JPWO2012053305A1 - 筋萎縮性側索硬化症マーカー及びその利用 - Google Patents

筋萎縮性側索硬化症マーカー及びその利用 Download PDF

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Abstract

筋萎縮性側索硬化症に特異的なバイオマーカー及びその用途を提供することを課題とする。膜貫通糖タンパク質nmbからなる筋萎縮性側索硬化症マーカー及びそれを利用した筋萎縮性側索硬化症の検査法等が提供される。

Description

本発明は筋萎縮性側索硬化症の検査に有用な筋萎縮性側索硬化症マーカーに関する。詳しくは、筋萎縮性側索硬化症の発症可能性の判定に利用可能なバイオマーカー及びそれを利用した筋萎縮性側索硬化症の検査法等に関する。本出願は、２０１０年１０月１８日に出願された日本国特許出願第２０１０−２３３２１０号に基づく優先権を主張するものであり、当該特許出願の全内容は参照により援用される。
筋萎縮性側索硬化症（Amyotrophic lateral sclerosis：ALS）は、上位及び下位運動ニューロンをほぼ選択的に障害する慢性進行性の変性疾患である。運動ニューロン逸脱による筋力低下がALSの主症状であるが、知覚ニューロンは正常であり、体の自由はきかないものの痛みは感じる非常に残酷な疾患である。治療薬としてはグルタミン酸拮抗薬リルゾールが唯一用いられているが、満足できる効果は得られていない。ALSは長年の精力的な研究活動にもかかわらず今なお有効な治療法を見出すことのできない神経難病であり、早急な発症機序の解明ならびに治療薬の開発が必要とされている。
特表２００６−５１４６２０号公報 特表２００９−５２８０５９号公報 特表２００７−５２８４８７号公報
Serum proteome analysis for profiling protein markers associated with carcinogenesis and lymph node metastasis in nasopharyngeal carcinoma., Clin Exp Metastasis., 2008. APPLYING PROTEOMICS TO THE DIAGNOSIS AND TREATMENT OF ALS AND RELATED DISEASES., Muscle Nerve., 2009. Plasma and Cerebrospinal Fluid-Based Protein Biomarkers for Motor Neuron Disease., Mol Diag Ther., 2006.
長年の研究において多くのALS病態関連分子が同定されてきたが（例えば特許文献１〜３、非特許文献１〜３を参照）、ALSの原因は依然として不明である。現在の技術ではALSの発症（或いは発症可能性）を早期に把握することはもとよりALSの診断ですら容易ではない。ALSの診断に有用な客観的指標がないために治療的介入が遅れ、その結果、難治化している症例が少なくない。
そこで本発明は、ALSの早期診断や信頼度の高い診断等を可能にすべく、ALS特異的なバイオマーカー及びその用途、即ちALSの検査に有用な技術を提供することを課題とする。具体的には、本発明の課題は、ALSの検査に有用なバイオマーカー、当該バイオマーカーを利用した検査法、及び当該検査法に利用される検査試薬などを提供することにある。
ALS特異的なバイオマーカーを見出すべく本発明者らは、ALSモデルマウスを用いて研究を進めた。DNAマイクロアレイ法による詳細な解析の結果、ALSモデルマウスの脊髄において膜貫通糖タンパク質nmb（glycoprotein(transmenbrane）nmb；GPNMB） mRNAの有意な上昇を認めた。そこで当該分子に注目して検討した結果、運動神経細胞及びアストログリア細胞に局在することが判明するなど、GPNMBがALSの病態形成に関与することが示唆された。また、ALSモデルマウスの脊髄中では発症前よりGPNMBの発現量増加を認めるとともに、病態進行に伴ってGPNMBの発現量が増加することが判明した。一方、ALS患者の臨床サンプルを用いて更に検討を進めた結果、ALS患者の脊髄前角においてGPNMBの凝集・沈着を認めるとともに、ALS患者血清中においてGPNMBの有意な増加を認めた。即ち、ALSのバイオマーカーとしてGPNMBが臨床上極めて有用であることが示された。下記の本発明は主として以上の成果に基づく。
［１］膜貫通糖タンパク質nmbからなる、筋萎縮性側索硬化症マーカー。
［２］膜貫通糖タンパク質nmbの検体中レベルを指標として用いることを特徴とする、筋萎縮性側索硬化症検査法。
［３］以下のステップ（１）〜（３）を含む、［２］に記載の筋萎縮性側索硬化症検査法：
（１）被検者由来の検体を用意するステップ；
（２）前記検体中の膜貫通糖タンパク質nmbを検出するステップ；及び
（３）検出結果に基づいて、筋萎縮性側索硬化症の現在又は将来の発症可能性を判定するステップ。
［４］検出値が高いと発症可能性が高いとの基準、又は検出できると発症可能性が高いとの基準に従い、ステップ（３）の判定を行う、［３］に記載の筋萎縮性側索硬化症検査法。
［５］ステップ（２）で得られた検出値と対照検体の検出値との比較に基づきステップ（３）の判定を行う、［３］又は［４］に記載の筋萎縮性側索硬化症検査法。
［６］ステップ（２）で得られた検出値と、同一の被検者から過去に採取された検体中の検出値との比較に基づきステップ（３）の判定を行う、［３］又は［４］に記載の筋萎縮性側索硬化症検査法。
［７］前記検体が血液、血漿、血清、骨髄、又は脳脊髄液である、［２］〜［６］のいずれか一項に記載の筋萎縮性側索硬化症検査法。
［８］［１］に記載の筋萎縮性側索硬化症マーカーに特異的結合性を示す物質からなる、筋萎縮性側索硬化症検査試薬。
［９］前記物質が抗体である、［８］に記載の筋萎縮性側索硬化症検査試薬。
［１０］［８］又は［９］に記載の筋萎縮性側索硬化症検査試薬を含む、筋萎縮性側索硬化症検査用キット。
14週齢SOD1G93Aおよび野生型（WT）マウス脊髄を用いたDNAマイクロアレイの結果より作成されたスキャッタープロット（scatchard plot）である。(A)はWTマウス間、(B)はWTおよびSOD1G93Aマウス間の遺伝子発現の差異を示す。上側の直線及び下側の直線はそれぞれ発現遺伝子の2倍増加および減少を示す。 SOD1G93AマウスおよびWTマウス間で発現が二倍以上かつ有意(p < 0.05)に増加した遺伝子群上位30を示す表である。 14週齢SOD1G93AおよびWTマウス脊髄におけるGPNMB mRNA量を示すグラフである。データは平均±標準誤差で表される。**P < 0.01vs. WT(スチューデントのt検定)。 14週齢SOD1G93AおよびWTマウス脊髄におけるGPNMBの局在を示す図である。NeuNは神経細胞、GFAPは活性化アストロサイト、Iba-1はミクログリアおよびヘキスト（Hoechst）は核をそれぞれ示す。スケールバーは50μm。 ALS病態進行によるGPNMBの発現変化を示す図である。6、10、14週齢および病態末期における、SOD1G93AおよびWTマウス脊髄のGPNMBの発現を示す。スケールバーは100μm。データは平均±標準誤差で表される。**P < 0.01 vs. WT(スチューデントのt検定)。 脊髄組織を摘出した対象6例の背景をまとめた表である。年齢と死後経過時間（post mortem interval(PMI)）のデータは平均±標準偏差で表される。M：男性、F：女性 弧発性ALS患者および対照疾患患者脊髄におけるGPNMBの発現を示す図である。矢印は弧発性ALS患者脊髄におけるGPNMB陽性封入体を示す。スケールバーは100μm。データは平均±標準誤差で表される。**P < 0.01 vs.対照群 （スチューデントのt検定)。 血清サンプルを採取した対象20例の背景をまとめた表である。年齢のデータは平均±標準偏差で表される。 弧発性ALS患者および正常者の血清中GPNMB濃度を示す図である。データは平均±標準誤差で表される。**P < 0.01 vs. 対照群 (スチューデントのt検定)。
（本発明の第１の局面：筋萎縮性側索硬化症（ALS）のバイオマーカー）
本発明の第１の局面はALSのバイオマーカー（以下、「本発明のバイオマーカー」とも呼ぶ）に関する。本発明のバイオマーカーはALSの現在又は将来の発症可能性を評価する上で有用な指標である。「現在の発症可能性」は、検査時においてALSを発症しているか否か又は発症している確率を表すことになる。他方、「将来の発症可能性」はALSを将来発症する可能性（リスク）を表す。
本発明のバイオマーカーは、本発明者らによる検討の成果としてALSとの相関を認めた分子「膜貫通糖タンパク質nmb（glycoprotein(transmenbrane）nmb）」からなる。以下の説明では、慣例に従い、その遺伝子シンボル「GPNMB」を用いて当該分子を表す。
GPNMBはメラノサイト特異的タンパク質Pmel17に相同性を示す膜貫通型の糖タンパク質である。GPNMBには二つの転写バリアント、即ち572アミノ酸からなるアイソフォームaと560アミノ酸からなるアイソフォームbが存在する。特定の癌腫（メラノーマ、グリオーマ、乳癌など）においてGPNMBが高発現していることが報告されており、メラノーマや乳癌に対する抗体療法の標的としてGPNMBは注目されている。尚、GPNMBのアイソフォームaのアミノ酸配列及びそれをコードするヌクレオチド配列をそれぞれ配列表の配列番号１（NCBIのACCESSION： NP_001005340、DEFINITION: transmembrane glycoprotein NMB isoform a precursor [Homo sapiens].）及び配列番号２（NCBIのACCESSION: NM_001005340、DEFINITION: Homo sapiens glycoprotein (transmembrane) nmb (GPNMB), transcript variant 1, mRNA.）に示す。同様にGPNMBのアイソフォームbのアミノ酸配列及びそれをコードするヌクレオチド配列をそれぞれ配列表の配列番号３（NCBIのACCESSION: NP_002501、DEFINITION: transmembrane glycoprotein NMB isoform b precursor [Homo sapiens].）及び配列番号４（NCBIのACCESSION: NM_002510、DEFINITION: Homo sapiens glycoprotein (transmembrane) nmb (GPNMB), transcript variant 2, mRNA.）に示す。
（本発明の第２の局面：ALS検査法）
本発明の第２の局面は上記本発明のバイオマーカーの用途に関し、ALSの現在又は将来の発症可能性を検査する方法（以下、「本発明の検査法」とも呼ぶ）を提供する。本発明の検査法は、ALSを現在発症しているか否かを判定するための手段として、或いはALSを将来発症する可能性を判定するための手段として有用である。即ち、本発明の検査法はALSを診断する上で有用な情報を与える。本発明の検査法によればALSの発症可能性を簡便且つ客観的に判定することが可能となる。
本発明の検査法では、被検者由来の検体中における、本発明のバイオマーカーのレベルが指標として用いられる。ここでの「レベル」は、典型的には「量」ないし「濃度」を意味する。但し、慣例及び技術常識に従い、検出対象の分子を検出できるか否か（即ち見かけ上の存在の有無）を表す場合にも用語「レベル」が用いられる。
本発明の検査法では以下のステップを行う。
（１）被検者由来の検体を用意するステップ
（２）前記検体中の膜貫通糖タンパク質nmb（GPNMB）を検出するステップ
（３）検出結果に基づいて、筋萎縮性側索硬化症（ALS）の現在又は将来の発症可能性を判定するステップ
ステップ（１）では被検者由来の検体を用意する。検体としては被検者の血液、血漿、血清、骨髄、脳脊髄液等を用いることができる。被検者は特に限定されない。即ち、ALSの現在又は将来の発症可能性（即ち、ALSを発症している可能性の有無、ALSを発症している可能性の程度、ALSを将来発症する可能性の程度）の判定が必要な者に対して広く本発明を適用することができる。例えば、医師の問診などによってALSであると診断された患者に対して本発明を適用した場合、発現レベルという客観的な指標に基づいて当該診断の当否を判定することができる。即ち、本発明の検査法によれば従来の診断を補助或いは裏付ける情報が得られる。当該情報は、より適切な治療方針の決定に有益であり、治療効果の向上や患者のＱＯＬ（Quality of Life、生活の質）の向上を促す。一方、罹患状態のモニターに本発明を利用し、難治化、重篤化、再発等の防止を図ることもできる。
家族背景などからALSの罹患リスクが高いと推定される者（高リスク者）も好適な被検者である。このような被検者に対してALSの症状が現れる前に本発明を適用することは、発症の阻止又は遅延或いは早期の治療介入を可能にする。ALSの罹患リスクが高い者を特定する目的にも本発明は有用である。このような特定は、例えば、予防的措置や生活習慣の改善等による発症可能性（罹患可能性）の低下を可能にする。自覚症状がない者など、従来の診断ではALSであるか否かの判定が不能又は困難な者も本発明の好適な被検者である。尚、健康診断の一項目として本発明を実施することにしてもよい。
ステップ（２）では検体中における本発明のバイオマーカーを検出する。バイオマーカーのレベルを厳密に定量することは必須でない。即ち、後続のステップ（３）においてALSの発症可能性が判定可能となる程度にバイオマーカーのレベルを検出すればよい。例えば、検体中のバイオマーカーのレベルが所定の基準値を超えるか否かが判別可能なように検出を行うこともできる。
バイオマーカーの検出方法は特に限定されないが、好ましくは免疫学的手法を利用する。免疫学的手法によれば迅速且つ感度のよい検出が可能である。また、操作も簡便である。免疫学的手法による測定では、採用するバイオマーカーに特異的結合性を有する物質を使用する。当該物質としては通常は抗体が用いられるが、当該バイオマーカーに特異的結合性を有し、その結合量を測定可能な物質であれば抗体に限らず採用できる。尚、市販の抗体に限らず、免疫学的手法、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法などを利用して新たに調製した抗体を使用してもよい。
測定法として、ラテックス凝集法、蛍光免疫測定法（FIA法）、酵素免疫測定法（EIA法）、放射免疫測定法（RIA法）、ウエスタンブロット法を例示することができる。好ましい測定法としては、FIA法及びEIA法（ELISA法を含む）を挙げることができる。これらの方法によれば高感度、迅速且つ簡便に検出可能である。FIA法では蛍光標識した抗体を用い、蛍光をシグナルとして抗原抗体複合体（免疫複合体）を検出する。一方、EIA法では酵素標識した抗体を用い、酵素反応に基づく発色ないし発光をシグナルとして免疫複合体を検出する。
ELISA法は検出感度が高いことや特異性が高いこと、定量性に優れること、操作が簡便であること、多検体の同時処理に適することなど、多くの利点を有する。ELISA法を利用する場合の具体的な操作法の一例を以下に示す。まず、抗バイオマーカー抗体を不溶性支持体に固定化する。具体的には例えばマイクロプレートの表面を抗バイオマーカーモノクローナル抗体で感作する（コートする）。このように固相化した抗体に対して検体を接触させる。この操作の結果、固相化した抗バイオマーカー抗体に対する抗原（バイオマーカーであるタンパク質分子）が検体中に存在していれば免疫複合体が形成される。洗浄操作によって非特異的結合成分を除去した後、酵素を結合させた抗体を添加することで免疫複合体を標識し、次いで酵素の基質を反応させて発色させる。そして、発色量を指標として免疫複合体を検出する。尚、ELISA法の詳細については数多くの成書や論文に記載されており、各方法の実験手順や実験条件を設定する際にはそれらを参考にできる。尚、非競合法に限らず、競合法（検体とともに抗原を添加して競合させる方法）を用いることにしてもよい。また、検体中のバイオマーカーを標識化抗体で直接検出する方法を採用しても、或いはサンドイッチ法を採用してもよい。サンドイッチ法では、エピトープの異なる２種類の抗体（捕捉用抗体及び検出用抗体）が用いられる。
プロテインアレイやプロテインチップ等、多数の検体を同時に検出可能な手段を用いることにしてもよい。プローブには例えば標的のバイオマーカー特異的な抗体が用いられる。
ステップ（３）では、検出結果に基づいてALSの現在又は将来の発症可能性を判定する。精度のよい判定を可能にするため、ステップ（２）で得られた検出値を対照検体（コントロール）の検出値と比較した上で判定を行うとよい。発症可能性の判定は定性的、定量的のいずれであってもよい。尚、ここでの判定は、その判定基準から明らかな通り、医師や検査技師など専門知識を有する者の判断によらずとも自動的／機械的に行うことができる。
本発明では、典型的には、「バイオマーカーの検出値が高いと発症可能性が高い」との基準、又は「バイオマーカーが検出できると発症可能性が高い」との基準が採用される。言うまでもないが、前者の基準、即ち「バイオマーカーの検出値が高いと発症可能性が高い」との基準は「バイオマーカーの検出値が低いと発症可能性が低い」との基準と同義である（後者の基準についても同様）。定性的判定と定量的判定の具体例を以下に示す。
（定性的判定の例１）
基準値よりもバイオマーカーの検出値（検体中レベル）が高いときに「発症可能性が高い」と判定し、基準値よりもバイオマーカーの検出値（検体中レベル）が低いときに「発症可能性が低い」と判定する。
（定性的判定の例２）
バイオマーカーを検出できた（反応性を認めた）ときに「発症可能性が高い」と判定し、バイオマーカーを検出できなかったときに「発症可能性が低い」と判定する。
（定量的判定の例）
以下に示すように検出値の範囲毎に発症可能性（％）を予め設定しておき、検出値から発症可能性（％）を判定する。
バイオマーカーの検出値がａ〜ｂ：発症可能性は１０％以下
バイオマーカーの検出値ｂ〜ｃ：発症可能性は１０％〜３０％
バイオマーカーの検出値ｃ〜ｄ：発症可能性は３０％〜５０％
バイオマーカーの検出値ｄ〜ｅ：発症可能性は５０％〜７０％
バイオマーカーの検出値ｅ〜ｆ：発症可能性は７０％〜９０％
本発明のバイオマーカーは単独でALSの良好な判定指標となり得るが、ALSの発症可能性を判定するにあたって、ALSの検査に有用な他の指標も利用することにしてもよい。即ち、本発明のバイオマーカーと他の指標を併用してALSの発症可能性を判定することにしてもよい。通常、組み合わせる指標の種類や数などによって診断（検出）感度及び診断（検出）特異度が異なる。従って、目的に合わせて最適な指標の組合せを選択するとよい。例えば、診断感度の高い組合せはスクリーニング的な検査に適する。対照的に、診断特異度の高い組み合わせは、より信頼性の高い判定が必要な検査（例えば２次検査や３次検査）に適する。診断感度及び診断特異度のバランスの異なる判定法を組み合わせることによって、効率化や確度ないし信頼性の向上を図ることが可能である。例えば、高い診断感度を与える指標の組合せを用いて陽性対象を絞り込んだ後（一次検査、スクリーニング検査）、高い診断特異度を与える指標の組合せを用いて最終的な判定を行う（２次検査）。このような２段階の判定に限らず、３段階以上の判定を行うことも可能である。
判定区分の数、及び各判定区分に関連付けられるバイオマーカーのレベル及び判定結果はいずれも上記の例に何らとらわれることなく、予備実験等を通して任意に設定することができる。例えば、所定の閾値を境界として発症可能性の高低を判定する場合の「閾値」や、発症可能性の高低に係る区分に関連づける「バイオマーカーのレベル範囲」は、多数の検体を用いた統計的解析によって決定することができる。統計処理を利用して解析する場合には、一般に、高リスク群と低リスク群を設定することが有効である。高リスク群としては例えば、ALS患者の集団や家系にALS患者の多い者の集団が該当し、低リスク群としては例えば、健常者の集団や家系にALS患者のいない者の集団が該当する。
本発明の一態様では、同一の被検者について、ある時点で測定されたバイオマーカーのレベルと、過去に測定されたバイオマーカーのレベルとを比較し、バイオマーカーのレベルの増減の有無及び／又は増減の程度を調べる。その結果得られる、バイオマーカーの発現レベル変化に関するデータはALSの発症可能性をモニターするため、治療効果を把握するため、或いは予後推定に有用な情報となる。具体的には例えば、バイオマーカーレベルの変動を根拠として、前回の検査から今回の検査までの間に発症可能性が高くなった又は低くなった或いは変化がないとの判定を行うことができる。このような評価をALSの治療と並行して行えば、治療効果の確認が行えることはもとより、ALSの再発の兆候を事前に把握することができる。これによって、より適切な治療方針の決定が可能となる。このように本発明は、治療効果の最大化及び患者のＱＯＬ（生活の質）向上に多大な貢献をし得る。
（本発明の第３の局面：ALSの発症可能性検査用試薬及びキット）
本発明はさらに、ALSの発症可能性を検査するための試薬及びキットも提供する。本発明の試薬は本発明のバイオマーカーに特異的結合性を示す物質（以下、「結合分子」と呼ぶ）からなる。結合分子の例として、バイオマーカーを特異的に認識する抗体、核酸アプタマー及びペプチドアプタマーを挙げることができる。結合分子は、採用するバイオマーカーに対する特異的結合性を有する限り、その種類や由来などは特に限定されない。また、抗体の場合、ポリクローナル抗体、オリゴクローナル抗体（数種〜数十種の抗体の混合物）、及びモノクローナル抗体のいずれでもよい。ポリクローナル抗体又はオリゴクローナル抗体としては、動物免疫して得た抗血清由来のIgG画分のほか、抗原によるアフィニティー精製抗体を使用できる。Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv抗体などの抗体断片であってもよい。
結合分子は常法で調製すればよい。市販品が入手可能であれば、当該市販品を用いても良い。例えば、抗体であれば免疫学的手法、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法などを利用して調製することができる。免疫学的手法によるポリクローナル抗体の調製は次の手順で行うことができる。抗原（バイオマーカー又はその一部）を調製し、これを用いてマウスやラット或いはウサギ等の動物に免疫を施す。生体試料を精製することにより抗原を得ることができる。また、組換え型抗原を用いることもできる。組換え型抗原は、例えば、バイオマーカーをコードする遺伝子（遺伝子の一部であってもよい）を、ベクターを用いて適当な宿主に導入し、得られた組換え細胞内で発現させることにより調製することができる。
免疫惹起作用を増強するために、キャリアタンパク質を結合させた抗原を用いてもよい。キャリアタンパク質としてはKLH（Keyhole Limpet Hemocyanin）、BSA（Bovine Serum Albumin）、OVA（Ovalbumin）などが使用される。キャリアタンパク質の結合にはカルボジイミド法、グルタルアルデヒド法、ジアゾ縮合法、MBS（マレイミドベンゾイルオキシコハク酸イミド）法などを使用できる。一方、バイオマーカー（又はその一部）を、GST、βガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク、又はヒスチジン（His）タグ等との融合タンパク質として発現させた抗原を用いることもできる。このような融合タンパク質は、汎用的な方法により簡便に精製することができる。
必要に応じて免疫を繰り返し、十分に抗体価が上昇した時点で採血し、遠心処理などによって血清を得る。得られた抗血清をアフィニティー精製し、ポリクローナル抗体とする。
一方、モノクローナル抗体については次の手順で調製することができる。まず、上記と同様の手順で免疫操作を実施する。必要に応じて免疫を繰り返し、十分に抗体価が上昇した時点で免疫動物から抗体産生細胞を摘出する。次に、得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合してハイブリドーマを得る。続いて、このハイブリドーマをモノクローナル化した後、目的タンパク質に対して高い特異性を有する抗体を産生するクローンを選択する。選択されたクローンの培養液を精製することによって目的の抗体が得られる。一方、ハイブリドーマを所望数以上に増殖させた後、これを動物（例えばマウス）の腹腔内に移植し、腹水内で増殖させて腹水を精製することにより目的の抗体を取得することもできる。上記培養液の精製又は腹水の精製には、プロテインG、プロテインA等を用いたアフィニティークロマトグラフィーが好適に用いられる。また、抗原を固相化したアフィニティークロマトグラフィーを用いることもできる。更には、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、硫安分画、及び遠心分離等の方法を用いることもできる。これらの方法は単独ないし任意に組み合わされて用いられる。
バイオマーカーへの特異的結合性を保持することを条件として、得られた抗体に種々の改変を施すことができる。このような改変抗体を本発明の試薬としてもよい。
特異的結合分子として標識化抗体を使用すれば、標識量を指標に結合抗体量を直接検出することが可能である。従って、より簡便な検査法を構築できる。その反面、標識物質を結合させた抗体を用意する必要があることに加えて、検出感度が一般に低くなるという問題点がある。そこで、標識物質を結合させた二次抗体を利用する方法、二次抗体と標識物質を結合させたポリマーを利用する方法など、間接的検出方法を利用することが好ましい。ここでの二次抗体とは、採用するバイオマーカーに特異的な抗体に対して特異的結合性を有する抗体である。例えば、バイオマーカーに特異的な抗体をウサギ抗体として調製した場合には抗ウサギIgG抗体を二次抗体として使用することができる。ウサギやヤギ、マウスなど様々な種の抗体に対して使用可能な標識二次抗体が市販されており（例えばフナコシ株式会社やコスモ・バイオ株式会社など）、本発明の試薬に応じて適切なものを適宜選択して使用することができる。
標識物質の例は、ペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ及びグルコース−６−リン酸脱水素酵素などの酵素、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）及びユーロピウムなどの蛍光物質、ルミノール、イソルミノール及びアクリジニウム誘導体などの化学発光物質、NADなどの補酵素、ビオチン、並びに131I及び125Iなどの放射性物質である。
一態様では、本発明の試薬はその用途に合わせて固相化されている。固相化に用いる不溶性支持体は特に限定されない。例えばポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、シリコン樹脂、ナイロン樹脂等の樹脂や、ガラス等の水に不溶性の物質からなる不溶性支持体を用いることができる。不溶性支持体への抗体の担持は物理吸着又は化学吸着によって行うことができる。
本発明のキットは主要構成要素として本発明の試薬を含む。検査法を実施する際に使用するその他の試薬（緩衝液、ブロッキング用試薬、酵素の基質、発色試薬など）及び／又は装置ないし器具（容器、反応装置、蛍光リーダーなど）をキットに含めてもよい。また、標準試料として本発明のバイオマーカー分子又はその断片をキットに含めることが好ましい。尚、通常、本発明のキットには取り扱い説明書が添付される。
ALS関連分子の同定を目指し、以下の実験を行った。
１．材料と方法
(1)実験材料
本実験に用いた薬物および試薬は、以下の通りである。パラホルムアルデヒド(paraformaldehyde)、スクロース(sucrose)、塩化カリウム(potassium chloride)、エタノール(ethanol)、クロロホルム(chloroform)、メタノール(methanol)およびrabbit anti- ionized calcium-binding adaptor molecule 1(Iba1)polyclonal antibodyは和光純薬株式会社(大阪、日本)、リン酸水素二ナトリウム・12水和物(sodium hydrogenphosphate 12-water)、リン酸二水素ナトリウム二水和物(Sodium dihydrogenphosphate dehydrate)はナカライテスク株式会社(京都、日本)、キシレン(xylene)、塩化ナトリウム(sodium chloride)はキシダ化学株式会社(大阪、日本)、ネンブタール(Nembutal)は大日本住友製薬株式会社(大阪、日本)、RNAlater-ICEはライフテクノロジーズジャパン株式会社(東京、日本)、正常ヤギ血清（normal goat serum）、正常ウマ血清（normal horse serum）、Vectastain elite Avidin Biotinylated Enzyme complex(ABC)kit、M.O.M. immunodetection kitおよびdiaminobenzidine(DAB)peroxidase substrate kitはVector Laboratories（バーリンゲーム、米国)、O.C.T.コンパウンドはサクラ精機株式会社(東京、日本)、Can Get Signal（登録商標） immunostain solution Aは東洋紡績株式会社(大阪、日本)、マウス抗GPNMBポリクローナル抗体はSanta Cruz Biotechnology(サンタクルーズ、米国)、マウス抗NeuNモノクローナル抗体およびマウス抗グリア線維酸性タンパク質（glial fibrillary acidic protein；GFAP)モノクローナル抗体はMillipore(ベッドフォード、米国)、マウス抗CD11bモノクローナル抗体はBMA Biomedicals(Augst、スイス)、Alexa 488結合ロバ抗ヤギIgG抗体、Alexa 546結合ロバ抗ウサギIgG抗体、Alexa 488結合ウサギ抗マウスIgG抗体、Alexa 546結合ウサギ抗ヤギIgG抗体およびヘキスト33342はインビトロジェン社(東京、日本)、fluoromountはDiagnostic BioSystems(プレザントン、米国)、EUKITT試薬はO. Kindler(フライブルク、ドイツ)、Human Osteoactivin/GPNMB DuoSetはR&D Systems(ミネアポリス、米国)よりそれぞれ購入した。
(2)実験動物
SOD1G93Aマウスおよび野生型(wild-type: WT) マウス [B6SJL-Tg (SOD1-G93A) 1Gur/J]は、Jackson Laboratory(バー・ハーバー、米国)より購入した。実験には、雄性SOD1G93Aマウスおよび雌性WTマウスとの交配により生まれたSOD1G93A (+/-)マウスを用いた。マウスはプラスチック製ケージ(縦24.5 × 横17.5 × 高さ12.5 cm)を用い、自由給水下に固形飼料(CE-2、日本クレア株式会社、東京、日本)にて飼育した。実験を行うにあたっては、岐阜薬科大学動物舎運営委員会に動物実験承認申請を行い、許可を受けた上で実施した。
(3)DNAマイクロアレイ
14週齢雄性SOD1G93AマウスおよびWTマウスにネンブタール20 mg/kgを腹腔内投与して深麻酔させ、生理食塩水(pH 7.4)を左心室内に注入して2分間灌流し、脊髄を単離した。単離した組織は冷却したマイクロチューブの中に入れ、急速凍結した。サンプルはRNA抽出まで-80℃にて保存した。サンプルは、RNAlater-ICEに浸潤させ、DNAチップ研究所(神奈川、日本)にてRNA抽出および解析を行った。
(4)リアルタイムPCR
リアルタイムPCRは、SYBR（登録商標）Premix Ex TaqTMII(タカラバイオ株式会社)を用いてThermal Cicler Dice（登録商標）Real Time System TP800(タカラバイオ株式会社)により測定を行った。GPNMBのプライマーは、センス: 5’-TCTGAACCGAGCCCTGACATC-3’（配列番号５）およびアンチセンス: 5’-AGCAGTAGCGGCCATGTGAAG-3’ （配列番号６）を用いた。グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；GAPDH)のプライマーは、センス:5’-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3’ （配列番号７）およびアンチセンス:5’-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3’ （配列番号８）を用いた。PCR反応は、変性を95℃で5秒間行い、アニーリングおよび伸張反応を60℃で30秒間行った。これを1サイクルとして45サイクル繰り返した。また、95℃で15秒間、60℃で30秒間、95℃で15秒間の反応を行い、解離曲線を作成し、生成産物の純度を確認した。
(5)ヒト脊髄組織サンプル
本試験はヘルシンキ宣言に従い、新潟大学倫理委員会の審議、承認を得た後実施した。また、全対象者へインフォームドコンセントを実施し実験参加同意書への記名押印を得た。対象は弧発性ALS患者3例および非神経疾患患者3例である。年齢、性別、死後経過時間および罹病期間は図6に示した。ヒト脊髄サンプルを用いた試験はすべて新潟大学医学部にて実施した。頸髄(C7)、胸髄(T8)および腰髄(L8)をそれぞれパラフィンにて包埋し、4μmの切片を作成した。
(6)マウス脊髄組織サンプル
6週齢(発症前)、10週齢(発症前)、14週齢(発症後)および18〜20週齢(病態末期)の雄性SOD1G93AマウスおよびWTマウスにネンブタール20 mg/kgを腹腔内投与して深麻酔させ、4%パラホルムアルデヒド含有0.1 Mリン酸バッファー(PB; pH 7.4)を左心室内に注入して灌流固定(灌流圧130 cm H2O)した。10分後に脊髄を取り出し、同液にて一晩静置(4℃)した。ついで25%スクロース含有0.1 M PB(pH7.4)液に24時間(4℃)静置した。その後、O.C.T.コンパウンドにて脊髄を包埋し、速やかに液体窒素で凍結し、薄切するまで-80℃で保存した。薄切はクリオスタット(CM1850、ライカ、東京、日本)を用いて、-20℃下で厚さ14μmの切片を作製し、MASコーティングされたスライドグラス(松浪ガラス工業株式会社、大阪、日本)に載せ、-80℃で保存した。
(7)組織学的検討
凍結切片は-80℃より取り出し-20℃で1時間放置した後、室温で10分間乾燥させ、PBSに浸してO.C.T.コンパウンドを洗浄した。パラフィン切片は、キシレンに浸してパラフィンを洗浄した。続いて段階的にアルコール濃度を下げた溶液に浸し、蒸留水に浸透した。その後、super PAP pen(ZYMED、サンフランシスコ、米国)にて反応液の流出を防ぐために切片の周囲を囲んだ。0.3% H2O2含有メタノールで30分間反応させた後、10% 正常ウマ血清で2時間ブロッキングした。ブロッキング後、Can Get Signal immunostain solution Aにて希釈したヤギ抗GPNMBポリクローナル抗体(×50)を用いて4℃で一晩反応させた。その後、ビオチン化抗ヤギIgG抗体(×1,000)にて2時間反応させ、Vectastain Elite ABC kitおよびDAB peroxidase substrate kitを用いて染色した。染色後、蒸留水で2分間2回洗浄し、70%、95%、99%、無水エタノールの順に3分間ずつ浸し脱水した。キシレンに5分間2回浸し透徹した後、EUKITT試薬を用いてカバーグラスで封入した。ネガティブコントロールには、一次抗体を除いたコントロールを用意し、一次抗体の特異性について検討を行った。切片は顕微鏡(BX50、オリンパス株式会社、東京、日本)下で観察し、デジタルカメラ(COOLPIX 4500、株式会社ニコン、東京、日本)を用いて記録した。
(8)蛍光免疫二重染色
マウス組織切片を(7)の方法に従い反応液の流出を防ぎ、M.O.M. immunodetection kitまたは10% 正常ウマ血清で2時間ブロッキングした。ブロッキング後、一次抗体を用いて4℃で一晩反応させた。その後、二次抗体にて2時間反応させた。染色後、ヘキスト33342(×1,000)を室温で15分間反応させ、FluoromountTMにて封入した。一次抗体には、マウス抗NeuNモノクローナル抗体(×1000)、ウサギ抗Iba1ポリクローナル抗体(×1,000)、マウス抗GFAPモノクローナル抗体(×1,000)をCan Get Signal immunostain solution Aにて希釈して用いた。二次抗体には、Alexa 488結合ロバ抗ヤギIgG抗体(×1,000)、Alexa 546結合ロバ抗ウサギIgG抗体(×1,000)、Alexa 488結合ウサギ抗マウスIgG抗体(×1,000)、Alexa 546結合ウサギ抗ヤギ抗体(×1,000)を用いた。また、ネガティブコントロールには、一次抗体を除いたコントロールを用意し、一次抗体の特異性について検討を行った。切片は蛍光顕微鏡(BX50、オリンパス株式会社)またはレーザー共焦点顕微鏡(FV10i、オリンパス株式会社)下で観察した。
(9)ヒト血清サンプル
本試験はヘルシンキ宣言に従い、岐阜大学倫理委員会の審議、承認を得た後実施した。また、全対象者へインフォームドコンセントを実施し実験参加同意書への記名押印を得た。対象は弧発性ALS患者10例、および対照群10例である。ヒト血清サンプルを用いた試験はすべて岐阜大学医学部にて実施した。年齢、性別および血清採取時期は図8に示した。血清サンプルは試験実施まで-80℃で保存した。
(10)ELISA解析
血清中GPNMB量の定量は、Human Osteoactivin/GPNMB DuoSetを用い、そのプロトコールに従って行った。抗GPNMB抗体を用いて96ウェルプレートをコーティングし、Reagent Diluentでブロッキングを行った。血清サンプルを-80℃から取り出し、氷上で解凍した。各ウェルに96μLのReagent Diluentを添加し、サンプルおよびコントロールを4μLずつ添加して25倍に希釈した。スタンダードも同様にReagent Diluentを用いて段階希釈をして添加した。その後、室温で2時間インキュベートした。各ウェルを洗浄バッファーにて洗浄し、100μLの抗GPNMB検出抗体を添加し、室温で2時間インキュベートした。各ウェルを洗浄後、100μLのストレプトアビジン-HRPを添加して遮光下で20分間インキュベートした後、各ウェルを洗浄した。100μLの基質溶液を添加して遮光下で20分間インキュベートし、50μLの反応停止溶液を添加した後、450 nmの吸光度を測定した。
(11)統計学的解析
実験成績は平均値±標準誤差または標準偏差で示した。統計学的な比較は、STAT VIEW(SAS institute、カリー、米国)を用いてスチューデントのt検定により行った。危険率5%未満を有意差有りとした。
２．結果
(1)ALS遺伝子発現プロファイリング
スキャッタープロット法によってSOD1G93Aおよび野生型（WT）マウス脊髄における遺伝子発現量を解析した(図1)。スキャッタープロットより、SOD1G93AマウスおよびWTマウス間で発現が二倍以上かつ有意(p < 0.05)に変化した遺伝子群を解析したところ、WTマウスに比べSOD1G93Aマウスにおいて免疫応答、炎症反応およびストレス応答の関連遺伝子群の発現が増加していた(図2)。中でも、膜貫通糖タンパク質nmb （Glycoprotein transmembrane nmb；GPNMB)がALS病態で最も発現上昇率の高かった。これらの結果に基づきGPNMBに着目し、以下検討を行った。
(2)リアルタイムRT-PCR
リアルタイムPCR法を用いて、14週齢SOD1G93AおよびWTマウス脊髄におけるGPNMB mRNA量を測定した。SOD1G93AマウスにおいてGPNMB mRNAは、WTマウスに比べて約11倍上昇していた(図3)。
(3)マウス脊髄におけるGPNMBの局在
マウス脊髄におけるGPNMBの局在を明らかにするために、NeuN、GFAPおよびIba-1蛍光免疫二重染色を行った。14週齢SOD1G93Aマウス脊髄灰白質において、GPNMBはNeuN陽性神経細胞およびGFAP陽性活性化アストロサイトにおいてその発現が強く認められたが、Iba-1陽性ミクログリアおよび核では認められなかった(図4)。また脊髄白質においても同様に、GFAP陽性活性化アストロサイトにおいてその発現が強く認められたが、Iba-1陽性ミクログリアでは認められなかった(図4)。これらの結果は、ALSの病態形成へのGPNMBの関与を示唆する。
(4)マウス脊髄におけるGPNMBの経時的発現変化
SOD1G93Aマウスは、WTマウスと比較して、10週齢より脊髄におけるGPNMBの有意(p < 0.01)な発現上昇が認められ、病態進行に伴いその発現量は増加した(図5)。一方、WTマウスにおけるGPNMBの発現量の変化は認められなかった(図5)。これらの結果は、GPNMBがALSの病態を反映するマーカーとして有望であることを示唆する。また、発症前よりGPNMBの発現上昇を認めた事実は、ALSの早期診断用のマーカーにGPNMBがなり得ることを強く示唆する。
(5)ヒト脊髄におけるGPNMBの発現
ヒトALS病態におけるGPNMBの関与を明らかにするために、ヒト脊髄におけるGPNMBの発現を免疫染色法を用いて検討した。患者背景を図6に示す。弧発性ALS患者は総数3名(男性2名、女性1名)、対照疾患患者は総数3名(男性1名、女性2名)であった。対照疾患として、脳幹部梗塞、多発性筋炎および多発性脳梗塞が挙げられる。弧発性ALSおよび対照疾患患者の死亡年齢はそれぞれ62.0±16.1歳および68.0±3.5歳であった。弧発性ALSおよび対照疾患患者の死後経過時間はそれぞれ2.6±0.1時間および2.6±1.1時間であった。ヒト弧発性ALS患者脊髄において、GPNMB陽性の凝集体が認められ、その凝集体は対照疾患患者脊髄と比べ、弧発性ALS患者脊髄において有意(p < 0.01)に増加していた(図7)。これらの結果はALSの病態形成にGPNMBが深く関与すること及びALSのマーカーとしてGPNMBが有用であることを示唆する。
(6)弧発性ALS患者血清中GPNMB濃度
弧発性ALS患者および正常者の血清中GPNMB濃度をELISA法で測定した。患者背景を図8に示す。弧発性ALS患者は総数10名(男性7名、女性3名)、正常者は総数10名(男性3名、女性7名)であった。弧発性ALSおよび正常者の年齢はそれぞれ66.4±10.1歳および45.5±20.7歳であった。血清中GPNMB濃度は正常者(平均±標準誤差、29.8±1.6μg/mL)に比べ弧発性ALS患者(39.1±2.8μg/mL)で有意(p < 0.01)な高値を示した(図9)。このように、ALSのマーカーとしてGPNMBが臨床上有用であることが示された。血清中でその変動を検知できたことは、GPNMBの臨床応用を図る上で極めて重要な意味をもつ。
本発明の検査法は、ALSの発症可能性を簡便且つ客観的に判定することを可能にする。本発明の検査法は、ALSを発症しているか否かを判定するための手段として有用である。また、将来発症する可能性を把握するための手段としての利用も期待される。本発明の検査法を利用した早期発見・早期治療によって、ALSの難治化、重篤化（病勢の進行）、再発等の防止を図ることが期待される。また、予後を推定するための手段として本発明の検査法の利用が図られることも想定される。
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。

Claims (10)

  1. 膜貫通糖タンパク質nmbからなる、筋萎縮性側索硬化症マーカー。
  2. 膜貫通糖タンパク質nmbの検体中レベルを指標として用いることを特徴とする、筋萎縮性側索硬化症検査法。
  3. 以下のステップ（１）〜（３）を含む、請求項２に記載の筋萎縮性側索硬化症検査法：
    （１）被検者由来の検体を用意するステップ；
    （２）前記検体中の膜貫通糖タンパク質nmbを検出するステップ；及び
    （３）検出結果に基づいて、筋萎縮性側索硬化症の現在又は将来の発症可能性を判定するステップ。
  4. 検出値が高いと発症可能性が高いとの基準、又は検出できると発症可能性が高いとの基準に従い、ステップ（３）の判定を行う、請求項３に記載の筋萎縮性側索硬化症検査法。
  5. ステップ（２）で得られた検出値と対照検体の検出値との比較に基づきステップ（３）の判定を行う、請求項３又は４に記載の筋萎縮性側索硬化症検査法。
  6. ステップ（２）で得られた検出値と、同一の被検者から過去に採取された検体中の検出値との比較に基づきステップ（３）の判定を行う、請求項３又は４に記載の筋萎縮性側索硬化症検査法。
  7. 前記検体が血液、血漿、血清、脊髄、又は脳脊髄液である、請求項２〜６のいずれか一項に記載の筋萎縮性側索硬化症検査法。
  8. 請求項１に記載の筋萎縮性側索硬化症マーカーに特異的結合性を示す物質からなる、筋萎縮性側索硬化症検査試薬。
  9. 前記物質が抗体である、請求項８に記載の筋萎縮性側索硬化症検査試薬。
  10. 請求項８又は９に記載の筋萎縮性側索硬化症検査試薬を含む、筋萎縮性側索硬化症検査用キット。
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