidrofóbicas e hidrofílicas. Este fragmento de terminal N de BPl humana posee la actividad antibacteriana de la holoproteína BPl humana de 25 kD derivada naturalmente. [Ooi et al., J. Bio. Chem., 262:14891-14894 (1987)]. En contraste con la porción de terminal N, la región de terminal C de la proteína BPl humana aislada presenta solamente una actividad antibacteriana ligeramente detectable contra organismos gram negativos. [Ooi et al., J. Exp. Med., 174:649 (1991)]. Un fragmento de BPl de terminal N de aproximadamente 23 kD, conocido como "rBPI23", ha sido producido por medios recombinantes y conserva también una actividad antibacteriana contra organismos gram negativos. [Gazzano-Santoro et al., Infect. Immun. 60:4754-4761 (1992)]. Un análogo de terminal N de BPl, rBPdi, ha sido producido y descrito en Horwitz et al., Protein Expression Purification, 8:28-40 (1996). El efecto bactericida de BPl ha sido reportado como altamente específico para especies gram negativas, por ejemplo, Elsbach and Weiss, .Inflam ation: Basic Principies and Clinical Correlates, ediciones. Gallin et al., capítulo 30, Raven Press, Ltd. (1992) . Esta especificidad de célula blanco reportada es el resultado de la acción fuerte de BPl para lipopolisacárido (LPS) , lo que es único para la membrana externa (o bien envoltura) de organismos gram negativos. Aún cuando se creía comúnmente que BPl no era tóxica para otros microorganismos, incluyendo levadura y para células eucarióticas superiores, se ha descubierto recientemente, y comentado infra, que productos de proteína BPl presentan una actividad contra bacterias gram positivas, icroplasma, microbacterias, hongos, protozoarios, y cla idia. El mecanismo preciso a través del cual BPl marca las bacterias gram negativas a la fecha no se conoce totalmente, pero se cree que BPl debe primero unirse con la superficie de la bacteria a través de interacciones electrostáticas e hidrofóbicas entre la proteína BPl catiónica y sitios cargados negativamente en LPS, Se ha calificado LPS de "endotoxinas" debido a la potente respuesta inflamatoria que estimula, es decir, la liberación de mediadores por células inflamatorias del huésped que pueden resultar finalmente en un choque endotóxico irreversible. BPl se une al lípido A, reportado como el componente más tóxico y más biológicamente 5 activo de LPS. En bacterias gram negativas susceptibles, el enlace de BPl trastorna, según se cree, la estructura de LPS, provocando la activación de enzimas bacterianas que degradan los fosfolípidos y péptidoglicanos, alterando la permeabilidad de 10 la membrana externa de la célula, e iniciando eventos que • provocan finalmente la muerte de la célula. [Elsbach and Weiss (1992)]. Se cree que BPl actúa en dos etapas. La primera etapa es una etapa subletal caracterizado por una suspensión inmediata de crecimiento, permeabilización de la 15 membrana externa y activación selectiva de enzimas bacterianas que hidrolizan los fosfolípidos y los péptidoglicanos. Las bacterias en esta etapa pueden ser rescatados por crecimiento en medio complementado con albúmina sérica [Mannion et al., J. Clin. Invest., 85:853-860 20 (1990) ] . La segunda etapa, definida como inhibición de crecimiento que no puede ser revertida por albúmina sérica, ocurre después de una exposición prolongada de la bacteria a BPl y se caracteriza por cambios fisiológicos y estructurales extensivos, incluyendo un daño aparente a la membrana 25 citoplásmica interna.
El enlace inicial de BPl sobre LPS provoca cambios organizacionales que resultan probablemente de la unión con los grupos aniónicos de LPS, lo que estabiliza normalmente la membrana externa a través del enlace de Mg*+ y Oa++ . La unión 5 de BPl sobre la membrana externa de bacterias gram negativas produce una permeabilización de la membrana externa para los agentes hidrofóbicos como por ejemplo actinomicina D. La unión de BPl y la muerte subsecuente de las bacterias gram negativas dependen, por lo menos en parte, de la longitud de | 10 la cadena de polisacáridos de LPS, con la cadena 0 larga llevando organismos "suaves" que son más resistentes a los efectos bactericidas de BPl que la cadena O corta que lleva, organismos "ásperos" [Weiss et al., J. Clin. Invest. 65:619- 628 (1980)]. Esta primera etapa de la acción de BPl, la 15 permeabilización de la envoltura externa de bacterias gram negativas es reversible al disociarse de BPl, un proceso que requiere de altas concentraciones de cationes bivalentes y tt síntesis de nuevos LPS [Weiss et al., J. Immunol. 132: 3109- 3115 (1984)]. La pérdida de la viabilidad de bacterias gram 20 negativas sin embargo no es revertida por procedimientos que restauran la integridad de la envoltura, lo que sugiere que la acción bactericida es mediada por lesiones adicionales inducidas en el organismo blanco y que pueden encontrase en la membrana citoplásmica (Mannion et al., J. Clin. Invest. 25 86:631-641 (1990)). Una investigación específica de esta posibilidad ha mostrado que en una base molar BPl tiene por lo menos una capacidad inhibitoria de la función de vesícula de membrana citoplásmica igualmente grande que polimixina B (In't Veld et al., Infection and Im unity 56:1203-1208 (1988)), pero el mecanismo exacto así como la relevancia de tales vesículas sobre estudios de organismo intactos todavía no se ha determinado. Productos de proteína BPl (que incluyen proteína BPl producida naturalmente y de manera recombinante; fragmentos de polipéptido naturales, sintéticos, y recombinantes biológicamente activo de proteína BPl; variantes de polipéptido biológicamente activas de proteína BPl o fragmentos de la misma, incluyendo proteínas de fusión híbridas y dímeros; análogos de polipéptido biológicamente activos de proteína BPl o fragmentos u variantes de la misma, incluyendo análogos sustituidos con cisteína; y péptidos derivados de BPl) demostraron tener varias actividades benéficas. Se sabe que productos de proteína BPl son bactericidas para bacterias gram negativas, según se describió en la patente Norteamericana No. 5,198,541 y en la patente Norteamericana No. 5,523,288, ambas incorporando aquí por referencia, se sabe también que productos de proteína BPl incrementan la efectividad de la terapia antibiótica en infecciones provocadas por bacterias gram negativas, según se describió en la patente Norteamericana No. 5,523,288 y en la publicación internacional correspondiente No. WO 95/08344 (PCT/US94/11225) , que se incorporan aquí por referencia. Se sabe también que productos de proteína BPl son bactericidas para bacterias gram positivas y micoplasma, y sabe que incrementan la efectividad de antibióticos en infecciones bacterianas gram positivas, de conformidad con lo descrito en la patente Norteamericana No. 5,578,572 y publicación internacional correspondiente No. WO 95/19180 (PCT/US95/00656) , que se incorporan aquí por referencia. Se sabe además que productos de proteína BPl presenta la actividad anti-fungal y mejoran la actividad de otros agentes anti-fungales, de conformidad con lo descrito en la patente Norteamericana No.5,627,153 y en la publicación internacional correspondiente No. WO 95/19179 (PCT/US95/00498 ) , y de conformidad con lo descrito adicionalmente para péptidos anti-fungales en la solicitud de patente Norteamericana mancomunada copendiente No. de serie 08/621,259 presentada el día 21 de Marzo de 1996, que a su vez en una continuación en parte de la solicitud de patente Norteamericana No. de serie 08/504,841 presentada el día 20 de Julio de 1994, y publicaciones internacionales correspondientes No. WO 96/08509 (PCT/US95/09262) y WO 97/04008 (PCT/US96/03845) , todas las cuales se incorporan aquí por referencia. Se sabe además que productos de proteína BPl presentan una actividad anti-protozoaria, de conformidad con lo descrito en la patente Norteamericana No. 5,646,11 y publicación internacional correspondiente WO 96/01647 (PCT/US95/08624) , todas las cuales se incorporan aquí por referencia. Se sabe que productos de proteína BPl presentan una actividad anti-clamidia, de conformidad con lo descrito en la solicitud de patente Norteamericana mancomunada, copendiente No. de serie 08/694,843, presentada el día 9 de Agosto de 1996, y en publicación internacional correspondiente WO 98/06415 (PCT/US97/13810) , todas las cuales se incorporan aquí por referencia. Finalmente, se saben de productos de proteína BPl presentan una actividad anti-microbacteriana, de conformidad con lo descrito en la solicitud de patente Norteamericana mancomunada, copendiente No. de serie 08/626,646 presentada el día 1 de Abril de 1996, que es a su vez una continuación de la solicitud de patente Norteamericana No. de serie 08/283,803, presentada el día 14 de Agosto de 1994, que a su vez en una continuación en parte de la solicitud de patente Norteamericana No. de serie 08/031,145, presentada el día 12 de Marzo de 1993 y publicación internacional correspondiente WO 94/20129 (PCT/US94/02463, 13810) , todas las cuales se incorporan aquí por referencia. Los efectos de productos de proteína de BPl en seres humanos con endotoxina en circulación, incluyendo efectos sobre TNF, IL-6 y endotoxinas se describen en las patentes Norteamericanas No. 5,643,875 y 5,753,620 y en la publicación internacional correspondiente No. WO .95/19784 (PCT/US95/01151) , todas las cuales se incorporan aquí por referencia. Se conocen también productos de proteína de BPl que son útiles para el tratamiento de condiciones de enfermedad específicas, tales como meningococcemia en seres humanos (de conformidad con lo descrito en la solicitud Estadounidense mancomunada, copendiente No. de serie 08/644,287 presentada el día 10 de Mayo de 1996, y en la publicación internacional correspondiente No. WO 97/42966 (PCT/US97/08016) , que se incorporan aquí por referencia) , trauma hemorrágico en seres humanos (de conformidad con lo descrito en la solicitud Estadounidense mancomunada, copendiente 'No. de serie 08/862,785, una continuación en parte de la solicitud Norteamericana No. de serie 08/652,292 presentada el día 23 de Mayo de 1996, ahora patente Norteamericana No. 5,756,464, y en la publicación internacional correspondiente No. WO 97/44056 (PCT/US97/08941) , todas las cuales se incorporan aquí por referencia) , lesión por quemadura (de conformidad con lo descrito en la patente Norteamericana No. 5,494,896 y en la publicación internacional correspondiente No. WO 96/30037 (PCT/US96/02349) , ambas se incorporan aquí por referencia) , isquemia/lesión por reperfusión (de conformidad con lo descrito en la patente Norteamericana No. 5,578,568, que se incorpora aquí por referencia) y resección hepática (de conformidad con lo descrito en la solicitud Norteamericana, mancomunada, copendiente, No. de serie 08/582,230 presentada el día 16 de Marzo de 1998, que es una solicitud de continuación del mismo No. de serie presentado el día 3 de Enero de "1996, que a su vez es una continuación de una solicitud Norteamericana No. de serie 08/318,357 presentada el día 5 de Octubre de 1994, que a su vez es una continuación en parte de la solicitud Norteamericana No. de serie 08/132,510 presentada el día 5 de Octubre de 1993, y publicación internacional correspondiente No. WO 95/10297 (PCT/US94/11404) , todas las cuales se incorporan aquí por referencia. Productos de proteína BPl se conocen también por neutralizar la actividad anticoagulante de heparina exógena, como se describe en la patente Norteamericana No. 5,348,942, incorporada aquí por referencia así como por ser útil para el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas tales como artritis reumatoide y reactiva, de conformidad con lo descrito en la patente Norteamericana No. 5,639,727, que se incorpora aquí por referencia, y para inhibir la angiogénesis y para el tratamiento de trastornos asociados con angiogénesis, incluyendo tumores malignos, retinopatía ocular y endometriosis de conformidad con lo descrito en las solicitudes Norteamericanas copendientes, mancomunadas No. de serie 08/435,855, 08/466,624 y 08/466,826, y las publicaciones internacionales correspondientes No. WO94/20128 (PCT/US94/02401) , todas incorporándose aquí por referencia.
Se conocen también productos de proteína BPÍ para su uso en métodos anti-trombóticos, de conformidad con lo descrito en la patente Norteamericana No. 5,741,779 y las publicación internacional correspondiente No. W097/42967 (PCT/US97/08017) , las cuales se incorporan aquí por referencia. Las Patentes Norteamericanas Nos. 5,420,019 y 5,674,834 y la Publicación Internacional correspondiente No. W094/18323 (PCT/US94/01235) , todas las cuales se incorporan aquí por referencia, divulgan que el reemplazo del residuo de cisteína en la posición de aminoácido 132 o 135 con otro aminoácido vuelve el polipéptido BPl resultante resistente a la dimerización y formación de aductos de cisteína. Divulga también la terminación de BPl de terminal N en la posición de aminoácido de BPl 193 resulta en un producto de expresión con una heterogeneidad de terminal carboxi reducido. Es interesante en el reporte presentado en Capodici y Weiss, J, Immunol., 156:4789-4796(1996) que los productos de transcripción/traslación in vitro de DNA que codifica los residuos de aminoácido 1 a 193 (BPI?_?93) y residuos 13 a 193 (BPI13-?93) de BPl madura mostraron una unión dependiente de LPS similar con LPS inmovilizado. Sigue existiendo la necesidad de una técnica de unas preparaciones de producto de proteína BPl biológicamente activas mejoradas, especialmente las preparaciones con una mejor estabilidad, homogeneidad, mejorada y/o activa biológica mayor in vivo. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención ofrece análogos de activación de BPl biológicamente activos novedosos y preparaciones de los mismos que se caracterizan por su estabilidad y homogeneidad mejorados, incluyendo, por ejemplo, resistencia a la dimerización y formación de aducto de cisteína así como heterogeneidad reducida de terminal amino y terminal carboxi del producto recombinante, así como por una actividad biológica in vivo mejorada, propiedades que hacen que estos análogos sean altamente adecuados para usos terapéuticos y de diagnóstico. .Análogos novedosos de remoción de BPl son el producto de la expresión de residuos de aminoácido que codifica ADN de 10 a 193 de BPl humano (SEQ ID NO: 2), en donde la cisteína en la posición 132 ha sido remplazado por un aminoácido diferente, de preferencia un aminoácido no polar, por ejemplo, resina o alanina. En la modalidad preferida, conocida como "rBPI (10-193) " o "rBPI(10-193) ala132", la cisteína en la posición 132 es remplazada por alanina. La invención ofrece además secuencias novedosas codificadas y aisladas de polinucleótidos (por ejemplo, .ADN o ARN) que codifican esos productos de proteína BPl; materiales y métodos para su producción recombinante, incluyen vectores y células huéspedes que comprenden el ADN; composiciones farmacéuticas estables mejoradas que comprenden estos productos de proteína BPl; así como métodos mejorados de tratamiento empleando estas composiciones, ya sea solas o bien administradas de manera concurrente por otros agentes terapéuticos. Se contemplan además el uso de análogos de remoción de BPl de la presente invención en la fabricación de un fármaco para el tratamiento de un paciente que aprovecharía el beneficio de la administración de un producto de proteína BPl . Numerosos aspectos y ventajas adicionales de la invención serán aparentes a los a expertos en al materia al leer la siguiente descripción detallada de la invención, que describe las modalidades actualmente preferidas de la misma. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 representa la elevación de la presión sanguínea, medida en área bajo la curva (AUC) que ocurre después de la administración de rBPI (10-193) C132A o bien rBPI2?. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención ofrece análogos de remoción de BPl novedosos que consisten de residuos de aminoácido 10 a 193 de BPl humana madura (presentada en SEQ ID No: 2) , donde el residuo de cisteína en la posición de aminoácido de BPl 132 es reemplazado por otros aminoácidos, de preferencia un aminoácido no polar, por ejemplo serina o alanina. Una modalidad preferida, en la cual la cisteína en la posición • 132 es reemplazada por alanina, se conoce como rBPI(10- 5 193)C132A o bien rBPI ( 10-193) ala132. El producto de proteína de BPl, rBPI2?, es el producto de expresión de ADN que codifica residuos de aminoácido 1 a 193 de BPl humana madura donde la cisteína en el número de residuo 132 es sustituida por alanina, como se describe en la jÉ 10 Patente Norteamericana No. 5,420,019. Cambios en cuanto a los procedimientos de fermentación empleados para producir BPI2? por métodos recombinantes que permiten la obtención de densidades más altas de células y títulos más elevados de rBIP2? resultaron también en un incremento aparente de la 15 homogeneidad de terminal amino del producto purificado. En algunos experimentos de fermentación, se observó que hasta aproximadamente un 20% de producto codificado era una especie con aminoácido 10-193 de BPl, en vez de los aminoácidos codificados 1-193. Geles de SDS-PAGE de muestra de 20 fermentador de 500 litros en el transcurso de un experimento de fermentación mostraban que esta especie 10-193 apareció en los últimos 2-3 del experimento, con la mayor cantidad apareciendo el día de la cosecha. Una investigación adicional reveló que la incubación de rBPI2i con un homogeneado de 25 células CH0-K1 proporcionó un producto diferido, lo que sugiere que la actividad proteasa asociada con las células estaba involucrada. Para simular la actividad proteasa de manera controlada, rBPI2? fue incubada con aminopeptidasa M y elastasa. La rBPI;: fue resistente a la digestión con aminopeptidasa M, pero la elastasa convirtió rápidamente la rBPI2? en 40% BPl (8-193) Y 60% BPl (10-193). Como se describió aquí, las preparaciones homogéneas estables de rBPI (10-193) C132A fueron producidas de manera proteolítica y por métodos recombinantes. La proteína fue purificada y fue ensayada para determinar su actividad biológica. Se llevaron a cabo experimentos para comparar rBPI (10-193) C132A con rBPI2? en varios ensayos biológicos in vitro, dos modelos de eficacia de animales diferentes y en estudios de características farmacocinéticas y de toxicolpgía. Como se ha descrito en los ejemplo 5-7, rBPI (10-193) C132A y rBPI2? tenían actividades in vitro similares cuando se compararon con ensayos bactericidas de difusión radial y icrodilución en caldo con Escherichia coli J5, un ensayo de difusión radial con una forma de L de Staphylococcus aureus, un ensayo de enlace de competencia de LPS de J5 de E. coli, y en ensayos de neutralización de LPS con células RAW y THP1. Experimentos adicionales descritos en el ejemplo 5 mostraron que rBPI(10-193)C132A pareció ser aproximadamente 2 veces más potente que rBPI21 en un ensayo de enlace de LPS empleando nefelometría de velocidad. De conformidad con lo descrito en el ejemplo, rBPI (10-193)C132A purificada y rBPdi presentaron perfiles de toxicidad similares en un estudio de toxicología de GLP en ratas en dosis de hasta 120 mg/Kg/día durante tres días y características farmacocinéticas similares en ratas en dosis de 2 mg/Kg. Experimentos descritos en el ejemplo 8 mostrarán también que en un modelo de producto de endotoxina de ratón, rBPI (10-193) C132A pareció ser por lo menos dos veces más potente que rBPI21 en dos estudios en los cuales un modelo de ratón de bacteremia letal, rBPI ( 10-193) C132A y rBPI2? fueron similarmente potentes. Además, experimentos in vivo en ratas conscientes, dosis de 40 y 50 mg/Kg de rBPI2? en infusión provocaron una disminución pasajera significativa de la presión sanguínea con relación al control vehículo, mientras que las mismas dosis de rBPI (10-193) C132A no resultaron en una disminución pasajera significativa desde una perspectiva estadística de la presión sanguínea con relación al control. Así, la invención de rBPI (10-193) C1.32A proporciona una reducción del efecto adverso en presión sanguínea en comparación con infusión de rBPI21. La invención contempla además la fusión de rBPI (10-193) C132A con por lo menos una porción de por lo menos otro polipéptido. Ejemplos de tales proteínas de fusión híbridas se describen en la Patente Norteamericana No. 5,643,570 y en la Publicación Internacional correspondiente No W093/23434 (PCT/US93/04754) , que se incorporan aquí por referencia e incluyen proteínas de fusión híbridas que comprenden, en el extremo de terminal amino, una proteína de BPl o un fragmento biológicamente activo de la misma y, en el extremo de terminal carboxi, por lo menos un dominio constante de una cadena pesada de inmunoglobulina o una variante anémica de la misma. La invención contempla además secuencias de polinucleótido purificadas y aisladas (por ejemplo, .ADN o ARN) que codifican los análogos de remoción de BPl novedosos o proteínas de fusión de la presente invención; lectores de expresión que contienen tales polinucleótidos, de preferencia enlace operativo con una secuencia de control de expresión endógena o heteróloga; células huéspedes eucarióticas transfectadas de manera estable o bien transformadas con un vector de ADN o un vector de la presente invención; y métodos para la producción recombinante de los productos de proteína de BPl de análogo de remoción novedoso de la presente invención, por ejemplo, métodos en los cuales una células huésped es cultivada en un medio de nutrimento adecuado y después se aisla por producto de proteína BPl de análogo de remoción de la célula o del medio. Tales secuencias de polinucleótidos o vectores pueden codificar opcionalmente la secuencia líder de BPl de 27 aminoácidos y la señal de poliadenilación de cadena ligera de protón. El análogo de remoción de BPl novedoso producido de manera recombinante de la presente invención puede ser producido de conformidad con lo métodos descritos en la Patente Norteamericana Nc . 5,439,807 y en la Publicación Internacional No. WO 93/23540 (PCT/US93/04752) , que se incorporan aquí por referencia. La Patente Norteamericana No. 5,439,807 divulga métodos para la purificación de productos de proteína BPl recombinantes expresados en células huéspedes de mamífero transfectadas genéticamente en cultivo y secretadas a partir de dichas células en cultivo, y divulga cómo se pueden obtener grandes cantidades de producto de BPl recombinantes adecuados para su incorporación en preparaciones farmacéuticas homogéneas, estables. La presente invención ofrece además unas composiciones farmacéuticas estables mejoradas que comprenden los análogos de remoción de BPl novedoso y métodos de tratamiento mejorados empleando tales composiciones, ya sea solos o bien administrados concurrentemente con otros agentes terapéuticos. Se contempla que tales composiciones puedan emplearse en cualesquiera de los usos terapéuticos conocidos para los productos de proteína BPl, incluyendo los usos terapéuticos comentados arriba. La administración de producto de proteína BPl en general, incluyendo análogos de remoción de BPl, se logra de preferencia con una composición farmacéutica que comprende un producto de proteína de BPl y un diluyente farmacéuticamente aceptable, ayudante o vehículo. El producto de proteína BPl puede ser administrado sin surfactantes conocidos, otros agentes quimioterapéuticos o bien agentes anti-clamidia conocidos, o bien en combinación con tales surfactantes conocidos, otros agentes quimioterapéuticos o bien agentes anti-clamidia conocidos. Una composición farmacéutica estable que contiene productos de proteína BPl (por ejemplo, rBPI23) comprende el uso de proteína BPl en una concentración de un mg/ml en una fórmula de solución salina regulada con citrato (5 o 20 mM de citrato, 150 mM de NaCl, pH 5.0) que comprende 0.1% en peso de poloxámero 188 (Pluronic F-68, BASF, Parsippany, NJ) y 0.002% en peso de polisorbato 80 (Tween 80, ICI Americas Inc., Wilmington, DE o bien JT Baker, Phillipsburg, NJ) . Otra composición farmacéutica estable que contiene productos de proteína BPl (por ejemplo, rBPI2?) comprende el producto de proteína BPl en una concentración de 2 mg/ml en 5mM de citrato, 150mM de NaCl, 0.2% poloxámero 188 y 0.002% polisorbato 80. Tales combinaciones preferidas se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,488,034 y 5,696,090 y en la Publicación Internacional correspondiente No. WO 94/17819 (PCT/US94/01239) , cuyas divulgaciones se incorporan aquí por referencia. Como se describe en la Solicitud de Patente número de serie No. 08/586,133 presentada el 12 de Enero de 1996, que es a su vez una continuación en parte de la solicitud Norteamericana número de serie No. 08/530,599 presentada el día 19 de Septiembre de 1995, que es a su vez una continuación en parte de las solicitudes Norteamericanas número de serie No. 08/372,104 presentada el día 13 de Enero de 1995 y la Publicación Internacional correspondiente Nc. W096/21436 (PCT/US96/01095) , que se incorporan aquí por referencia, se pueden emplear otras formulaciones de poloxémero de productos de proteína de BPl con actividad mejorada. Se pueden administrar las composiciones terapéuticas que comprenden producto de proteína BIP ya sea sistémica o tópicamente. Vías sistémicas de administración incluyen las vías oral y parenteral, incluyendo inyección intravenosa, o subcutánea (incluyendo un deposito para liberación de largo plazo) , intraocular y retrobulbar, intratecal, intraperitoneal (por ejemplo, por lavado intraperitoneal) , intrapulmonar (empleando un fármaco en polvo o bien en la solución de fármaco atomizada) o bien transdérmica. Formulaciones atomizadas mejoradas se describen en la Solicitud de Patente Norteamericana mancomunada, co-pendiente número de serie No. 08/962,217 presentada el día 31 de Octubre de 1997 y a la Publicación Internacional correspondiente No. WO 98/19694 (PCT/US97/19850) , ambas incorporándose aquí por referencia. Cuando se administran de manera parenteral, composiciones de producto de proteína de BPl se inyectan generalmente en dosis que se ubican dentro el mismo rango de un 1 µg/Kg a 100 mg/Kg por día, de preferencia en dosis que se ubican dentro del mismo rango de 0.1 mg/Kg a 20 mg/Kg por día, con mayor preferencia en dosis que se ubican entre el mismo rango de 1 5 a 20 g/Kg/día y con mayor preferencia en dosis que se ubican dentro del mismo rango de 2 a 10 mg/kg/día. El tratamiento puede proseguir mediante infusión continúa o inyección o infusión intermitente, en la misma dosis, una dosis reducida 0 una dosis incrementada por día durante, por ejemplo, uno a jj 10 tres días, y 'además de conformidad con lo determinado por el médico tratante. Cuando se administran de manera intravenosa, los productos de proteína de BPl se administran de preferencia mediante una breve infusión inicial seguido por infusión continua. El régimen intravenoso preferido es una 15 infusión intravenosa breve de 1 a 20 mg/kg de producto de proteína BPl seguido por una infusión intravenosa continua en una dosis de 1 a 20 mg/kg/día, durante hasta una semana. Un régimen de dosificación intravenosa particularmente preferido es una breve infusión intravenosa inicial de 1 a 4 mg/kg 20 seguida por una infusión intravenosa continua en una dosis de 1 a 4 mg/kg/día durante hasta 72 horas. Vías tópicas incluyen administración en forma de ungüentos, cremas, geles, gotas oftálmicas (de conformidad con lo descrito en la Solicitud de Patente Norteamericana 25 mancomunada, co-pendiente número de serie No.08/557, 289, presentada en día 14 de Noviembre de 1995 y Patente Norteamericana No. 5,686,414 y Publicaciones Internacionales correspondientes Nos. WO 97/17990 (PCT/US96/18632) y WO 97/17989 (PCT/US96/18416) , que se incorporan aquí por referencia) , gotas para los oídos, supositorios, fluidos de irrigación (por ejemplo, para la irrigación de heridas) y shampues con fármacos. Por ejemplo, para la .administración tópica en forma de gotas, se puede aplicar de aproximadamente 10 a 200 µL de composición de producto de proteína BPl una o varias veces al día según por lo determinado por el médico tratante. Los expertos en la materia podrán optimizar fácilmente las dosificaciones efectivas y los regímenes de administración para composiciones terapéuticas que comprenden producto de proteína BPl, de conformidad con lo determinado por la buena práctica médica y la condición clínica del paciente individual . Otros aspectos y ventajas de la presente invención se entenderán tomando en cuenta los siguientes ejemplos ilustrativos. El ejemplo 1 se enfoca hacia la construcción de un vector de expresión, de pING1742, que codifica rBPI(10-193)C132A. El ejemplo 2 se enfoca hacia la transformación de células CHO con pING1742 y la selección de clones de mayor producción que secretan rBPI (10-193) C132A. El ejemplo 3 se enfoca hacia la producción y purificación de rBPI(10- 193)C132A en termentadores de 2 litros y 500 litros. El ejemplo 4 se enfoca hacia la caracterización bioquímica de rBPI (10-193) C132A y rBPI::. Los ejemplos 5, 6 y 7 se enfocan respectivamente hacia la actividad de enlace LPS in vivo en un ensayo de enlace de composición y en un enlace de medición de velocidad de producción empleando nefelometría de velocidad, actividad bactericida, y actividad de neutralización de LPS de rBPI (10-193) C132A en comparación con rBPI2?. El ejemplo 8 se enfoca hacia la actividad in vivo de rBPI (10-139)C132A. EJEMPLO 1 CONSTRUCCIÓN DEL V?CTOR DE EXPRESIÓN PING1742 El vector de expresión de rBPI (10-193) C132A, pING1742, fue construido de la siguiente manera. El vector de expresión pING4155 fue construido primero mediante la unión de un fragmento BamHI-Bsal que contiene el gen neo de pING3174 con un fragmento de Bsal -Xhol que contiene el conductor de CMV y el gen de rBPI2i a partir de pING4144 y un fragmento de Xhol - BamHI que contiene la región no trasladada 3' de cadena ligera de ratón (kappa) de pING4537 (Ping3174, pING4144 y pING4537 se describen en la Patente Norteamericana No. 5,420,019, que se incorpora aquí por referencia). El vector pING4155 resultante contiene el gen que codifica rBPI2i fusionado sobre el incrementador de IgG humano, el promotor de CMV humano y la región de trasladado 3' de cadena ligera de ratón (kappa) . Contiene también el gen neo que codifica neomicinfosfotrasferasa, portador de selección de transfectantes resistentes al antibiótico de Genéticin® (G418) . El vector pING1732 fue producido mediante la remoción del fragmento HindIII-HindIII de 0.7 kbp de pING4155 que contiene el incrementador de Ig humano. Después los 27 nucleótidos que codifican los aminoácidos 1 a 9 de la porción madura de rBPI2? y los removidos de pING1732 mediante empalme de mutagénesis de reacción en cadena de polimerasa empleando los siguientes iniciadores : Iniciador 1: 5' -CTGCTCTAAAAGCTGCTGCAG-3' (SEQ ID No: 3) Iniciador 2: 5' -CCAGGCCCTTCTGGGAGGCCGCTGTCACGGCGG-3' (SEQ ID No: 4) Iniciador 3: 5' -GCCGTGACAGCGGCCTCCCAGAAGGGCCTGGAC-3' (SEQ ID No: 5) Iniciador 4: 5' -CTGGGAACTGGGAAGCTG-3' (SEQ ID No: 6) Iniciadores complementarios de empalme 2 y 3 incorporaron la remoción de 27 pares de bases de los nucleótidos que codifican los aminoácido 1 a 9, mientras que los iniciadores 1 y 4 codificaron nucleótidos inmediatamente corriente arriba y corriente abajo, respectivamente, de los sitios SalJ y EcoRI en pING1742. Primero, se obtuvieron fragmentos por amplificación por reacción en cadena de polimerasa empleando la combinación de iniciadores de oligonucleótidos 1 y 3, e iniciadores 2 y 4. Después de la obtención de estos fragmentos individuales, fueron fusionados, extendidos y reamplificados empleando iniciadores 1 y 4. Este fragmento amplificado puede ser digerido con Sal í y EcoRI y clonado en pING1742 digerido con Sal I-EcoRI par generar el plásmido pING1742. Para confirmar la ausencia de mutaciones durante la reacción en cadena de polimerasa, se sometió la región Sal I-EcoRI de pING1742 ha secuenciación. No se observaron cambios en la región de codificación madura para BPl. Si embargo, se encontró un cambio de dos pares de bases (ACC->GCT) en el ADN que codifica la secuencia de señal, lo que resulto en la conversión de un Thr en un Ala en la posición de aminoácido -6 con relación al inicio de la secuencia e proteína madura. EJEMPLO 2 TRANSFORMACIÓN DE CÉLULAS CHO CON PING1742 Se adaptaron células CHO-K1 (American Type Culture Collection (ATCC) número de acceso CCL61) admitido en medio Ex-cell 301 exento de suero de la siguiente manera. La célula CHO-K1 cultivadas en medio F12 de Ham fueron tripsinizadas, centrifugadas y resuspendidas en medio Ex-Cell 301. Las células fueron cultivadas en un frasco de 125 ml a 100 revoluciones por minuto y pasadas cada 2 o 3 días en frasco de 125 ml o bien de 250 ml . Esta células CHO adaptadas para Ex-cell 301 pero transfectadas por electroporación con pING1742. Antes de la transfección, pING1742 fue digerido con Notl, que lineariza el plásmido. Después de una recuperación de 48 horas, las células fueron colocadas en platos a aproximadamente 104 células/pozo en placas de 96 pozos que contienen medio Ex-cell 301 complementado con 0.6 mg/mL de G418 (Life Technologies, Gaithersburg, MD) . Aproximadamente a las dos semanas, se tamizaron sobrenadantes de aproximadamente 250 pozos que contenían colonias, mediante ELISA, para determinar la presencia de proteína reactiva con BPl empleando un anticuerpo monoclonal anti-BPI . Quince clones que tenían los niveles de expresión más altos fueron transferidos a placas de 24 pozos que contenían medio Ex-cell 301. Para efectuar un tamizaje para determinar la productividad, las células fueron cultivadas en placas de 24 pozos que contenían medio Ex-Cell complementado con 2% de FBS y 40 µL de células de S-Sepharose estériles durante 10 días, después de los cuales las perlas fueron removidas, lavadas con amortiguador con bajo contenido de sal (NaCl 0.1M en lOmM de acetato de Na, pH 4.0) y la BPl fue eluída con NaCl 1.5 M en el mismo amortiguador. Los niveles de rBPI (10-193) C132A secretada fueron determinados por ELISA. Análisis Western blot de eluídos tratados en un gen de SDS no reductor al 12% revelaron una bada prominente que migró ligeramente más rápidamente que rBPI2?.
Los ocho productores superiores fueron transferidos a frascos Erlenmeyer de 125 ml estériles y cultivados en un medio Ex-Cell. Estas células fueron evaluadas otra vez para productividad cultivándolas en frascos que contienen un medio Ex-Cell 301 complementado con FBS 12% y 1% de perlas de S-Sepharose estériles (volumen/volumen). rBPI (10-193) C132A fue eludía a partir de perlas de S-Sepharose que habían sido incorporadas en el medio de cultivo y los niveles de rBPI(10-193)C132A fueron determinados por HPLC. Se escogió el clon 139, que se encontraba entre los productores mayores, para cultivo adicional y producción de producto. EJEMPLO 3 PRODUCCIÓN Y PURIFICACIÓN DE RBPI (10-193) C132A Grandes cantidades de rBPI (10-193) C132A fueron producidos para caracterización mediante el cultivo de células del clon 139 en fermentadores de investigación de dos litros (Biolafitte, ST. Germain en Laye, Francia) y después en un fermentador ABEC de 500 litros (4ABEC, Allentown, PA) . El producto de proteína obtenido a partir de los termentadores de 2 litros fue empleado para los estudios in vitro descritos abajo, mientras que el fermentador obtenido de 500 litros fue empleado para estudios de eficacia y toxicología en animales. A. Cultivo en fermentadores de dos litros Células de clon 139 fueron pasadas en frascos giratorios de volúmenes crecientes que contenían un medio Ex-cell complementado con FBS al 1% hasta lograr un volumen y densidad celular suficientes para inocular los bioreactores de dos litros a razón de aproximadamente de 2 X 103 células/ml. Las células fueron cultivadas en tres fermentadores de 2 litros en medio Ex-cell complementado con FBS al 1%, a una temperatura de 37° C, pH 7.2, 150 revoluciones por minuto con oxigeno disuelto mantenido a 5-10%. Se agregaron perlas de SP-Sepharose estériles grandes (Pharmacia and Upjohn, Piscataway, NJ) a 1.5% (volumen/volumen) . El nivel inicial de glucosa fue de aproximadamente fue de 3.5 g/L y la glucosa fue pulsada diariamente a 3 g/L durante el trascurso del experimento. La fermentación fue terminada a 238 horas, en dicho momento las viabilidades de la célula fueron de 63%, 80% y 84%. Después de la fermentación, se cosecharon las perlas de cada fermentador, se permitió su asentamiento y se lavaron varias veces con 10 mM de fosfato de Na/NaCl 0.15 M, pH 7.0, para remover los componentes celulares y las impurezas débilmente unidas 'de las perlas. Las perlas lavadas fueron empacadas en una columna, lavadas con 10 M de fosfato de Na, NaCl 0.25 M, pH 7.0 y eluída con el mismo amortiguador que contenía NaCl 0.8 M, 5mM de glicina. El producto eluído fue después diluido con 3 volúmenes de agua estéril para inyección (WFI), cargado en una columna CM-spherodex (Sepracor, Marlborough, MA) y lavado con 10 mM de fosfato de Na, NaCl 0.25 M, pH 7.0, seguido por 20 Mm de acetato de Na, NaCl 0.2 M, pH 4.0, seguido por 20 mM de acetato de Na, NaCl 0.3 M, pH 4.0, y la muestra fue eluída a Nací 0.1 M en el mismo amortiguador. Después de concentración en una membrana Centricon con corte de 10,000 MW (.Amicon, Beverly, MA) , el producto eluído de la columna CM fue cargado en una columna Sephacryl S-100 (Pharmacia and Upjohn) equilibrada con 5mM de citrato Na, NaCl 0.15 M, pH 5.0. fracciones que contenían rBPI (10-193) C132A identificadas por absorbencia a 280 nm fueron combinadas, concentradas en un filtro .Amicon a 1.9 mg/mL y formuladas con 0.002% de polisorbate 80 (JT Baker,. Phillipsburg, NJ) , 0.2% de poloxámero 188 (Pluronic F-68, BASF, Parsippany, NJ) . La separación final fue esterilizada empleando un filtro de 0.2 µm. B. Cultivo en fermentador de 500 litros Células de clon 139 fueron pasadas en un medio Ex-cell exento de fetuina con FBS al 1% de una serie de frascos giratorios de volúmenes crecientes para proporcionar inoculo para el frasco giratorio Bélico 35L (Bélico Glass, Vineland, NJ) , que a su vez proporcionó el inoculo para el fermentador 4ABEC de 500 litros. Se cultivaron células en medio Ex-cell completo sin fetuina pero complementado con FBS al 1%, glucosa adicional (a 10 g/L) y glutamina (a 10 mM) . El fermentador fue operado en un modo de alimentación por lotes con impulso de complemento Primatones RL 0.5% y un impulso de glucosa/glutamina agregado durante el experimento. Se agregaron de cinco a seis litros de perlas de SP-Sepharose grandes 24 horas después de la inoculación del fermentador de 500 litros. El pH fue controlado manualmente con 10% de bicarbonato de sodio a un pH de 7.0, se controló el oxígeno a 5% y la temperatura a 37%. Se mantuvo la agitación a 25 revoluciones por minuto con dos impulsores de tres aspas. El experimento de fermentación terminó a la 184 horas, en este momento la viabilidad celular era del 90%. De conformidad con lo descrito arriba para la fermentación en recipiente de dos litros, se permitió el asentamiento de las perlas después de fermentación y después se lavó varias veces con un amortiguador de fosfato con bajo contenido de sal (0.1 M) . Los pasos para esta purificación fueron similares a los descritos arriba para las muestra de 2 litros excepto que se incluyó un paso de desactivación viral a un pH de 3.0 después de elusión a partir de las perlas de S-Sepharose y se incluyó una segunda columna CM-spherodex como un paso de concentración. Para la segunda columna CM, el producto eluído fue diluido con 3 volúmenes de WFI, el pH fue ajustado a 5.0, la columna fue equilibrada y lavada con 20 Mm de acetato, NaCl 0.3 M, pH 5.0, y la muestra fue eludía a NaCl 1.0 M en el mismo amortiguador. Se eluyó rBPI (10-193) C132A a partir de la columna Sephacryl S-100 en 5Mm de citrato de Na, NaCl 0.15 M, pH 5.0, se ajustó a 2 mg/mL, y se filtró a través de un filtro de 0.2 µm. Se formuló rBPI (10-193) C132A con 0.002% de polisorbate 80, 0.2% de poloxámero 188, se filtró de manera estéril, y se llenó en frascos de suero de vidrio de tipo I de 100 mL. EJEMPLO 4 CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA DE rBPI ( 10-193) C132A A. Proteína proveniente de fermentación en recipiente de 2 litros El producto de rBPI (10-193) C132A purificado a partir del ejemplo 3 fue observado como una banda única que migro ligeramente más rápidamente en SDS-electroforesis en gel poliacrilamida (SDS-PAGE) que la banda de r3PI21, lo que es consistente con la remoción de nueve aminoácidos de terminal N de rBPI2?. Un análisis de secuencias demostró que rBPI(10-193)C132A contenía la secuencia de terminal N predicha de SQKGLDYASQQGTAALQKEL . Al efectuarse un análisis de espectroscopio de masa (ESI-MS) se observaron dos componentes, una con una masa de 20,470 daltones' que es consistente con una masa predicha de 20,472 daltones para rBPI (10-193) C132A, y un segundo componente con una masa de 20,255 daltones, lo que es consistente con la masa predicha de 20,258 daltones para rBPI (10-191) . Los perfiles de HPLC de intercambio de iones (Hewlett Packard, modelo 1050, Palo Alto, CA) de rBPI (10-193) C132A y rBPI21 presentan ambos picos individuales con tiempos de retención similares.
B. Proteína a partir de recipiente de fermentación de 500 litros Al efectuarse un experimento SDS-PAGE, la rBPI (10-193) C132A fue una banda única que migró ligeramente más rápidamente que 5 la banda rBPdi. Al efectuarse una espectroscopia de masa, se observó un componente principal con una masa de 20,471 daltones, lo que es consistente con la masa predicha de 20,474 Da para rBPI (10-193) C132A, y dos componentes menores con una masa de 20, 668 daltones, lo que es consistente con la ^k 10 adición de N-acetilhexosamina (masa predicha: 20,677 daltones) y una masa de 20,843 daltones, lo que es consistente con la adición de N-acetilhexosamina más hexosa (masa predicha: 20,839 daltones). Un componente similar con de N-acetilhexosamina agregada se observa de manera rutinaria 15 durante la producción de rBPI21. En HPLC de fase reversa (Shimadzu, Kyoto, Japón), tanto rBPI (10-193) C132A como rBPI2? se eluyeron en forma de un pico * principal y un pico menor. Sin embargo, los picos de rBPI (10-193) C132A se eluyeron ligeramente antes que los picos de 20 rBPI2? correspondientes en el control. El pico menor en el perfil de rBPI (10-193) C132A representa con mayor probabilidad las formas glicosiladas identificadas en el espectro de masa. Los perfiles de HPLC de intercambio de iones de rBPI (10-193) C132A y rBPI2i presentaron ambos tipos únicos con tiempos de 25 retención similares.
Se efectúo un análisis del mapeo tríptico de conformidad con métodos convencionales. Se trató primero rBPIi o rBPIdO-193)C132A precipitada en acetona con ditiotreitol (DTT) seguido por yodoacetamida y después con tripsina. Bel producto tratado con tripsina fue analizado por HPLC (Beckman modelo 126) con una columna C18 (Beckman Ultrasphere) . En rBPI;;, se observan dos fragmentos trípticos de terminal N (TI y Ala-Tl) que resultan de una disociación imprecisa de la secuencia líder. Como predicho, el mapa tríptico de rBPI(10-193)C132A fue similar a rBPdi excepto que los fragmentos de terminal N faltaban. EJEMPLO 5 ACTIVIDAD DE ENLACE CON LPS IN VITRO DE rBPI ( 10-193) C132A A. En un ensayo de enlace de competencia Se evaluó en un envase de ensayo de competencia, la capacidad de rBPI (10-193) C132A producida de conformidad con el ejemplo 3A y rBPI21 para competir con rBPI2? marcada para enlace con LPS. En resumen, una concentración fija (0.5 nM) de rBPI2i marcada con 125I fue mezclada con rBPI2i no marcada o bien rBPI (10-193) C132A no marcada en diluciones que se ubicaban dentro de un rango 5µM a 0.01 nM en DMEM que contenía amortiguador HEPES y albúmina sérica bovina (BSA) [U.S. Biochemicals, Cleveland, OH] y 100 µL de la mezcla se agregaron a pozos de placa Immulon-II prerrevestidas con 2.5 µg/mL de LPS de J5 de E.coli (Calbiochem, San Diego, CA) . Las placas fueron incubadas a una temperatura de 4° C durante 5 horas y lavadas 3 veces con el medio DMEM. 75 µL de NaOH 0.1 N se agregaron y se removió y contó rBPI2? marcada con i25I unida. Los resultados demostraron que ambas proteínas competían de manera similar con rBPI2? radiomarcada. B. En un ensayo medición de la velocidad de formación de complejos Se comparó la actividad de enlace con LPS de rBPI (10-193) C132A con rBPI2i empleando nefelometría de velocidad. Este enfoque para evaluar el enlace de rBPI2? con LPS mide la velocidad de incremento de la dispersión de la luz como resultado de formación de complejos productos de LPS-proteína BPl en solución. Todos los experimentos fueron efectuados con un nefelómetro de velocidad Beckman Array 360 que mezcla automáticamente muestras, mide la dispersión de la luz y lleva a cabo cálculos de velocidad. Experimentos previos emplean este enfoque examinaron especies y concentraciones óptimas de LPS, especificidad de ensayo, capacidad de reproducción de ensayo así como correlación de resultados de ensayos con ensayos bactericidas. Se observó que LPS de J5 de E. coli y lípido A formaban complejos con rBPI2? que podían ser medidos en el nefelómetro, pero LPS de E.coli 0111:B4 no formo complejos medibles. Con base en resultados de estos estudios, se escogió LPS de J5 de E. coli para su uso en una concentración (en la célula de flujo) de 49.4 a 61.7 µg/mL según el lote de LPS, en combinación con concentraciones de rBPI2? (en la célula de flujo) de 5 a 30 µg/mL. El rango de concentración de rBPI:: óptimo, que debe ser determinado para cada lote LPS, fue de aproximadamente 15 a 25 µg/mL lo que represento la porción más lineal de la curva. El rango óptimo para los valores de velocidad de agregación (Temperatura .Ambiente) fue de 700 a 2000. concentraciones menores de rBPI2? fueron requeridas para lograr los mismos valores de velocidad de agregación cuando se cambio el amortiguador de formulación para incluir PLURONIC P103 o bien cuando se incremento la concentración de NaCl. La adición ya sea de proteína de enlace de polisacárido recombinante (rLBP50) que se une con LPS, o bien heparina que se une con productos de proteína BPl inhibió la formación de agregados rBPI21-LPS lo que demuestra la especificidad de la interacción. Se confirmó la capacidad de reproducción de ensayo por pruebas de lotes múltiples de BPl y pruebas del mismo lote de rBPI2? varias veces. .Análisis nefelométrico de muestras rBPI?? habían sido parcialmente desactivados por tratamiento a una temperatura de 45° C durante una semana y se correlacionaron bien con los análisis de ensayos bactericidas de microdilución de caldo con células J5 de E.coli . Se efectuaron experimentos de nefelometría que comparan rBPI (10-193) C132A y rBPI2i de la siguiente manera. LPS sonicado [LPS de J5 de E.coli lote No. 30119B de List Biochemicals] y rBPI (10-193)C132A o bien rBPI2? [ambas formuladas en 0.2% PLURONIC F68 (poloxámero 188), 0.002% TWEEN 80 (polisorbate 80), 5 M de citrato, pH 5.0, 150 mM NaCl] fueron diluidas directamente en amortiguador de PBS (complementado con PEG) suministrado por Beckman. La concentración de LPS fue fijada mientras que la concentración de producto de proteína BPl varió dentro de cada experimento. Se probaron, dios concentraciones de LPS: 24.7 y 49.4 µg/mL de LPS. Cada reacción fue iniciada mediante la adición a 600 µl de amortiguador PBS-PEG hacia la célula de flujo seguido por 42 µl de disolución de producto de proteína BPl. Después del establecimiento de una línea basal, se agregaron 42 µl de la solución de LPS de J5 de E.coli. Después de la adición del último componente, el nefelómetro mide la velocidad de formación de complejos con base en la magnitud de la dispersión de la luz. Los datos fueron analizados dividiendo los valores RT para cada muestra de prueba que contenía una concentración dada de producto de proteína BPl por los valores de RT correspondientes para el estándar con el objeto de generar un porcentaje de valor de control. Para cada concentración de producto de proteína BPl probada, se determinó la velocidad máxima de agregación y se generó una curva. Solamente puntos hacia la izquierda del valor máximo (punto de equivalencia) se emplearon para el análisis comparativo con varias muestra de producto de proteína BPl. La actividad relativa de las muestras puede ser medida comparando los valores de RT para prueba y lotes estándares en la región lineal de las curvas. Se puede emplear o bien un enfoque de punto a punto o bien un enfoque de ajuste de curva. Además de probar rBPI ( 10-193) C132A purificada y rBPI2? purificada [que contiene aproximadamente 7.8% de rBPI (10-193) C132A] , se evaluó una mezcla igual de estas proteínas así como una preparación de rBPI2? con 16% de rBPI (10-193) C132A (a 49.4 µg/mL de LPS solamente). Los resultados demostraron que 'a 49.4 µg/mL de LPS rBPI ( 10-193) C132A logró velocidades de agregación similares a las velocidades de rBPI2? en una concentración aproximadamente 255 menor. rBPI (10-193) C132A logró también una velocidad de agregación máxima más elevada que la de rBPI2? tanto a 24.7 como a 49.4 µg/mL de LPS. Una mezcla igual de las dos moléculas proporcionó una curva que pasó entre rBPI2? y rBPI (10-193) mientras que los lotes de rBPIci con 7.8% y 16% de 10-193 se comportaron de manera idéntica entre ellos. Un análisis de punto a punto de los resultados (LPS a 49.4 µg/mL) reveló que rBPI (10-193) era aproximadamente dos veces más potente que rBPI2? en este ensayo. EJEMPLO 6 ACTIVIDAD BACTERICIDA IN VITRO DE rBPI ( 10-193) C132A Todos los ensayos en este ejemplo se efectuaron con rBPI(10-193)C132A producido en los fermentadores de 2 litros de conformidad con el ejemplo 3A. A. Efecto sobre E.coli en un ensayo de difusión radial Este ensayo de difusión radial comparó el efecto bactericida de rBPI (10-193) C132A y rBPI2? purificadas sobre la cepa J5 de E.coli que es un mutante "áspero" de UDP-galactosa-4-epimerasa de la cepa suave de E.coli 011B4, y es relativamente sensible a rBPI2?. Células de cepa J5 de E.coli (Mannion et al., J. Clin. Invest., 85:853-860 (1990); List Biological Laboratories, Campbell, CA) fueron cultivadas hasta una fase exponencial, centrifugadas y lavadas dos veces en 10 mM de fosfato de Na, pH 7.4, y se agregaron a una concentración final de aproximadamente 1 x 10b CFU/ml a agarosa derretida complementada con caldo de soya Trypticase Soy Broth (TBS, DIFCO Laboratories, Detroit, MI), 10 mM de fosfato de Na. Pozos de 3mm de diámetro fueron preparados en la agarosa endurecida y se agregaron a los pozos 5 µL de rBPI2? o rBPI (10-193) C132A diluida en serie. Las placas fueron incubadas a una temperatura de 37° C durante 3 horas para permitir la difusión, y después se agregó un recubrimiento de agarosa derretida que contenía 6% de TSB. Las placas fueron incubadas durante la noche a una temperatura de 37° C y se gráfico el área neta de inhibición contra la concentración.
Los resultados demostraron que rBPI (10-193) C132A y rBPI2? se comportaron de manera similar en este ensayo. B. Efectos sobre la forma L de S aureus en un ensayo de difusión radial Este ensayo de difusión radial comparó el efecto de bactericida de rBPI (10-193) C132A y rBPI2? purificadas en las bacterias gram positivas S aureus cultivadas como formas L sin sus paredes celulares. Como se describe en la patente Norteamericana No. 5,578,572, que se incorpora aquí por referencia, las células de forma L de S. aureus fueron cultivadas hasta fase logarítmica en caldo de infusión de corazón (Hl) complementado con 3.5% de NaCl, lOmM de CaCd y 1000 U/mL de penicilina G. Las células fueron diluidas hasta aproximadamente 5 x 104 o bien 5 x 10° células/Mi en agarosa derretida al 0.8% que contenía el medio Hl complementado con NaCl, y se vaciaron 8 ml de la suspensión de células/agarosa en placas de lOcm. Se prepararon pozos de 3 mm de diámetro y se agregaron 5µl de rBPI2i o bien rBPI (10-193) C132A diluida en serie. Las placas fueron incubadas a una temperatura de 37° C durante 24 horas, y el área neta de inhibición fue graficado contra la concentración. Los resultados demostraron que tanto rBPI2? como rBPI (10-193) C132A inhibieron el crecimiento de las formas L de S. aureus en densidades de células de aproximadamente 5 x 104 o bien 5 x 105 de manera similar en este ensayo.
C. Efecto sobre la cepa J5 de E.coli en un ensayo de microdilución en caldo Este ensayo de microdilución en caldo comparó el efecto bactericida de rBPI (10-193) C132A y rBPI2? purificadas sobre la cepa J5 de E.coli. células de la cepa J5 de E.coli fueron cultivadas durante la noche en caldo de extracto de levadura Tryptone (TYE) y después hasta la fase logarítmica en medio TEA de conformidad con lo previamente descrito por Horwitz et al., Infect. Immun., 63:522-527 81995). Las células fueron incubadas aproximadamente 1 x 104 y 1 x 105 células/mL en caldo de infusión de corazón (Hl), y se agregaron 95 µl a placas de 96 pozos. Cinco µl de varias diluciones de rBPI (10-193) C132A y rBPI2?, preparadas en amortiguador de formulación, fueron agregadas a cada pozo y las placas fueron incubadas a una temperatura de 37° C durante 24 horas. Los resultados demostraron que rBPI (10-193) C132A y rBPI2? tienen actividades similares en estos ensayos. EJEMPLO 7 ACTIVIDAD DE NEUTRALIZACIÓN DE LPS IN VITRO DE rBPI(10- 193)C132A El ensayo en la sección A de este ejemplo se llevo a cabo con rBPI (10-93) C132A producida en los fermentadores de 2 litros de conformidad con el ejemplo 3A, mientras que el ensayo en la sección B de este ejemplo se llevo a cabo con rBPI(10-193)C132A producida en el fermentador de 500 litros e conformidad con el ejemplo 3B. A. Actividad en un ensayo de proliferación de células RAW El ensayo de proliferación de células RAW se empleó para compara la actividad de neutralización de rBPI2? y rBPI(10-193)C132A. En este ensayo, LPS inhibe la proliferación de células RAW y rBPI2? neutraliza este efecto de LPS. Células RAW 264.7 de ratón (número de acceso AATCC: T1B71), mantenidas en un medio RPMI 1640 (GIBCO) , complementado . con 10 mM de amortiguador HEPES (pH 7.4), 2mM de L-glutamina, penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 µg/mL), 0.075% de bicarbonato de sodio, 2-mercaptoetanol 0.15M y 10% de suero bovino fetal (Hyclone, Inc., Logan, UT) , fueron inducidas primero por incubación en presencia de 50 U/mL de ?-interferón de ratón recombinante (Genzyme, Cambridge, MA) durante 24 horas antes del ensayo. Las células inducidas fueron después recogidas mecánicamente y centrifugadas a 500 x g a una temperatura de 4° C, después suspendidas en 50 L de medio RPMI 1640 (sin complemento) , re-centrifugadas y re-suspendidas a través en medio RPMI 1640 (sin complemento) . Las células fueron contadas, su concentración fue ajustada a 2 x 105 células/mL, y se agregaron alícuotas de 100 µL a cada pozo de una placa de 96 pozos. Las células fueron después incubadas durante aproximadamente 15 horas con LPS de E. coli oll3 (Estándar de Control, Asociación de Cape Code, Woods Hole, MA) , que se agregó en alícuotas de 100 µL/pozo a una concentración de 1 ng/mL en medio RPMI 1640 exento de suero desta concentración es el resultado de experimentos de titulación en donde la concentración de LPS fue variada entre 50 pg/mL y 100 ng/mL) . Esta incubación se llevo a cabo en la ausencia o presencia de rBPI2? o rBPI (10-193) C132A en concentraciones variables entre 25 ng/mL y 50 µg/mL. rBPI2? humana recombinante, que se conoce también como rBPI2? ?cys, que es rBPI 1-193 con alanina sustituida en la posición 132 por cisteína (ver Patente Norteamericana mancomunada No. 5,420,019) se agregó como control positivo en una concentración de 1 µg/ml. Se midió cuantitativamente la proliferación de células mediante la adición de 1 µCi/pozo [3H] -timidina 5 horas después del tiempo de inicio del ensayo. Después de la incubación de 15 horas, las células marcadas fueron cosechadas en filtros de fibra de vidrio con un cosechador de células (Inotech Biosystems, INB-384, Sample Processing and Filter Counting System, Lansing, MI.). La inhibición mediada por LPS de la proliferación de células RAW 264.7 depende de la presencia de LBP, según lo agregado a la mezcla de reacción ya sea como componente de suero o bien como LBP recombinante (como una concentración de 1 µg/mL) . En estos experimentos, tanto rBPI2? como rBPI (10-193) C132A inhibieron de manera similar la inhibición mediada por LPS de la proliferación de células RAW.
B. Actividad en el ensayo de inhibición TNF Se empleó un ensayo de inhibición de factor de necrosis tumoral (TNF) para comparar la actividad de neutralización de LPS in vitro de rBPI21 y rBPI (10-193) C132A. En este ensayo, el LPS, en combinación con LBP purificada (o bien LBP que contiene sueros) estimula la síntesis de TNF por células THP-1 (una línea de células- de monocito humano) y rBPI2? neutraliza este efecto de LPS . Células THP-1 (número de acceso ATCC No: TIB-202) fueron mantenidas en RPMI (GibcoBRL, Gaithersburg, MD) con FBS al 10% y fueron cultivadas en RPMI con FBS al 10% más 50 ng/mL de 1,25 deshidroxi vitamina D (BIOMOL Research Laboratories Inc. PIymouth Meeting, PA) durante tres días ates del tratamiento con LPS para inducir la expresión de CD14. Antes e la inducción con LPS las células fueron lavadas con RPMI y suspendidas ya sea en RPMI con FBS al 10% o bien en medio exento de suero [RPMI complementado con 1% de HB101 (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) ] . La expresión de TNF fue inducido con 1 ng/ml de LPS de E. coli 0128 (Sigma, St. Louis, MO) en placas de 96 pozos con aproximadamente 5 x 104 células por pozo. Las placas fueron incubadas durante tres horas a una temperatura de 37 °C, 5% de C02 y después se removió una alícuota del líquido sobre nadante y se ensayo para TNF a través del ensayo de toxicidad de WEHI 164, empleando CellTiter 96™ AQ (Promega Corp., Madison, Wl) para monitorear la viabilidad celular. TNFa humano recombinante (Genzyme Diagnostics, Cambridge, MA) se empleó como estándar positivo. Tanto rBPI ? como rBPI ( 10-193) C132A inhibieron de manera similar la estimulación inducida por LPS de la síntesis de TNF. EJEMPLO 8 ACTIVIDAD BIOLÓGICA IN VIVO DE rBPI ( 10-193) C132A Los ensayos in vivo descritos a continuación fueron efectuados empleando rBPI (10-193) C132A purificada producida en el fermentador de 500 litros de conformidad con el ejemplo 3B. A. Estudio de toxicidad en ratas Se compararon perfiles de toxicidad de rBPI2? y rBPI(10-193)C132A en ratas. En este estudio, grupos de seis ratas Sprague-Dawley machos y seis ratas hembras recibieron ya sea el vehículo (amortiguador de formulación), dosis bajas (50 mg/Kg/día) o bien dosis altas (120 mg/Kg/día) ya sea de rBPI2? o rBPI (10-193) C132A. Las dosis fueron administradas por infusión intravenosa continua a través de un catéter femoral permanente durante tres días consecutivos a un régimen de infusión de 4.2 mL/Kg/hora (100 mL/Kg/día) . Se registraron observaciones clínicas por lo menos dos veces al día y los pesos corporales fueron registrados diariamente. Se tomaron muestras de sangre y orina cerca del final para evaluaciones de hematología, química clínica y análisis de orina. Al final, los órganos fueron pesados y los tejidos recogidos mediante examen histopatológico. No hubo fallecimientos ni efectos colaterales significativos. Los datos indicaron perfiles de toxicidad similares para rBPI2? y rBPI(10-193)C132A cuando se administraron por medio de infusión continua. b. Características farmacocinéticas Las características farmacocinéticas de rBPI2? y rBPI(10-193)C132A a 2 mg/Kg se investigaron en las ratas. Las depuraciones plasmáticas de rBPI2? y rBPI (10-193) C132A fueron bien descritas mediante una función de disposición farmacocinética y exponencial. No se determinaron diferencias estadísticas en cuanto a los parámetros farmacocinéticos entre los productos de rBPI (prueba de rango de Wicoxon no paramétrica, p<0.005). La mayor parte del fármaco administrado (más que el 96%) fue depurada con una vida media de fase alfa de 0.2-0.4 minutos y una vida media beta de 3.9 a 4.3 minutos, mientras que el resto fue depurado durante la fase gama con la vida media de 27-33 minutos. El volumen de distribución del compartimiento central (Ve) fue de 41-45 mL/Kg, y el régimen de depuración (CL) fue de 24-30mL/minutos/Kg. El volumen de estadio de equilibrio de distribución fue de 152-184 mL/Kg. C. Eficacia en cuanto á reto de endotoxina en ratón Se efectuaron dos estudios separados para examinar las potencias revertidas de rBPI2? y rBPI ( 10-193) C132A en un modelo de ratón de endotoxemia letal generalmente de conformidad con Ammons et al., en "Novel Therapeutic Strategies in the Treatment of Sepsis", (Estrategias Terapéuticas numerosas en el tratamiento de la Sepsis) Morrison and Ryan, eds, Marcel Dekker, New York (1996), páginas 55-69. En ambos estudios, estuvieron 14 ratones en cada uno de grupos de tratamiento y control. En el primer estudio ratones de CD1 fueron retados de manera intravenosa con 25 mg/kg de lipopolisacárido (LPS) de E. coli 0111 :B4. Inmediatamente después del reto, los ratones fueron tratados de manera intravenosa con rBPI2? o rBPI (10-193) C132A en dosis de 15, 20, 25 y 30 mg/kg, o bien con el vehículo de control (amortiguador de formulación solamente) . La mortalidad fue registrada dos veces al día durante 7 días. Los resultados del primer estudio, que aparecen en la tabla I a continuación, indican que el tratamiento con rBPI(10-193)C132A y rBPI2? incrementaron significativamente la sobrevivencia en comparación con los controles que recibieron vehículo. Además, rBPI (10-193) C132A fue por lo menos dos veces más potente que rBPI2? con un beneficio de sobrevivencia similar observado con una dosis dos veces menor de rBPI(10-193)C132A en comparación con rBPI2?. Tabla I No. de sobrevivientes de 15 Dosis (mg/kg) control rBPI2? rBPI (10-193) C132A 0 (vehículo) 0 NA1 NA 15 0 15**. ## 20 4 15**, # 25 11** 15** 30 13** 13** *NA, no aplicable **,p <O.01 versus control #,p<0.05 versus rBPI ? ##, p < 0.01 versus control En el segundo estudio, se estudió un rango más amplio de dosis rBMPI ( 10-193) C132A (5, 10, 15, 20, 25, 30 mg/kg). Los resultados aparecen en la tabla 2 a continuación y confirman que tanto rBPI2? como rBPI ( 10-193) C132A proporcionaron un beneficio de sobrevivencia significativo en comparación con el control, como en el primer estudio, rBPI (10-193) C132A fue por lo menos dos veces más potente, logrando una . eficacia similar a rBPI?? con una dosis 2 veces menor. Tabla 2 No. de sobrevivientes entre 15 Dosis (mg/kg) control rBPI2? rBPI (10-193) C132A 0 (vehículo) 2 NA1 NA 5 ND1 3 10 ND 10* 15 ND 14** 20 7 14**, # • 25 13** 15** 5 30 14** 15* 1NA, no aplicable; ND, no efectuado **,p <0.05 versus control **,p <0.01 versus control #,p<0.05 versus rBPI2? 10 D. Eficacia en modelo de murino de bacteremia letal Se efectuaron dos estudios separados para examinar las potencias relativas de rBPI2? y rBPI (10-193) C132A en un modelo de ratón de bacteremia letal. En ambos estudios, estaban 20 ratones por grupo de tratamiento. En el primer 15 estudio, ratones CD1 fueron retados con 6.8 X 10' unidades de formación de colonia (CFU) de E. coli 07:K1 administrada de manera intravenosa. Inmediatamente después del reto, los '^ ratones fueron tratados de manera intravenosa con rBPIn o rBPI (10-193) C132A en dosis de 10, 20 y 30 mg/kg, o bien con 20 un vehículo de control (amortiguador de formulación solamente) . La mortalidad fue registrada dos veces al día durante siete días. Los resultados del primer estudio aparecen en la tabla 3 a continuación, y demuestran un incremento significativo de la 25 sobrevivencia para los grupos tratados con 10 y 30 mg/kg de rBPI2? (p<0.05 versus control). Mientras no se observó un incremento significativo similar de la sobrevivencia con rBPI (10-193) C132A versus control, no se observó ninguna diferencia significativa en cuanto a la ventaja de sobrevivencia entre grupos tratados con rBPI2? y rBPI(10-193)C132A en este estudio. Tabla 3 No. de sobrevivientes entre 20 Dosis (mg/kg) control rBPI2i rBPI (10-193) C132A 0 (vehículo) 6 NA 10 14* 12 20 12 10 30 14* 10 *,p <0.05 versus control Para caracterizar más cabalmente los efectos de rBPI;? y rBPI (10-193) C132A en este modelo, se efectuó un segundo estudio en el cual se estudió un rango más amplio de dosis. En este estudio, ratones CD1 fueron retados con 2.57X108 unidades formadoras de colonias (CFU) de E. coli 07:K1 administrado de manera intravenosa. Inmediatamente después del reto, los ratones fueron tratados de manera intravenosa con 1.0, 3.0, 10 y 30 m g /kg de rBPI2i y 0.3, 1.0, y 3.0, 10 y 30 mg/kg de rBPI (10-193) C132A. Los resultados que aparecen en la tabla 4 a continuación, indican que ambas proteínas proporcionaron protección y que no se observó ninguna diferencia significativa en los efectos protectores de las dos variantes en cualesquiera de las dosis. Tabla 4 No. de sobrevivientes entre 20 Dosis (mg/kg) control rBPI2? rBPI (10-193) C132A 0 (vehículo) 6 0.3 ND1 6 1.0 4 6 3.0 9 10* 10 13** 8 30 11* 14** XND, no efectuado *,p <0.05 versus control **,p <0.01 versus control E . Efectos cardiovasculares en ratas concientes Se efectuaron varios experimentos para determinar los efectos relativos de rBPI2? y rBPI (10-193) C132A sobre la presión sanguínea en ratas. Cada rata fue anestesiada con una mezcla de quetamina (Fort Dodge Labs, Fort Dodge, IA) y Rompum (Bayer Corp., Shawnee Misión, KS) . Se colocó un catéter en la arteria carótida derecha y se conectó dicho catéter a un transductor de presión para registrar la presión sanguínea. Se colocó un segundo catéter en la vena yugular derecha para inyectar rBPI o bien vehículo. A las ratas se les permitió después recuperarse antes del inicio de los experimentos. Los experimentos fueron iniciados cuando las ratas estaban alertas, móviles y cuando la presión sanguínea era estable dentro del rango normal. Se inyectó rBPI;?, rBPI (10-193) C132A o un vehículo de control (amortiguador de formulación) en forma de un bolo durante 15 segundos y se registró la presión arterial media (mm Hg) en los siguientes 60 minutos. En experimentos preliminares, se determinó que dosis de 20 y 30 mg/kg de rBPI2? no tenían efectos significativos sobre la presión sanguínea con relación al vehículo pero tiene una dosis de 40 mg/kg resultó en una disminución significativa de la presión sanguínea lo que fue evidente dentro de 5 minutos. Esta respuesta de hipotensión fue mayor 15 minutos después de la inyección cuando la presión sanguínea disminuyó por 48 ± 12 mm Hg (media ± error estándar; p >0.05). Después de 60 minutos, la presión sanguínea de los animales tratados con rBPI2? se recuperó y no se observaron diferencias significativas con relación a los niveles obtenidos en los animales tratados con el vehículo. Para comparar los efectos de rBPI2? y rBPI (10-193) C132A, grupos de 5 ratas recibieron 40 mg/kg de cada sustancia farmacológica o control de vehículo, y se analizaron respuestas de presión sanguínea como área bajo la curva (AUC) . La figura 1 muestra que, como se observó previamente, rBPI2? provocó una caída significativa de la presión sanguínea indicada por una AUC elevada con relación al control de vehículo. En comparación, rBPI ( 10-193) C132A no tuvo ningún efecto significativo sobre la presión sanguínea en comparación con el control de vehículo. Una dosis de 50 mg/kg de rBPI2? (N = 4 ratas) tuvo un efecto de hipotensión aun mayor que el efecto de la dosis de 40 mg/kg se indica a través de un incremento adicional del AUC en la figura 1. En esta dosis más alta, se observó también una cierta reducción de la presión sanguínea en ratas que recibieron rBPI(10-193)C132A (N=3) , pero este efecto no fue significativo en comparación con el control de vehículo. Los expertos en la materia podrán idear numerosas modificaciones y variaciones a la invención descrita arriba. Por consiguiente, la invención es limitada solamente a las reivindicaciones anexas.
LISTA DE SECUENCIAS <110> XOMA Limited Ltd. Horwitz, Arnold (inventor) Carroll, Stephen 'F. (inventor) Burke, David (inventor) <120> .Análogo de remoción de proteína que incrementa la actividad bactericida/permeabilidad (BPl) <130> 27129/35765 PCT <140> <141> <150> 09/099,725 <151> 1998-06-19 <160> 6 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1813 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (31) .. (1491) <220> <221> mat_peptide <222> (124) .. (1491) <220> <223> rBPI <400> 1 caggccttga ggttttggca gctctggagg atg aga gag aac atg gcc agg ggc 54 • Met Arg Glu Asn Met Ala Arg Gly 5 -30 -25 cct tgc aac gcg ccg aga tgg gtg tec ctg atg gtg etc gtc gcc ata 102 Pro Cys Asn Ala Pro Arg Trp Val Ser Leu Met Val Leu Val Ala lie -20 -15 -10 ggc acc gcc gtg acá gcg gcc gtc aac cct ggc gtc gtg gtc agg ate 150 10 Gly Thr Ala Val Thr Ala Ala Val Asn Pro Gly Val Val Val Arg He -5 -1 1 5 tec cag aag ggc ctg gac tac gcc age cag cag ggg acg gcc gct ctg 198 Ser Gln Lys Gly Leu Asp Tyr Ala Ser Gln Gln Gly Thr Ala Ala Leu 10 15 20 25 15 cag aag gag ctg aag agg ate aag att cct gac- tac tea gac age ttt 246 Gln Lys Glu Leu Lys Arg He Lys He Pro Asp Tyr Ser Asp Ser Phe 30 35 40 aag ate aag cat ctt ggg aag ggg cat tat age ttc tac age atg gac 294 Lys He Lys His Leu Gly Lys Gly His Tyr Ser Phe Tyr Ser Met Asp 20 45 50 55 ate cgt gaa ttc cag ctt ccc agt tec cag ata age atg gtg ccc aat 342 He Arg Glu Phe Gln Leu Pro Ser Ser Gln He Ser Met Val Pro Asn 60 65 70 gtg ggc ctt aag ttc tec ate age aac gcc aat ate aag ate age ggg 390 25 Val Gly Leu Lys Phe Ser He Ser Asn Ala Asn He Lys He Ser Gly 75 80 85 aaa tgg aag gca caá aag aga ttc tta aaa atg age ggc aat ttt gac 438 Lys Trp Lys Ala Gln Lys Arg Phe Leu Lys Met Ser Gly Asn Phe Asp 90 95 100 105 ctg age ata gaa ggc atg tec att tcg gct gat ctg aag ctg ggc agt 486 Leu Ser He Glu Gly Met Ser He Ser Ala Asp Leu Lys Leu Gly Ser 110 115 120 aac ccc acg tea ggc aag ccc acc ate acc tgc tec age tgc age age 534 Asn Pro Thr Ser Gly Lys Pro Thr He Thr Cys Ser Ser Cys Ser Ser 125 130 135 cae ate aac agt gtc cae gtg cae ate tea aag age aaa gtc ggg tgg 582 His He Asn Ser Val His Val His He Ser Lys Ser Lys Val Gly Trp 140 145 150 ctg ate caá etc ttc cae aaa aaa att gag tet gcg ctt cga aac aag 630 Leu He Gln Leu Phe His Lys Lys He Glu Ser Ala Leu Arg Asn Lys 155 160 165 atg aac age cag gtc tgc gag aaa gtg acc aat tet gta tec tec aag 678 Met Asn Ser Gln Val Cys Glu Lys Val Thr Asn Ser Val Ser Ser Lys 170 175 180 185 ctg caá cct tat ttc cag act ctg cea gta atg acc aaa ata gat tet 726 Leu Gln Pro Tyr Phe Gln Thr Leu Pro Val Met Thr Lys He Asp Ser 190 195 200 gtg gct gga ate aac tat ggt ctg gtg gca cct cea gca acc acg gct 774 Val Ala Gly He Asn Tyr Gly Leu Val Ala Pro Pro Ala Thr Thr Ala 205 210 215 gag acc ctg gat gta cag atg aag ggg gag ttt tac agt gag aac cae 822 Glu Thr Leu Asp Val Gln Met Lys Gly Glu Phe Tyr Ser Glu Asn His 220 225 230 cae aat cea cct ccc ttt gct cea cea gtg atg gag ttt ccc gct gcc 870 His Asn Pro Pro Pro Phe Ala Pro Pro Val Met Glu Phe Pro Ala Ala 235 240 245 cat gac cgc atg gta tac ctg ggc etc tea gac tac ttc ttc aac acá 918 His Asp Arg Met Val Tyr Leu Gly Leu Ser Asp Tyr Phe Phe Asn Thr 250 255 260 265 gee ggg ctt gta tac caá gag gct ggg gtc ttg aag atg aec ctt aga 966 Ala Gly Leu Val Tyr Gln Glu Ala Gly Val Leu Lys Met Thr Leu Arg 270 275 280 gat gac atg att cea aag gag tec aaa ttt cga ctg acá acc aag ttc 1014 Asp Asp Met He Pro Lys Glu Ser Lys Phe Arg Leu Thr Thr Lys 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Asp He Met Asn Tyr He Val Pro He Leu Val Leu Pro Arg Val 405 410 415 Asn Glu Lys Leu Gln Lys Gly Phe Pro Leu Pro Thr Pro Ala Arg Val 420 425 430 Gln Leu Tyr Asn Val Val Leu Gln Pro His Gln Asn Phe Leu Leu Phe 435 440 445 Gly Ala Asp Val Val Tyr Lys 450 455 <210> 3 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador <400> 3 ctgctctaaa agctgctgca g 21 <210> 4 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador <400> 4 ccaggccctt ctgggaggcc gctgtcacgg cgg 33 <210> 5 <211> 33 <212> .ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador <400> 5 gccgtgacag cggcctccca gaagggcctg gac 33 <210> 6 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador <400> 6 ctgggaactg ggaagctg # 5 10 15 20 25

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un análogo de remoción de proteína de incremento de la capacidad bactericida/permeabilidad (BPl) que consiste de los residuos de aminoácido 10 a 193 de BPl humana 5 madura, donde un residuo de cisteína en la posición 132 se encuentra reemplazado por un aminoácido diferente. 2. El análogo de remoción de BPl de conformidad con la reivindicación 1 donde el aminoácido que reemplaza dicho residuo de cisteína es un aminoácido no polar 10 seleccionado dentro del grupo que consiste de alanina y serina. 3. El análogo de remoción de BPl de conformidad con la reivindicación 1 donde el residuo de cisteína en la posición 132 es remplazado por alanina. 15 4. Un polinucleótido que codifica el análogo de remoción de BPl de la reivindicación 1. 5-. Un polinucleótido que codifica el análogo de remoción de BPl de la reivindicación 3. 6. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 20 4 que comprende además la secuencia líder de veintisiete aminoácidos de BPl, 7. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 4 que es un .ADN. 8. Un vector de expresión que comprende el ADN de 25 conformidad con la reivindicación 7. 9. Una célula huésped transformada o transfectada de manera estable con el ADN de la reivindicación 7 para permitir la expresión en dicha célula huésped de dicho análogo de remoción de polipéptido. 10. Una célula huésped eucariótica de conformidad con la reivindicación 9. 11. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 10 que es una célula CHO. 12. Un método para producir un polipéptido análogo de remoción de BPl que comprende el cultivo de una célula huésped de conformidad con la reivindicación 9 en un medio de cultivo adecuado y el aislamiento de dicho polipéptido de dicha célula huésped o dicho medio de cultivo. 13. El producto de polipéptido del método de la reivindicación 12. 14. Una composición que comprende el análogo de remoción de BPl de la reivindicación 1 y un diluyente, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable. 15. Una composición que comprende el análogo de remoción de BPl de la reivindicación 3 y un diluyente, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable. 16. Una composición que comprende el análogo de remoción de BPl de la reivindicación 13 y un diluyente, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable. 17. Un método mejorado para administrar un producto de proteína BPl a un paciente, que comprende la administración de la composición de la reivindicación 14 a dicho paciente. 18. Un método mejorado para administrar un producto de proteína BPl a un paciente, que comprende la administración de la composición de la reivindicación 15 a dicho paciente. 19. Un método mejorado para administrar un producto de proteína BPl a un paciente, que comprende la administración de la composición de la reivindicación 16 a dicho paciente.
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