CN103250054B

CN103250054B - 细菌性脑膜炎的诊断方法

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Publication number: CN103250054B
Application number: CN201180050272.7A
Authority: CN
Inventors: L·博乔克; 贝蒂尔·克里斯汀森; 海科·赫沃尔德; 亚当·林德; 波尔·艾克森
Original assignee: Hansa Medical AB
Current assignee: Lufthansa biopharmaceutical Co., Ltd
Priority date: 2010-09-24
Filing date: 2011-09-23
Publication date: 2015-06-17
Anticipated expiration: 2031-09-23
Also published as: US9759720B2; EP2619583A1; WO2012038541A1; US20140080754A1; JP5891230B2; EP2619583B1; JP2013543581A; GB201016161D0; CN103250054A

Abstract

已证明HBP的水平在患有细菌性脑膜炎的个体中增加。因此，个体中HBP的水平可用于确定个体是否患有细菌性脑膜炎。

Description

细菌性脑膜炎的诊断方法

发明领域

本发明涉及细菌性脑膜炎的诊断和治疗。

发明背景

细菌性脑膜炎是一种威胁生命的疾病。在成人中，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)是主要的病原，分别具有大致30％和10％的总致死率。病毒性脑膜炎和脑炎也是威胁生命的。尽管最常见的病原体(肠病毒)相对很少表现神经性并发症，单纯疱疹病毒-1(HSV-1)脑膜脑炎如果不治疗的话具有＞70％的死亡率。早治疗改善所有形式的脑膜炎和脑炎的预后，因此早诊断是至关重要的。

诊断和治疗仍是主要的挑战，这主要是由于在表现上难以区别急性细菌性脑膜炎与病毒性CNS感染或神经疏螺旋体病(neuroborreliosis)。常规的临床变量和实验室变量诸如通常在脑脊液(CSF)中测量的白细胞(WBC)计数或乳酸、蛋白、葡萄糖或血浆C反应蛋白(CRP)通常在该病的早期不足以区分。最终的诊断需要细菌感染阳性的血液或CSF培养物，或在例如革兰氏染色后对CSF中细菌的阳性鉴定。通常采用这些测定之一中的阳性结果来证实细菌来源的证据，且另外是试验是不必要的。然而，这些测试具有仅60％至90％的总灵敏度。另外，许多患者在腰椎穿刺之前接受抗生素，减少了来自CSF培养物或革兰氏染色的确定性结果的机会。特别是培养也是耗时的，导致诊断的延迟。由于这些因素，怀疑患有脑膜炎的患者通常被给予广谱抗生素和抗病毒疗法的默认治疗，等待最终的诊断。

尽可能早地确定个体是否具有细菌性脑膜炎的可靠的生物或临床标志物是需要的。

发明概述

肝素结合蛋白(HBP，CAP37，Azurocidin)是与人嗜中性白细胞弹性蛋白酶显示44％序列同一性的一种糖基化的、单链、带正电的37kDa无活性丝氨酸蛋白酶同源物。已公布了HBP的三维结构(Iversen等人NatStruct Biol.1997Apr；4(4)：265-8)。它被包含在人嗜中性白细胞的嗜天青颗粒和分泌囊泡中(Lindmark等人，J Leukoc Biol1999；66(4)：634-43和Tapper等人，Blood2000；96：2329-2337)。它是已显示通过改变血管细胞骨架的Ca²⁺平衡来引起血管渗漏的多功能蛋白(Gautam等人，NatureMedicine2001；7(10)：1123-7)。已显示与纤维蛋白原复合的A链球菌群(group A streptococci，GAS)的M蛋白通过刺激嗜中性白细胞的B2整联蛋白受体而引起HBP释放(Herwald等人，Cell2004；116(3)：367-79)。LPS还可以通过未知机制引起HBP释放(Rasmussen等人，FEBS Lett1996；390(1)：10912)。HBP的序列是可公开获得的(例如以NCBI登录号NP_001691REGION：27..248获得)且在以下被再现为SEQ ID NO.1

SEQ ID NO：1

IVGGRKARPRQFPFLASIQNQGRHFCGGALIHARFVMTAASCFQSQNPGVSTVVLGAYDLRRRERQSRQTFSISSMSENGYDPQQNLNDLMLLQLDREANLTSSVTILPLPLQNATVEAGTRCQVAGWGSQRSGGRLSRFPRFVNVTVTPEDQCRPNNVCTGVLTRRGGICNGDGGTPLVCEGLAHGVASFSLGPCGRGPDFFTRVALFRDWIDGVLNNPGP

之前没有研究怀疑具有脑膜炎的患者中的HBP水平。发明人第一次表明HBP的水平在患有急性细菌性脑膜炎的个体中提高。根据本发明因而提供了鉴定个体是否患有细菌性脑膜炎的方法，该方法包括测量个体中的HBP从而确定个体是否患有细菌性脑膜炎。

本发明还提供：

-用于确定个体是否患有细菌性脑膜炎的检测HBP的剂；

-在用于确定个体是否患有细菌性脑膜炎的方法中使用的测试试剂盒，该测试试剂盒包括用于检测个体中的HBP的剂；

-一种治疗个体的细菌性脑膜炎的方法，该方法包括：

(i)使用本发明的方法确定个体是否患有细菌性脑膜炎；和

(ii)向(i)中被鉴定为有风险的个体施用治疗有效量的至少一种适于治疗细菌性脑膜炎的剂。

附图说明

图1显示在患有急性细菌性脑膜炎(ABM)、病毒性脑炎、病毒性脑膜炎、神经疏螺旋体病(疏螺旋体(Borrelia))的患者和具有正常WBC以及无CNS感染的患者(对照)中HBP(A)、WBC计数(B)、嗜中性白细胞(多(poly))计数(C)、单核细胞(单(mono))计数(D)、葡萄糖(E)、蛋白(F)、和乳酸(G)的脑脊液(CSF)水平。点线指示HBP的50ng/mL的截止水平。给出了中值。所有散点图以Log2标度呈现。

图2显示HBP的水平和细菌病原。当比较不同的细菌物种时，在HBP水平上不存在显著差异。空心三角形指示在28天内死亡的患者且点线指示50ng/mL的截止水平。给出了中值。散点图以Log2标度呈现。

图3显示利用脑脊液(CSF)中的HBP(粗实线)、乳酸(细虚线)、嗜中性白细胞(多：细点线)、单核细胞(单：细实线)和总WBC(粗不规则点线)区别细菌性脑膜炎与其他CNS感染的接收者工作特征(ROC)曲线。差异存在于细菌性脑膜炎(n＝40)与病毒性CNS感染或神经疏螺旋体病(n＝35)之间。ROC曲线下面积对于HBP为0.994(95％置信区间(CI)，0.984-1.004)，对于乳酸为0.955(95％CI，0.911-1.000)，对于嗜中性白细胞(poly)为0.966(95％CI，0.920-1.011)，对于单核细胞(mono)为0.729(95％CI，0.614-0.843)，以及对于总WBC为0.898(95％CI，0.826-0.970)。

发明详述

诊断

本发明涉及鉴定受试者是否患有细菌性脑膜炎特别是急性细菌性脑膜炎的方法。本发明因此涉及细菌性脑膜炎的诊断。本发明涉及区分细菌性脑膜炎与引起相似症状的其他疾患特别是病毒性脑膜炎或病毒性脑炎(病毒性脑膜脑炎)以及神经疏螺旋体病。

传统上，CSF WBC计数被认为是用于区别诊断细菌性脑膜炎的有用工具，较低的脑脊液细胞增多(pleocytosis)和相对淋巴球增多被认为是非细菌原因的体征。然而，之前的研究已报道＞1000个细胞的CSF脑脊液细胞增多作为神经外科患者的CSF感染的诊断标志物仅具有61％的灵敏度和68％的特异性。而且，尽管94％患有细菌性脑膜炎的患者具有多形核细胞优势，该标准仅具有28％的特异性。

此外，在临床怀疑患有细菌性脑膜炎的患者中，在腰椎穿刺之前开始抗生素是屡见不鲜的，减少了通过革兰氏涂片或CSF培养等方法快速确定性诊断的机会，且可能在一些病例中错误地延长抗生素治疗。更重要地，CSF培养对细菌感染阳性一般被认为是诊断细菌性脑膜炎的黄金标准，所以在阴性培养物病例中错误分类的风险是可能的。简而言之，患有细菌性和病毒性脑膜炎的患者的临床特征可能相当类似，且脑脊液(CSF)发现结果通常是非决定性的。

本发明人第一次研究了怀疑患有脑膜炎的患者中的HBP水平。发明人证明在患有细菌性脑膜炎的患者中的HBP水平相对于患有病毒性脑膜炎或脑炎、神经疏螺旋体病的患者或不患有脑膜炎的对照患者升高了。HBP水平在患有由广泛范围的不同细菌感染所引起的脑膜炎的患者中升高了。这包括患有神经外科手术(neurosurgical procedure)后获得的感染的患者。因为术后脑膜炎/脑室炎的区别诊断是困难的，HBP作为神经外科环境中的诊断标志物将是特别有用的。

受测试的个体通常被怀疑患有脑膜炎。所述个体通常是哺乳动物。所述哺乳动物通常是人或家养哺乳动物诸如马、牛、羊、狗或猫。所述个体优选是人。所述个体可能通常被怀疑患有脑膜炎因为他们表现出以下症状的一种或多种：

发烧/呕吐；严重头痛；颈项强直(年幼儿童中较少见)；畏光；畏声；嗜睡(通常非常嗜睡/失神(vacant)/难以醒来)；混乱/谵妄；身体任何部位的皮疹(不是在所有情况下都存在)；癫痫。

在个体受试者是年幼儿童或婴儿的情况下，以上症状通常不存在。相反，年幼儿童或婴儿可能通常被怀疑患有脑膜炎因为他们表现出以下症状的一种或多种：

拒绝吃东西/进食；易怒(不想被抱/触摸)；身体僵硬，急跳运动(jerkymovement)，或松弛(floppiness)和不能站立；卤门突出(在达到6个月大的受试者中)；高音调啼哭或呻吟(moaning)；腿疼；肢冷；皮肤颜色异常。

在成人中，严重头痛是最常见的脑膜炎症状-在几乎90％细菌性脑膜炎病例中出现。其次最常见的症状是在70％的成人病例中出现的颈项强直(颈部僵硬)。经典的三个诊断体征由颈项强直、突发高热和精神状态改变组成；然而，所有三个特征仅存在于所有细菌性脑膜炎病例中的44-46％的病例中。如果这三个体征均不存在，那么脑膜炎被认为是不可能的但没有排除。常见的与脑膜炎相关的其他体征包括畏光(不耐明光)和畏声(不耐大声噪声)。

可产生疑似脑膜炎的其他体征是阳性凯尔尼格征(Kernig′s sign)或布鲁金斯基氏征(Brudzinski′s sign)的存在。如下评价凯尔尼格征：使患者处于仰卧位，使髋部与膝部屈曲成90度。在患有凯尔尼格征的患者中，疼痛限制了膝部的被动扩展。阳性布鲁金斯基氏征在颈部的屈曲引起膝部和髋部的非自愿屈曲时发生。尽管凯尔尼格征和布鲁金斯基氏征均常见地用于筛选脑膜炎，这些测试的灵敏度是有限的。称为“颠簸加重法(joltaccentuation maneuver)”的另一项测试帮助确定脑膜炎是否存在于报告发烧和头痛的患者中。患者被告知水平地快速旋转他或她的头；如果这没有使头痛更重，脑膜炎是不可能的。

以上提到的皮疹症状通常采取快速传播的点状皮疹的形式，这可能在其他症状之前。皮疹包括在躯干、下肢、粘膜、结膜和(偶尔)手掌或足底上的许多小的、不规则的紫色或红色斑点(“瘀点”)。皮疹通常是非热烫性的：在用手指或玻璃杯按压时发红不消失。这种皮疹一般只存在于患有由细菌脑膜炎奈瑟氏球菌引起的脑膜炎(称为“脑膜炎球菌性脑膜炎”)的受试者中，尽管皮疹确实偶尔出现在由其他细菌引起的脑膜炎。

可导致疑似脑膜炎的其他症状可以是手足口病和/或生殖器疱疹的皮肤体征，手足口病和/或生殖器疱疹与各种形式的病毒性脑膜炎相关。

个体受试者可因为一种或多种风险因素的存在被怀疑患有脑膜炎。脑膜炎的风险因素包括：

-居住在公共环境中，特别是大量个体首次居住在一起的环境。例如，在转移过程中的军队营房；大学校园；

-颅骨外伤；特别是影响脑底部或朝向鼻窦和岩锥(petrous pyramid)延伸的颅骨骨折

-解剖异常，特别是允许外部环境与神经系统之间的连续性的异常。典型实例包括颅部或颈部异常，诸如：异位脑组织、脑膜瘤、颅底缺陷(例如，对筛骨、岩骨或蝶窦)、皮样囊肿/表皮样囊肿/皮肤窦道、颅脑淋巴管瘤(Cranial lymphangiomatosis)、神经管原肠囊肿、内耳异常、或Mondini发育异常(Mondini dysplasia)、或腰骶异常诸如脑脊膜膨出或皮毛窦/皮样囊肿；

-存在耳蜗植入物；或另一种颅部或神经外科植入物(neurosurgicalimplant)诸如脑分流或相关装置(例如，脑室外引流或Ommaya储液囊(Ommaya reservoir))；

-免疫系统受损/免疫缺陷，例如补体缺陷；

-HIV/AIDS的诊断；

-近期的神经外科手术，例如脑室-腹腔分流术(ventriculoperitonealshunt)或脊髓手术，或导致CSF渗漏的其他形式的颅部或颌面部手术，或近期的耳鼻喉干预；

-头和/或颈区域中感染(脑膜旁感染)的近期或进行中的诊断，诸如鼻窦炎、中耳炎、乳突炎、骨髓炎、Maffuci氏综合征或神经纤维瘤1型；

-脑膜炎相关病毒的近期或进行中的诊断，脑膜炎相关病毒诸如肠病毒、单纯疱疹病毒1型或2型、水痘带状疱疹病毒(水痘/带状疱疹)、流行性腮腺炎病毒、HIV、巨细胞病毒或LCMV。

本发明涉及测量个体中的HBP水平。通常在从个体获得的样品中体外测量HBP的水平。样品通常包括个体的体液。液体样品可以是血液、血浆、血清、尿、脑脊液或关节液样品。样品优选为脑脊液样品。

根据本发明，与基线水平或浓度相比增加的HBP水平或浓度指示个体患有细菌性脑膜炎。基线水平通常为被怀疑脑膜炎但随后证实没有细菌性脑膜炎的个体中的HBP水平。

例如，发明人已表明，当通过测定从怀疑患有脑膜炎的个体获得的CSF样品中的HBP浓度来测量HBP的水平时，随后显示患有病毒性脑膜脑炎(病毒性脑膜炎或脑炎)的个体具有约4.7ng/ml的中值HBP浓度，随后显示患有神经疏螺旋体病的个体具有约3.6ng/ml的中值HBP浓度，而表现出导致怀疑脑膜炎的症状但随后显示没有脑膜炎的个体具有约3.5ng/ml的中值HBP浓度。被怀疑患有脑膜炎但没有细菌性脑膜炎的所有类型的个体的中值HBP浓度为大约3.6ng/ml。

更详细地说，每种类型个体以ng/ml计的平均HBP浓度如下：(i)患有病毒性脑膜炎/脑炎的个体(n＝29)：平均值7.3，中值4.7，范围3.0-41.0；(ii)患有病毒性脑膜炎或疏螺旋体病的个体(n＝36)：平均值6.7，中值4.4，范围3-41；和(iii)所有的非细菌性脑膜炎个体(n＝133)：平均值4.5，中值3.6，范围2.4-41。

因此HBP的基线水平或浓度可能通常在3至5ng/ml的范围内。例如，HBP的基线水平或浓度可以是大约3ng/ml、4ng/ml或5ng/ml。

根据本发明，与细菌性脑膜炎的诊断相关的HBP水平或浓度的增加是相对基线水平或浓度增加至少3倍、4倍、5倍或10倍。HBP水平或浓度的增加优选为相对于基线水平或浓度至少4倍。

在本发明中，与细菌性脑膜炎的诊断相关的增加的HBP的水平或浓度通常为大于约11ng/ml、或大于约12ng/ml、13ng/ml、14ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、23ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、32ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、41ng/ml、42ng/ml、43ng/ml、44ng/ml、45ng/ml、46ng/ml、47ng/ml、48ng/ml、49ng/ml、50ng/ml、51ng/ml、52ng/ml、53ng/ml、54ng/ml、55ng/ml、56ng/ml、57ng/ml、58ng/ml、59ng/ml60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、600ng/ml、700ng/ml、800ng/ml、或900ng/ml。与细菌性脑膜炎的诊断相关的增加的HBP的浓度优选为大于约50ng/ml。

HBP的检测

本发明通常通过体外测量从个体中获得的样品中的HBP的水平来执行。样品通常包括个体的体液。液体样品可以是血液、血浆、血清、尿、脑脊液或关节液样品。样品优选为脑脊液样品。

样品通常在测定之前例如通过离心被处理。样品还可以通常在测定之前优选在-70℃以下被储存。

本领域已知的标准方法可用于测定HBP的水平。这些方法通常涉及使用检测HBP的剂。该剂通常特异性结合HBP。该剂可以是对HBP特异性的抗体、结合HBP的适体、丝氨酸蛋白酶抑制剂诸如牛胰蛋白酶抑制剂(aprotinin)，例如描述在Petersen等人，Eur J Biochem1993；271-9中；或整联蛋白的可溶性片段，例如描述在Cai和Wright，S.D.J Exp Med1996；184：213-23中。说到特异性，应理解所述剂或抗体结合HBP而对任何其他分子特别是任何其他蛋白没有显著的交叉反应性。例如，对HBP特异性的剂或抗体将不会显示与人嗜中性白细胞弹性蛋白酶的显著交叉反应性。交叉反应性可以通过任何适宜方法评价。

在本发明的方法中使用的抗体可以是完整抗体或其能够结合HBP的片段。抗体可以是单克隆抗体。这种完整抗体通常是通过本领域已知的任何适宜方法产生的抗体。例如，多克隆抗体可通过以下获得：在适宜条件下用HBP免疫哺乳动物，通常是兔或小鼠，并且从例如所述哺乳动物的血清中分离抗体分子。单克隆抗体可通过杂交瘤或重组方法获得。

杂交瘤方法涉及在适宜条件下用HBP免疫哺乳动物，通常是兔或小鼠，然后收集所述哺乳动物的脾细胞并将它们与骨髓瘤细胞融合。然后稀释融合细胞的混合物并从单个亲本细胞生长克隆。然后测试由不同克隆分泌的抗体结合HBP的能力，然后使最多产且稳定的克隆生长在培养基中达到高体积。收集并纯化分泌的抗体。

重组方法涉及将不同免疫球蛋白基因区段克隆到噬菌体或酵母中以创建具有稍微不同的氨基酸序列的抗体的文库。可选择这些产生结合HBP的抗体的序列并将序列克隆到例如细菌细胞系中用于生产。

通常抗体是哺乳动物抗体，诸如灵长类动物、人、啮齿动物(例如小鼠或大鼠)、兔、羊、猪、马或骆驼抗体。抗体可以是骆驼科抗体(camelidantibody)或鲨鱼抗体。抗体可以是纳米抗体。抗体可以是任何类或同种型的抗体，例如IgM，但优选IgG。

可用在本方法中的完整抗体的片段包括抗原结合位点，例如Fab或F(ab)2片段或ScFV。完整抗体或片段可以与可用来将2个或更多个片段或抗体接合在一起的其他部分诸如接头缔合。此类接头可以是化学接头或者能够以与片段或完整抗体的融合蛋白的形式存在。接头因而可用于将具有相同或不同结合特异性的完整抗体或片段，例如可结合相同或不同多态性的完整抗体或片段接合在一起。抗体可以是能够结合两种不同抗原，通常为本文提到的多态性中任何两种的双特异性抗体。抗体可以是通过背靠背接合两个可变结构域而形成的“双抗体”。在用于本方法的抗体以具有拥有不同特异性的不同抗原结合位点的上述形式中任一种存在的情况下，这些不同特异性则通常是针对不同位置处或不同蛋白上的多态性的。在一个实施方案中，抗体是包含来自不同天然抗体的序列的嵌合抗体，例如人源化抗体。

评价HBP水平的方法通常涉及将样品与能够特异性结合HBP的剂或抗体接触。此类方法可包括试纸条测定(dipstick assay)和酶联免疫吸附测定(ELISA)。通常试纸条包括特异性结合HBP的一种或多种抗体或蛋白。如果存在多于一种抗体，则抗体优选地具有不同的非重叠决定簇以使得它们可同时结合HBP。

ELISA是一种需要试剂分离的异质固相测定。ELISA通常使用夹心技术或竞争技术进行。夹心技术需要两种抗体。第一种特异性结合HBP且结合固体支持体。第二种抗体结合标志物，通常为酶缀合物。酶的底物用于对HBP抗体复合物因此对样品中HBP的量进行定量。抗原竞争性抑制测定通常还需要与支持体结合的HBP特异性抗体。HBP酶缀合物被添加到待测定的样品(包含HBP)中。在HBP酶缀合物与未标记的HBP之间的竞争性抑制允许对样品中HBP的量进行定量。用于ELISA反应的固体支持体优选地包含孔。

本发明还可以采用不包含抗体的测量HBP的方法。高效液相色谱(HPLC)分离和荧光检测优选地用作确定HBP水平的方法。可使用之前描述的HPLC装置和方法(Tsikas D等人J Chromatogr B Biomed Sci Appl1998；705：174-6)。在HPLC过程中的分离通常根据大小或电荷进行。在HPLC之前，内源性氨基酸和内标L-高精氨酸通常被添加到测定样品中且这些在CBA盒(CBA cartridge，Varian，Harbor City，CA)上被相萃取(phaseextract)。样品内的氨基酸优选地用邻苯二甲醛(OPA)衍生。优选地在所有氨基酸的质量控制样品中确定该测定的准确性和精度。

本发明还提供了包括用于测量个体中的HBP水平从而确定所述个体是否患有细菌性脑膜炎的工具(mean)的诊断试剂盒。试剂盒通常包含特异性结合HBP的一种或多种抗体。例如，试剂盒可包括单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、CDR移植的抗体或人源化抗体。抗体可以是完整的免疫球蛋白分子或其片段，诸如Fab、F(ab’)₂或Fv片段。如果存在多于一种抗体，则抗体优选地具有不同的非重叠决定簇以使得它们可同时结合HBP。

试剂盒可另外包括用于测量其他实验室或临床参数的工具。例如，试剂盒可包括用于测量个体中的WBC计数和/或乳酸、葡萄糖和C反应蛋白中的一种或多种的水平或浓度的工具。

试剂盒可另外包括一种或多种使得以上提到的方法的实施方案中的任一种能够被执行的其他试剂或器械。此类试剂或器械包括以下的一种或多种：适宜的缓冲液(水溶液)、从样品分离HBP的工具、从个体获得样品的工具(诸如器皿或包括针的器械)或包括可在其上进行定量反应的孔的支持体。试剂盒可以任选地包括使得试剂盒能够用于本发明的方法的说明书或有关该方法可对哪些个体执行的详细资料。

治疗

本发明还涉及由本发明的方法鉴定为患有细菌性脑膜炎的个体的治疗。因此，在细菌性脑膜炎的治疗中使用的物质可用于制造在由本发明的方法鉴定为患有细菌性脑膜炎的个体的治疗中使用的药物。由本发明的方法鉴定为患有细菌性脑膜炎的个体的病症因此可通过施用这种物质而改善。治疗有效量的可用于治疗细菌性脑膜炎的物质可被给予由本发明的方法鉴定为需要这种物质的个体。适于治疗细菌性脑膜炎的物质通常包括一种或多种抗生素和/或一种或多种静脉内液体和/或一种抗炎剂。一种或多种抗生素通常为广谱抗生素。广谱抗生素通常选自一种或多种氨基糖苷类、糖肽类、头孢菌素类、氟喹诺酮类、林可酰胺类、大环内酯类、青霉素类、碳青霉烯类、磺胺类或四环素类。例如，适宜的抗生素包括但不限于庆大霉素、卡那霉素、新霉素、链霉素、妥布霉素、万古霉素、头孢唑啉、头孢氨苄、头孢匹林、头孢拉定、头孢呋辛、头孢克肟、头孢噻肟、头孢他啶、头孢唑肟、头孢曲松、环丙沙星、左氧氟沙星、氧氟沙星、克林霉素、阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、阿莫西林、氨苄西林、氨苄西林-舒巴坦、氯唑西林、双氯青霉素、美洛西林、萘夫西林、苯唑西林、苄星青霉素G、青霉素G钾、普鲁卡因青霉素G、青霉素V钾、哌拉西林、替卡西林、替卡西林-克拉维酸钾、亚胺培南、美洛培南、乙胺嘧啶-磺胺多辛、磺胺嘧啶(Sulfadizine)、磺胺异噁唑(Sulfisoxazole)、磺胺甲噁唑(Sulfmethoxazole)、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑、金霉素、多西环素和四环素。

一种或多种抗炎剂通常是皮质类固醇、最通常是地塞米松、倍他米松、氢化可的松或甲基强的松龙。

可用于治疗根据本发明的细菌性脑膜炎的物质通常与药学上可接受的载体或稀释剂一起配制用于在本发明中施用。所述药学载体或稀释剂可以是例如等渗溶液。例如，固体口服形式可包括与活性物质一起的稀释剂，例如，乳糖、右旋糖、蔗糖、纤维素、玉米淀粉或马铃薯淀粉；润滑剂，例如二氧化硅、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁或硬脂酸钙、和/或聚乙二醇；粘合剂，例如，淀粉、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮；解聚剂，例如，淀粉、海藻酸、海藻酸盐(alginate)或羟基乙酸淀粉钠；泡腾混合物；染料；甜味剂；润湿剂，诸如卵磷脂、聚山梨酯、月桂基硫酸盐(laurylsulphate)；和在药物制剂中使用的一般无毒性且无药学活性的物质。此类药物制品可以以已知方式例如通过混合、成粒、压片、包糖衣或薄膜包衣工艺制造。

口服施用的液体分散体可以是糖浆、乳剂或悬浮剂。糖浆可包含例如蔗糖或蔗糖与甘油和/或甘露醇和/或山梨醇作为载体。

悬浮剂和乳剂可包括例如天然胶质、琼脂、海藻酸钠、果胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯醇作为载体。用于肌内注射的悬浮剂或溶液可包含与活性物质一起的药学上可接受的载体，例如无菌水、橄榄油、油酸乙酯、二醇例如丙二醇，以及如果需要，适量的盐酸利多卡因。

用于静脉内施用或输注的溶液可包含例如无菌水作为载体，或优选地它们可以是无菌、水性、等渗的盐水溶液的形式。

向根据本发明的方法鉴定的患者施用用于治疗细菌性脑膜炎的治疗有效量的物质。剂量例如抗生素的剂量可以根据各种参数确定，尤其是根据使用的物质；待治疗的患者的年龄、体重和病症；施用途径；和所需方案来确定。此外，医师将能够确定对于任何特定患者所需的施用途径和剂量。根据具体抗生素的活性，待治疗的受试者的年龄、体重和病症以及施用的频率和途径，典型的每日剂量是每kg体重大约0.1到50mg。优选地，每日剂量水平为5mg到2g。该剂量可以按单剂量提供或者可以按多剂量提供，例如，以规律的间隔服用，例如每天施用例如2、3或4个剂量。

以下实施例说明了本发明：

实施例

方法

研究群体

分析了来自两个不同的同龄组的总计174位患者的CSF。经历腰椎穿刺的患有临床上疑似脑膜炎的一百五十九位患者在2006年3月和2009年11月之间在瑞典隆德大学医院传染病诊所(Clinic for Infectious Diseases，Lund University Hospital，Sweden)的一项前瞻性研究中入选。十四位具有由疑似的病毒CNS感染或神经疏螺旋体病引起的CSF脑脊液细胞增多但没有证实的微生物诊断的患者被排除，因此总计145位患者被包括。此外，在1995年和2004年之间在瑞典哥德堡的萨尔格伦斯卡大学医院传染病诊所(Clinic for Infectious Diseases，Sahlgrenska University Hospital，Gothenburg，Sweden)采集的16位患有细菌性脑膜炎的患者和13位患有HSV-1脑炎的患者的另一可追溯同龄组被包括。这样做是为了扩大研究材料，尤其是在预期采集的患者材料中少见的患有HSV-1脑炎的患者的数目，且还为了提高更不平常的细菌性脑膜炎病原的数目。由不知道HBP结果的主治医师利用标准的实验室和微生物测试对患者进行病情检查和最终诊断。患者分类为五组：1.急性细菌性脑膜炎，2.病毒性脑膜炎，3.病毒性脑膜炎，4.神经疏螺旋体病，5.具有正常的CSF WBC计数的对照患者。

细菌性脑膜炎的分类基于Durand等人的标准(N Engl J Med1993Jan7；328(1)：21-8)，其中相容的临床特征、脑脊液细胞增多和以下之一是细菌性脑膜炎的诊断所需的：a)阳性CSF培养物；b)阴性CSF培养物，但阳性的CSF抗原测试，CSF革兰氏染色的细菌鉴定，阳性16S rDNA PCR或阳性血液培养物。仅包括接受小于48小时的充分抗生素治疗的患者。

病毒性CNS疾病的诊断基于与病毒性脑膜炎或脑炎相容的症状的急性发作，细菌性CNS感染的排除，以及要么a)CSF中病毒DNA或RNA的阳性PCR结果，要么b)蜱传脑炎(Tick-borne encephalitis，TBE)病毒的特异性血清IgM抗体。CSF细胞增多结合CSF中特异性伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi)抗体的检测是神经疏螺旋体病的诊断所需的。隆德大学和哥德堡大学的伦理委员会批准该研究并且所有的样品的取得获得参与者的知情同意。

HBP的脑脊液浓度和其他CSF标志物的分析

由主治医师采集CSF样品作为常规患者管理的一部分。使用常规方法通过ELISA确定HBP的浓度。简而言之，用针对人HBP的小鼠单克隆抗体(2F23A)以包被缓冲液(0.05M NaHCO₃，pH9.6)中的1.1μg/mL包被微量滴定板(NUNC)。用PBST(含有0.05％吐温的磷酸盐缓冲盐水)洗涤板并用PBST中的2％牛血清白蛋白(Sigma)封闭。然后将在样品缓冲液(1M NaCl)中1/40稀释的患者CSF样品一式两份地加至孔并且在37°孵育60min。每个板还包含已知浓度的重组人HBP(0-600ng/mL)的校准样品。在洗涤后，用1/7000稀释的针对人HBP的多克隆兔抗血清孵育板。通过与过氧化物酶缀合的针对兔IgG的抗体(Bio-Rad)(1/3000)一起孵育来检测结合的抗体。使板显色并使用常规方法确定405nm的光密度。通过计算与标准曲线的结果相关的重复孔的平均光密度来确定每个患者样品中的HBP的水平。该测定的天与天之间的变化具有＜10％的变异系数。CSF中WBC、葡萄糖和蛋白的分析是标准程序且作为隆德大学和萨尔格伦斯卡大学医院临床化学实验室的常规测试进行。根据制造商的说明书用试剂在Cobas c501(Amazonas)上分析CSF样品中的乳酸浓度。

统计分析

通过非参数的Mann-Whitney U检验进行两个不同组之间的比较，且在多于两组的比较中使用非参数的Kruskal-Wallis单因素ANOVA分析。双尾p值＜.05被认为是统计学显著的。Spearmans非参数相关系数用于计算患者组之间的相关性。构建接收者工作特征(ROC)曲线和曲线下面积(AUC)来阐释HBP的各个截止水平。以95％置信区间(95％CI)报告AUC值。SPSS14.0软件系统(SPSS)和Graph-Pad Prism5.0(Graph-Padsoftware，La Jolla，CA)用于计算。

结果

患者特征

四十一位患者被分类为患有细菌性脑膜炎，19位病毒性脑炎，10位病毒性脑膜炎，7位神经疏螺旋体病，且97位患者具有正常的CSF WBC计数(＜5×10⁶/L)且被认为是没有CNS感染的对照组。人口特征(年龄和性别)在具有感染的四个患者组之间是相似的(表1)。在对照组中，男性/女性比是41/56，平均年龄为42岁(范围18-85岁)。在对照组中97位患者中的39位具有无CNS感染的发烧和头痛，且后来被诊断患有各种细菌性和病毒性感染。在细菌性脑膜炎组(n＝41)中，有37位患者患有社区获得性细菌性脑膜炎，且四位患者在神经手术后患有术后细菌性脑膜炎。二十三位患者(56％)具有阳性CSF培养物，13位阳性16S rDNA，一位CSF抗原测试阳性，且四位患者具有阳性血液培养物。细菌病原是肺炎链球菌(n＝16)、脑膜炎奈瑟氏球菌(n＝5)、单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)(n＝5)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)(n＝2)、肠埃希氏菌(Escherichia coli)(n＝2)、A群链球菌(n＝2)、G群链球菌(n＝2)，以及金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、α-链球菌、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、孪生球菌属(Gemella)的种、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)各一位。在细菌性脑膜炎组的预期部分，28天死亡率是16％。在病毒性CNS感染组中，有19位患者患有脑炎(HSV-1n＝15，TBE n＝4)，以及十位患有脑膜炎(肠病毒n＝4，水痘-带状疱疹病毒(VZV)n＝3，单纯疱疹病毒2型(HSV-2)n＝2，和巨细胞病毒(CMV)n＝1)。在患有HSV-1脑炎的患者中，五位患者在腰椎穿刺时没有接受阿昔洛韦治疗，且在腰椎穿刺之前的阿昔洛韦治疗的中值时间是48小时(范围0-8天)。

CSF特征

在细菌性脑膜炎组中的CSF中的总WBC、嗜中性白细胞和单核细胞计数显著高于病毒性CNS感染和神经疏螺旋体病组(p＜.01)，尽管在这些组之间存在大量重叠(图1B-D)。而且，十一位患有细菌性感染的患者(27％)具有单核细胞优势，且17位患者(41％)具有低于1000个细胞的总CSF WBC计数(图1B)，而在病毒性CNS感染组中两位患者具有嗜中性白细胞优势。与另外三组相比，在细菌性脑膜炎组中CSF葡萄糖水平显著更低(p＝.01)，而CSF蛋白和乳酸水平显著更高(p＝.01)(图1E-G)。当比较CSF特征时在病毒性脑膜炎或病毒性脑炎与神经疏螺旋体病的组之间没有显著差异(p＞.05)(图1B-F)。

HBP的CSF水平

HBP的水平在患有细菌性脑膜炎的患者(中值376ng/mL，范围12-858ng/mL)中比在患有病毒性脑炎(中值5.0ng/mL，范围3.0-41ng/mL)、病毒性脑膜炎(中值4.2ng/mL，范围3.1-40ng/mL)、神经疏螺旋体病(中值3.6ng/mL，范围3.2-10ng/mL)的患者和没有CSF细胞增多的对照组的患者(中值3.5ng/mL，范围2.4-8.7ng/mL)中显著更高(p＜.01)(图1A)。

41位患有细菌性脑膜炎的患者中有37位(90％)具有高于50ng/mL的HBP浓度，超过了另外三组中发现的最高HBP水平(图1A)。在CSF HBP水平低于50ng/ml的四位患者中，两个病例中单核细胞增生利斯特氏菌的CSF培养物呈阳性，一位患者中流感嗜血杆菌的CSF抗原测试为阳性，且一位患者中A群链球菌的血液培养物为阳性(图2)。41位患者中15位，在抗生素开始前采集CSF样品。11、8和7位患者分别在CSF样品采集之前1-12、12-24和24-48小时接受充分的抗生素治疗。在采样前接受达24小时的抗生素治疗的26位患者中，24位具有超过50ng/mL的HBP水平。发现十四种不同的细菌病原，全部伴有升高的HBP水平。所有六位非幸存者具有升高的HBP水平(＞385ng/mL)(图2)。

在病毒感染组中发现的最高HBP水平是在一位患有HSV-1脑炎的患者(41ng/mL)中和在另一位患有HSV-2脑膜炎的患者(40ng/mL)中(图lA)。在HSV-1/2感染的患者的阿昔洛韦治疗的持续时间与HBP、乳酸、WBC、嗜中性白细胞或单核细胞的水平之间不存在相关性。

50ng/mL的截止水平对于细菌性脑膜炎的检测来说具有90％的灵敏度和100％的特异性。接收者工作特征(ROC)曲线显示HBP的曲线下面积(AUC)为0.994，使之成为本研究中区别细菌性和非细菌性脑膜炎或神经疏螺旋体病的最好标志物，接下来是乳酸和嗜中性白细胞(多)(图3)。在HBP与乳酸、WBC、嗜中性白细胞、单核细胞、蛋白和ICU天数之前存在显著相关性(p＜.01)。

讨论

患有细菌性和病毒性CNS感染的患者的临床特征可能相当相似且CSF发现结果是非决定性的。这是调查CSF中的嗜中性白细胞衍生的HBP的存在的第一项研究，且我们的发现显示HBP是区分患有细菌性CNS感染和病毒性CNS感染的有用的诊断标志物。传统上，CSF中的细胞增多被认为是区别细菌性病原和病毒性病原的有用工具，其中较低的脑脊液细胞增多或相对淋巴球增多指示非细菌来源。然而，认识到存在几次对不存在明显的CSF细胞增多的细菌性脑膜炎的记录病例的报告是重要的。Ross等人(J Neurosurg1988Nov；69(5)：669-74)报告了＞1000×10⁶/L细胞的CSF细胞增多作为在术后神经外科患者中CSF感染的诊断标志物仅具有61％的灵敏度和68％的特异性。而且，尽管94％患有细菌性脑膜炎的患者具有嗜中性白细胞优势，该标准仅具有28％的特异性。在我们的研究中，61％患有细菌性脑膜炎的患者和3％患有病毒性CNS感染的患者具有＞1000×10⁶/L细胞的CSF细胞增多。分别在73％和7％的患有细菌性脑膜炎和病毒性CNS感染的患者中发现嗜中性白细胞优势。

在患有临床疑似细菌性脑膜炎的患者中，在腰椎穿刺之前开始抗生素是屡见不鲜的，减少了微生物诊断的机会，且可能在一些病例中延长抗生素治疗。这在本研究中看到，其中64％的患者在腰椎穿刺之前接受达48小时的抗生素。然而，这26位患者中有24位仍具有超过50ng/mL的HBP水平。阳性CSF培养物是细菌性脑膜炎的诊断的黄金标准，且在阴性培养物病例中错误分类的风险是可能的。23位具有阳性CSF培养物的患者中有21位具有升高的HBP水平(＞50ng/mL)的事实进一步支持使用HBP作为诊断标志物。有趣的发现是患有由伯氏疏螺旋体引起的亚急性细菌性脑膜炎的患者在CSF中具有低的HBP水平。神经疏螺旋体病患者通常具有轻微的疾病且很少住院。在细菌性脑膜炎组中，最普遍的细菌病原是肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、和单核细胞增生利斯特氏菌，这与其他研究一致。然而，在本研究的患者中发现存在14种不同的细菌物种，且在所有这些病例中引起了显著的HBP释放。因而，大部分细菌物种似乎能够完成这种特异性嗜中性白细胞活化，这还显示在具有严重败血症的患者中。在细菌性脑膜炎组中四位患者具有由铜绿假单胞菌、肠埃希氏菌、粪肠球菌和表皮葡萄球菌引起的神经外科术后CNS感染，且所有患者具有升高的HBP水平。术后脑膜炎/脑室炎的诊断可能是诊断挑战，所以HBP将是神经外科环境中特别有用的标志物。

患有细菌性脑膜炎的四位患者具有低于50ng/mL的HBP水平。一位由在血液培养物中发现的A群链球菌引起，且另一位由通过阳性抗原测试而诊断的流感嗜血杆菌引起。这些患者都具有阴性CSF培养物。在这些病例中的CSF总WBC计数是300×10⁶/L和700×10⁶/L，乳酸水平分别是2.7和2.1mmol/L，且在充分抗生素治疗后24小时和48小时之间采集CSF样品。HBP水平低于50ng/mL的另两位患者患有由单核细胞增生利斯特氏菌引起的细菌性脑膜炎，具有阳性CSF培养物以及在抗生素开始时采集的样品。CSF乳酸水平是2.8和3.9mmol/L，且CSF WBC超过1000×10⁶/L。单核细胞增生利斯特氏菌是引起人脑膜炎和脑炎的兼性细胞内细菌且在其入侵机制和随后的生命周期与其他常见细菌性脑膜炎的病原体相比不同。总计五位患者被诊断患有单核细胞增生利斯特氏菌脑膜炎。这些患者中，两位具有仅轻度升高的HBP水平的患者还患有更为良性的疾病，具有正常的意识且不需要ICU治疗。在病毒性CNS感染组中，两位患者相比于其他患者具有相当高的HBP浓度(41ng/mL和40ng/mL)。一位患者患有HSV-2脑膜炎，在CSF中具有496×10⁶/L的总的WBC和显著升高的6.6mmol/L的乳酸水平。另一位患者患有HSV-1脑炎，具有轻度升高的CSF-WBC(84)和乳酸(2.3)。二者都具有以阿昔洛韦治疗的不复杂的病程。

HBP引起血管渗漏和水肿形成，且脑水肿是严重的且有时是细菌性脑膜炎中致命的并发症。与之前的研究相似，在本研究的预期部分中存在16％的死亡率。然而，所有的非幸存者具有强烈升高的HBP水平(＞385ng/mL)。考虑到HBP对具有随后的血管渗漏的内皮细胞的影响，这表明HBP在细菌性脑膜炎的脑水肿发展中的作用。之前的研究已显示用肝素和单克隆CD18抗体治疗阻断嗜中性白细胞上负责HBP释放的β2-整联蛋白受体。这些治疗抑制白细胞的滚动、粘附和活化，这减少了大鼠和兔的肺炎球菌脑膜炎模型中的脑水肿和死亡率。假设，这种作用可能与由HBP引起的血管渗漏的阻断有关。

综上所述，本研究显示HBP在患有急性细菌性脑膜炎的患者的CSF中升高。在区别细菌性CNS感染和病毒性CNS感染上的更好的诊断准确性将允许临床医生更早地开始充分的治疗。

表1.研究群体的特征

“最初的抗生素治疗”是指对疑似急性细菌性脑膜炎接受最初的抗生素的患者。

Claims

1.用于检测肝素结合蛋白(HBP)的剂在制备用于在鉴定个体是否患有细菌性脑膜炎的方法中使用的测试试剂盒中的用途，所述方法包括测量取自所述个体的脑脊液(CSF)样品中的HBP并从而确定所述个体是否患有细菌性脑膜炎。

2.根据权利要求1所述的用途，其中确定所述个体是否患有细菌性脑膜炎包括确定所述样品中HBP的浓度是否大于15ng/ml。

3.根据权利要求1所述的用途，其中确定所述个体是否患有细菌性脑膜炎包括确定所述样品中HBP的浓度是否大于25ng/ml。

4.根据权利要求1所述的用途，其中确定所述个体是否患有细菌性脑膜炎包括确定所述样品中HBP的浓度是否大于35ng/ml。

5.根据权利要求1所述的用途，其中确定所述个体是否患有细菌性脑膜炎包括确定所述样品中HBP的浓度是否大于50ng/ml。

6.根据权利要求1所述的用途，其中所述样品中HBP的水平或浓度相对于HBP的基线水平或浓度增加至少3倍。

7.根据权利要求1所述的用途，其中所述样品中HBP的水平或浓度相对于HBP的基线水平或浓度增加至少4倍。

8.根据权利要求1所述的用途，其中所述个体被怀疑患有脑膜炎。

9.根据权利要求8所述的用途，其中所述个体最近经历了神经外科手术。

10.根据权利要求8所述的用途，其中所述个体具有颅骨外伤和/或影响颅部、颈部或腰骶部的解剖异常的病史。

11.根据权利要求8至10中任一项所述的用途，其中所述个体是：免疫受损的；具有耳蜗植入物的患者；具有颅骨或神经外科植入物的患者，或其任何组合。

12.根据权利要求8至10中任一项所述的用途，其中所述个体已接受针对细菌性脑膜炎的治疗。

13.根据权利要求1所述的用途，其中所述个体是哺乳动物。

14.如权利要求13所述的用途，其中所述哺乳动物是人。

15.根据权利要求1至8和13中任一项所述的用途，其中所述剂包括HBP特异性抗体或其HBP结合片段。