CN202676703U

CN202676703U - 一种定量检测盐酸克伦特罗的试剂盒

Info

Publication number: CN202676703U
Application number: CN 201220300557
Authority: CN
Inventors: 王金爱
Original assignee: BEIJING KANGMEI TIANHONG BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING KANGMEI TIANHONG BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2012-06-20
Filing date: 2012-06-20
Publication date: 2013-01-16
Anticipated expiration: 2022-06-20

Abstract

本实用新型公开了一种基于胶体金免疫层析技术定量检测盐酸克伦特罗（CBL）的试剂盒。该试剂盒包括扣卡和胶体金免疫层析试纸条，所述扣卡包括记录有试剂盒产品信息以及标准曲线的一维或二维条形码；当与胶体金定量分析仪结合使用时，定量分析仪读取背景、定量带、质控带的光密度值，以及上述条形码的标准曲线信息，经内部软件计算得出定量带校正后的实际光密度值，再根据条形码上所记录的标准曲线，通过内部软件计算得出CBL的精确含量。本实用新型试剂盒操作简便、结果直观，并且检测灵敏度高。

Description

一种定量检测盐酸克伦特罗的试剂盒

技术领域

本实用新型涉及动物性食品、血液及尿液中盐酸克伦特罗的检测，特别涉及一种定量检测动物性食品、血液及尿液中盐酸克伦特罗浓度的试剂盒。

背景技术

盐酸克伦特罗（HCl-clenbuterol)）简称克伦特罗（CBL），商品名称为克喘素、息喘宁、舒喘宁、平喘素、安喘素及瘦肉精，化学名为a-[（叔丁氨基）甲基]-4-氨基-3,5-二氯苯甲醇盐酸盐，分子式为C₁₂H₁₈Cl₁₂N₂O·HCl，相对分子质量为313.65。它是一种选择性β-2肾上腺素受体激动剂，具有调节动物神经兴奋及其体内营养素重分配的功能。

盐酸克伦特罗（CBL）于1964年首次在美国合成，属于β-类兴奋剂，最初在临床上主要用于防治人、畜支气管哮喘和痉挛。1984年美国一家公司意外发现高于治疗剂量5~10倍以上（>1μg/kg·d）CBL添加于饲料饲喂动物后，可明显促进动物生长、改善胴体品质、提高瘦肉率，于是欧美等国开始将CBL广泛用于动物饲料。

但是，盐酸克伦特罗的应用对动物有害，在饲用初期会在短期内出现如下症状：血压升高、血管扩张、心率加快、呼吸加剧、体温上升、心脏和肾脏负担加重等剧烈反应，并出现采食下降、行为动作失调、神经紧张不安甚至全身震颤等症状。人食用了含有克喘素等盐酸克伦特罗残留的肉食，会出现类似于动物甚至比动物更严重的症状。盐酸克伦特罗对人体危害的持续时间较长，虽然目前未有中毒患者死亡的报道，但给患者的精神、健康及正常生活工作造成了严重危害。

我国政府严令申明不得在家畜的饲料及其他添加物中使用盐酸克伦特罗，并且通过相关政策手段对相关领域进行行政干预和抽检。

限制盐酸克伦特罗滥用的有力手段之一即为现场快速检测，因此市场急切的需要一种快捷简单、价格低廉、不依赖任何仪器设备，同时又能准确、灵敏的检测盐酸克伦特罗的手段，这一手段可以供所有检验检疫部门甚至消费者自己使用，为使用者提供盐酸克伦特罗浓度的基本信息，为是否需要进行下一步精确检测提供依据。

以胶体金试纸条技术为代表的快速膜检测技术作为一种稳定和实用的技术，适合在多样情况下使用。目前，胶体金试纸条技术进行定量或半定量检测的方式主要有三种：

第一种，简单根据测试结果信号在视觉上的对比，提供半定量结果，可分为阴性、弱阳性、中阳性和强阳性；

第二种，在检测区域设计多条检测线，每条检测线设计成只结合已知一定量的分析物，当分析物过量或不足量时，分析物将会和下一条检测线结合，这样会在测试区产生一个温度计式的条带梯度，因此可以根据检测结果中出现检测线的多少，判断样品中被测物的浓度范围。

第三种，测试样品所产生的信号由一个小型的、便携式的分析仪读取，并由分析仪将有色的测试线转换为数字信号，从而根据信号的强弱判断被测物的量；此类型的最终检测结果仍以阴性、弱阳性、中阳性和强阳性表示，并没有快捷地给出CBL的精确含量。

发明内容

本实用新型要解决的技术问题为提供一种定量检测盐酸克伦特罗的试剂盒，在与配套的胶体金定量分析仪结合使用时，可以得到样品中盐酸克伦特罗的准确含量。

为解决上述技术问题，本实用新型提供了一种定量检测盐酸克伦特罗的试剂盒，包括扣卡和胶体金免疫层析试纸条；所述扣卡包括记录有试剂盒产品信息以及标准曲线的一维或二维条形码；所述胶体金免疫层析试纸条包括样品垫（1）、结合垫（2）、层析膜（3）、吸水垫（4）和背衬垫（7），其中样品垫（1）、结合垫（2）、层析膜（3）和吸水垫（4）搭载于背衬垫（7）之上，样品垫（1）连接于结合垫（2），结合垫（2）连接于层析膜（3），层析膜（3）上设置有质控带（5）和定量带（6），层析膜（3）连接于吸水垫（4）。

上述试剂盒中，所述定量带包被有盐酸克伦特罗-BSA抗原，所述质控带包被有无关抗原，所述结合垫上固定有胶体金标记的抗盐酸克伦特罗抗体和胶体金标记的抗所述无关抗原的抗体；所述抗无关抗原的抗体与所述盐酸克伦特罗-BSA抗原无非特异性免疫反应，所述抗盐酸克伦特罗抗体与所述无关抗原无非特异性免疫反应。

在具体的实施例中，所述抗盐酸克伦特罗的抗体为鼠源单克隆抗体，所述无关抗原为兔免疫球蛋白IgG，所述抗无关抗原的抗体为羊抗兔IgG抗体。

上述试剂盒中，所述胶体金的颗粒大小为25～30nm，采用鞣酸-柠檬酸钠还原法制备胶体金分散颗粒，具体步骤如下：将超纯水加热到60℃，然后加入1％氯化金溶液2ml，搅拌1min后，向其中快速加入还原剂（1％柠檬酸钠，0.5％单宁酸）4ml，继续搅拌，反应持续大约10min，此时颜色由黑变蓝再变为亮红(近似红葡萄酒颜色)，然后用冷水浴使反应溶液降到室温。

所述胶体金标记抗体的制备方法为：取胶体金1ml，至搅拌器上匀速搅拌；加入5~10μl 0.2M K₂CO₃调整PH及形成一个标记缓冲体系；将5~10μg抗体用纯水稀释至50~100μl，逐滴加入至1ml金液中，标记搅拌时间1h；匀速加入50μl 10%BSA进行封闭，搅拌时间0.5h；平衡离心，12000r/min，25min；弃上清，用0.02mol/L,pH 8.0的Tris-HCl缓冲液复溶沉淀物至100μl；加入20%蔗糖和5%海藻糖。

所述试剂盒可以检测动物肌肉及组织、动物尿液和血液等，根据样品的不同，前处理的方法不同。当样品为尿液和血清时，可以直接检测；当样品为动物肌肉或组织时，前处理方法如下：将精肉或内脏样本4克以上（越细越好），装入5ml的离心管中（以装满管子四分之三为宜），拧紧管盖（不要让水进入管子内）。将装有样品的离心管在90℃以上水浴加热（采用耐高温的容器例如铝饭盒等，注入水，升温至90℃以上，将离心管放入容器内水浴中加热）10分钟后（肉熟透为准）取出冷却至室温。取3滴（约100μl）配套的PBST缓冲液，到1.5ml的小离心管中，然后甩净吸管内的残留液，用此吸管吸取煮出的样品渗出液，加3滴（约100μl）到1.5ml小离心管中，充分混合，待测。

本实用新型试剂盒检测盐酸克伦特罗的原理：

取一定量样品溶液加入样品垫，样本和被溶解的胶体金抗体结合物一起在过滤片上移动。如果样品溶液含有盐酸克伦特罗的残留，盐酸克伦特罗将和抗体先行反应，因此当扩散至定量带时，抗体的活性位点将因被样品溶液中的CBL占据而无法与定量带上CBL抗原结合。当样品中的CBL含量超过试剂板检出限时，试剂板上的定量带将较质控带显色淡或甚至无显色。反之，当样品中CBL含量在试剂板检出限以下或无残留时，试剂板上的定量带显色与质控带相近或偏深。

本实用新型试剂盒与胶体金定量分析仪结合使用定量检测待检样品中CBL含量的原理：

胶体金定量分析仪的光学系统采用了一个CMOS数字图像传感器，扫描并读取背景、定量带和质控带的光密度信息，以及上述一维或二维条形码所记录的标准曲线。读取的背景及条带（定量带和质控带）的光密度值为原始反射密度值，经过内部计算得到扣除背景噪声并经质控带校正后的实际光密度值（质控带用于校正环境因素如温度、湿度等对条带强度的影响），即实际光密度值=（背景值-定量带值）/质控带值，具体处理过程包括以下几个步骤：

1、条带区域采集

系统截取条带区域，为条带上下左右1mm范围内的矩形区域；

2、选取条带区域内的光密度峰值，并通过内部处理去除条带区域内的非特异光密度峰，以使结果更准确；

3、读取原始反射光密度值并经内部计算报告结果。

4、根据条形码所记录的标准曲线，通过内部计算得出样品中CBL的实际含量。

因此，当将本实用新型试剂盒与配套的胶体金定量分析仪结合使用时，可以直接得出待检样品中盐酸克伦特罗的准确含量，具有简单、直观的特点，且其检测灵敏度高、应用灵活、方便。

附图说明

图1为本实用新型胶体金免疫层析试纸条组装示意图，其中1为样品垫，2为结合垫，3为层析膜，4为吸水垫，5为质控带，6为定量带，7为背衬垫。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本实用新型的技术方案，下面结合具体实施例对本实用新型作进一步的详细说明。

实施例1胶体金的制备

所用试剂：

A液：1%氯化金；

B液：1%柠檬酸钠，0.5%单宁酸；

用水均为电导率达到18.2的超纯水。

采用鞣酸-柠檬酸钠还原法制备胶体金分散颗粒，具体步骤如下：

将超纯水加热到60℃，然后加入A液2mL，搅拌1min后，向其中快速加入B液4mL，继续搅拌，反应持续大约10min，此时颜色由黑变蓝再变为亮红(近似红葡萄酒颜色)。然后用冷水浴使反应溶液降到室温。制备的胶体金颗粒约为30nm，在紫外吸收光度仪上进行全波长扫描，最大吸收波长约为524nm。制备的胶体金在4℃下可以保存一个月。

实施例2胶体金标记抗体的制备

1）取实施例1所制胶体金100ml，至搅拌器上匀速搅拌。

2）加入600μl 0.2M K₂CO₃调整PH及形成一个标记缓冲体系。

3）分别将500μg抗CBL的鼠源单克隆抗体、羊抗兔IgG用纯水稀释至5ml，再分别逐滴加入至100ml金液中，标记搅拌时间1h。

4）匀速加入5ml10%BSA进行封闭，搅拌时间0.5h。

5）平衡离心，12000r/min，25min。

6）弃上清，用G-buffer复溶沉淀物至10ml；切记上清尽可能弃干净，否则会影响后期灵敏度。

7）加入20%蔗糖，约2g；5%海藻糖，约0.5g。

8）测OD，点小样，37℃烘干，分别得到抗CBL的胶体金标记抗体和羊抗兔IgG的胶体金标记抗体。

实施例3试纸条组装

将实施例2所得胶体金标记的CBL抗体、羊抗兔IgG抗体以一定比例混合均匀，并加入一定量蔗糖、牛血清白蛋白(BSA)和Tween-20、Tween-80、Brij等表面活性剂，其中表面活性剂含量在0.01~1%之间，然后喷涂在玻璃纤维膜上，得到结合垫，37℃干燥后密封，4℃下保存。

在硝酸纤维素膜上用机器划两条平行带，条带间隔5mm，条带宽都约为1mm。其中第一条为质控带，第二条为定量带。质控带上喷涂兔免疫球蛋白(IgG)，浓度为1~1.5mg/ml，；第二条带喷涂的CBL-BSA抗原浓度为0.2~0.5mg/ml。得层析膜，37℃干燥4h后密封，常温下保存。

在PVC板上，依次粘贴上层析膜（长30cm，宽2.5cm）、结合垫（长30cm，宽8mm）、样品垫（长30cm，宽17mm）和吸水垫（长30cm，宽17mm）。用切条机将粘贴好的塑料板纵向切成3.8mm宽的试纸条，放入扣卡中组装成免疫层析试剂盒，干燥后密封，常温下保存。

实施例4本实用新型试剂盒标准曲线的绘制及样本检测

将盐酸克伦特罗阴性猪尿作为稀释液，将盐酸克伦特罗标准品配置成系列浓度待测质控品如下：0ng/mL、1.25ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL。

检测时将阴性样本稀释液或系列浓度质控品80μL垂直滴到样品垫上，层析，10min后使用胶体金定量分析仪检测各浓度质控品的背景、条带（检测带和质控带）的光密度信号，经仪器内部计算后得出实际值为：（背景值-定量带值）/质控带值，以该实际值为纵坐标，以对应的质控品浓度为横坐标，绘制标准曲线。

将所得到的标准曲线输入一维或二维条形码，并黏贴到扣卡上，以备检测使用。

随机收集猪尿样本，滴加到试纸条样品垫上，层析；在读数阶段，使用胶体金定量分析仪读取背景、条带（定量带和质控带）以及扣卡条形码上的标准曲线信息，根据内部计算得出定量带的实际光密度值即（背景值-定量带值）/质控带值，以及扣卡条形码上的标准曲线信息，经内部软件计算得出样品中的CBL含量。

经测试，本实用新型试剂盒的最低检测限为2.5ng/mL，批内与批间重复性均较好，且相关系数R²>0.99，可为检测单位及部门提供参考价值。

以上所述仅是本实用新型的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本实用新型原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本实用新型的保护范围。

Claims

1.一种定量检测盐酸克伦特罗的试剂盒，包括扣卡和胶体金免疫层析试纸条；所述扣卡包括记录有试剂盒产品信息以及标准曲线的一维或二维条形码；所述胶体金免疫层析试纸条包括样品垫（1）、结合垫（2）、层析膜（3）、吸水垫（4）和背衬垫（7），其中样品垫（1）、结合垫（2）、层析膜（3）和吸水垫（4）搭载于背衬垫（7）之上，样品垫（1）连接于结合垫（2），结合垫（2）连接于层析膜（3），层析膜（3）上设置有质控带（5）和定量带（6），层析膜（3）连接于吸水垫（4）。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述定量带包被有盐酸克伦特罗-BSA抗原，所述质控带包被有无关抗原，所述结合垫上固定有胶体金标记的抗盐酸克伦特罗抗体和胶体金标记的抗所述无关抗原的抗体。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述抗盐酸克伦特罗的抗体为鼠源单克隆抗体，所述无关抗原为兔免疫球蛋白IgG，所述抗无关抗原的抗体为羊抗兔IgG抗体。

4.如权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述胶体金的颗粒大小为25～30nm。