ES2356599T3 - Método y kit para el diagnóstico de colitis ulcerosa. - Google Patents
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Abstract
Método para la diferenciación entre colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn basándose en el análisis de perfiles de expresión génica en una o más muestras de biopsia obtenidas a partir de tejido inflamado de los intestinos de un paciente, caracterizado porque se determinan los niveles de expresión de al menos dos de varios genes marcadores, seleccionándose dichos al menos dos genes marcadores de SLC6A14, SLC26A2, GRO1, MMP-7, MAF-17, GISP y Vanin-1 y en el que - en relación con SLC6A14, la expresión de dicho gen marcador en tejido inflamado se considera una indicación de colitis ulcerosa, - en relación con SLC26A2, la falta de expresión de dicho gen marcador en tejido inflamado se considera una indicación de colitis ulcerosa, - en relación con GRO1, la expresión de dicho gen marcador en tejido inflamado se considera una indicación de colitis ulcerosa, - en relación con MMP-7, la expresión de dicho gen marcador en tejido inflamado se considera una indicación de colitis ulcerosa, - en relación con MAP-17, la expresión de dicho gen marcador en tejido inflamado se considera una indicación de colitis ulcerosa, - en relación con GISP, la expresión preferente de dicho gen marcador en tejido inflamado se considera una indicación de colitis ulcerosa, - en relación con Vanin-1, la expresión de dicho gen marcador en tejido inflamado se considera una indicación de colitis ulcerosa.
Description
Método y kit para el diagnóstico de colitis
ulcerosa.
La presente invención se refiere a diagnóstico
de enfermedades inflamatorias del intestino, y en particular a un
método y un kit para la predicción y/o el diagnóstico de colitis
ulcerosa. La invención da a conocer genes marcadores específicos
cuyo cambio en el estado de expresión, o bien conjuntamente o bien
un subconjunto de los mismos, es indicativo de colitis ulcerosa. La
presente invención se refiere además a métodos relacionados con ADN
mediante los que la cuantificación de los niveles de expresión de
dichos genes marcadores asociados con la enfermedad directamente a
partir de una biopsia proporciona una prueba de diagnóstico
inmediata y precisa para determinar el tipo de enfermedad, y/o la
evaluación del efecto de un régimen de tratamiento particular. La
invención da a conocer además kits de diagnóstico para la detección
de los niveles de expresión de dichos genes.
Enfermedad inflamatoria del intestino (EII) es
una expresión que abarca varios estados que implican inflamación
crónica en el sistema gastrointestinal. Dos de las formas más
debilitantes de EII son la colitis ulcerosa (CU) y la enfermedad de
Crohn (EC). Estas enfermedades afectan a personas jóvenes, con una
aparición típica a la edad de 20-30 años, y el
tratamiento de la enfermedad es un compromiso a largo plazo tanto
para el paciente como para el médico, puesto que en la actualidad no
existe cura para ninguno de los estados. Aproximadamente el 30% de
los pacientes con EII se someten a cirugía durante su vida y los
pacientes con EII de larga duración corren un riesgo considerable de
desarrollar cáncer colorrectal. Tres de cada diez pacientes con EII
no responden a la mejor terapia médica disponible hoy en día,
incluso cuando se usan dosis altas, que provocan efectos secundarios
considerables.
El tratamiento de los pacientes con CU activa
está dirigido a reducir la inflamación y a promover la curación del
colon y la recuperación de la mucosa. La causa subyacente de CU no
se comprende, ni se sabe qué desencadena que la enfermedad se repita
entre sus formas inactiva y activa. Sin embargo, el estadio activo
de la enfermedad se caracteriza por una inflamación significativa de
la mucosa, un aumento de la permeabilidad celular, una pérdida de
proteína y fluidos. En estadios graves, la inflamación profunda de
la pared intestinal puede desarrollarse con dolor con la exploración
abdominal, taquicardia, fiebre y riesgo de perforación
intestinal.
Un síntoma temprano de la colitis ulcerosa es
estreñimiento con paso de sangre o mucosidad a las heces. Pueden
pasar varios meses o años antes de que se desarrolle diarrea con
dolor abdominal. Los síntomas tardíos incluyen fatiga intensa,
pérdida de peso, pérdida del apetito, fiebre y ocasionalmente
artralgia.
El camino hacia un diagnóstico de colitis
ulcerosa establecido incluye con frecuencia un estudio meticuloso de
la historia clínica del paciente, la exclusión de otros estados, así
como varias pruebas, por ejemplo análisis de sangre, examen de las
heces, rayos X con enema de bario, sigmoidoscopia, colonoscopia y
biopsia. La biopsia puede realizarse como parte de un examen
mediante sigmoidoscopia o colonoscopia.
Es obvio que una posibilidad de distinguir
clínicamente CU de EC del colon en un estadio temprano
proporcionaría enormes beneficios tanto para el paciente como para
el médico. Permitiría diseñar regímenes de tratamiento precisos,
evitar medicaciones innecesarias y reducir los costes del
tratamiento. Aunque el cuadro clínico global en pacientes con EII
pueda mostrar algunas diferencias clínicamente importantes entre los
principales grupos de pacientes con CU y EC, existen similitudes
sustanciales, haciéndose así difícil para el personal sanitario
establecer un diagnóstico correcto.
La técnica anterior indica que los métodos
disponibles para distinguir entre las formas de EII, y en particular
la diferenciación entre CU y EC, aparte de los ejemplos dados
anteriormente de diferentes procedimientos de examen, se han
centrado en métodos basados en anticuerpos.
Por ejemplo, el documento WO 03/036262 describe
un método y aparato para la diferenciación de enfermedad de Crohn de
otras afecciones gastrointestinales, tales como colitis ulcerosa y
síndrome del intestino irritable, usando la presencia de anticuerpos
anti-Saccharomyces cerevisiae (ASCA) fecales como marcador
para la enfermedad de Crohn. El aparato incluye un inmunoensayo
ligado a enzimas u otro inmunoensayo que utiliza anticuerpos
específicos frente a inmunoglobulinas humanas para la medición de
los ASCA endógenos totales en una muestra fecal humana. El método y
aparato pueden usarse por los profesionales sanitarios para
distinguir la enfermedad de Crohn de otras afecciones
gastrointestinales, tales como colitis ulcerosa y síndrome del
intestino irritable.
El documento WO 01/58927 describe métodos de
diagnóstico para detectar enfermedades asociadas con una respuesta
autoantigénica frente a hTM en tejido afectado, y en particular
colitis ulcerosa.
Sigue existiendo una necesidad de métodos
mejorados para el diagnóstico preciso, rápido y fiable de la colitis
ulcerosa, en particular en el contexto de distinguir entre colitis
ulcerosa y enfermedad de Crohn en pacientes con EII.
Un objetivo de la presente invención es hacer
disponibles tales métodos y kits para este fin. Un objetivo
particular es hacer disponible un método y un kit que hagan posible
alcanzar un diagnóstico fiable en un estadio temprano de la
enfermedad. Otro objetivo es hacer posible distinguir entre EC y CU
también en casos difíciles, en los que el cuadro ciánico puede ser
muy similar.
Objetivos adicionales que subyacen a la
invención, así como las soluciones ofrecidas por la invención y las
ventajas asociadas resultarán evidentes para un experto tras el
estudio de la descripción, los ejemplos y las reivindicaciones.
Los presentes inventores han descubierto
sorprendentemente que la diferenciación entre colitis ulcerosa y
enfermedad de Crohn se hace posible mediante un enfoque de múltiples
genes en el que se estudian los perfiles de expresión génica en
muestras de biopsia obtenidas a partir de zonas inflamadas y
opcionalmente también no inflamadas en los intestinos de un
paciente.
La presente invención se basa en el
descubrimiento de posibles genes marcadores que, o bien
conjuntamente o bien en subgrupos, son indicativos del estado humano
de colitis ulcerosa (CU). Los presentes inventores descubrieron
sorprendentemente que la cuantificación de los niveles de expresión
de varios genes específicos puede utilizarse para diagnosticar de
manera precisa y sencilla a partir de una biopsia, si el paciente
está aquejado del estado de CU o, por ejemplo, enfermedad de
Crohn.
Más específicamente, se proporcionan métodos que
permiten la amplificación de ácido nucleico de siete (7) marcadores
genéticos diferenciados o subgrupos de los mismos, usando cebadores
específicos de gen preseleccionados que permiten la
semicuantificación de los niveles de expresión de dichos marcadores
genéticos. Se determinan los niveles de expresión de al menos dos de
los marcadores genéticos seleccionados de SLC6A14, SLC26A2, GRO1,
MMP-7, MAP-17, GISP y
Vanin-1. Los cebadores específicos de gen están
diseñados para hibridarse con cadenas opuestas del ADN que codifica
para el marcador genético de interés de manera que a través de
amplificación por PCR se produce una región definida del ADN
codificante del gen de marcador genético. Se proporcionan un ensayo
y un kit para la detección y monitorización del estado de expresión
de dichos siete genes marcadores o subconjuntos de los mismos en una
muestra biológica. El ensayo es un ensayo basado en PCR, no en
cultivo, para la detección de dichos genes marcadores.
La presente invención se describirá en mayor
detalle en la siguiente descripción y ejemplos, con referencia a los
dibujos en los que
La figura 1 muestra el análisis por
RT-PCR del estado de expresión de siete genes
marcadores en muestras de biopsia de pacientes aquejados de o bien
colitis ulcerosa (CU) o bien de enfermedad de Crohn (EC). El
protocolo experimental se resume en el ejemplo 6. (Claves: M, es un
marcador de pares de bases, H, representa una biopsia de un
individuo sano totalmente normal, I, representa una muestra de
biopsia tomada de una zona inflamada, y N, representa una biopsia
tomada de una zona no inflamada del mismo paciente. Los números en
la parte inferior de la figura indican el número del paciente y las
líneas negras verticales indican una muestra de biopsia N e I
derivada del mismo paciente). Se usó gamma-actina
como control de carga e indica el estado de expresión de un gen de
mantenimiento usado comúnmente para demostrar una entrada de ARNm
igual en todas las reacciones de RT-PCR.
Antes de darse a conocer y describirse la
presente invención, ha de entenderse que un experto en la técnica
apreciará fácilmente que la presente invención está bien adaptada
para llevar a cabo los objetivos y obtener los fines y ventajas
mencionados, así como aquellos objetivos, fines y ventajas
inherentes al presente documento. Los presentes ejemplos, junto con
los métodos, procedimientos, tratamientos, moléculas y compuestos
específicos descritos en el presente documento son este momento
representativos de realizaciones preferidas, son a modo de ejemplo,
y no pretenden limitar el alcance de la invención.
Tal como se usa en el presente documento, la
expresión "cebador de ADN complementario" significa un
oligonucleótido que se aparea con el molde de ARN en una orientación
particular para permitir la síntesis de una cadena de ADN naciente
en presencia de transcriptasa inversa en la muestra biológica en las
condiciones descritas en el presente documento.
También tal como se usa en el presente
documento, la "condición" en la que se sintetiza una cadena de
ADN incluyen la presencia de nucleótidos, cationes y agentes de
tamponamiento apropiados en cantidades y a temperaturas tales que el
molde de ARN y el cebador de ADN se aparearán y se incorporarán
oligonucleótidos a una cadena de ADN sintetizada si no se inhibe la
transcriptasa inversa por el fármaco inhibidor de la transcriptasa
inversa. Se exponen condiciones a modo de ejemplo en los ejemplos a
continuación. Las condiciones descritas se han optimizado a partir
de otros protocolos de síntesis de RT/ADNc conocidos. Generalmente
se sabe que pueden establecerse otras condiciones para la
optimización de una reacción de transcriptasa inversa particular
basándose en protocolos bien conocidos por un experto habitual en la
técnica.
Tal como se usa en el presente documento, la
expresión "par de cebadores" se refiere a dos cebadores,
denominándose uno directo y denominándose el otro inverso con
respecto a sus orientaciones respectivas en una molécula de ADN
bicatenaria que consiste en una secuencia sentido y antisentido, de
manera que en las condiciones de amplificación descritas en el
presente documento, el cebador directo se aparea con y ceba la
amplificación de la secuencia sentido y el cebador inverso se aparea
con y ceba la amplificación de la secuencia antisentido. Pueden
seleccionarse cebadores para su uso en la reacción de amplificación
basándose en, que tengan complementariedad mínima con otros
cebadores en la reacción (para minimizar la formación de dímeros de
cebadores) y que tengan valores de Tm con el intervalo de
temperaturas de reacción apropiadas para el método de amplificación,
preferiblemente PCR. Además, pueden seleccionarse cebadores para
aparearse con regiones específicas del molde de ARN de manera que el
tamaño del producto de amplificación de ADN resultante oscile desde
100 hasta 500 pares de bases de longitud, y lo más preferiblemente
alrededor de 300 pares de bases de longitud.
Por ejemplo, en las condiciones descritas
anteriormente, el par de cebadores puede consistir en el
oligonucleótido de SEQ ID NO: 13 como cebador directo y el
oligonucleótido de SEQ ID NO: 14 como cebador inverso.
Tal como se usa en el presente documento, los
términos "detectar" o "detección" del ADN amplificado se
refieren a determinar cualitativa o cuantitativamente la presencia
de la cadena de ADN amplificada, que sólo se sintetiza si la
transcriptasa inversa es resistente al fármaco inhibidor de la
transcriptasa inversa añadido a la mezcla de ensayo. La
amplificación del ADN sintetizado puede detectarse mediante
cualquier método para la detección de ADN conocido en la técnica.
Por ejemplo, la detección del ADN amplificado puede tener lugar
mediante un ensayo de hibridación mediante transferencia de tipo
Southern, mediante visualización de productos de amplificación de
ADN de peso molecular específico en geles de agarosa teñidos con
bromuro de etidio, mediante la medición de la incorporación de
nucleótidos radiomarcados en la cadena de ADN sintetizado mediante
autorradiografía o medición de centelleo.
El método de detección preferido es mediante
electroforesis en gel de agarosa usando tinción con bromuro de
etidio y visualización bajo luz UV.
Los principios de la PCR y las condiciones para
la amplificación y detección de ácidos nucleicos diana se conocen
bien en la técnica y pueden encontrarse en numerosas referencias
conocidas por el experto, incluyendo, por ejemplo, los documento
U.S. 4.683.195; U.S. 4.683.202 y U.S. 4.965.188; todas concedidas a
Mullis et al. En resumen, se calienta una muestra que se
sospecha que contiene un ácido nucleico diana para desnaturalizar el
ácido nucleico bicatenario en presencia de dos cebadores de
oligonucleótido que son complementarios a las secuencias diana que
flanquean la región que va a amplificarse. Los cebadores se aparean
con las cadenas dianas separadas y se extienden desde cada extremo
hidroxilo 3' mediante un agente de polimerización tal como una
polimerasa termoestable. Puede amplificarse ADN bicatenario o
monocatenario mediante PCR. ARN también puede servir como diana
mediante transcripción inversa de ARN en ADNc.
Las etapas de desnaturalización, apareamiento de
cebadores y síntesis de ADN se llevan a cabo a temperaturas
diferenciadas, y ciclos repetidos dan como resultado una acumulación
exponencial del ácido nucleico diana. El recipiente para PCR es
generalmente una bolsa o una cubeta o un recipiente de plástico con
tapón tal como se describe en el documento U.S. 5.229.297. Los
reactivos para la amplificación por PCR se mezclan normalmente en un
único recipiente, y generalmente incluyen cebadores, nucleósidos
trifosfato (generalmente dATP, dCTP, dGTP y dTTP o dUTP), ADN
polimerasa termoestable, tampón que contiene magnesio, y ácido
nucleico diana. Los reactivos y condiciones para la PCR se conocen
bien por un experto habitual en la técnica, y pueden encontrarse,
por ejemplo, en Guatelli et al. (1989) Clin. Microbiol. Rev.
2:217. Para la amplificación de dianas de ARN, puede utilizarse una
transcriptasa inversa además de o en lugar de la ADN polimerasa
termoestable. Las transcriptasas inversas termoestables son
particularmente útiles, ya que son ADN polimerasas termoestables que
tienen actividad de transcriptasa inversa. Un experto habitual en la
técnica conoce métodos para la amplificación por PCR de dianas de
ARN y éstos se describen, por ejemplo, en los documentos U.S.
5.176.995, 5.310.652 y 5.322.770.
La detección del ADN amplificado mediante la PCR
se lleva a cabo generalmente de manera que el ADN se somete a
electroforesis usando gel de agarosa, gel de acrilamida o similares,
y entonces se somete a tinción con reactivos de tinción específicos
para ácidos nucleicos. En el caso de la detección de ADN
bicatenario, habitualmente se deja que entre un reactivo
fluorescente tal como bromuro de etidio entre las dos cadenas del
ADN y entonces se excita el reactivo fluorescente mediante una
fuente de luz ultravioleta. Debido a que el bromuro de etidio que
entra entre las dos cadenas del ADN emite fluorescencia, la
detección se realiza por medio de captura de fluorescencia con una
cámara CCD o similar.
El objeto de la presente invención se logra
mediante la amplificación, por PCR, de siete genes marcadores
específicos o subconjuntos de los mismos y posterior separación
mediante electroforesis de los productos de esta amplificación,
seguido de técnicas de coloración apropiadas que permiten una
visualización adecuada del ADN en el gel incluyendo, pero sin
limitarse a: coloración con sales de plata, radioisótopos y enzimas
combinadas con sustratos que permiten su detección.
Un objeto de ciertas realizaciones de la
presente invención es proporcionar un método de llevar a cabo
reacciones de amplificación de ácido nucleico en una única cámara de
reacción mediante lo cual se hibridan pares de cebadores internos
con regiones opuestas de dichos genes de marcador genético diana, y
la amplificación se produce mediante reacción en cadena de la
polimerasa.
Se diseñaron pares de cebadores de control
interno para hibridarse con cadenas opuestas de un gen de
mantenimiento de control adecuado de manera que pueden realizarse
comparaciones semicuantitativas. Un gen de mantenimiento preferido
de este tipo puede ser actina, GADPH, o factores de elongación.
Midiendo la intensidad de la señal de control interno y comparándola
con las señales proporcionadas por dichos genes de marcador
genético, puede determinarse el grado de cambio de expresión de
dicho gen de marcador genético a partir de los niveles de expresión
normales (es decir aquellos niveles en los que no está presente
ningún estado patológico).
En el método de la presente invención, la
amplificación por PCR se logra incubando previamente todos los
reactivos de PCR y una muestra que contiene un ácido nucleico diana
en presencia de cebadores específicos de gen apropiados y una enzima
polimerasa termoestable. La mezcla de reacción resultante se
calienta cíclicamente en condiciones que permiten la formación y
amplificación de productos de extensión de cebador.
Los expertos en la técnica conocen los reactivos
requeridos para la PCR, y generalmente incluyen al menos dos
cebadores de oligonucleótido que son suficientemente complementarios
a las regiones conservadas del ácido nucleico diana para hibridarse
con las mismas, cuatro nucleósidos trifosfato diferentes, un agente
de polimerización termoestable y cualquier cofactor requerido para
el agente de polimerización. Nucleósidos trifosfato preferidos son
los desoxirribonucleósidos trifosfato dATP, dCTP, dGTP y dTTP o
dUTP, denominados conjuntamente dNTP. Nucleósidos trifosfato se
encuentran comercialmente disponibles.
Los cebadores incluyen oligonucleótidos que se
producen de manera natural o producidos de manera sintética que
pueden aparearse con el ácido nucleico diana y que actúan como el
punto de iniciación de síntesis de ácido nucleico en condiciones
apropiadas, es decir, en presencia de nucleósidos trifosfato, un
agente de polimerización, tampón, pH y temperatura adecuados. Los
cebadores tienen secuencias suficientemente complementarias al ácido
nucleico diana para hibridarse con el mismo, y son de longitud
suficiente, normalmente desde 10-60 nucleótidos,
para cebar la síntesis de productos de extensión en presencia de un
agente de polimerización. Los cebadores pueden producirse
sintéticamente mediante síntesis automatizada mediante métodos bien
conocidos para un experto habitual en la técnica.
En la técnica se conocen bien consideraciones de
diseño para los cebadores. Los cebadores se seleccionan para que
sean sustancialmente complementarios a las secuencias de las cadenas
del ácido nucleico especifico que va a amplificarse, de manera que
el producto de extensión sintetizado a partir de un cebador, cuando
se separa de su complemento, puede servir como molde para el
producto de extensión del otro cebador. Preferiblemente, los
cebadores son exactamente complementarios con la región diana. Se
destaca que los pares de cebadores dados en la presente memoria
descriptiva, ejemplos y reivindicaciones pueden sustituirse por
cebadores funcionalmente equivalentes, que muestren especificidad
para los genes marcadores, sin apartarse del alcance de la
invención.
Los inventores han identificado inesperadamente
siete (7) genes marcadores cuyos cambios específicos en el estado de
expresión, conjuntamente o en subconjuntos, es indicativo del estado
de la enfermedad inflamatoria del intestino, CU. Esto brinda la
posibilidad de un protocolo de detección rápida a nivel molecular
diseñado para ayudar al médico que examina a afirmar correctamente
el tipo de enfermedad.
El perfil de expresión en tejido inflamado y no
inflamado se muestra a modo de ejemplo en la figura 1 y en la tabla
1 a continuación.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Los marcadores genéticos son familia 6 de
portadores de solutos, miembro 14 (SLC6A14), familia 26 de
portadores de solutos, miembro 2 (SLC26A2), oncogén alfa relacionado
con el crecimiento quimiocina CXC (Gro-alfa)
o
(CXCL-1), matrilisina también conocida como metaloproteinasa 7 de matriz (MMP-7), proteína secretora gastrointestinal (GISP) también conocida como gen regenerador de tipo IV (Reg IV), proteína 17 asociada a la membrana (MAP-17), y vanin-1. Véase la tabla 2.
(CXCL-1), matrilisina también conocida como metaloproteinasa 7 de matriz (MMP-7), proteína secretora gastrointestinal (GISP) también conocida como gen regenerador de tipo IV (Reg IV), proteína 17 asociada a la membrana (MAP-17), y vanin-1. Véase la tabla 2.
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Los agentes de polimerización son compuestos que
funcionan para logar la síntesis de los productos de extensión de
cebador. Los agentes de polimerización son termoestables, es decir,
no se inactivan permanentemente cuando se calientan durante breves
periodos hasta las temperaturas usadas normalmente en la PCR para la
desnaturalización de las cadenas de ADN, por ejemplo,
93-95ºC, y preferiblemente son activos a alta
temperaturas. En una realización preferida el agente de
polimerización es una ADN polimerasa termoestable, incluyendo, por
ejemplo, ADN polimerasa obtenida de bacterias termófilas tales como,
Thermococcus litoralis, Bacillus stearothermophilus,
Methanothermus fervidus, Thermus aquaticus, T. filiformis, T.
flavus, T. lacteus, T. ruhens, T. ruber y T.
thermophilus;
o de arqueobacterias termófilas tales como Desulfurococcus mobilis, Methanobacterium thermoautotrophilcum, Sulfolobus solfataricus, S. acidocaldarius y Thermoplasma acidophilum. En una realización más realización preferida, el agente de polimerización es polimerasa de Thermus aquaticus (Taq), polimerasa de T. thermophilus (Tth) o polimerasa de Thermococcus litoralis. También se contemplan como agentes de polimerización transcriptasa inversa termoestable y ADN polimerasas que tienen actividad de transcriptasa inversa.
o de arqueobacterias termófilas tales como Desulfurococcus mobilis, Methanobacterium thermoautotrophilcum, Sulfolobus solfataricus, S. acidocaldarius y Thermoplasma acidophilum. En una realización más realización preferida, el agente de polimerización es polimerasa de Thermus aquaticus (Taq), polimerasa de T. thermophilus (Tth) o polimerasa de Thermococcus litoralis. También se contemplan como agentes de polimerización transcriptasa inversa termoestable y ADN polimerasas que tienen actividad de transcriptasa inversa.
Las polimerasas termoestables pueden obtenerse
comercialmente o mediante métodos conocidos en la técnica. En
particular, Taq polimerasa se encuentra comercialmente disponible de
forma recombinante y nativa (Perkin Elmer-Cetus) o
puede producirse mediante el método descrito por Lawyer et
al., (1989) o en el documento U.S. 4.889.818. Tth polimerasa se
encuentra comercialmente disponible de Finnzyme Co., Finlandia y de
Toyobo Co., Japón. La polimerasa de Thermococcus litoralis se
encuentra comercialmente disponible de New England Biolabs y puede
producirse mediante el método descrito en el documento U.S.
5.322.785.
Pueden incluirse anticuerpos específicos para
los agentes de polimerización termoestables en la etapa de
amplificación previa para inhibir el agente de polimerización antes
de la amplificación. Pueden producirse anticuerpos mediante métodos
conocidos por un experto habitual en la técnica y que se encuentran,
por ejemplo, en Harlowe et al. (1988) Antibodies: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY. Según la presente
invención, el término anticuerpos incluye anticuerpos monoclonales y
policlonales producidos mediante metodologías convencionales,
anticuerpos producidos de manera recombinante, y fragmentos de
anticuerpos producidos de manera química o recombinante, tales como
los fragmentos Fab. En una realización preferida, los anticuerpos
son monoclonales.
En una realización preferida el anticuerpo es un
anticuerpo monoclonal frente a Taq polimerasa, Tth polimerasa, o
polimerasa de Thermococcus litoralis. En una realización más
preferida, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal frente a Taq
polimerasa. En la técnica se conocen anticuerpos monoclonales frente
a Taq polimerasa y se describen, por ejemplo, en el documento U.S.
5.338.671. Según la presente invención, anticuerpos definidos como
específicos para agente de polimerización son aquellos anticuerpos
que pueden inhibir la actividad enzimática del agente de
polimerización a temperaturas de desde aproximadamente
20-40ºC. Los anticuerpos de la invención se
inactivan a las temperaturas elevadas usadas durante los ciclos
térmicos de la PCR. La capacidad de los anticuerpos para inhibir la
actividad enzimática de la puede determinarse mediante ensayos
conocidos por un experto habitual en la técnica, tal como se
describe, por ejemplo, por Sharkey et al., (1994).
La presente descripción proporciona un método
para la. amplificación de un ácido nucleico diana, y opcionalmente,
la detección posterior del ácido nucleico, en una muestra que se
sospecha que contiene el ácido nucleico diana. La muestra puede ser
cualquier muestra que se sospecha que contiene un ácido nucleico
diana, incluyendo, por ejemplo, una muestra de tejido, sangre, pelo,
fluido corporal, bacterias, virus, hongos, célula infectada por
bacterias, célula infectada por virus, etc. El ácido nucleico diana
puede ser ADN o ARN. Debe conocerse un número suficiente de bases a
ambos extremos de la secuencia que va a amplificarse con el fin de
diseñar cebadores que pueden hibridarse con las diferentes cadenas
del ácido nucleico diana en posiciones adecuadas para la
amplificación por PCR. El ácido nucleico diana puede extraerse o
extraerse parcialmente de la muestra de tejido antes de la PCR, por
ejemplo, eliminando proteínas o material celular de la muestra. Un
experto habitual en la técnica conoce métodos para extraer ácidos
nucleicos de las muestras y éstos pueden encontrarse, por ejemplo,
en Sambrook et al., (1989) y Saiki et al., (1985).
En una realización preferida, se prefieren
particularmente con fuente de material biopsias resecadas del
sistema gastrointestinal y de una zona que se cree que presenta
signos de la enfermedad.
En el método de amplificación, se pone en
contacto la muestra o una preparación de ácidos nucleicos extraídos
de la muestra con los reactivos usados normalmente para la PCR,
incluyendo al menos dos cebadores de oligonucleótido modificados
para que contengan al menos un enlace fosforotioato, cuatro
nucleósidos trifosfato diferentes, un agente de polimerización
termoestable, y un tampón apropiado, y adicionalmente con una
exonucleasa para formar una mezcla de reacción. En otra realización,
se incluye en la mezcla un anticuerpo especifico para el agente de
polimerización.
Los reactivos para PCR convencionales,
incluyendo cebadores, nucleósidos trifosfato, agente de
polimerización, y tampón apropiado se utilizan a concentraciones
generalmente apropiadas para la PCR y conocidas por un experto
habitual en la técnica. En una realización preferida, los
nucleósidos trifosfato son dATP, dCTP, dGTP y dTTP. En una
realización preferida el agente de polimerización es una ADN
polimerasa termoestable. ADN polimerasas preferidas son Taq
polimerasa, Tth polimerasa y polimerasa de Thermacoccus
litoralis. Se prefiere particularmente Taq polimerasa.
El método de amplificación se lleva a cabo
preferiblemente de manera continua, automatizada. El experto
habitual conoce bien la instrumentación apropiada para la PCR
automatizada y ésta se describe, por ejemplo, en las patentes
estadounidenses n.^{os} 4.965.188, 5.089.233 y 5.229.297. El
experto también puede detectar fácilmente el producto amplificado,
por ejemplo, separando los productos de la PCR mediante
electroforesis en gel de agarosa y visualizando mediante tinción con
bromuro de etidio, o detectando mediante hibridación con una sonda
marcada que puede hibridarse con el ácido nucleico amplificado o una
variedad de otros métodos de detección bien conocidos por un experto
habitual en la técnica.
Por tanto, una realización de la invención es un
método para la diferenciación entre colitis ulcerosa y enfermedad de
Crohn basándose en el análisis de perfiles de expresión génica en
muestras de biopsia obtenidas a partir de zonas inflamadas y no
inflamadas en los intestinos de un paciente, en el que se determinan
los niveles de expresión de al menos dos de varios genes marcadores,
seleccionándose dichos al menos dos genes marcadores de SEQ.ID.NO.
1, SEQ.ID.NO. 2, SEQ.ID.NO. 3, SEQ.ID.NO. 4, SEQ.ID.NO. 5,
SEQ.ID.NO. 6, y SEQ.ID.NO. 7.
Otra realización de la invención es un método en
el que se determinan los niveles de expresión de SEQ.ID.NO. 1 y
SEQ.ID.NO. 2 y en el que la expresión de SEQ.ID.NO. 1 en tejido
inflamado y la falta de expresión en tejido no inflamado, junto con
la falta de expresión de SEQ.ID.NO. 2 en tejido inflamado se
considera una indicación de colitis ulcerosa.
Una tercera realización de la invención es un
método en el que se determinan los niveles de expresión de
SEQ.ID.
NO. 1, SEQ. ID.NO. 2 y SEQ. ID.NO. 3, y en el que la expresión de SEQ.ID.NO. 1 en tejido inflamado y la falta de expresión en tejido no inflamado, junto con la falta de expresión de SEQ.ID.NO. 2 en tejido inflamado, y la expresión de SEQ. ID.NO. 3 en tejido inflamado y la falta de expresión en tejido no inflamado, se considera una indicación de colitis ulcerosa.
NO. 1, SEQ. ID.NO. 2 y SEQ. ID.NO. 3, y en el que la expresión de SEQ.ID.NO. 1 en tejido inflamado y la falta de expresión en tejido no inflamado, junto con la falta de expresión de SEQ.ID.NO. 2 en tejido inflamado, y la expresión de SEQ. ID.NO. 3 en tejido inflamado y la falta de expresión en tejido no inflamado, se considera una indicación de colitis ulcerosa.
Una cuarta realización es un método en el que se
determinan los niveles de expresión de SEQ.ID.
NO. 1, SEQ.ID.NO. 2 y SEQ. ID.NO. 4, y en el que la expresión de SEQ.ID.NO. 1 en tejido inflamado y la falta de expresión en tejido no inflamado, junto con la falta de expresión de SEQ.ID.NO. 2 en tejido inflamado, y la expresión de SEQ.ID.NO. 4 en tejido inflamado y la falta de expresión en tejido no inflamado, se considera una indicación de colitis ulcerosa.
NO. 1, SEQ.ID.NO. 2 y SEQ. ID.NO. 4, y en el que la expresión de SEQ.ID.NO. 1 en tejido inflamado y la falta de expresión en tejido no inflamado, junto con la falta de expresión de SEQ.ID.NO. 2 en tejido inflamado, y la expresión de SEQ.ID.NO. 4 en tejido inflamado y la falta de expresión en tejido no inflamado, se considera una indicación de colitis ulcerosa.
Una quinta realización es un método en el que se
determinan los niveles de expresión de SEQ.ID.NO. 1 a 7, y en el que
la expresión de SEQ.ID.NO. 1, 3, 4, 5, 6 y 7 en tejido inflamado y
la falta de expresión en tejido no inflamado, junto con la falta de
expresión de SEQ. ID. NO. 2 en tejido inflamado, se considera una
indicación de colitis ulcerosa.
Según una realización preferida, el método según
una cualquiera de las realizaciones anteriores incluye una etapa en
la que se determina el nivel de expresión de cada gen marcador a
través de amplificación de ácido nucleico de dichos genes usando
cebadores específicos de gen, y determinación de los resultados de
amplificación. La amplificación de ácido nucleico se realiza
preferiblemente usando PCR y los cebadores específicos de gen
preferiblemente seleccionados de SEQ.ID.NO.
13-26.
La determinación de los resultados de
amplificación se realiza preferiblemente usando tinción con bromuro
de etidio y visualización bajo luz UV.
La presente descripción proporciona además un
kit para PCR que comprende, en el mismo recipiente o recipientes
separados, un agente de polimerización termoestable, y pares de
cebadores diseñados para permitir la amplificación por PCR de dichos
genes diana. También pueden proporcionarse recipientes adicionales
para la inclusión de, por ejemplo, anticuerpos adicionales
específicos para el agente de polimerización de PCR y reactivos para
PCR, incluyendo, por ejemplo, nucleósidos trifosfato, cebadores y
tampones.
En consecuencia, la presente invención hace
disponible un kit para la diferenciación entre colitis ulcerosa y
enfermedad de Crohn basándose en el análisis de perfiles de
expresión génica en muestras de biopsia obtenidas a partir de zonas
inflamadas y no inflamadas en los intestinos de un paciente,
incluyendo dicho kit pares de cebadores específicos de gen dirigidos
a al menos dos genes marcadores seleccionados de SEQ.ID.NO. 1,
SEQ.ID.NO. 2, SEQ.ID.NO. 3, SEQ.ID.NO. 4, SEQ.ID.NO. 5, SEQ.ID.NO. 6
y SEQ.ID.NO. 7.
Dichos pares de cebadores específicos de gen se
seleccionan preferiblemente de SEQ.ID.NO. 13 y SEQ.ID.NO. 14;
SEQ.ID.NO. 15 y SEQ.ID.NO. 16; SEQ.ID.NO. 17 y SEQ.ID.NO. 18;
SEQ.ID.NO. 19 y SEQ.ID.NO. 20; SEQ.ID.NO. 21 y SEQ.ID.NO. 22;
SEQ.ID.NO. 23 y SEQ.ID.NO. 24; y SEQ.ID.NO. 25 y SEQ.ID.NO. 26.
Según una realización de la invención, dichos
cebadores específicos son SEQ.ID.NO. 13 y SEQ.ID.NO. 14; SEQ.ID.NO.
15 y SEQ.ID.NO. 16; y SEQ.ID.NO. 17 y SEQ.ID.NO. 18.
Según otra realización de la invención, dichos
cebadores específicos son SEQ.ID.NO. 13 y SEQ.ID.NO. 14; SEQ.ID.NO.
15 y SEQ.ID.NO. 16; y SEQ.ID.NO. 19 y SEQ.ID.NO. 20.
El kit según la invención preferiblemente
comprende además un agente de polimerización termoestable y
cofactor(es) requerido(s). En una realización preferida el agente de polimerización es una ADN polimerasa. En una realización más preferida la polimerasa es Taq polimerasa, Tth polimerasa, o polimerasa de Thermococcus litoralis. Se prefiere particularmente Taq polimerasa. El anticuerpo preferido es un anticuerpo monoclonal especifico para Taq polimerasa.
cofactor(es) requerido(s). En una realización preferida el agente de polimerización es una ADN polimerasa. En una realización más preferida la polimerasa es Taq polimerasa, Tth polimerasa, o polimerasa de Thermococcus litoralis. Se prefiere particularmente Taq polimerasa. El anticuerpo preferido es un anticuerpo monoclonal especifico para Taq polimerasa.
Los cebadores de oligonucleótido preferiblemente
son de 19-25 nucleótidos de longitud y están
diseñados como pares de cebadores que en condiciones convencionales
se aparearán con el ADN diana de dichos genes de marcador genético.
En este caso se proporcionan siete pares de cebadores que permitirán
la amplificación satisfactoria de dichos siete genes de marcador
genético. Los cebadores específicos usados se presentan en la tabla
3.
Los marcadores genéticos dados a conocer son,
familia 6 de portadores de solutos, miembro 14 (SLC6A14), tal como
se facilita mediante SEQ.ID.NO.1, familia 26 de portadores dé
solutos, miembro 2 (SLC26A2) tal como se facilita mediante
SEQ.ID.NO. 2, oncogén alfa relacionado con el crecimiento quimiocina
CXC (Gro-alfa) o (CXCL-1) tal como
se facilita mediante SEQ.ID.NO. 3, matrilisina también conocida como
metaloproteinasa 7 de matriz (MMP-7) tal como se
facilita mediante SEQ.ID.NO. 4, proteína 17 asociada a la membrana
(MAP-17) tal como se facilita mediante SEQ.ID.NO.
5, proteína secretora gastrointestinal (GISP) también conocida como
gen regenerador de tipo IV (Reg IV) tal como se facilita mediante
SEQ.ID.NO. 6 y Vanin-1 tal como se facilita mediante
SEQ.ID.NO. 7. Véase la tabla 2, citada anteriormente.
En los métodos ilustrados mediante los ejemplos
se usaron varias secuencias basadas en el método. Éstas se presentan
en la tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las proteínas portadoras de solutos (SLC) están
comprendidas por una familia muy grande de moléculas de transporte
dependiente de la energía y tienen papeles fisiológicos críticos en
el transporte de nutrientes y pueden utilizarse como mecanismo para
aumentar la absorción de fármacos. Sin embargo, existe una
comprensión limitada de estas proteínas a nivel molecular debido a
la ausencia de estructuras cristalinas de alta resolución.
En total, el 1-2% de los adultos
y el 6-8% de los niños que padecen de cálculos
renales tienen cistinuria, un defecto en el transporte de
aminoácidos que conduce a altas concentraciones de cistina en la
orina. Se ha. implicado a dos genes, familia 3 de portadores de
solutos transportador de aminoácidos (cistina, básicos y) neutros,
miembro 1 (SLC3A1) que codifican para la proteína relacionada con el
sistema de transportador de aminoácidos, y familia 7 de portadores
de solutos, miembro 9 (SLC7A9). Se cree que estos dos portadores de
solutos están implicados en la formación de
cálculos que en última instancia pueden conducir infección de las vías urinarias y, finalmente, insuficiencia renal.
cálculos que en última instancia pueden conducir infección de las vías urinarias y, finalmente, insuficiencia renal.
El portador de solutos SLC6A14 se identificó y
se clonó por primera vez por Sloan et al, 1999 en glándula
mamaria de seres humanos. Sloan et al mostraron una fuerte
expresión en el pulmón y glándulas salivares y en menor medida en el
útero, próstata, estómago, glándula mamaria e hipófisis. En este
punto el gen se conocía todavía como transportador hATB^{0+}.
SLC6A14 (o hATB^{0+}) es un transportador de aminoácidos
catiónicos y neutros dependiente de Na+ y Cl- (Bode, 2001). En el
documento WO 2002/014500, SLC6A14 se identifica en el colon humano
(véase la tabla 2 y 3A, SEQ ID NO. 738).
El gen de portador de solutos SLC26A2 (también
denominado DTDST) se clonó por Hästbacka, 1996 y se dio a conocer su
función como transportador de sulfato. En Rossi, 2001, se dan a
conocer mutaciones en SLC26A2 y su participación en estados de
displasia ósea. En Haila et al se identificó la expresión del
gen SLC26A2, con el nombre DTDST, en el epitelio de la cripta
superior de la mucosa del colon.
Los inventores han identificado los dos
portadores de solutos conocidos (SLC6A14 y SLC26A2) cuya expresión
se ve significativamente alterada en la EII. Según saben los
inventores, esta es la primera notificación de la posible
participación de los portadores de solutos en enfermedades
inflamatorias del intestino. Por tanto, es un hallazgo novedoso que
los portadores de solutos puedan contribuir a la patogenia de la
EII.
El oncogén alfa relacionado con el crecimiento
quimiocina CXC (Gro-alfa también conocido como GRO1)
es tal como se describe una citocina y como tal puede alterar las
respuestas migratorias de numerosos tipos de células en zonas
localizadas de inflamación. Se ha descrito que se sobreexpresa en
córneas inflamadas humanas (Spandau et al., 2003) y además,
se ha mostrado que ratas que se han inducido químicamente para
presentar inflamación del intestino muestran niveles regulados por
incremento de GRO1 (Hirata et al., 2001). Usando un enfoque
de micromatriz de ADNc, Heller et al., 1997 describe la
participación novedosa de la quimiocina Gro alfa en la artritis
reumatoide y enfermedad inflamatoria del intestino, sin embargo la
invención presentada en el presente documento, según saben por
primera vez los inventores, que GRO1, aunque se sobreexpresa en
estados de CU, se regula por disminución en estados de EC. Aunque en
Isaacs et al, 1992, se describe que la expresión de GRO1 en
CU es mayor que la observada en EC, en este caso se ha demostrado
que existe una correlación inversa de CU frente a EC con respecto a
los niveles de expresión de GRO1. Por último, Lawrence et
al., 2001 describe la identificación de que GRO1 se regula por
incremento en CU, pero el diseño del estudio fue tal que las
muestras de biopsia se reunían antes del análisis, por tanto no fue
posible saber si GRO1 se regulaba por incremento en más de 1
paciente.
Matrilisina o (metaloproteinasa 7 de matriz) se
descubrió por primera vez en el útero de rata en involución; se ha
conocido también como metaloproteinasa uterina, metaloproteinasa
putativa (Pump-1), y metaloproteinasa 7 de matriz
(MMP-7). Es el miembro más pequeño (28 kDa) de una
familia de 15 MMP que juntas pueden degradar la mayoría de las
macromoléculas de la matriz extracelular. Esta familia se revisa
brevemente; todos los miembros son metaloproteinasas de zinc que
aparecen en forma de zimógeno con el sitio activo de zinc bloqueado
por cisteina. La matrilisina puede degradar una amplia gama de
gelatinas, proteoglicanos y glicoproteinas de la matriz y pueden
activar varias MMP distintas incluyendo colagenasa (revisado en
Woessner, 1996).
Se expresa frecuentemente en diversos tipos de
cáncer incluyendo cánceres de colon, estómago, próstata y cerebral.
Estudios previos han sugerido que la matrilisina desempeña papeles
importantes en la progresión y la metástasis del cáncer de colon.
Recientemente se ha descrito por Newell et al., 2002 que
existe un aumento en la expresión de matrilisina en diferentes fases
de neoplasia asociada con CU. Sin embargo, este trabajo no determina
si tal aumento de expresión es un resultado de CU o si más bien se
debe a la presencia de neoplasia.
Se han determinado expresiones de MAP 17
(también conocido como DD96) a niveles significativos sólo en una
única población de células epiteliales, las células epiteliales
tubulares proximales del riñón. También se expresaba de manera
difuminada en diversos carcinomas que se originaban en riñón, colon,
pulmón y mama. En tejidos normales, MAP 17 se expresa en cantidades
significativas sólo en el riñón, donde se localizaba en el ribete en
cepillo de células epiteliales tubulares proximales. Sin embargo,
MAP17 se expresa abundantemente en carcinomas que surgen de riñón,
colon, pulmón y mama, en algunos casos con una distribución
glandular apical asociada a la membrana (Kocher, 1996). También se
ha mostrado que el gen se expresa en queratinocitos humanos y que
podría estar implicado en la fisiología y patología epidérmica
(Jaeger, 2000). No se ha mostrado ninguna conexión con la
inflamación o la EII.
Proteína secretora gastrointestinal (GISP, tal
como se mencionó anteriormente conocida también como RegIV), tiene
un patrón de expresión restringido, con expresión destacada en el
sistema gastrointestinal. También se ha mostrado que RegIV se regula
por incremento significativamente mediante lesión en la mucosa a
partir de enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa activa (Hartupee
et al., 2001). Hartupee et al. no da a conocer ninguna
diferencia en la expresión en -las dos enfermedades. El nivel de
expresión de GISP se ha identificado también como un marcador para
el cáncer de estómago (documento JP2002-209600)
comparándose el nivel de GISP en una muestra biológica con un nivel
umbral y correlacionándose con el riesgo de desarrollar cáncer de
estómago.
La panteteinasa (EC 3.5.1.) es una enzima ubicua
que se ha demostrado que in vitro recicla ácido pantoténico
(vitamina B5) y produce cisteamina, un potente antioxidante. La
enzima se codifica por el gen Vanin-1 y se expresa
ampliamente en tejidos de ratón. Vanin-1 es una
panteteinasa anclada a GPI, y en consecuencia una ectoenzima. Se ha
sugerido que Vanin/panteteinasa podrían estar implicados en la
regulación de algunas funciones inmunitarias, quizás en el contexto
de la respuesta al estrés oxidativo (Pitari et al.,
2000).
Según saben los inventores, esta es la primera
descripción del posible papel Vanin-1 en la EII.
Aunque la presente invención se ha descrito con
especificidad según algunas de sus realizaciones preferidas, los
siguientes ejemplos pretenden sólo ilustrar la invención y no
limitar la misma. Aunque son típicos de métodos y etapas de método
que podrían usarse, pueden adoptarse otros conocidos por los
expertos en la técnica sin recurrir a experimentación indebida.
\vskip1.000000\baselineskip
Las biopsias se tomaron de pacientes que se
seleccionaron basándose en evidencias clínicas y patológicas de
tener el estado inflamatorio de EC o CU. Se recogieron un total de
tres biopsias en un sitio inflamado del colon, junto con tres
muestras de biopsia de una región no inflamada de un solo paciente
individual. Esto se realizó para un total de 16 pacientes diferentes
de los que a ocho se les diagnosticó EC (paciente
1-8) y a ocho CU (paciente 9-16). El
grupo de pacientes con CU comprendía 2 mujeres y 6 hombres, siendo
el intervalo de edades de 29-77 años. El grupo de
edades con EC, de manera correspondiente, 3 mujeres y 5 hombres,
intervalo de edades 27-59.
Se reunieron las biopsias de cada sitio
anatómico de un paciente y se aisló el ARN total usando el kit
Rneasy de Quiagen y un homogeneizador Pellet Pestel Motor según el
protocolo del fabricante. De este modo se aislaron 32 muestras de
ARN total, dos muestras por paciente: inflamado (diana) y no
inflamado (control).
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron dos microgramos de cada muestra de ARN
(32 en total) para una síntesis de la primera cadena de ADNc usando
10 pM del oligo-dT-cebador
dT-unión (5'-TAG TCT ATG ATC GTC GAC
GGC TGA TGA AGC GGC CGC TGG AGT TTT TTT TTT TTT TTT
TTV-3' (SEQ. ID. NO. 8.) introduciendo en cada
molécula de ADNc sintetizada tres sitios de corte de enzima de
restricción: Salí, NotI y BpmI. El tampón, los desoxinucleótidos
trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP) y la enzima transcriptasa
inversa (Superscript II) se adquirieron de Gibco BRL y las
reacciones se realizaron según las directrices del fabricante. La
mezcla de reacción para la síntesis de la primera cadena excluyendo
la enzima se preincubó durante 5 min. a 65ºC en una máquina para PCR
(PCR sprint de Hybaid), se enfrió en hielo, y entonces se precalentó
hasta 42ºC, antes de añadirse la enzima Superscript II y se incubó
durante 1 h a 42ºC en una máquina para PCR (PCR sprint de
Hybaid).
Para la síntesis de la segunda cadena, se
añadieron 41 ul de tampón para la segunda cadena a las reacciones
según el protocolo proporcionado (Gibco BRL) y 4 \mul de
Polimerasa I de E. coli (New England Biolabs), 1,5 \mul de
ADN ligasa de E. coli (New England Biolabs) y 0,7 \mul de
Rnase H (Gibco BRL) en un volumen total de 160 \mul. Se incubaron
las reacciones durante 2,5.h a 16ºC en la máquina para PCR PCR
sprint y entonces se purificó usando el kit de purificación para PCR
de Quiagen según el protocolo proporcionado. Se eluyó cada muestra
(32 en total) con 32 \mul de tampón de elución y se usaron 26
\mul de cada muestra para las etapas siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Debido a las cantidades limitadas de material
obtenido de tales biopsias, fue necesaria una etapa de amplificación
previa. Para la amplificación in vitro del extremo 3' de los
ADNc, se digirieron 26 \mul de ADNc de cada muestra con 10 U de la
enzima de restricción DpnII en un volumen de 30 \mul durante 3 h a
37ºC. Se purificaron los ADNc cortados una vez más usando el kit de
purificación para PCR de Quiagen y se eluyeron los ADNc en 47 \mul
de tampón de elución. Se realizó la siguiente etapa de ligación
circular en un volumen de 50 \mul que incluían 44 \mul del ADNc
cortado con DpnII y 2000 U de ADN ligasa de T4 (New England
Biolabs). Se incubaron estas mezclas de reacción a 22ºC durante 1 h,
se inactivaron por calor mediante 65ºC durante 10 min. y se usaron
25 \mul de cada mezcla de reacción para la etapa de amplificación.
Se reunió una mezcla para 5 reacciones por muestra (5 x 50 \mul=
250 \mul en total) que contenía 25 \mul de ADNc (cortado con
DpnII y ligado de manera circular), 25 \mul de tampón para PCR
Advantage 2 PCR 10x (Clontech), 5 \mul de cebador
unión-Not (10 pmol/\mul; 5'-TGA
TGA AGC GGC CGC TGG-3' (SEQ. ID. NO. 9)), 5 \mul
de cebador unión-Sal (10 pmol/\mul;
5'-TTC ATC AGC CGT CGA CGA TC-3.'
(SEQ. ID. NO. 10), 5 \mul de mezcla de dNTP 10 mM y 5 \mul de
Taq-Polimerasa Advantage 2 50x (Clontech). Para
cada muestra se distribuyó la mezcla en 5 tubos de reacción para PCR
y se realizó la PCR en las siguientes condiciones: 1 min. a 94ºC
entonces 16x (20 s a 94ºC, 20 s a 55ºC, 1 min. a 72ºC).
Se retiraron cuatro de las reacciones por
muestra y se colocaron en hielo y se determinó el número de ciclos
óptimo con una de las reacciones por muestra. Se determinó que el
número de ciclos optimo era de 18 ciclos para las 32 muestras, por
tanto para las cuatro reacciones restantes por muestra se realizaron
dos ciclos adicionales [2x (20 s a 94ºC, 20 s a 55ºC, 1 min. a
72ºC)]. Posteriormente se purificaron las 4 reacciones de PCR por
muestra usando el kit de purificación para PCR de Quiagen. Para la
purificación, se reunieron las cuatro reacciones por muestra (total
de 200 mi) y entonces se eluyeron con 34 \mul de tampón de
elución. Las reacciones purificadas fueron el material de partida
para la identificación del protocolo de genes que se expresan de
manera diferencial.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó el aislamiento de ADNc expresados de
manera diferencial según el protocolo resumido en (von Stein O. D.,
2001) con modificaciones minoritarias al protocolo.
\vskip1.000000\baselineskip
Tras la construcción de una biblioteca de ADNc,
se sembraron en placa 2.000 clones a partir de cada sustracción en
una placa de agar de 22 cm^{2}. A partir de esta placas se
recogieron 384 colonias y se colocaron en placas de 384 pocillos con
70 \mul de medio LB/pocillo (véase Maniatis et al.,
Molecular cloning laboratory book, apéndice A.1) (+ ampicilina 100
mg/ml) usando la máquina BioPick de BioRobotics (Cambridge, RU). Se
incubaron los clones bacterianos durante la noche a 37ºC y entonces
se usaron para la PCR de las colonias. Esta PCR se realizó en placas
para PCR de 384 pocillos en un volumen-de 20 \mul
por muestra. Una reacción de PCR incluía: 2 \mul de tampón para
PCR 10x, 0,4 \mul de cebador Sport-Not (10 pmol de
5'-CGT AAG CTT GGA TCC TCT AGA GC-3'
(SEQ. ID. NO. 11), 0,4 \mul de cebador Sport-Sal
(10 pmol 5'-TGC AGG TAC CGG TCC GGA ATT
CC-3' (SEQ. ID. NO. 12)), 1,6 \mul de mezcla de
dNTP (25 mM cada uno), 0,4 \mul de azul de bromofenol al 0,1% y
0,5 \mul de Taq-polimerasa DynAzyme (2 U/\mul;
Finnzyme). Se preparó una mezcla madre para todas las reacciones, se
distribuyó y entonces se inoculó con 384 réplicas en plástico. Los
parámetros de los ciclos de la PCR fueron: 2 min. a 94ºC, 37 veces
(30 s a 94ºC; 30 s a 50ºC, 1 min. a 72ºC) y 5 min. a 72ºC.
Tras la amplificación, se colocaron por puntos
las reacciones de PCR sobre una membrana Hybond N+ (Amersham) usando
Microgrid TAS de BioRobotics. Se colocaron por puntos todos los
clones por duplicado y se usó ADN genómico como puntos guía. En un
filtro se situaron 384 genes de las cuatro sustracciones. Se
realizaron 24 duplicados para los análisis mediante hibridación con
sondas de ADNc radioactivas diferentes.
Entonces se hibridaron estos filtros con los
ADNc sustraídos marcados de manera radioactiva de los ocho
pacientes. Se usaron dieciséis filtros en 16 experimentos de
hibridación diferentes. Para esto se usaron 1 \mul de los ADNc
para el mareaje con polimerasa de Klenow. El protocolo de
hibridación fue el del protocolo de Church tal como se resume en
(Maxam y Gilbert 1984).
Se usaron el aparato para obtención de imágenes
Phospho-imager Fuji film BAS 1800II con el programa
BAS 1800 III R y Array visión versión 6.0 (Imaging Research Inc)
para determinar el grado de expresión de manera diferencial. Se
secuenciaron los genes que se expresaron de manera diferencial en al
menos tres de los ocho pacientes con una tasa de inducción o
reducción de tres veces y se realizó un análisis de BLAST para
identificar estos genes expresados de manera diferencial
aislados.
\vskip1.000000\baselineskip
Varios genes mostraron una fuerte desregulación
durante estos análisis. Para confirmar estos datos se realizaron
RT-PCR usando oligonucleótidos específicos de gen y
material de ADNc sin amplificar derivado de los mismos ocho
pacientes. Aproximadamente, se tomaron 2 \mug de ARN total de
tejido inflamado y no inflamado (el mismo que se usó para la
sustracción) para una síntesis de la primera cadena de ADNc tal como
se describió en el ejemplo 5. Tras la síntesis del ADNc se incubaron
las muestras durante 3 min. a 96ºC y entonces se diluyó 1:10 con
agua desti-
lada.
lada.
\newpage
Se tomaron 10 \mul de diluciones 1:10
adicionales para una reacción de PCR de 50 \mul. La reacción de
PCR incluía: 5 \mul de tampón para PCR 10x, 1 \mul de cebador
directo (10 pmol/\mul) y 1 \mul de cebador inverso (10
pmol/\mul) de los genes específicos (SEQ. ID. NO.
1-7)), 0,5 \mul de mezcla de dNTP (25 mM cada uno)
y 0,5 \mul de Taq-polimerasa DynAzyme (2 U/ml;
Finnzyme). Se preparó una mezcla madre menos el ADNc para las
reacciones, se distribuyó y entonces se añadió el ADNc. Los
parámetros de los ciclos de PCR fueron: 1 min. a 94ºC,
26-35 veces (30 s a 94ºC; 30 s a 55ºC, 1 min. a
72ºC) y 5 min. a 72ºC. El número de ciclos dependía de qué
fragmentos de genes se amplificaban. Los pares de cebadores fueron
los mostrados en la tabla 3.
Estos análisis conducen a la identificación de
siete (7) marcadores genéticos cuyo cambio en el estado de
expresión, conjuntamente o en subconjuntos, en comparación con
tejido normal permitiría una tasa predicación correcta por encima
del 90% con respecto a CU. Para confirmar estos hallazgos, los
marcadores se seleccionaron adicionalmente frente a una recogida de
muestras mayor de biopsias.
\vskip1.000000\baselineskip
Para confirmar los resultados preliminares de la
RT-PCR usando el ADNc de ocho pacientes con CU y
tres pacientes con EC (véase el ejemplo 6), se decidió analizar la
expresión de todos los genes aislados a gran escala. Para este fin,
se colocaron por puntos todos los genes que pudieron aislarse a
partir de la selección sobre una membrana Hybond N+ (Amersham)
usando el Microgrid TAS (BioRobotics). Tal como se describió en el
ejemplo 5 los genes se amplificaron a través de una PCR de las
colonias para la colocación por puntos.
Entonces se sintetizó esta membrana de filtro
madre 240 veces y se hibridó con ADNc marcado de manera radioactiva
y que se derivaba de biopsias de 50 pacientes con CU individuales y
50 pacientes con EC individuales. Se tomaron las biopsias de la zona
inflamada y no inflamada de los pacientes en el lado izquierdo del
colon. Como control de referencia se reunieron las biopsias que se
derivaban del lado izquierdo del colon de cinco personas sanas.
\vskip1.000000\baselineskip
Para proporcionar un mayor peso estadístico, fue
necesario realizar análisis de expresión de los siete marcadores
genéticos en muestras "ciegas" de biopsia, mediante lo cual no
se sabia si la biopsia se derivaba de un paciente que padecía CU o
EC. Tal como se describió anteriormente, se realizó el análisis por
RT-PCR de dichos marcadores genéticos y combinando
el cuadro total de los patrones de expresión que resultaron de
dichos marcadores genéticos fue posible determinar con más del 90%
de certeza la forma correcta de EII.
El análisis de los resultados (estudio ciego)
muestra que ya la combinación de SEQ. ID. NO. 1 y 2 proporciona un
resultado fiable, mientras que la combinación de las SEQ. ID. NO. 1,
2 y 3 o la combinación de las SEQ. ID. NO. 1, 2, y 4 proporciona un
resultado mejorado adicional. Los resultados preliminares indican
que se alcanzó una precisión de aproximadamente el 90% usando la
combinación de las SEQ. ID. NO. 1, 2, 3 y 4. Se mostró que el uso
del conjunto completo de las SEQ. ID. NO. 1 a 7 dio como resultado
una precisión de más del 90%.
\vskip1.000000\baselineskip
Bode BP (2001). Recent molecular
advances in mammalian glutamine transport. J Nutr. Sep; 131
(supl. 9): 2475S-85S; discusión
2486S-7S.
Breuning MH, Hamdy NA
(2003). From gene to disease; SLC3A1, SLC7A9 and cystinuria.
Ned Tijdschr Geneeskd. 147:245-7.
Guatelli JC, Gingeras TR,
Richman DD (1989). Nucleic acid amplification in
vitro: detection of sequences with low copy numbers and
application to diagnosis of human immunodeficiency virus type 1
infection. Clin Microbiol Rev. 2: 217-26.
Haila S,
Saarialho-Kere U,
Karjalainen-Lindsberg ML, Lohi H,
Airola K, Holmberg C, Hästbacka J, Kere
J, Höglund P. (2000). The congenital chloride diarrhea
gene is expressed in seminal vesicle, sweat gland, inflammatory
colon epithelium, and in some dysplastic colon cells. Histochem
Cell Biol. Abril; 113 (4):279-86.
Harlowe E y Lane D (1989).
Antibodies. A laboratory manual, Cold Spring Harbour, NY.
Hartupee JC, Zhang H,
Bonaldo MF, Soares MB, Dieckgraefe BK.
(2001). Isolation and characterization of a cDNA encoding a
novel member of the human regenerating protein family: Reg IV.
Biochim Biophys Acta. 16 de abril; 1518(3):
287-93.
Heller RA, Schena M, Chai
A, Shalon D, Bedilion T, Gilmore J,
Woolley DE, Davis RW (1997). Discovery and
analysis of inflammatory disease-related genes using
cDNA microarrays. Proc Natl Acad Sci USA. 94:
2150-5.
Hirata I, Murano M, Nitta
M, Sasaki S, Toshina K, Maemura K, Katsu
K (2001). Estimation of mucosal inflammatory mediators in rat
DSS-induced colitis. Possible role of PGE(2)
in protection against mucosal damage. Digestión. Supl. 63 1:
73-80.
Hästbacka J,
Superti-Furga A, Wilcox WR,
Rimoin DL, Cohn DH, Lander ES. (1996).
Sulfate transport in chondrodysplasia. Ann N Y Acad Sci. 8 de
junio; 785: 131-6.
Isaacs KL, Sartor RB,
Haskill S (1992). Cytokine messenger RNA profiles in
inflammatory bowel disease mucosa detected by polymerase chain
reaction amplification. Gastroenterology. 103:
1587-95.
Jaeger C, Schaefer BM,
Wallich R, Kramer MD (2000). The
membrane-associated protein pKe#192/MAP17 in human
keratinocytes. J Invest Dermatol. Sept.; 115 (3):
375-80.
Kocher O, Cheresh P, Lee SW
(1996). Identification and partial characterization of a
novel membrane-associated protein (MAP17)
up-regulated in human carcinomas and modulating cell
replication and tumor growth. Am J Pathol. Agosto;
149(2): 493-500.
Lawrance IC, Fiocchi C,
Chakravarti S (2001). Ulcerative colitis and Crohn's
disease: distinctive gene expression profiles and novel
susceptibility candidate genes. Hum Mol Genet. 10:
445-56.
Lawyer, F.C., Stoffel, S.,
Saiki, R.K., Myambo K, Drummond R,
Gelfand DH (1989). Isolation, characterization, and
expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene
from Thermus aquaticus. J Biol Chem. 2641:
6427-37.
Newell, K.J., Matrisian, L.M.,
Driman, D.K. (2002). Matrilysin (matrix
metalloproteinase-7) expression in ulcerative
colitis-related tumorigenesis. Mol Carcinog.
34: 59-63.
Pitari, G., Malergue F,
Martin F, Philippe JM, Massucci MT,
Chabret C, Maras B, Dupre S, Naquet P,
Galland (2000). Pantetheinase activity of
membrane-bound Vanin-1: lack of free
cysteamine in tissues of Vanin-1 deficient mice.
FEBS Lett. 83: 149-54.
Rossi A,
Superti-Furga A (2001). Mutations in
the diastrophic dysplasia sulfate transporter (DTDST) gene
(SLC26A2): 22 novel mutations, mutation review, associated skeletal phenotypes, and diagnostic relevance. Hum Mutat. Marzo; 17(3): 159-71.
(SLC26A2): 22 novel mutations, mutation review, associated skeletal phenotypes, and diagnostic relevance. Hum Mutat. Marzo; 17(3): 159-71.
Saiki, R.K., Scharf S,
Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich
HA, Arnheim N (1985) Enzymatic amplification of
betaglobin genomic sequences and restriction site analysis for
diagnosis of sickle cell anemia. 1985. Biotechnology.
1992; 24: 476-80.
Sambrook, J., Russell DW,
Sambrook J (1989). Molecular cloning, Cold Spring
Habor Press, Cold Spring Habor, NY
Sharkey, D.J., Scalice ER,
Christy KG Jr, Atwood SM, Daiss JL
(1994). Antibodies as thermolabile switches: high temperature
triggering for the polymerase chain reaction. Biotechnology
(N Y). 12: 506-9.
Sloan JL, Mager S (1999).
Cloning and functional expression of a human Na (+) and
C1(-)-dependent neutral and cationic amino acid
transporter B(O+). J Biol Chem. 20 de agosto;
274(34): 23740-5.
Spandau, U.H, Toksoy A,
Verhaart S, Gillitzer R, Kruse FE. High
expression of chemokines Gro-alpha
(CXCL-1), IL-8 (CXCL-8), and MCP-1 (CCL-2) in inflamed human corneas in vivo. Arch Ophthatmol. Junio de 2003; 121(6): 825-31.
(CXCL-1), IL-8 (CXCL-8), and MCP-1 (CCL-2) in inflamed human corneas in vivo. Arch Ophthatmol. Junio de 2003; 121(6): 825-31.
von Stein, O.D., Isolation of
differentially expressed genes through subtractive suppression
hybridization. Methods Mol Biol 2001; 175:
263-78.
Woessner, J.F. Jr., Regulation of
matrilysin in the rat uterus. Biochem Cell Biol. 1996;
74(6): 777-84.
Claims (17)
1. Método para la diferenciación entre colitis
ulcerosa y enfermedad de Crohn basándose en el análisis de perfiles
de expresión génica en una o más muestras de biopsia obtenidas a
partir de tejido inflamado de los intestinos de un paciente,
caracterizado porque se determinan los niveles de expresión
de al menos dos de varios genes marcadores, seleccionándose dichos
al menos dos genes marcadores de SLC6A14, SLC26A2, GRO1,
MMP-7, MAF-17, GISP y
Vanin-1 y en el que
- -
- en relación con SLC6A14, la expresión de dicho gen marcador en tejido inflamado se considera una indicación de colitis ulcerosa,
- -
- en relación con SLC26A2, la falta de expresión de dicho gen marcador en tejido inflamado se considera una indicación de colitis ulcerosa,
- -
- en relación con GRO1, la expresión de dicho gen marcador en tejido inflamado se considera una indicación de colitis ulcerosa,
- -
- en relación con MMP-7, la expresión de dicho gen marcador en tejido inflamado se considera una indicación de colitis ulcerosa,
- -
- en relación con MAP-17, la expresión de dicho gen marcador en tejido inflamado se considera una indicación de colitis ulcerosa,
- -
- en relación con GISP, la expresión preferente de dicho gen marcador en tejido inflamado se considera una indicación de colitis ulcerosa,
- -
- en relación con Vanin-1, la expresión de dicho gen marcador en tejido inflamado se considera una indicación de colitis ulcerosa.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método según la reivindicación 1, en el
que:
- -
- en relación con SLC6A14, la falta de expresión de dicho gen marcador en tejido inflamado se considera una indicación de enfermedad de Crohn,
- -
- en relación con SLC26A2, la expresión de dicho gen marcador en tejido inflamado se considera una indicación de enfermedad de Crohn,
- -
- en relación con GRO1, la falta de expresión de dicho gen marcador en tejido inflamado se considera una indicación de enfermedad de Crohn,
- -
- en relación con MMP-7, la falta de expresión de dicho gen marcador en tejido inflamado se considera una indicación de enfermedad de Crohn,
- -
- en relación con MAP-17, la falta de expresión de dicho gen marcador en tejido inflamado se considera una indicación de enfermedad de Crohn,
- -
- en relación con GISP, la expresión no preferente de dicho gen marcador en tejido inflamado se considera una indicación de enfermedad de Crohn,
- -
- en relación con Vanin-1, la falta de expresión de dicho gen marcador en tejido inflamado se considera una indicación de enfermedad de Crohn.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Método según la reivindicación 1, en el que
también se obtiene una muestra a partir de tejido no inflamado de
los intestinos del paciente y en el que:
- -
- en relación con SLC6A14, la falta de expresión de dicho gen marcador en tejido no inflamado se considera una indicación de colitis ulcerosa,
- -
- en relación con SLC26A2, la expresión preferente de dicho gen marcador en tejido no inflamado se considera una indicación de colitis ulcerosa,
- -
- en relación con GRO1, la falta de expresión de dicho gen marcador en tejido no inflamado se considera una indicación de colitis ulcerosa,
\newpage
- -
- en relación con MMP-7, la falta de expresión de dicho gen marcador en tejido no inflamado se considera una indicación de colitis ulcerosa,
- -
- en relación con MAP-17, la falta de expresión de dicho gen marcador en tejido no inflamado se considera una indicación de colitis ulcerosa,
- -
- en relación con GISP, la expresión no preferente de dicho gen marcador en tejido no inflamado se considera una indicación de colitis ulcerosa,
- -
- en relación con Vanin-1, la falta de expresión de dicho gen marcador en tejido no inflamado se considera una indicación de colitis ulcerosa.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Método según la reivindicación 1, en el que
se determinan los niveles de expresión de SLC6A14 y SLC26A2 y en el
que la expresión de SLC6A14 en tejido inflamado junto con la falta
de expresión de SLC26A2 en tejido inflamado, se considera una
indicación de colitis ulcerosa.
5. Método según las reivindicaciones 1 y 3, en
el que se determinan los niveles de expresión de SLC6A14 y SLC26A2 y
en el que la expresión de SLC6A14 en tejido inflamado y la falta de
expresión en tejido no inflamado, junto con la falta de expresión de
SLC26A2 en tejido inflamado o la expresión preferente en tejido no
inflamado, se considera una indicación de colitis ulcerosa.
6. Método según la reivindicación 1, en el que
la muestra es una muestra de biopsia, y se determinan los niveles de
expresión de SLC6A14, SLC26A2 y GRO1, y en el que la expresión de
SLC6A14 en tejido inflamado junto con la falta de expresión de
SLC26A2 en tejido inflamado, y la expresión de GRO1 en tejido
inflamado, se considera una indicación de colitis ulcerosa.
7. Método según las reivindicaciones 1 y 3, en
el que se determinan los niveles de expresión de SLC6A14, SLC26A2 y
GRO1, y en el que la expresión de SLC6A14 en tejido inflamado y la
falta de expresión en tejido no inflamado, junto con la falta de
expresión de SLC26A2 en tejido inflamado, o la expresión preferente
en tejido no inflamado, y la expresión de GRO1 en tejido inflamado y
la falta de expresión en tejido no inflamado, se considera una
indicación de colitis ulcerosa.
8. Método según la reivindicación 1, en el que
la muestra es una muestra de biopsia, y se determinan los niveles de
expresión de S1C6A14, SLC26A2 y MMP-7, y en el que
la expresión de SLC6A14 en tejido inflamado, junto con la falta de
expresión de SLC26A2 en tejido inflamado, y la expresión de
MMP-7 en tejido inflamado, se considera una
indicación de colitis ulcerosa.
9. Método según las reivindicaciones 1 y 3, en
el que se determinan los niveles de expresión de SLC6A14, SLC26A2 y
MMP-7, y en el que la expresión de SLC6A14 en tejido
inflamado y la falta de expresión en tejido no inflamado, junto con
la falta de expresión de SLC26A2 en tejido inflamado, o la expresión
preferente en tejido no inflamado, y la expresión de
MMP-7 en tejido inflamado y la falta de expresión en
tejido no inflamado, se considera una indicación de colitis
ulcerosa.
10. Método según la reivindicación 1, en el que
la muestra es una muestra de biopsia, y se determinan los niveles de
expresión de SLC6A14, SLC26A2, GRO1, MMP-7,
MAP-17, GISP y Vanin-1, y en el que
la expresión de SLC6A14, GRO1, MMP-7,
MAP-17, GISP y Vanin-1 en tejido
inflamado o la expresión preferente en tejido inflamado, junto con
la falta de expresión de SLC26A2 en tejido inflamado, se considera
una indicación de colitis ulcerosa.
11. Método según las reivindicaciones 1 y 3, en
el que se determinan los niveles de expresión de SLC6A14, SLC26A2,
GRO1, MMP-7, MAP-17, GISP y
Vanin-1, y en el que la expresión de SLC6A14, GRO1,
MMP-7, MAP-17, GISP y
Vanin-1 en tejido inflamado o la expresión
preferente en tejido inflamado, y la falta de expresión en tejido no
inflamado, junto con la falta de expresión de SLC26A2 en tejido
inflamado, o la expresión preferente en tejido no inflamado, se
considera una indicación de colitis ulcerosa.
12. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el nivel de expresión de cada
gen marcador se determina a través de amplificación de ácido
nucleico de dichos genes usando cebadores específicos de gen, y
determinación de los resultados de amplificación.
13. Método según la reivindicación 12, en el que
la amplificación de ácido nucleico se realiza usando PCR y los
cebadores específicos de gen seleccionados de SEQ.ID.NO.
13-26.
14. Kit para la diferenciación entre colitis
ulcerosa y enfermedad de Crohn basándose en el análisis de perfiles
de expresión génica en muestras obtenidas a partir de los intestinos
de un paciente, caracterizado porque dicho kit incluye pares
de cebadores específicos de gen dirigidos a al menos dos genes
marcadores seleccionados de SLC6A14, SLC26A2, GRO1,
MMP-7, MAP-17, GISP y
Vanin-1 y en el que dichos pares de cebadores
específicos de gen se seleccionan de SEQ.ID.NO. 13 y SEQ.ID.NO. 14;
SEQ.ID.NO. 15 y SEQ.ID.NO. 16; SEQ.ID.NO. 17 y SEQ.ID.NO. 18;
SEQ.ID.NO. 19 y SEQ.ID.NO. 20; SEQ.ID.NO. 21 y SEQ.ID.NO. 22;
SEQ.ID.NO. 23 y SEQ.ID.NO. 24; y SEQ.ID.NO. 25 y SEQ.ID.NO. 26 o
pares de cebadores funcionalmente equivalentes específicos para los
mismos genes marcadores.
15. Kit según la reivindicación 14, en el que
dichos cebadores específicos son SEQ.ID.NO. 13 y SEQ.ID.NO. 14;
SEQ.ID.NO. 15 y SEQ.ID.NO. 16; y SEQ.ID.NO. 17 y SEQ.ID.NO. 18.
16. Kit según la reivindicación 14, en el que
dichos cebadores específicos son SEQ.ID.NO. 13 y SEQ.ID.NO. 14;
SEQ.ID.NO. 15 y SEQ.ID.NO. 16; y SEQ.ID.NO. 19 y SEQ.ID.NO. 20.
17. Kit según una cualquiera de las
reivindicaciones 14-16, que comprende además un
agente de polimerización termoestable y cofactor(es)
requerido(s).
Applications Claiming Priority (11)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE0201954 | 2002-06-25 | ||
| SE0201956A SE0201956D0 (sv) | 2002-06-25 | 2002-06-25 | Novel sequence information and methods for its use in diagnosis and therapy VI |
| SE0201956 | 2002-06-25 | ||
| US395629P | 2002-07-15 | ||
| US395631P | 2002-07-15 | ||
| SE0202252 | 2002-07-18 | ||
| SE0202256 | 2002-07-18 | ||
| SE0202251 | 2002-07-18 | ||
| US407682P | 2002-09-04 | ||
| US407713P | 2002-09-04 | ||
| US409213P | 2002-09-10 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2356599T3 true ES2356599T3 (es) | 2011-04-11 |
Family
ID=20288314
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES03733803T Expired - Lifetime ES2356599T3 (es) | 2002-06-25 | 2003-06-25 | Método y kit para el diagnóstico de colitis ulcerosa. |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2356599T3 (es) |
| SE (1) | SE0201956D0 (es) |
-
2002
- 2002-06-25 SE SE0201956A patent/SE0201956D0/xx unknown
-
2003
- 2003-06-25 ES ES03733803T patent/ES2356599T3/es not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SE0201956D0 (sv) | 2002-06-25 |
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