BR122023026792A2 - Método e uso da combinação dos marcadores perm e clic1 como marcadores in vitro para diagnosticar ou prognosticar carcinoma endometrial, bem como kit para detectar nível de expressão proteica - Google Patents

Abstract

A presente invenção proporciona um método de diagnóstico ou prognóstico de carcinoma endometrial, compreendendo o método de determinar o nível de expressão de MMP9 em uma amostra de fluido aspirado uterino do trato genital feminino. A presente invenção ainda proporciona kits para o diagnóstico da doença.

Description

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Europeia EP16168328.9 depositado em 4 de maio de 2016.

[002] A invenção refere-se ao diagnóstico e prognóstico de carcinoma endometrial.

FUNDAMENTOS DA TÉCNICA

[003] O câncer do endométrio (EC) é o tumor invasivo mais frequentemente observado do trato genital feminino e o quarto câncer mais comum em mulheres nos países desenvolvidos, representando 54.870 casos diagnosticados e 10.170 mortes estimadas em 2015 nos Estados Unidos. Atualmente, 70 % dos casos de EC são diagnosticados em estágios iniciais da doença onde o tumor ainda está localizado dentro do endométrio e está associado a uma taxa de sobrevida global de 5 anos de 96 %. Entretanto, 30 % dos pacientes com EC são diagnosticados apenas em um estágio avançado da doença associada a uma drástica diminuição na taxa de sobrevida de 5 anos, que é reduzida para 67 % quando a invasão miometrial e/ou afetação de linfonodo já está presente e para 18 % em casos de metástase à distância. Melhorar o diagnóstico precoce é, consequentemente, uma questão importante para controlar apropriadamente a EC e diminuir a mortalidade associada à doença.

[004] A detecção precoce de pacientes com EC é favorecida pela presença de sintomas como sangramento vaginal anormal presente em 93 % das mulheres diagnosticadas com EC. Entretanto, muitos outros transtornos benignos geram sintomas similares. A discriminação de pacientes com patologias endometriais benignas e com EC só é obtida depois de um processo de diagnóstico tedioso que consiste em um exame pélvico e ultrassonografia transvaginal, seguidos por um exame histopatológico confirmatório de uma biópsia endometrial. A biópsia preferível usada neste procedimento é denominada aspirado uterino e/ou biópsia de pipelle e é obtida por uma aspiração minimamente invasiva de fluido endometrial de dentro da cavidade uterina. Como os atuais procedimentos diagnósticos em aspirados uterinos dependem da presença de material celular, este processo tem, infelizmente, uma falha diagnóstica e uma taxa de amostragem inadequada associada de 8 % e 15 %, respectivamente. Isto é aumentado em mulheres na pós-menopausa até 12 % e 22 %. Nesses casos, uma biópsia guiada por histeroscopia precisa ser realizada, onde esta técnica invasiva apresenta um risco aumentado de complicações, incluindo perfuração uterina, hemorragia e possível dano a outros órgãos.

[005] Até o momento, o desenvolvimento de ensaios diagnósticos baseados em proteômica permaneceu desafiador, apesar dos muitos estudos sobre tecidos tumorais de EC e endométrio normal. A ausência de tradução dos resultados produzidos por esses estudos na clínica é explicada por dois fatores determinantes: i) carecem de estudos em biofluidos para obter biomarcadores de EC. A maioria dos estudos foram fundamentados em tecidos e/ou soro ou plasma. Entretanto, a busca de biomarcadores no plasma ou soro é extremamente desafiadora devido à baixa concentração dos potenciais biomarcadores e à ampla faixa dinâmica na abundância de proteínas; e ii) carecem de estudos de verificação como uma ponte entre as fases de descoberta e validação do pipeline de biomarcadores. Os experimentos de descoberta de biomarcadores são repletos de falsas descobertas resultantes de variabilidade biológica e pequeno número de amostras incluídas.

[006] Portanto, apesar dos esforços realizados, ainda existe a necessidade de biomarcadores que permitam o diagnóstico de câncer do endométrio em estágios iniciais, com alta sensibilidade e especificidade.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[007] Os presentes inventores descobriram que as amostras de fluido uterino compreendem vários marcadores robustos que as torna amostras apropriadas para o diagnóstico de câncer do endométrio com alta sensibilidade e especificidade.

[008] Como é mostrado abaixo, os presentes inventores foram capazes de identificar, pela primeira vez, 27 proteínas que são diferencialmente expressadas em amostras de fluido uterino de pacientes sofrendo de câncer do endométrio. Surpreendentemente, todas as 27 proteínas exibem sensibilidade e especificidade muito alta (ver Tabela 1 abaixo), minimizando assim o risco de diagnóstico falso positivo ou negativo.

[009] Essas descobertas abrem a porta para o uso de amostras de fluido uterino como amostras biológicas para o diagnóstico da doença em vez de biópsia de sangue/soro ou tecido. Um biomarcador de diagnóstico útil não apenas tem que melhorar a discriminação entre pacientes sofrendo da doença e casos benígnos, mas também deve ser economicamente útil e vantajoso no cenário clínico. No caso de biomarcadores diagnósticos para EC, a redução do número de biópsias invasivas e dos custos de diagnósticos são valores muito importantes. Portanto, a identificação dos biomarcadores, objeto da presente invenção, em um biofluido de fácil acesso tal como uma amostra de fluido uterino, que é obtida em um procedimento minimamente invasivo já implementado no atual processo de diagnóstico, significa um avanço perceptível no diagnóstico precoce da doença.

[010] Portanto, a presente invenção significa um grande avanço no diagnóstico precoce de câncer do endométrio.

[011] Assim, em um primeiro aspecto, a presente invenção proporciona um método de diagnóstico ou prognóstico de carcinoma endometrial, compreendendo o método determinar o nível de expressão de uma ou mais proteínas selecionadas do grupo consistindo em: PERM, OSTP, CTNB1, CAYP1, XPO2, NGAL, SG2A1, CADH1, SPIT1, MMP9, NAMPT, LDHA, CASP3, PRDX1, MIF, K2C8, CAPG, MUC1, ANXA1, HSPB1, PIGR, CH10, CD44, CLIC1, TPIS, GSTP1 e GTR1; em uma amostra de fluido isolado do trato genital feminino.

[012] É notável que os biomarcadores do primeiro aspecto da invenção foram individualmente e coletivamente associados ao câncer, concluindo que eles mantiveram uma forte associação com processos moleculares comumente alterados no cancer, tais como movimento celular, morte e sobrevivência celular, entre outros.

[013] Portanto, em um segundo aspecto, a presente invenção proporciona o uso de PERM, OSTP, CTNB1, CAYP1, XPO2, NGAL, SG2A1, CADH1, SPIT1, MMP9, NAMPT, LDHA, CASP3, PRDX1, MIF, K2C8, CAPG, MUC1, ANXA1, HSPB1, PIGR, CH10, CD44, CLIC1, TPIS, GSTP1, ou GTR1 como um marcador in vitro para diagnosticar ou prognosticar o carcinoma endometrial em um fluido isolado do trato genital feminino. Este aspecto também pode ser formulado como um método para detectar um ou mais marcadores de câncer do endométrio em um sujeito, compreendendo: (a) obter uma amostra de fluido do trato genital feminino; e (b) detectar na amostra uma quantidade de pelo menos um marcador de câncer do endométrio selecionado de PERM, OSTP, CTNB1, CAYP1, XPO2, NGAL, SG2A1, CADH1, SPIT1, MMP9, NAMPT, LDHA, CASP3, PRDX1, MIF, K2C8, CAPG, MUC1, ANXA1, HSPB1, PIGR, CH10, CD44, CLIC1, TPIS, GSTP1 e GTR1.

[014] Em um terceiro aspecto, a presente invenção proporciona o uso de meios para determinar o nível de expressão de: PERM, OSTP, CTNB1, CAYP1, XPO2, NGAL, SG2A1, CADH1, SPIT1, MMP9, NAMPT, LDHA, CASP3, PRDX1, MIF, K2C8, CAPG, MUC1, ANXA1, HSPB1, PIGR, CH10, CD44, CLIC1, TPIS, GSTP1 e GTR1, para diagnosticar ou prognosticar o carcinoma endometrial no método do primeiro aspecto da invenção.

[015] É importante ressaltar que os biomarcadores de proteína objeto da presente invenção podem ser avaliados por métodos fáceis e de baixo custo, tais como imunoquímica ou ELISA, plataformas que estão amplamente disponíveis em hospitais. Consequentemente, esses biomarcadores de proteína podem ser facilmente implementados como kits de diagnóstico clínico de rotina com custos reduzidos para o sistema de saúde. Além disso, um teste de kit de diagnóstico com base nos biomarcadores fornecidos pela presente invenção pode melhorar o atual processo de diagnóstico, conferindo aos aspirados uterinos a capacidade de fornecer valiosa informação diagnóstica ou prognóstica da doença.

[016] Portanto, em um quarto aspecto, a presente invenção proporciona um kit compreendendo um suporte sólido e meios para detectar o nível de expressão de duas ou mais proteínas selecionadas do grupo consistindo em: PERM, OSTP, CTNB1, CAYP1, XPO2, NGAL, SG2A1, CADH1, SPIT1, MMP9, NAMPT, LDHA, CASP3, PRDX1, MIF, K2C8, CAPG, MUC1, ANXA1, HSPB1, PIGR, CH10, CD44, CLIC1, TPIS, GSTP1 e GTR1.

[017] Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona um método para identificar um sujeito suspeito de sofrer de carcinoma endometrial, compreendendo o método: a) determinar, in vitro, o nível de expressão de uma ou mais proteínas selecionadas do grupo consistindo em: PERM, OSTP, CTNB1, CAYP1, XPO2, NGAL, SG2A1, CADH1, SPIT1, MMP9, NAMPT, LDHA, CASP3, PRDX1, MIF, K2C8, CAPG, MUC1, ANXA1, HSPB1, PIGR, CH10, CD44, CLIC1, TPIS, GSTP1 e GTR1 em uma amostra de fluido do trato genital feminino do sujeito, e b) comparar o nível de etapa (a) com um nível de controle de referência, em que se o nível determinado na etapa (a) é maior que o nível de controle de referência, é indicativo que o sujeito é suspeito de sofrer de carcinoma endometrial.

[018] Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona um método de decidir ou recomendar se deve iniciar um regime médico de um sujeito suspeito de sofrer de carcinoma endometrial, método esse que compreende as etapas de: a) determinar, in vitro, o nível de expressão de uma ou mais proteínas selecionadas do grupo consistindo em: PERM, OSTP, CTNB1, CAYP1, XPO2, NGAL, SG2A1, CADH1, SPIT1, MMP9, NAMPT, LDHA, CASP3, PRDX1, MIF, K2C8, CAPG, MUC1, ANXA1, HSPB1, PIGR, CH10, CD44, CLIC1, TPIS, GSTP1 e GTR1 em uma amostra de fluido do trato genital feminino do sujeito; e b) diagnosticar o carcinoma endometrial ou determinar se o sujeito é suspeito de sofrer de carcinoma endometrial, se o nível de proteína na amostra de teste é maior que um nível de controle de referência; em que: i) se o sujeito é diagnosticado de sofrer de carcinoma endometrial, ou de ser suspeito de sofrer de carcinoma endometrial, então a iniciação do regime médico é recomendada, e ii) se o paciente é diagnosticado de não sofrer de carcinoma endometrial, o acompanhamento é realizado opcionalmente em consideração do resultado de uma examinação do paciente por um médico.

[019] Ao determinar o nível do marcador em uma amostra de teste, a pessoa habilitada pode estabelecer, adicionalmente, qual é a terapia mais adequada que pode ser recomendada, porque o nível detectado na amostra pode refletir a extensão (isto é, severidade) da doença.

[020] Além disso, quando é decidido que um sujeito tem que iniciar um regime médico porque ele sofre de, ou é suspeito de ter, carcinoma endometrial, pode ser monitorado quão eficiente é o regime usando os marcadores da invenção: uma diminuição ou retorno a um nível normal do marcador (isto é, ao nível de um sujeito controle livre de câncer) pode indicar que o paciente tem reagido favoravelmente ao regime médico e, portanto, o dito regime é eficaz; se o nível do marcador não mudar significantemente ou aumentar, isso pode indicar que o regime não é eficaz. Finalmente, o nível do marcador pode ser medido após o término do tratamento para controle de recidiva.

[021] Portanto, em um outro aspecto, a presente invenção proporciona um método para determinar a eficácia de um regime médico em um paciente já diagnosticado com carcinoma endometrial, compreendendo o método as etapas de: (a) medir in vitro o nível de expressão de uma ou mais proteínas selecionadas do grupo consistindo em: PERM, OSTP, CTNB1, CAYP1, XPO2, NGAL, SG2A1, CADH1, SPIT1, MMP9, NAMPT, LDHA, CASP3, PRDX1, MIF, K2C8, CAPG, MUC1, ANXA1, HSPB1, PIGR, CH10, CD44, CLIC1, TPIS, GSTP1 e GTR1 em uma amostra de fluido do trato genital feminino do sujeito antes da administração do regime médico; (b) medir in vitro o nível do(s) dito(s) marcador(s) em uma amostra de fluido do trato genital feminino do sujeito, uma vez iniciada a administração do regime médico; e (c) comparar os níveis medidos nas etapas (a) e (b), de tal forma que se o nível medido na etapa (b) é menor que o nível medido na etapa (a), é indicativo que o regime médico é eficaz no tratamento de carcinoma endometrial; ou, alternativamente, compreendendo o método as etapas de: a) medir in vitro o nível de expressão de uma ou mais proteínas selecionadas do grupo consistindo em: PERM, OSTP, CTNB1, CAYP1, XPO2, NGAL, SG2A1, CADH1, SPIT1, MMP9, NAMPT, LDHA, CASP3, PRDX1, MIF, K2C8, CAPG, MUC1, ANXA1, HSPB1, PIGR, CH10, CD44, CLIC1, TPIS, GSTP1 e GTR1 em uma amostra de fluido do trato genital feminino do sujeito, uma vez iniciada a administração do regime médico; e b) comparar o nível medido na etapa (i) com um nível de controle de referência do(s) marcador(s), em que, se o nível medido na etapa (i) não for maior que o nível de controle de referência, é indicativo que o regime médico é eficaz no tratamento de carcinoma endometrial.

[022] Com este método da invenção, pode ser determinado o resultado do tratamento (avaliação realizada para estimar os resultados ou consequências da administração e procedimentos usados no combate da doença de modo a determinar a eficácia, efetividade, segurança, praticabilidade etc., destas intervenções em casos individuais ou séries).

[023] Os presentes inventores também descobriram surpreendentemente, como mostrado abaixo, que MMP-9 é notavelmente altamente expressada em amostras de aspirado uterino (também conhecido como “biópsia de pipelle” ou o fluido contido em uma biópsia endometrial) de sujeitos com câncer do endométrio em comparação com controles saudáveis.

[024] Portanto, em outros aspectos, os presentes inventores fornecem: 1. Um método de diagnóstico ou prognóstico de carcinoma endometrial, compreendendo o método determinar o nível de expressão de MMP9 em uma amostra isolada de aspirado uterino; 2. O uso de MMP-9 como um marcador in vitro para diagnosticar ou prognosticar o carcinoma endometrial em uma amostra de fluido aspirado uterino; 3. Um método para identificar um sujeito suspeito de sofrer de carcinoma endometrial, compreendendo o método: a) determinar, in vitro, o nível de expressão de MMP9 em uma amostra de fluido aspirado uterino, e b) comparar o nível de etapa (a) com um nível de controle de referência, em que se o nível determinado na etapa (a) é maior que o nível de controle de referência, é indicativo que o sujeito é suspeito de sofrer de carcinoma endometrial; 4. Um método de decidir ou recomendar se deve iniciar um regime médico de um sujeito suspeito de sofrer de carcinoma endometrial, método esse que compreende as etapas de: a) determinar, in vitro, o nível de expressão de MMP9 em uma amostra de fluido aspirado uterino; e b) diagnosticar o carcinoma endometrial ou determinar se o sujeito é suspeito de sofrer de carcinoma endometrial, se o nível de proteína na amostra de teste é maior que um nível de controle de referência; em que: i) se o sujeito é diagnosticado de sofrer de carcinoma endometrial, ou de ser suspeito de sofrer de carcinoma endometrial, então a iniciação do regime médico é recomendada, e ii) se o paciente é diagnosticado de não sofrer de carcinoma endometrial, o acompanhamento é realizado opcionalmente em consideração do resultado de uma examinação do paciente por um médico; e 5. Um método para determinar a eficácia de um regime médico em um paciente já diagnosticado com carcinoma endometrial, compreendendo o método as etapas de: (a) in vitro medir o nível de expressão de MMP9 em uma amostra isolada de aspirado uterino de fluido do trato genital feminino do sujeito antes da administração do regime médico; (b) in vitro medir o nível do(s) dito(s) marcador(s) em uma amostra isolada de aspirado uterino de fluido do trato genital feminino do sujeito, uma vez iniciada a administração do regime médico; e (c) comparar os níveis medidos nas etapas (a) e (b), de tal forma que se o nível medido na etapa (b) é menor que o nível medido na etapa (a), é indicativo que o regime médico é eficaz no tratamento de carcinoma endometrial; ou, alternativamente, compreendendo o método as etapas de: (i) medir in vitro o nível de expressão de MMP9 em uma amostra isolada de aspirado uterino de fluido do trato genital feminino do sujeito, uma vez iniciada a administração do regime médico; e (ii) comparar o nível medido na etapa (i) com um nível de controle de referência do marcador, em que, se o nível medido na etapa (i) não for maior que o nível de controle de referência, é indicativo que o regime médico é eficaz no tratamento de carcinoma endometrial.

[025] Em um aspecto final, a invenção proporciona um fluxo de trabalho para a verificação de potenciais marcadores de proteína do câncer do endométrio pela condução de uma análise de espectrometria de massas no modo de aquisição direcionado. A partir de uma lista de potenciais marcadores de proteína de câncer do endométrio, pelo menos um peptídeo substituto por proteína foi selecionado de acordo com critérios de detectabilidade por espectrometria de massas e singularidade das sequências de aminoácidos. Uma versão desses peptídeos que inclui um aminoácido marcado com isótopos pesados estáveis de carbono e nitrogênio foi sintetizada. O fluido do trato genital feminino foi proteolizado individualmente por tripsina e suplementado por uma quantidade igual da mistura de peptídeos sintéticos marcados com isótopos estáveis. As amostras foram analisadas por cromatografia líquida de alto desempenho hifenizada com um espectrômetro de massa de alta resolução híbrido: (a) gerando-se um método de aquisição que inclui a lista de íons peptídicos a serem detectados associados aos seus tempos de eluição sob condições cromatográficas definidas de separação; (b) conduzindo-se a análise de espectrometria de massas por isolamento repetido durante as janelas de tempo de eluição dos líons peptídicos istados por um analizador de quadrupolo; (c) realizando-se uma fragmentação induzida por colisão dos íons peptídicos isolados; (d) e analizando-se os subsequentes íons de fragmentos de peptídeos com um analizador de alta resolução. Para cada peptídeo, o sinal dos íons de fragmentos de interesse foi extraído para construir perfis de eluição de peptídeos que podem ser integrados. A normalização das áreas resultantes de peptídeos endógenos foi reaizada com a área dos respectivos peptídeos marcados com isótopo estável. O método inclui uma etapa para confirmar identidades dos peptídeos por correspondência espectral.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[026] Todos os termos, como aqui usados, neste pedido, a menos que de outro modo estabelecido, devem ser entendidos em seu significado habitual como conhecido na técnica. Outras definições mais específicas para certos termos, como usado no presente pedido, são como apresentados abaixo e são intencionados a serem aplicados uniformemente ao longo da especificação e reivindicações, a menos que outra definição expressamente apresentada proporcione uma definição mais ampla.

[027] A presente invenção fornece novos biomarcadores para o diagnóstico ou prognóstico de carcinoma endometrial no fluido do trato genital feminino.

[028] O termo “diagnóstico” é conhecido da pessoa habilitada na técnica. Como aqui usado “diagnóstico” é entendido como tornar ciente de uma complicação ou risco particular da condição médica em um sujeito; a determinação da natureza da doença ou condição; ou a distinção de uma doença ou condição de outra. Refere-se tanto ao processo de tentar determinar ou identificar a possível doença ou transtorno, com à opinião alcançada por este processo. Um diagnóstico, no sentido de procedimento diagnóstico, pode ser considerado como uma tentativa de classificação de condição de um indivíduo em categorias separadas e distintas que possibilitam as decisões médicas acerca do tratamento e prognóstico a serem feitos. Subsequentemente, uma opinião diagnóstica é frequentemente descrita em termos de uma doença ou outra condição. Entretanto, um diagnóstico pode assimir muitas formas. Pode ser uma questão de detectar a presença e nomear a doença, lesão, disfunção ou incapacidade. Pode ser um exercício para atribuir uma categoria para a administração ou para o prognóstico. Pode indicar o grau de anormalidade em um continuum ou o tipo de anormalidade em uma classificação.

[029] O método de diagnóstico in vitro do primeiro aspecto da invenção pode ser realizado com uma amostra de: (a) um sujeito assintomático, (b) um sujeito que já tenha sido identificado como sendo suspeito de sofrer de carcinoma endometrial, (c) um sujeito já diagnosticado com carcinoma endometrial, como ensaio de diagnóstico de confirmação complementar ou (d) um sujeito com alto risco de sofrer da doença.

[030] “Prognóstico”, como aqui usado, refere-se à predição da provável progressão e resultado de uma doença. Inclui: classificação de neoplasma (tentative de expressar em termos replicáveis o nível de diferenciação celular em neoplasmas, pois o aumento da anaplasia se correlaciona com a agressividade da neoplasia), estadiamento da neoplasia (tentativa de expressar em termos replicáveis a extensão da neoplasia no paciente).

[031] O termo “amostra de fluido do trato genital feminino” refere-se a um fluido produzido pelo órgão uterino que faz parte do trato genital feminino e que foi tomado por aspiração, tai como aspiração a vácuo (isto é, “amostra aspirada”). De acordo com a presente invenção, a aspiração do fluido é realizada sem uma etapa prévia de infusão de solução salina. Isto é, o termo “aspirado” não abrange aquelas amostras resultantes de lavagens uterinas.

[032] Em uma outra modalidade do método do primeiro aspecto da invenção, opcionalmente em combinação com qualquer uma das modalidades fornecidas acima ou abaixo, o método compreende (a) medir, in vitro, o nível de expressão de uma ou mais proteínas selecionadas do grupo consistindo em: PERM, OSTP, CTNB1, CAYP1, XPO2, NGAL, SG2A1, CADH1, SPIT1, MMP9, NAMPT, LDHA, CASP3, PRDX1, MIF, K2C8, CAPG, MUC1, ANXA1, HSPB1, PIGR, CH10, CD44, CLIC1, TPIS, GSTP1 e GTR1, na amostra de teste; e (b) comparar o nível de expressão de cada uma das proteínas testadas com um valor controle de referência. Em uma outra modalidade do método do primeiro aspecto da invenção, opcionalmente em combinação com qualquer uma das modalidades fornecidas acima ou abaixo, o método compreende (a) medir, in vitro, o nível de expressão de uma ou mais proteínas selecionadas do grupo consistindo em: PERM, OSTP, CTNB1, CAYP1, XPO2, NGAL, SG2A1, CADH1, SPIT1, MMP9, NAMPT, LDHA, CASP3, PRDX1, MIF, K2C8, CAPG, MUC1, ANXA1, HSPB1, PIGR, CH10, CD44, CLIC1, TPIS, GSTP1 e GTR1, na amostra de teste; e (b) comparar o nível de expressão de cada uma das proteínas testadas com um valor controle de referência, em que se as proteínas estiverem superexpressadas, é indicativo de carcinoma endometrial ou mau prognóstico.

[033] Na presente invenção, o termo “nível de controle de referência” referido nos métodos do primeiro e segundo aspectos da invenção é para ser entendido como um valor pré-definido de um determinado marcador molecular, no presente caso qualquer uma das proteínas listadas no primeiro ou segundo aspectos assim como em modalidades particulares, que é derivada dos níveis do dito marcador molecular em uma amostra ou grupo de amostras. Se o nível de expressão é determinado pelo nível de proteína, então o “nível de expressão de referência” é um valor pré-definido de quantidade de proteína, considerando que se o nível de expressão é determinado pelo nível de mRNA, então o “nível de expressão de referência” é um valor pré-definido de quantidade de mRNA. As amostras são tomadas de um sujeito ou grupo de sujeitos em que a presença, ausência, estágio ou curso da doença foi devidamente realizado previamente. Este valor é usado como um limite para discriminar sujeitos em que a condição a ser analisada está presente a partir daqueles em que tal condição está ausente (isto é, sujeito tendo câncer do endométrio a partir de sujeitos livres de câncer do endométrio), para determinar o estágio da doença, o risco do desenvolvimento ou de estar sofrendo de carcinoma endometrial, entre outros. Este nível de controle de referência também é útil para determinar se o sujeito tem que iniciar um regime médico e quão eficaz é o regime. O sujeito ou sujeitos de quem o “nível de controle de referência” é derivado pode incluir sujeito/s em que a condição está ausente, sujeito/s em que a condição está presente, ou ambos. A pessoa habilitada na técnica, fazendo uso do conhecimento geral, é capaz de escolher o sujeito ou grupo de sujeitos mais adequado para obter o nível de controle de referência para cada um dos métodos da presente invenção. Os métodos para obter o valor de referência do grupo de sujeitos selecionados são bem conhecidos no estado da técnica (Burtis C. A. et al., 2008, Capítulo 14, seção “Statistical Treatment of Reference Values”). Em um caso particular, o “nível de controle de referência” é um valor de corte definido por meio de uma análise de ROC convencional (análise de Característica Operacional do Receptor). Como a pessoa habilitada avaliará, o valor de corte ótimo será definido de acordo com as aplicações particulares do método de diagnóstico ou prognóstico: propósito, população alvo para o diagnóstico ou prognóstico, equilíbrio entre especificidade e sensibilidade, etc.

[034] Em uma outra modalidade do primeiro aspecto da invenção, opcionalmente em combinação com qualquer uma das modalidades fornecidas acima ou abaixo, o método compreende ainda determinar o nível de expressão de uma ou mais proteínas selecionadas do grupo consistindo em: ENOA, KPYM, PDIA1, ANXA2 e FABP5.

[035] PERM, também conhecida como mieloperoxidase ou MPO, tem o número de acesso da base de dados Uniprot P05164, 19 de fevereiro de 2014 - v4. MPO é uma proteína liberada por leucócitos que desempenha um papel crucial na inflamação e estresse oxidativo no nível celular.

[036] CADH1, também conhecida como caderina-1 ou E-caderina, tem o número de acesso da base de dados Uniprot P12830, 1 de julho de 1993 - v3. Esta proteína está envolvida nos mecanismos que regulam adesões de célula-célula, mobilidade e proliferação de células epiteliais. Tem um potente papel supressor invasivo.

[037] SPIT1, também conhecida como inibidor 1 de protease tipo Kunitz, tem o número de acesso da base de dados Uniprot O43278, 15 de março de 2005 - v2. Esta proteína é um inibidor do ativador de HGF. Também atua como um inibidor de matriptase (ST14).

[038] ENOA, também conhecida como alfa-enolase, tem o número de acesso da base de dados Uniprot P06733, 23 de janeiro de 2007 - v2. É uma enzima multifuncional que, assim como seu papel em glicólise, desempenha uma parte em vários processos tais como controle de crescimento, tolerância à hipóxia e respostas alérgicas. Também pode funcionar no sistema fibrinolítico intravascular e pericelular devido a sua capacidade de servir como um receptor e ativador de plasminogênio na superfície celular de vários tipos de células tais como leucócitos e neurônios. Estimula a produção de imunoglobulina.

[039] MMP9, também conhecida como metaloproteinase da matriz-9, tem o número de acesso Uniprot P14780, 24 de novembro de 2009 - v3. Esta proteína pode desempenhar um papel essencial na proteólise local da matriz extracelular e na migração de leucócitos. Pode desempenhar um papel na reabsorsão osteoclástica óssea. Cliva KiSS1 em uma ligação Gly-|-Leu. Cliva o colágeno tipo IV e tipo V em fragmentos de três quartos C-terminais grandes e fragmentos de um quarto N- terminais curtos. Degrada a fibronectina, mas não laminina ou Pz-peptídeo

[040] NAMPT, também conhecida como nicotinamida fosforibosiltransferase, tem o número de acesso da base de dados Uniprot P43490, 1 de novembro de 1995 - v1. Esta enzima, que é a componente limitador de taxa na via de biossíntese de NAD de mamífero, cataliza a condensação de nicotinamide com 5-fosforibosil-1-pirofosfato para produzir mononucleotídeo de nicotinamida, um intermediário na biossíntese de NAD.

[041] LDHA, também conhecida como cadeia de L-lactato desidrogenase A, tem o número de acesso da base de dados Uniprot P00338, 23 de janeiro de 2007 - v2. Esta proteína está envolvida na etapa 1 da subvia que sintetiza (S)-lactato de piruvato.

[042] CASP3, também conhecida como caspase-3, tem o número de acesso da base de dados Uniprot P42574, 11 de outubro de 2005 - v2. Está envolvida na cascata de ativação de caspases responsável para execução de apoptose.

[043] KPYM, também conhecida como piruvato cinase PKM, tem o número de acesso da base de dados Uniprot P14618, 23 de janeiro de 2007 - v4. É uma enzima glicolítica que cataliza a transferência de um grupo fosforila de fosfoenolpiruvato (PEP) para ADP, generando ATP e desempenha um papel geral na morte celular independente de caspase de células tumorais.

[044] PRDX1, também conhecida como peroxiredoxina-1, tem o número de acesso da base de dados Uniprot Q06830, 1 de junho de 1994 - v1. Está envolvida na regulação de redox da célula.

[045] OSTP, também conhecida como osteopontina, tem o número de acesso da base de dados Uniprot P10451, 1 de julho de 1989 - v1. Atua como uma citocina envolvida no aumento da produção de interferon-gama e interleucina-12 e na redução da produção de interleucina-10 e é essencial na via que leva à imunidade tipo I.

[046] PDIA1, também conhecida como proteína dissulfeto-isomerase, tem o número de acesso da base de dados Uniprot P07237, 1 de novembro de 1997 - v3. Cataliza a formação, quebra e reagrupamento de ligações dissulfeto.

[047] MIF, também conhecida como fator inibitório de migração de macrófagos, tem o número de acesso da base de dados Uniprot P14174, 23 de janeiro de 2007 - v4. Está envolvida na resposta imune inata aos patógenos bacterianos

[048] CTNB1, também conhecida como catenina beta-1, tem o número de acesso da base de dados Uniprot P35222, 1 de fevereiro de 1994 - v1. Atua como um regulador negativo de coesão de centrossoma e bloqueia anoikis de células epiteliais renais e intestinais malignas.

[049] K2C8, também conhecida como queratina, citoesquelítico 8 tipo II, tem o número de acesso da base de dados Uniprot P05787, 23 de janeiro de 2007 - v7. Junto com KRT19, ajuda a ligação do aparelho contrátil para distrofina nos costameres de músculo estriado.

[050] ANXA2, também conhecida como anexina-2, tem o número de acesso da base de dados Uniprot P07355, 23 de janeiro de 2007 - v2. É uma proteína de ligação à membrana regulada por cálcio cuja afinidade para cálcio é muito reforçada por fosfolipídeos aniônicos. Liga-se a íons de cálcio com alta afinidade e pode estar envolvida na resposta ao estresse térmico.

[051] CAPG, também conhecida como proteína de nivelamento de macrófagos, tem o número de acesso da base de dados Uniprot P40121, 30 de novembro de 2010 - v2. É uma proteína sensível ao cálcio que reversivelmente bloqueia as extreminadades farpadas de filamentos de actina, mas não separa os filamentos de actina pré-formados. Pode desempenhar um importante papel na função de macrófago.

[052] FABP5, também conhecida como proteína de ligação ao ácido graxo, epidermal, tem o número de acesso da base de dados Uniprot Q01469, 23 de janeiro de 2007 - v3. Mostra alta especificidade para ácidos graxos e pode estar envolvida na diferenciação de queratinócito.

[053] MUC1, também conhecida como mucina-1, tem o número de acesso da base de dados Uniprot P15941, 18 de maio de 2010 - v3. A subunidade alfa tem propriedades adesivas celulares. Pode atuar tanto como uma proteína de adesão quanto uma proteína anti-adesão. Pode fornecer uma camada protetora em células epiteliais contra o ataque bacteriano e enzimático.

[054] CAYP1, também conhecida como calcifosina, tem o número de acesso da base de dados Uniprot Q13938, 1 de novembro de 1997 - v1. É uma proteína de ligação ao cálcio que pode desempenhar um papel em eventos de sinalização celular.

[055] XPO2, também conhecida como exportina-2, tem o número de acesso da base de dados Uniprot P55060, 29 de março de 2005 - v3. Entre outros, esta proteína foi divulgada como receptor de exportação para importina-alfa, mediando a re-exportação de importina-alfa do núcleo ao citoplasma depois de importar substratos (cargos) e ligar cooperativamente à importina-alfa e à GTPase Ran em sua forma ligada de GTP ativa.

[056] NGAL, também conhecida como lipocalina associada à neutrófilo gelatinase, tem o número de acesso da base de dados Uniprot P80188, 1 de novembro de 1995 - v2. Está envolvida na apoptose devido a privação de interleucina- 3 (IL3) e na imunidade inata.

[057] SG2A1, também conhecida como mamaglobina-B, tem o número de acesso da base de dados Uniprot O75556, 1 de novembro de 1998 - v1. Pode ligar andrógenos e outros esteroides.

[058] ANXA1, também conhecida como anexina-1, tem o número de acesso da base de dados Uniprot P04083, 23 de janeiro de 2007 - v2. Foi divulgada como desempenhando um importante papel na resposta imune inata, regulando o processo inflamatório, tendo atividade anti-inflamatória, e promovendo a resolução de inflamação e cura do ferimento, entre outros.

[059] HSPB1, também conhecida como proteína beta-1 de choque térmico, tem o número de acesso da base de dados Uniprot P04792, 26 de setembro de 2001 - v2. Está envolvida na resistência ao estresse e organização de actina.

[060] PIGR, também conhecida como receptor de imunoglobulina polimérica, tem o número de acesso da base de dados Uniprot P01833, 26 de junho de 2007 - v4. Este receptor liga IgA e IgM polimérica na superfície basolateral de células epiteliais.

[061] CH10, também conhecida como proteína de choque térmico 10 kDa, mitocondrial, tem o número de acesso da base de dados Uniprot P61604, 23 de janeiro de 2007 - v2. É essencial para biogênese de proteína mitocondrial, junto com CPN60. Liga a CPN60 na presença de Mg-ATP e suprime a atividade ATPase deste último.

[062] CD44, também conhecida como antígeno CD44, tem o número de acesso da base de dados Uniprot P16070, 5 de outubro de 2010 - v3. Medeia as interações de célula-célula e célula-matriz através de sua afinidade para HA, e possivelmente também através de sua afinidade para outros ligantes tais como osteopontina, colágenos e metaloproteinases da matriz (MMPs).

[063] CLIC1, também conhecida como proteína 1 do canal intracelular de cloreto, tem o número de acesso da base de dados Uniprot O00299, 23 de janeiro de 2007 - v4. Insere nas membranes e forma canais iônicos de cloreto. Atividade de canal depende do pH. Inserção de membrana parece ser regulada por redox e pode ocorrer apenas sob condições oxidantes. Envolvida na regulação do ciclo celular.

[064] TPIS, também conhecida como triosefosfato isomerase, tem o número de acesso da base de dados Uniprot P60174, 19 de outubro de 2011 - v3. Esta proteína está envolvida na via gluconeogenese, que é parte da biossíntese de carboidrato.

[065] GSTP1, também conhecida como glutationa S-transferase P, tem o número de acesso da base de dados Uniprot P09211, 23 de janeiro de 2007 - v2. Regula negativamente a atividade de CDK5 através da translocação de p25/p35 para evitar a neurodegeneração.

[066] GTR1 tem o número de acesso da base de dados Uniprot P11166, 3 de outubro de 2006 - v2. É um transportador de glicose facilitativo. Esta isoforma pode ser responsável para absorção de glicose constitutiva ou basal. Tem uma especificidade de substrato muito ampla; pode transportar uma ampla faixa de aldoses incluindo tanto pentoses quanto hexoses.

[067] Em uma outra modalidade do método do primeiro aspecto da invenção, opcionalmente em combinação com qualquer uma das modalidades fornecidas acima ou abaixo, o método compreende (a) medir, in vitro, em uma amostra de fluido isolado do trato genital feminino, o nível de expressão de uma ou mais proteínas selecionadas de um primeiro grupo de proteínas: PERM, OSTP, CTNB1, CAYP1, XPO2, NGAL, SG2A1, CADH1, SPIT1, MMP9, NAMPT, LDHA, CASP3, PRDX1, MIF, K2C8, CAPG, MUC1, ANXA1, HSPB1, PIGR, CH10, CD44, CLIC1, TPIS, GSTP1 e GTR1, e o nível de expressão de uma ou mais proteínas selecionadas de um segundo grupo consistindo em: ENOA, KPYM, PDIA1, ANXA2 e FABP5; e (b) comparar o nível de expressão de cada uma das proteínas testadas com um valor de referência; em que se as proteínas são superexpressadas, é indicativo de carcinoma endometrial ou mau prognóstico.

[068] Em uma modalidade do primeiro aspecto da invenção, opcionalmente em combinação com qualquer uma das modalidades fornecidas acima ou abaixo, o método compreende determinar o nível de expressão de duas proteínas selecionadas do grupo consistindo em: PERM, OSTP, CTNB1, CAYP1, XPO2, NGAL, SG2A1, CADH1, SPIT1, MMP9, NAMPT, LDHA, CASP3, PRDX1, MIF, K2C8, CAPG, MUC1, ANXA1, HSPB1, PIGR, CH10, CD44, CLIC1, TPIS, GSTP1, GTR1, ENOA, KPYM, PDIA1, ANXA2 e FABP5.

[069] Em uma modalidade do primeiro aspecto da invenção, opcionalmente em combinação com qualquer uma das modalidades fornecidas acima ou abaixo, o método compreende determinar o nível de expressão de três proteínas selecionadas do grupo consistindo em: PERM, OSTP, CTNB1, CAYP1, XPO2, NGAL, SG2A1, CADH1, SPIT1, MMP9, NAMPT, LDHA, CASP3, PRDX1, MIF, K2C8, CAPG, MUC1, ANXA1, HSPB1, PIGR, CH10, CD44, CLIC1, TPIS, GSTP1, GTR1, ENOA, KPYM, PDIA1, ANXA2 e FABP5.

[070] Em uma modalidade do primeiro aspecto da invenção, opcionalmente em combinação com qualquer uma das modalidades fornecidas acima ou abaixo, o método compreende determinar o nível de expressão de quatro proteínas selecionadas do grupo consistindo em: PERM, OSTP, CTNB1, CAYP1, XPO2, NGAL, SG2A1, CADH1, SPIT1, MMP9, NAMPT, LDHA, CASP3, PRDX1, MIF, K2C8, CAPG, MUC1, ANXA1, HSPB1, PIGR, CH10, CD44, CLIC1, TPIS, GSTP1, GTR1, ENOA, KPYM, PDIA1, ANXA2 e FABP5.

[071] Em uma modalidade do primeiro aspecto da invenção, opcionalmente em combinação com qualquer uma das modalidades fornecidas acima ou abaixo, o método compreende determinar o nível de expressão de cinco proteínas selecionadas do grupo consistindo em: PERM, OSTP, CTNB1, CAYP1, XPO2, NGAL, SG2A1, CADH1, SPIT1, MMP9, NAMPT, LDHA, CASP3, PRDX1, MIF, K2C8, CAPG, MUC1, ANXA1, HSPB1, PIGR, CH10, CD44, CLIC1, TPIS, GSTP1, GTR1, ENOA, KPYM, PDIA1, ANXA2 e FABP5.

[072] Em uma modalidade do primeiro aspecto da invenção, opcionalmente em combinação com qualquer uma das modalidades fornecidas acima ou abaixo, o método compreende determinar o nível de expressão de seis proteínas selecionadas do grupo consistindo em: PERM, OSTP, CTNB1, CAYP1, XPO2, NGAL, SG2A1, CADH1, SPIT1, MMP9, NAMPT, LDHA, CASP3, PRDX1, MIF, K2C8, CAPG, MUC1, ANXA1, HSPB1, PIGR, CH10, CD44, CLIC1, TPIS, GSTP1, GTR1, ENOA, KPYM, PDIA1, ANXA2 e FABP5.

[073] Em uma modalidade do primeiro aspecto da invenção, opcionalmente em combinação com qualquer uma das modalidades fornecidas acima ou abaixo, o método compreende determinar o nível de expressão de sete proteínas selecionadas do grupo consistindo em: PERM, OSTP, CTNB1, CAYP1, XPO2, NGAL, SG2A1, CADH1, SPIT1, MMP9, NAMPT, LDHA, CASP3, PRDX1, MIF, K2C8, CAPG, MUC1, ANXA1, HSPB1, PIGR, CH10, CD44, CLIC1, TPIS, GSTP1, GTR1, ENOA, KPYM, PDIA1, ANXA2 e FABP5.

[074] Em uma modalidade do primeiro aspecto da invenção, opcionalmente em combinação com qualquer uma das modalidades fornecidas acima ou abaixo, o método compreende determinar o nível de expressão de oito proteínas selecionadas do grupo consistindo em: PERM, OSTP, CTNB1, CAYP1, XPO2, NGAL, SG2A1, CADH1, SPIT1, MMP9, NAMPT, LDHA, CASP3, PRDX1, MIF, K2C8, CAPG, MUC1, ANXA1, HSPB1, PIGR, CH10, CD44, CLIC1, TPIS, GSTP1, GTR1, ENOA, KPYM, PDIA1, ANXA2 e FABP5.

[075] Em uma modalidade do primeiro aspecto da invenção, opcionalmente em combinação com qualquer uma das modalidades fornecidas acima ou abaixo, o método compreende determinar o nível de expressão de nove proteínas selecionadas do grupo consistindo em: PERM, OSTP, CTNB1, CAYP1, XPO2, NGAL, SG2A1, CADH1, SPIT1, MMP9, NAMPT, LDHA, CASP3, PRDX1, MIF, K2C8, CAPG, MUC1, ANXA1, HSPB1, PIGR, CH10, CD44, CLIC1, TPIS, GSTP1, GTR1, ENOA, KPYM, PDIA1, ANXA2 e FABP5.

[076] Em uma modalidade do primeiro aspecto da invenção, opcionalmente em combinação com qualquer uma das modalidades fornecidas acima ou abaixo, o método compreende determinar o nível de expressão de dez proteínas selecionadas do grupo consistindo em: PERM, OSTP, CTNB1, CAYP1, XPO2, NGAL, SG2A1, CADH1, SPIT1, MMP9, NAMPT, LDHA, CASP3, PRDX1, MIF, K2C8, CAPG, MUC1, ANXA1, HSPB1, PIGR, CH10, CD44, CLIC1, TPIS, GSTP1, GTR1, ENOA, KPYM, PDIA1, ANXA2 e FABP5.

[077] Em uma outra modalidade do primeiro aspecto da invenção, opcionalmente em combinação com qualquer uma das modalidades fornecidas acima ou abaixo, o método compreende determinar o nível de expressão de dois ou mais dos seguintes marcadores: MMP9, LDHA, KPYM, PERM, SPIT1, NAMPT e CADH1.

[078] Em uma modalidade do primeiro aspecto da invenção, opcionalmente em combinação com qualquer uma das modalidades fornecidas acima ou abaixo, o método compreende determinar o nível de expressão de um dos seguintes conjuntos de marcadores: MMP9,LDHA; MMP9,KPYM; MMP9,PERM; MMP9,SPIT1; MMP9,NAMPT; LDHA,KPYM; LDHA,PERM; LDHA,SPIT1; LDHA,NAMPT; KPYM,PERM; KPYM,SPIT1; KPYM,NAMPT; PERM,SPIT1; PERM,NAMPT; e SPIT1,NAMPT.

[079] Em uma modalidade do primeiro aspecto da invenção, opcionalmente em combinação com qualquer uma das modalidades fornecidas acima ou abaixo, o método compreende determinar o nível de expressão de um dos seguintes conjuntos de marcadores: MMP9,LDHA,KPYM; MMP9,LDHA,PERM; MMP9,LDHA,SPIT1; MMP9,LDHA,NAMPT; MMP9,KPYM,PERM; MMP9,KPYM,SPIT1; MMP9,KPYM,NAMPT; MMP9,PERM,SPIT1; MMP9,PERM,NAMPT; MMP9,SPIT1,NAMPT; LDHA,KPYM,PERM; LDHA,KPYM,SPIT1; LDHA,KPYM,NAMPT; LDHA,PERM,SPIT1; LDHA,PERM,NAMPT; LDHA,SPIT1,NAMPT; KPYM,PERM,SPIT1; KPYM,PERM,NAMPT; KPYM,SPIT1,NAMPT; e PERM,SPIT1,NAMPT.

[080] Em uma modalidade do primeiro aspecto da invenção, opcionalmente em combinação com qualquer uma das modalidades fornecidas acima ou abaixo, o método compreende determinar o nível de expressão de um dos seguintes conjuntos de marcadores: MMP9,LDHA,KPYM,PERM; MMP9,LDHA,KPYM,SPIT1; MMP9,LDHA,PERM,SPIT1; MMP9,LDHA,SPIT1,NAMPT; MMP9,KPYM,PERM,NAMPT; MMP9,PERM,SPIT1,NAMPT; LDHA,KPYM,PERM,NAMPT; LDHA,PERM,SPIT1,NAMPT; e

[081] Em uma modalidade do primeiro aspecto da invenção, opcionalmente em combinação com qualquer uma das modalidades fornecidas acima ou abaixo, o método compreende determinar o nível de expressão de um dos seguintes conjuntos de marcadores: MMP9,LDHA,KPYM,PERM,SPIT1; MMP9,LDHA,KPYM,PERM,NAMPT; MMP9,LDHA,KPYM,SPIT1,NAMPT; MMP9,LDHA,PERM,SPIT1,NAMPT; MMP9,KPYM,PERM,SPIT1,NAMPT; e LDHA,KPYM,PERM,SPIT1,NAMPT.

[082] Em uma modalidade do primeiro aspecto da invenção, opcionalmente em combinação com qualquer uma das modalidades fornecidas acima ou abaixo, o método compreende determinar o nível de expressão de MMP9, LDHA, KPYM, PERM, SPIT1, NAMPT e CADH1.

[083] Como é relatado abaixo, quando o nível de expressão de MMP9 é determinado em um aspirado uterino, é obtido uma informação exata de diagnóstico/prognóstico (valor de AUC de cerca de 0,89 a 0,90).

[084] Em uma tentativa de melhorar a robustez de MMP9 como biomarcador de EC, os presentes inventores descobriram surpreendentemente que quando a detecção de MMP9 foi combinada com a detecção de uma ou mais das seguintes proteínas: KPYM, ENOA, PRDX1, MIF, GSTP1, CAPG, CADH1, HSPB1, PDIA1, LDHA, CLIC1, CASP3, FABP5, TPIS, LDHA, CTNB1, CH10, NAMPT e ANXA2, uma melhoria substancial na sensibilidade foi obtida, atingindo um valor de AUC de cerca de até 0,96. Esta descoberta foi surpreendentemente porque quando a MMP9 foi combinada com outras proteínas, a AUC resultante da combinação não foi afetada ou defeituosa quando comparada com uma fornecida por apenas MMP9.

[085] Assim, em uma modalidade de qualquer um dos métodos e usos fornecidos pela presente invenção, acima ou abaixo, é determinada a quantidade de MMP9 e uma ou mais proteínas selecionadas do grupo consistindo em: KPYM, ENOA, PRDX1, MIF, GSTP1, CAPG, CADH1, HSPB1, PDIA1, LDHA, CLIC1, CASP3, FABP5, TPIS, LDHA, CTNB1, CH10, NAMPT e ANXA2.

[086] Em uma outra modalidade de qualquer um dos métodos e usos fornecidos pela presente invenção, acima ou abaixo, é determinada a quantidade de MMP9 com uma proteína selecionada do grupo consistindo em: KPYM, ENOA, PRDX1, MIF, GSTP1, CAPG, CADH1, HSPB1, PDIA1, LDHA, CLIC1, CASP3, FABP5, TPIS, LDHA, CTNB1, CH10, NAMPT e ANXA2.

[087] Em uma outra modalidade de qualquer um dos métodos e usos fornecidos pela presente invenção, acima ou abaixo, é determinada a quantidade de MMP9 com duas proteínas selecionadas do grupo consistindo em: KPYM, ENOA, PRDX1, MIF, GSTP1, CAPG, CADH1, HSPB1, PDIA1, LDHA, CLIC1, CASP3, FABP5, TPIS, LDHA, CTNB1, CH10, NAMPT e ANXA2.

[088] Em uma outra modalidade de qualquer um dos métodos fornecidos pela presente invenção, acima ou abaixo, é determinada a quantidade de MMP9 com três proteínas selecionadas do grupo consistindo em: KPYM, ENOA, PRDX1, MIF, GSTP1, CAPG, CADH1, HSPB1, PDIA1, LDHA, CLIC1, CASP3, FABP5, TPIS, LDHA, CTNB1, CH10, NAMPT e ANXA2.

[089] Em uma outra modalidade de qualquer um dos métodos fornecidos pela presente invenção, acima ou abaixo, é determinada a quantidade de MMP9 com quatro proteínas selecionadas do grupo consistindo em: KPYM, ENOA, PRDX1, MIF, GSTP1, CAPG, CADH1, HSPB1, PDIA1, LDHA, CLIC1, CASP3, FABP5, TPIS, LDHA, CTNB1, CH10, NAMPT e ANXA2.

[090] Em uma outra modalidade de qualquer um dos métodos fornecidos pela presente invenção, acima ou abaixo, é determinada a quantidade de MMP9 com cinco proteínas selecionadas do grupo consistindo em: KPYM, ENOA, PRDX1, MIF, GSTP1, CAPG, CADH1, HSPB1, PDIA1, LDHA, CLIC1, CASP3, FABP5, TPIS, LDHA, CTNB1, CH10, NAMPT e ANXA2.

[091] Em qualquer uma das modalidades fornecidas acima ou abaixo, por qualquer um dos aspectos da invenção, o nível de expressão é determinado pelo nível de proteína. Nesta modalidade, o(s) marcador(s) de proteína incluem, mas não se limitam a polipeptídeos de sequência nativa, isoformas, polipeptídeos quiméricos, todos os homológos, fragmentos e precursores dos marcadores, incluindo formas modificadas dos polipeptídeos e derivados destes.

[092] Em qualquer uma das modalidades fornecidas acima ou abaixo, o nível de expressão é determinado por imunoquímica.

[093] O termo “imunoquica”, como aqui usado, refere-se a uma variedade de técnicas para detecção de antígenos (normalmente proteínas e petídeos, e no presente caso qualquer uma das proteínas listadas acima sozinhas ou em combinação) em uma amostra através da exploração do princípio de ligação de anticorpos especificamente aos ditos antígenos. A visualização de uma interação anticorpo-antígeno pode ser realizada de várias maneiras. No caso mais comum, um anticorpo é conjugado a uma enzima, como a peroxidase, que pode catalisar uma reação de produção de cor. Alternativamente, o anticorpo pode também ser marcado a um fluoróforo, tal como fluoresceína ou rodamina. A técnica de imunoquímica pode ser direta ou indireta. O método direto é um método de coloração de uma etapa e envolve um anticorpo marcado (por exemplo, anti-soro conjugado com FITC) reagindo diretamente com o antígeno. Embora esta técnica utilize apenas um anticorpo e, portanto, seja simples e rápida, a sensibilidade é menor devido à pouca amplificação do sinal, como nos métodos indiretos, e é menos comumente usada que os métodos indiretos. O método indireto envolve um anticorpo primário não marcado (primeira camada) que se liga ao antígeno alvo na amostra e um anticorpo secundário marcado (segunda camada) que reage com o anticorpo primário. Este método é mais sensível do que as estratégias de detecção direta devido à amplificação do sinal devido à ligação de vários anticorpos secundários a cada anticorpo primário se o anticorpo secundário for conjugado ao repórter fluorescente ou enzimático.

[094] A amplificação adicional pode ser alcançada se o anticorpo secundário for conjugado com várias moléculas de biotina, que podem recrutar complexos de avidina, estreptavidina ou enzima Neutravidina. O método indireto, além de sua maior sensibilidade, também tem a vantagem de que apenas um número relativamente pequeno de anticorpos secundários conjugados (marcados) padrão precisa ser gerado. Com o método direto, seria necessário rotular cada anticorpo primário para cada antígeno de interesse. Deve-se ter em mente que técnicas de imunoquímica também podem ser usadas para detectar certas sequências de ácido nucléico se uma sonda de ácido nucléico marcada (projetada para se ligar especificamente a uma determinada sequência de ácido nucléico alvo) pode ser posteriormente detectada com um anticorpo marcado. Assim, a detecção da proteína pode ser realizada utilizando um ácido nucleico marcado concebido para ligar uma sequência específica do RNA da proteína alvo, e depois detectar o referido ácido nucleico marcado com um anticorpo marcado que se liga selectivamente ao marcador.

[095] Os procedimentos de imunoensaio adequados incluem ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA), ensaio de imunodetálise enzimática, ensaio de aglutinação, ensaio sanduíche anticorpo-antígeno-anticorpo, ensaio sanduíche antígeno-anticorpo-antígeno, imunocromatografia ou outros formatos de imunoensaio bem conhecidos técnico normalmente habilitado.

[096] Em uma modalidade, em combinação com qualquer uma das modalidades fornecidas acima ou abaixo, o nível de expressão de proteína é determinado por um imunoensaio.

[097] Em uma outra modalidade, em combinação com qualquer uma das modalidades fornecidas acima ou abaixo, o nível de expressão de proteína é determinado por ELISA.

[098] Alternativamente, o nível de expressão de proteína pode ser determinado por bioluminescência, fluorescência, quimiluminescência, eletroquímica ou espectrometria de massas.

[099] Em uma outra modalidade, em combinação com qualquer uma das modalidades fornecidas acima ou abaixo, o nível de expressão de proteína é determinado usando um anticorpo ou um fragmento deste capaz de se ligar à(s) proteína(s) alvo.

[0100] O termo “anticorpo ou um fragmento deste capaz de se ligar à(s) proteína(s) alvo” é para ser entendido como qualquer imunoglobulina ou fragmento desta capaz de se ligar seletivamente à proteína alvo. Inclui anticorpos monoclonais e policlonais. O termo “fragmento deste abrange qualquer parte de um anticorpo tendo o tamanho e conformação adequados para se ligar a um epítopo da proteína alvo. Fragmentos adequados incluem F(ab), F(ab’) e Fv. Um “epítopo” é a parte do antígeno sendo reconhecida pelo sistema imune (células B, células T ou anticorpos).

[0101] Os anticorpos usados para a detecção específica pode ser policlonais ou monoclonais. Existem meios bem conhecidos no estado da técnica para preparar e caracterizar anticorpos. Os métodos para gerar anticorpos policlonais são bem conhecidos na técnica anterior. Resumidamente, prepara-se anticorpos policlonais por imunização de um animal com a proteína; depois, o soro do animal imunizado é recolhido e os anticorpos isolados. Uma vasta gama de espécies animais pode ser usada para a produção do anti-soro. Tipicamente, o animal usado para a produção de anti-soros pode ser um coelho, ratinho, rato, hamster, porquinho-da-índia ou cabra.

[0102] Além disso, anticorpos monoclonais (MAbs) podem ser preparados usando técnicas bem conhecidas. Tipicamente, o procedimento envolve a imunização de um animal adequado com a proteína associada à doença. A composição imunizante pode ser administrada numa quantidade eficaz para estimular células produtoras de anticorpos. Métodos para preparar anticorpos monoclonais são iniciados geralmente seguindo as mesmas linhas que a preparação de anticorpo policlonal. O imunógeno é injetado em animais como antígeno. O antigénio pode ser misturado com adjuvantes tais como adjuvante completo ou incompleto de Freund. A intervalos de duas semanas, aproximadamente, a imunização é repetida com o mesmo antígeno.

[0103] Em uma outra modalidade particular do terceiro aspecto, os meios para realizar a invenção formam parte de um kit. O anticorpo ou fragmento deste para detectar a(s) proteína(s) alvo pode ser incluído em um kit. O kit pode adicionalmente compreender meios (aditivos, solventes) para visualizar as interações de anticorpo- proteína.

[0104] Estes anticorpos podem ser usados como “meios” para determinar a expressão das proteínas alvo no quinto aspecto da invenção.

[0105] Todos as modalidades fornecidas acima, sob o primeiro aspecto da invenção, com respeito às proteínas para serem analisadas (de 2 a 10 da lista e dos conjuntos de proteína compreendendo 2, 3, 4, 5 ou 6 marcadores particulares), também são modalidades particulares do uso do terceiro aspecto da invenção.

[0106] Alternativamente, o nível de expressão é determinado pelo nível de mRNA.

[0107] Em uma modalidade, a quantidade de mRNA de cada um dos marcadores é detectada através da reação em cadeia de polimerase usando, por exemplo, iniciadores de oligonucleotídeo que hibridizam um ou mais marcadores de câncer do endométrio de polinucleotídeo ou complementos de tais polinucleotídeos. Dentro de outras modalidades, a quantidade de mRNA é detectada usando uma técnica de hibridização, utilizando sondas de oligonucleotídeo que hibridizam um ou mais marcadores de câncer do endométrio de polinucleotídeo ou complementos de tais polinucleotídeos.

[0108] Quando se utiliza a detecção de mRNA, o método pode ser realizado combinando mRNA isolado com reagentes para converter em cDNA de acordo com métodos padrão bem conhecidos na técnica, tratando o cDNA convertido com reagentes de reação de amplificação (tais como reagentes de reação de PCR de cDNA) em um recipiente juntamente com uma mistura apropriada de iniciadores de ácido nucleico; reagindo o conteúdo do recipiente para produzir produtos de amplificação; e analisando os produtos de amplificação para detectar a presença de um ou mais dos marcadores de câncer do endométrio polinucleotídicos na amostra. Para mRNA, a etapa de analisar pode ser realizada utilizando ánalise Northern Blot para detectar a presença de marcadores de câncer do endométrio polinucleotídicos na amostra. A etapa de analisar pode ser adicionalmente conseguida detectando quantitativamente a presença de marcadores de câncer do endométrio polinucleotídicos no produto de amplificação e comparando a quantidade de marcador detectada contra um painel de valores esperados para a presença ou ausência de tais marcadores em tecidos normais e malignos derivados usando iniciadores similares.

[0109] Em uma outra modalidade, a invenção proporciona um método em que mRNA é detectado por: (a) isolar mRNA de uma amostra e combinar o mRNA com reagentes para convertê-lo ao cDNA; (b) tratar o cDNA convertido com reagentes de reação de amplificação e iniciadores de ácido nucleico que hibridizam um ou mais dos marcadores de câncer do endométrio polinucleotídicos para produzir produtos de amplificação; (c) analisar os produtos de amplificação para determinar a quantidade de mRNA presente que codifica o marcador de proteína de câncer do endométrio; e (d) comparar a quantidade de mRNA determinada para uma quantidade detectada contra um painel de valores esperados para tecido normal e doente (por exemplo, tecido maligno) derivado usando métodos similares.

[0110] Em modalidades particulares da invenção, RT-PCR pode ser usada para amplificar o mRNA para marcadores de proteína de câncer do endométrio para detecção e análise. Outras modalidades da invenção usam RT-PCR quantitativa para determinar quantitativamente a quantidade de mRNA para marcadores de proteína de câncer do endométrio. Além disso, as modalidades da invenção usam RT-PCR em tempo real para quantificação e análise.

[0111] Em um quarto aspecto, a presente invenção proporciona um kit.

[0112] Em uma modalidade do quarto aspecto da invenção, os meios para determinar o(s) nível(s) de expressão são anticorpos ou fragmentos destes que especificamente se ligam à(s) proteína(s) alvo.

[0113] O número de anticorpos específicos ou fragmentos destes incluídos no kit dependerá do número de proteínas a ser detectado. A este respeito, as modalidades anteriores do método do primeiro aspecto da invenção forneceram vários conjuntos de proteínas a serem determinados para realizar um diagnóstico ou prognóstico apropriado de carcinoma endometrial, estes conjuntos de proteínas compreendendo duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez proteínas. Partindo desta informação, a pessoa habilitada pode ser capaz de escolher um dos conjuntos previamente mencionados e selecionar o anticorpo mais apropriado ou fragmento deste, daqueles já disponíveis, para a detecção de cada proteína. A incorporação dos anticorpos selecionados no suporte sólido apropriado pode ser realizada usando métodos de rotina.

[0114] Em uma modalidade do quarto aspecto, opcionalmente em combinação com qualquer uma das modalidades fornecidas acima ou abaixo, o kit compreende meios para detectar o nível de expressão de duas ou mais proteínas selecionadas de MMP9, LDHA, KPYM, PERM, SPIT1, NAMPT e CADH1.

[0115] Em uma modalidade do quarto aspecto da invenção, opcionalmente em combinação com qualquer uma das modalidades fornecidas acima ou abaixo, o kit compreende meios para determinar o nível de expressão de um dos seguintes conjuntos de marcadores: MMP9,LDHA; MMP9,KPYM; MMP9,PERM; MMP9,SPIT1; MMP9,NAMPT; LDHA,KPYM; LDHA,PERM; LDHA,SPIT1; LDHA,NAMPT; KPYM,PERM; KPYM,SPIT1; KPYM,NAMPT; PERM,SPIT1; PERM,NAMPT; SPIT1,NAMPT; MMP9, GSTP1; MMP9, HSPB1; e MMP9, CH10.

[0116] Em uma modalidade do quarto aspecto da invenção, opcionalmente em combinação com qualquer uma das modalidades fornecidas acima ou abaixo, o kit compreende meios para determinar o nível de expressão de um dos seguintes conjuntos de marcadores: MMP9,LDHA,KPYM; MMP9,LDHA,PERM; MMP9,LDHA,SPIT1; MMP9,LDHA,NAMPT; MMP9,KPYM,PERM; MMP9,KPYM,SPIT1; MMP9,KPYM,NAMPT; MMP9,PERM,SPIT1; KPYM,PERM,NAMPT; KPYM,SPIT1,NAMPT; e PERM,SPIT1,NAMPT.

[0117] Em uma modalidade do quarto aspecto da invenção, opcionalmente em combinação com qualquer uma das modalidades fornecidas acima ou abaixo, o kit compreende meios para determinar o nível de expressão de um dos seguintes conjuntos de marcadores: MMP9,LDHA,KPYM,PERM; MMP9,LDHA,KPYM,SPIT1;

[0118] Em uma modalidade do quarto aspecto da invenção, opcionalmente em combinação com qualquer uma das modalidades fornecidas acima ou abaixo, o kit compreende meios para determinar o nível de expressão de um dos seguintes conjuntos de marcadores: MMP9,LDHA,KPYM,PERM,SPIT1; MMP9,LDHA,KPYM,PERM,NAMPT; MMP9,LDHA,KPYM,SPIT1,NAMPT; MMP9,LDHA,PERM,SPIT1,NAMPT; MMP9,KPYM,PERM,SPIT1,NAMPT; e LDHA,KPYM,PERM,SPIT1,NAMPT.

[0119] Em uma outra modalidade do quarto aspecto, opcionalmente em combinação com qualquer uma das modalidades fornecidas acima ou abaixo, o kit compreende meios para detectar o nível de expressão de MMP9, LDHA, KPYM, PERM, SPIT1, NAMPT e CADH1.

[0120] Em qualquer uma das modalidades do quarto aspecto da invenção fornecidas acima, o kit pode opcionalmente compreender meios para detectar o nível de expressão de uma ou mais proteínas selecionadas de ENOA, KPYM, PDIA1, ANXA2 e FABP5.

[0121] Em uma outra modalidade, a presente invenção proporciona um kit compreendendo um suporte sólido e meios para detectar o nível de expressão de MMP9 e uma ou mais proteínas selecionadas do grupo consistindo em: KPYM, ENOA, PRDX1, MIF, GSTP1, CAPG, CADH1, HSPB1, PDIA1, LDHA, CLIC1, CASP3, FABP5, TPIS, LDHA, CTNB1, CH10, NAMPT e ANXA2.

[0122] Em uma outra modalidade, a presente invenção proporciona um kit compreende meios para determinar o nível de expressão de MMP9 e de uma proteína selecionada do grupo consistindo em: KPYM, ENOA, PRDX1, MIF, GSTP1, CAPG, CADH1, HSPB1, PDIA1, LDHA, CLIC1, CASP3, FABP5, TPIS, LDHA, CTNB1, CH10, NAMPT e ANXA2.

[0123] Em uma outra modalidade do quarto aspecto da invenção, o kit é um kit de ELISA. Nesta modalidade, o kit compreende um suporte sólido e meios para determinar o nível de expressão de qualquer um dos conjuntos de proteínas fornecidos acima. Em uma outra modalidade, o kit compreende um suporte sólido e anticorpos ou fragmentos destes dos quais especificamente se ligam às proteínas alvo a serem detectadas, estes anticorpos sendo conjugados com uma molécula reporter capaz de produzir um sinal.

[0124] O “suporte sólido” inclui uma membrana de nitrocelulose, vidro ou um polímero. Os polímeros mais comumente usados sendo celulose, poliacrilamida, náilon, poliestireno, cloreto de polivinila ou polipropileno. Os suportes sólidos podem ser na forma de tiras, tubos, esferças, discos ou microplacas, ou qualquer outra superfície adequada para conduzir um imunoensaio.

[0125] A “molécula reporter” como usado na presente especificação significa uma molécula que, por sua natureza química, fornece um sinal analiticamente identificável que permite a detecção de anticorpo de ligação ao antígeno. Detecção pode ser qualitativa ou quantitativa. As moléculas reporteres mais comumente usadas neste tipo de ensaio são quaisquer enzimas, fluoroforos ou radionuclídeo contendo moléculas (isto é, radioisótopos). No caso de um imunoensaio enzimático, uma enzima é conjugada ao segundo anticorpo, geralmente por meio de glutaraldeídeo ou periodato. Como será facilmente reconhecido, entretanto, existe uma ampla variedade de diferentes técnicas de conjugação, que são facilmente disponíveis àqueles habilitados na técnica. As enzimas comumente usadas incluem peroxidase de raiz forte, oxidase de glicose, β-galactosidase e fosfatase alcalina, entre outros. Os substratos a serem usados com as enzimas específicas são geralmente escolhidos para a produção, sob hidrólise pela enzima correspondente, de uma mudança de cor detectável. Por exemplo, fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolila/tetrazólio nitroazul é adequado para o uso com conjugados de tetrazólio alcalina; para conjugados de peroxidase, 1,2-fenilenodiamina, ácido 5-aminosalicílico, 3,3:5,5:tetra metil benzidina ou tolidina são comumente usados. Também é possível utilizar substratos fluorogênicos, que podezem um produto fluorescente ao invés de substratos cromogênicos observados acima. Exemplos de substratos fluorogênicos são fluoresceína e rodamina. Quando ativado por iluminação com luz de um comprimento de onda particular, o anticorpo rotulado por fluorocromo absorve a energia de luz, induzindo um estado de excitabilidade na molécula, seguido por emissão da luz em uma cor característica visualmente detectável com um microscópio de luz. Imunofluorescência e técnicas de EIA são bem estabelecidas na técnica e são particularmente preferidas para o presente método. Entretanto, outras moléculas reporteres, tais como moléculas e/ou corantes radioisótopos, quimioluminescentes e bioluminescentes e outras substâncias cromogênicas, também podem ser usados.

[0126] A escolha de um anticorpo conjugado a molécula reporter particular será, para a maior parte, determinada pelo uso intencionado e usuário do kit de teste da presente invenção.

[0127] Em uma outra modalidade, o kit é um microarranjo.

[0128] Em uma outra modalidade, o kit é um microarranjo incluindo um conjunto definido de genes que codifica marcadores de proteína de câncer do endométrio. Todas as modalidades fornecidas acima para conjuntos particulares de proteínas com 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 proteínas, cuja expressão é significantemente alterada por doença do endométrio, também são modalidades particulares de microarranjos.

[0129] Os métodos in vitro da invenção fornecem a informação de diagnóstico e prognóstico. Em uma modalidade, os métodos da invenção compreendem ainda as etapas de (i) coletar a informação de diagnóstico ou prognóstico, e (ii) salvar a informação em um portador de dados.

[0130] No sentido da invenção, um “portador de dados” deve ser entendido como qualquer meio que contenha dados significativos de informação para o diagnóstico ou prognóstico do carcinoma endometrial, como o papel. O portador pode também ser qualquer entidade ou dispositivo capaz de transportar os dados do prognóstico. Por exemplo, o portador pode compreender um meio de armazenamento, tal como uma ROM, por exemplo, um CD-ROM ou uma ROM de semicondutor, ou uma mídia de gravação magnética, por exemplo, um disquete ou disco rígido. Além disso, o portador pode ser um portador transmissível, tal como um sinal elétrico ou óptico, que pode ser transportado através de cabo elétrico ou óptico, ou por rádio ou outros meios. Quando os dados do prognóstico são incorporados em um sinal que pode ser transmitido diretamente por um cabo ou outro dispositivo ou meio, o portador pode ser constituído por esse cabo ou outro dispositivo ou meio. Outros portadores estão relacionados a dispositivos USB e arquivos de computadores. Exemplos de suporte de dados adequado são papel, CDs, USB, arquivos de computador em PCs ou registro de som com a mesma informação.

[0131] Ao longo da descrição e reivindicações, a palavra “compreende” e variações da palavra não se destinam a excluir outras características técnicas, aditivos, componentes ou etapas. Além disso, a palavra “compreende” e as suas variações englobam o termo “consistindo em”. Objetivos adicionais, vantagens e características da invenção tornar-se-ão evidentes para os especialistas na técnica após exame da descrição ou podem ser aprendidos pela prática da invenção. Os exemplos seguintes são fornecidos a título ilustrativo, e não pretendem limitar a presente invenção. Além disso, a presente invenção abrange todas as combinações possíveis de modalidades particulares e preferidas aqui descritas.

EXEMPLOS Exemplo 1 Reagentes

[0132] As colunas SpinTrap de Depleção de Albumina e IgG foram adquiridas da GE Healthcare (cat. no 28-9480-20). O grau de MS de endoproteinase Lys C foi adquirido da Thermo Scientific (cat. no 90051). Cartuchos de extração em fase sólida, Sep Pak tC18, 50 mg, foram obtidos da Waters (cat. no WAT054960). Todos os outros reagentes foram obtidos da Sigma-Aldrich.

Pacientes e coleta de amostras

[0133] Um total de 38 pacientes (20 mulheres sofrendo de EC e 18 controles não EC, isto é, mulheres tendo sintomas de EC, mas não diagnosticadas com EC) participantes deste estudo prospectivo foram recrutados no Hospital Universitário Vall d’Hebron (Barcelona, Espanha) durante 2012 a 2015. Os termos de consentimento informado, aprovados pelo Comitê de Ética de Vall d'Hebron, foram assinados por todos os pacientes (número de aprovação: PR_AMI_50-2012).

[0134] As amostras de fluido uterino foram coletadas por aspiração com um Cornier Pipelle (Ref. Eurogine 03040200) no consultório do clínico ou na sala de operações antes da cirurgia e transferidas a microtubos de 1,5 ml. Solução salina tamponada com fosfato foi adicionada em uma proporção de 1:1 (v/v) e centrifugada a 2.500 rcf por 20 min de modo a separar a fração solúvel (sobrenadante) a partir da fração sólida (sedimento). As frações separadas foram mantidas a -80 °C até serem utilizadas.

Preparação de amostras para o estudo de verificação

[0135] Os sobrenadantes de aspirados uterinos provenientes de 20 pacientes com EC e 18 controles não-EC foram sonicados para interromper potenciais microvesículas, agregados de proteína e/ou muco por 5 ciclos a 100 % de amplitude durante 5 segundos (Labsonic M). A albumina e a imunoglobulina G foram então esgotadas a partir de 50 μl de amostras de sobrenadante utilizando o kit “spin trap” de depleção de Albumin e IgG de acordo com as instruções do fabricante. A concentração total de proteína foi medida pelo ensaio de Bradford realizado em triplicado. Cada uma das 38 amostras foi então separada em duas alíquotas de 25 μg para gerar duplicatas para todo o processo, com exceção de uma amostra para a qual a quantidade de material não foi suficiente para duplicação. As amostras foram diluídas em uma solução 50 mM de bicarbonato de amônio a um volume final de 120 e foram desnaturadas por adição de 185 de ureia 10 M suspensa em bicarbonato de amônio 50 mM, incubadas a 22 sob agitação durante 20 min e seguido por 10 min de incubação em um banho de ultrassons (Branson 5510). As amostras foram então reduzidas com 7,8 μl de ditiotreitol 200 mM durante 60 minutos a 37 °C, e alquiladas com 12,2 μl de iodoacetamida 400 mM a 22 °C durante 30 minutos no escuro. As amostras foram digeridas durante 4 h a 37 °C com Lys C (proporção de quantidade de protease/proteína total de 1/150; p/p). Posteriormente, a concentração de ureia foi diluída para 1 M com 50 mM de tampão de bicarbonato de amônio, e as amostras foram incubadas durante a noite a 37 °C com tripsina (proporção de quantidade de protease/proteína total de 1/50; p/p). A atividade de tripsina foi extinta pela adição de 1 μl de ácido fórmico puro por 100 μl de solução. As amostras foram misturadas com a mistura de peptídeos sintéticos pesados e depois dessalinizadas em cartuchos de extração em fase sólida (Sep Pak tC18, 50 mg, Waters). Os eluatos foram subsequentemente evaporados até à secura em uma centrífuga a vácuo e depois ressuspensos em ácido fórmico a 0,1 % antes da análise por LC-PRM.

Configuração de PRM LC-MS/MS

[0136] A configuração de LC MS consistiu de um sistema de cromatografia Dionex Ultimate 3000 RSLC configurada para um gradiente binário de alta pressão e operada em modo de comutação de coluna. A fase móvel A consistiu de ácido fórmico a 0,1 % em água, a fase B em ácido fórmico a 0,1 % em acetonitrila e a fase de carga em ácido trifluoroacético a 0,05 % e acetonitrila a 1 % em água. O equivalente de 250 ng de cada amostra digerida foi injetado e carregado em uma coluna trap (75 μm x 2 cm, C18 pepmap 100, 3 μm) a 5 μl/min e eluído na coluna analítica (75 μm x 15 cm, C18 pepmap 100, 2 μm) a 300 nl/min por um gradiente linear partindo de A 2 % a B 35 % em 48 min. A análise de MS foi realizada por um espectrômetro de massa orbitrap quadrupolo híbrido (Q Exactive plus, Thermo Scientific) operado na modo PRM. O ciclo de MS iniciou com uma varredura de MS1 completa realizada em um poder de resolução de 70.000 (a 200 m/z) seguido por varreduras de PRM direcionadas programadas no tempo adquiridas em um poder de resolução de 35.000 (a 200 m/z) com uma energia de colisão normalizada de 20. A janela de isolamento de quadrupolo para os eventos de PRM foi definida para unidade de 1 m/z e a duração das janelas programadas no tempo para cada par de peptídeos endógenos e isotopicamente marcados foi definida para 2 min.

Análise estatística

[0137] Todas as análises foram realizadas no SPSS versão 20.0 (IBM, EUA) e Graph Pad Prism v.6.0 (GraphPad Software, CA, EUA). As proporção médias de área leve/pesada foram calculadas entre duplicatas. A correlação linear entre os peptídeos de assinatura da mesma proteína foi calculada usando o coeficiente de correlação de Pearson. Devido ao conjunto de dados não normalmente distribuídos, avaliado pelos testes de Kolmogorov-Smirnova e Shapiro-Wilk, a comparação da expressão dos peptídeos monitorados entre amostras de tumor e controle foi avaliada pelo teste não-paramétrico de Mann-Whitney U. Valores de P menores que 0,05, juntamente com mudanças de dobra ao longo de 3 foram considerados estatisticamente significativos. Curvas de características operacionais do receptor (ROC) foram usadas para calcular a relação entre sensibilidade e especificidade para EC versus o grupo controle não EC e, portanto, para avaliar o desempenho diagnóstico para cada candidato a biomarcador.

Resultados

[0138] A expressão de cada candidato a biomarcador entre 20 pacientes com EC e 18 controles não-EC foi comparada. É importante ressaltar que tanto os pacientes quanto os controles eram mulheres pós-menopausadas que sofriam de um sangramento vaginal anormal, já que 93 % dos pacientes que sofrem de EC apresentam essas características clínicas, mas apenas 15 % deles serão finalmente diagnosticados com EC.

[0139] Com base nos ensaios de Bradford, 250 ng da concentração total de proteínas após a depleção de albumina e IgG foram injetados para cada amostra. A quantidade constante de proteína injetada entre as amostras foi confirmada pela integração do cromatograma total de íons das varreduras MS1. Após a cura dos dados de MS, os níveis relativos (razão luz/peso) dos 98 peptídeos monitorizados em MS2 foram submetidos ao teste de Mann Whitney para a sua comparação entre amostras de tumor e de controle. 58 peptídeos correspondentes a 32 proteínas mostraram diferenças significativas entre os dois grupos com valor de p <0,05 e trocas maiores que 1,5: PERM, CADH1, SPIT1, ENOA, MMP9, LDHA, CASP3, KPYM, PRDX1, OSTP, PDIA1, NAMPT, MIF, CTNB1, K2C8, ANXA2, CAPG, FABP5, MUC1, CAYP1, XPO2, NGAL, SG2A1, ANXA1, HSPB1, PIGR, CH10, CD44, CLIC1, TPIS, GSTP1 e GTR1. Todas estas proteínas foram superexpressas em amostras de tumor em comparação com as amostras controle.

[0140] Para avaliar melhor sua utilidade como biomarcadores para o diagnóstico de EC, foi realizada uma análise de ROC para determinar a sensibilidade e especificidade de cada biomarcador. Curiosamente, todas as proteínas alcançaram excelentes valores de área sob a curva (AUC) para definir um aumento da probabilidade de EC em aspirados uterinos minimamente invasivos, variando de 0,71 a 0,95. As 10 proteínas individuais de melhor desempenho foram PERM, CADH1, SPIT1, ENOA, MMP9, LDHA, CASP3, isoforma M1-M2 de KPYM, PRDX1 e a isoforma A de OSTP, todas com valores de AUC superiores a 0,9. TABELA 1

[0141] Estes resultados permitem concluir que estas proteínas apresentam sensibilidade e especificidade muito elevadas em amostras de fluido isoladas do trato genital feminino.

[0142] Além disso, uma análise bioinformática usando análise de trajetória de engenhosidade (IPA) para entender melhor a associação dessas proteínas com câncer e sua origem em relação à localização subcelular também foi realizada. Como esperado, a integração dos dados resultou na identificação de câncer, doença inflamatória, lesão orgânica e anormalidades, e doença do sistema reprodutivo como as principais doenças associadas a esses biomarcadores. As cinco principais funções moleculares e celulares envolvidas com estas proteínas incluíam o movimento celular, a morte e a sobrevivência celular, o desenvolvimento celular, o crescimento e a proliferação celulares e a sinalização e interação célula-célula, todos os processos importantes alterados no câncer. Essas proteínas são encontradas principalmente no citoplasma, na membrana plasmática e no espaço extracelular, indicando que são provenientes da secreção das células epiteliais e inflamatórias do endométrio ou por necrose de células no tecido proximal. Essas características foram cruciais para facilitar o uso desses biomarcadores para diagnosticar EC em fluidos corporais proximais relacionados ao trato genital feminino.

Exemplo 2

[0143] O desempenho diagnóstico de várias proteínas foi avaliado por cromatografia líquida com detecção de espectrometria de massa usando o método de aquisição de monitoramento de reação paralelo (LC-PRM), como descrito acima, em amostras de aspirado uterino de 116 mulheres.

[0144] O processamento de aspirados uterinos incluiu a sua colheita por aspiração com um dispositivo especializado e a diluição do aspirado em um tubo com uma solução salina PBS1x em uma proporção de 1:1 (v/v). Em seguida, a centrifugação a 2.500 x g por 20 min foi realizada para separar a fração líquida da fração celular. Os sobrenadantes dos aspirados uterinos foram utilizados para avaliar os biomarcadores protéicos.

[0145] Das 116 mulheres, 69 foram diagnosticadas com EC, incluindo 49 endometrióides EC (EEC) e 20 ECs serosas não endometrióides (SEC); e as 47 mulheres restantes eram mulheres não-EC com endométrio normal ou com diagnóstico de doenças benignas.

[0146] Para obter biomarcadores significativos de EC, a expressão de cada marcador, que foi medida como a razão de área leve/pesada obtida no estudo LC- PRM (a configuração de LC-PRM é a mesma que no Exemplo 1), foi comparada na população tumoral (n = 69) contra a população não-EC (n = 47) usando o teste U não- paramétrico de Mann-Whitney. Valores de p ajustados menores que 0,05 foram considerados estatisticamente significantes. A análise de característica operacional do receptor (ROC) foi utilizada para avaliar a especificidade e sensibilidade dos biomarcadores e a área sob a curva de ROC (AUC) foi estimada para cada proteína individual. Os resultados estão resumidos na Tabela 2 abaixo: Tabela 2

[0147] Dos biomarcadores mais robustos, os inventores prestaram atenção na melhoria das informações de diagnóstico fornecidas pela MMP9. Para tanto, um modelo de regressão logística foi ajustado aos dados, a fim de avaliar o poder das diferentes combinações de proteínas para classificar as amostras em duas categorias clínicas (câncer e controle). Curvas de ROC foram geradas para cada um desses modelos de regressão; a AUC, a sensibilidade e especificidade no ponto de corte “ótimo” para discriminação entre grupos foram obtidas. O ponto de corte ótimo correspondia ao limiar que maximizava a distância até a linha de identidade (diagonal). O critério de otimalidade foi: max (sensibilidades + especificidades). Os intervalos de confiança de 95 % (CI) de AUCs foram calculados com o método de Delong (20). Os ICs de 95 % dos valores de sensibilidade e especificidade foram calculados com reamostragem bootstrap e os métodos de média descritos por Fawcett (Fawcett T., “An Introduction to ROC Analysis”, Pattern Recogn Lett. 2006, v. 27, páginas 861-874). Todas as análises de ROC foram realizadas usando o pacote R “pROC” (Robin X. et al., “pROC: an opensource package for R and S+ to analyze and compare ROC curves”, BMC Bioinformatics, 2011, v. 12, página 77). Para avaliar a robustez de cada painel de proteínas, foi realizado o procedimento de validação cruzada “leave-one-out” aplicando a cada amostra do conjunto de dados o modelo de regressão logística ajustado às demais amostras no conjunto de dados, obtendo uma nova curva de ROC e depois executando a análise de ROC usual. De forma semelhante, o poder de discriminação do painel de proteínas de diagnóstico foi ainda validado aplicando a cada amostra de um conjunto independente de amostras (coorte 2: coorte no Exemplo 1) o modelo de regressão logística ajustado ao conjunto inicial (coorte 1: coorte no Exemplo 2), derivando uma nova curva de ROC e depois executando a análise de ROC usual.

[0148] Assim, verificou-se que o valor do biomarcador MMP9 foi notavelmente melhorado quando a sua determinação foi realizada em combinação com KPYM, ENOA, PRDX1, MIF, GSTP1, CAPG, CADH1, HSPB1, PDIA1, LDHA, CLIC1, CASP3, FABP5, TPIS, LDHA, CTNB1, CH10, NAMPT e ANXA2; ao contrário de outras proteínas que, quando combinadas com a MMP9, afetaram negativamente o valor de biomarcador de EC de apenas MMP9.

[0149] Um exemplo específico de uma combinação positiva é a combinação MMP9 + KPYM que mostrou um valor de AUC de 0,96. Este achado foi surpreendente porque MMP9 e KPYM têm um valor de AUC individual de 0,89 e 0,90, respectivamente e, quando combinados, o valor de AUC da MMP9 é aumentado.

[0150] Pelo contrário, a combinação de MMP9 com PERM não melhorou a precisão para detectar EC. Nos exemplos 1 e 2, os valores individuais de AUC obtidos para MMP9 foram 0,91 e 0,89; e os valores de AUC para PERM foram 0,96 e 0,86. Contudo, a sua combinação não reportou qualquer valor de AUC melhorado. A combinação de MMP9 com PERM tem um valor de AUC de 0,89.

Exemplo 3

[0151] A detecção de MMP9 e KPYM através da tecnologia ELISA. Kits ELISA (R&D Systems e USCN life Science and Technology Company, respectivamente) de acordo com o protocolo do fabricante. Para MMP9, 105 amostras de aspirado uterino foram analisadas usando 1:10; Diluições 1:100 ou 1:1000. Para KPYM, apenas 39 amostras de aspirado uterino puderam ser analisadas usando diluições 1:2, 1:4 ou 1:10 devido à falta de material de amostra. Todas as amostras foram analisadas em duplicatas e os valores médios foram relatados como ng/mL. A correlação linear entre os resultados dos ensaios de LC-PRM e ELISA foi calculada usando o coeficiente de correlação de Pearson. Verificou-se que os resultados de ELISA foram altamente correlacionados com os observados em espectrometria de massa. Assim, MMP9 e KPYM podem ser usados em técnicas baseadas em anticorpos para diagnosticar EC.

Claims (11)

1. Método para diagnóstico ou prognóstico de carcinoma endometrial CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende determinar o nível de expressão de PERM e CLIC1 em uma amostra de fluido uterino aspirado do trato genital feminino.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda determinar o nível de expressão de uma ou mais das seguintes proteínas: MMP-9, KPYM, ENOA, PRDX1 , MIF, GSTP1 , CAPG, CADH1 , HSPB1 , PDIA1 , LDHA, CASP3, FABP5, TPIS, LDHA, CTNB1 , CH10, NAMPT, e ANXA2.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de expressão é determinado ao nível de proteína.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de expressão de proteína é determinado usando um anticorpo ou um fragmento deste capaz de se ligar à proteína.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo ou fragmento deste forma parte de um kit.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra isolada é fluido uterino.

8. Uso da combinação dos marcadores PERM e CLIC1, CARACTERIZADO pelo fato de que é como um marcador in vitro para diagnosticar ou prognosticar carcinoma endometrial em uma amostra de fluido uterino aspirado do trato genital feminino.

8. Uso da combinação dos marcadores PERM e CLIC1 CARACTERIZADO pelo fato de que é para diagnóstico ou prognóstico de carcinoma endometrial no método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

9. Kit CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um suporte sólido e meios para detectar o nível de expressão de MMP9 e CLIC1.

10. Kit, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda meios para determinar o nível de expressão de MMP9 e uma proteína selecionada do grupo que consiste em: PERM, KPYM, ENOA, PRDX1, MIF, GSTP1, CAPG, CADH1, HSPB1, PDIA1, LDHA, CASP3, FABP5, TPIS, LDHA, CTNB1, CH10, NAMPT, e ANXA2.

11. Kit, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, CARACTERIZADO pelo fato de que os meios para detectar o nível de expressão das proteínas são anticorpos ou fragmentos destes.