ES2749514T3

ES2749514T3 - Panel de marcadores genéticos diagnósticos del cáncer colorrectal

Info

Publication number: ES2749514T3
Application number: ES13788103T
Authority: ES
Inventors: Peter Molloy; Lawrence Lapointe; Susanne Pedersen
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO; Clinical Genomics Pty Ltd
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO; Clinical Genomics Pty Ltd
Priority date: 2012-05-11
Filing date: 2013-05-10
Publication date: 2020-03-20
Anticipated expiration: 2033-05-10
Also published as: JP2020089378A; CA3152533A1; NZ701527A; US20150141275A1; IL235411A0; JP6837458B2; AU2021265861A1; AU2019201294B2; EP4001436B1; MX368034B; DK2847355T3; MX2019010935A; DK3594366T3; BR112014028122A2; CA3152533C; CN104411835B; EP3594366A1; EP2847355A1; AU2019201294A1; EP2847355A4

Abstract

Un método para detectar la aparición o predisposición a la aparición o el seguimiento de una neoplasia de intestino grueso en un individuo, comprendiendo dicho método evaluar el estado de metilación de: la región génica, que incluye 2kb en dirección 5' de: (1) BCAT1; en combinación con una o más de las siguientes regiones, que incluye 2kb en dirección 5' de: (2) IKZF1; (3) IRF4; (4) GRASP; y (5) CAHM; en una muestra biológica de dicho individuo en la que un mayor nivel de metilación de al menos una de las regiones de ADN respecto a los niveles de control es indicativo de una neoplasia de intestino grueso o una predisposición a la aparición de un estado neoplásico del intestino grueso.

Description

DESCRIPCIÓN

Panel de marcadores genéticos diagnósticos del cáncer colorrectal

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a un método de detección de la aparición, predisposición a la aparición y/o progresión de una neoplasia. Más particularmente, la presente invención se refiere a un método de detección de la aparición, predisposición a la aparición y/o progresión de una neoplasia mediante la detección de los cambios a nivel de metilación de un panel de marcadores genéticos. El método de la presente invención es útil en una variedad de aplicaciones incluyendo, aunque no de forma limitativa, aquellas relacionadas con el diagnóstico y/o control de neoplasias colorrectales, tales como la adenocarcinosis colorrectal.

Antecedentes de la invención

El cáncer colorrectal incluye crecimientos cancerosos en el colon, el recto y el apéndice. Con 655.000 muertes en todo el mundo por año, es la cuarta forma más común de cáncer en los Estados Unidos y la tercera causa principal de muerte relacionada con el cáncer en el mundo occidental. Los cánceres colorrectales surgen de pólipos adenomatosos en el colon. Estos crecimientos en forma de hongo son generalmente benignos, pero con el tiempo, algunos se convierten en cáncer. El cáncer de colon localizado generalmente se diagnostica mediante colonoscopia. Los cánceres invasivos que están confinados dentro de la pared del colon (estadios I y II) son curables con cirugía. Si no se tratan, se propagan a los ganglios linfáticos regionales (estadio III), donde hasta el 73% son curables mediante cirugía y quimioterapia. El cáncer que metastatiza en sitios distantes (estadio IV) generalmente no es curable, aunque la quimioterapia puede prolongar la supervivencia y, en casos raros, la cirugía y la quimioterapia juntas han conseguido la cura de los pacientes (Markowitz and Bertagnolli, 2009, N. Engl. J. Med. 361(25): 2449-60). La radiación se usa para el cáncer rectal.

El cáncer colorrectal está precedido por adenomas. Los adenomas son tumores benignos, o neoplasias, de origen epitelial que se derivan del tejido glandular o exhiben estructuras glandulares claramente definidas. Algunos adenomas muestran elementos tisulares reconocibles, como el tejido fibroso (fibroadenomas) y estructura epitelial, mientras que otros, como los adenomas bronquiales, producen compuestos activos que pueden dar lugar a síndromes clínicos.

Los adenomas pueden progresar hasta convertirse en una neoplasia invasiva y se denominan adenocarcinomas. En consecuencia, los adenocarcinomas se definen como tumores epiteliales malignos que surgen de las estructuras glandulares, que son partes constitutivas de muchos órganos del cuerpo. El término adenocarcinoma también se aplica a tumores que muestran un patrón de crecimiento glandular. Estos tumores pueden subclasificarse según las sustancias que producen, por ejemplo, adenocarcinomas secretores de moco y serosos, o según la disposición microscópica de sus células en patrones, por ejemplo, adenocarcinomas papilares y foliculares. Estos carcinomas pueden ser sólidos o quísticos (cistadenocarcinomas). Cada órgano puede producir tumores que muestran una variedad de tipos histológicos, por ejemplo, el ovario puede producir tanto mucinoso como cistadenocarcinoma. Los adenomas en diferentes órganos se comportan de manera diferente. En general, la probabilidad global de que el carcinoma esté presente dentro de un adenoma (es decir, un foco de cáncer que se ha desarrollado dentro de una lesión benigna) es aproximadamente del 5 %. Sin embargo, esto está relacionado con el tamaño de un adenoma. Por ejemplo, en el intestino grueso (colon y recto específicamente) la aparición de un cáncer dentro de un adenoma es rara en adenomas de menos de 1 centímetro. Tal desarrollo se estima que se produce en un 40 a 50% en adenomas que son mayores de 4 centímetros y muestran cierto cambio histopatológico como cambio velloso o displasia de alto grado. Los adenomas con mayores grados de displasia tienen una mayor incidencia de carcinoma. En cualquier adenoma colorrectal dado, los predictores de la presencia de cáncer en el presente o la aparición futura de cáncer en el órgano incluyen el tamaño (especialmente mayor de 9 mm), grado de cambio de morfología tubular a vellosa, presencia de displasia de alto grado y el cambio morfológico descrito como "adenoma serrado". En cualquier individuo dado, las características adicionales de mayor edad, la aparición familiar de adenoma o cáncer colorrectal, el género masculino o la multiplicidad de adenomas, predicen un mayor riesgo futuro de cáncer en el órgano, los llamados factores de riesgo de cáncer. Excepto por la presencia de adenomas y su tamaño, ninguno de estos está definido objetivamente y todos los que no sean número y tamaño están sujetos a error del observador y a confusión en cuanto a la definición precisa de la característica en cuestión. Debido a que dichos factores pueden ser difíciles de evaluar y definir, su valor como predictores del riesgo actual o futuro de cáncer es impreciso.

Una vez que se ha desarrollado un adenoma esporádico, la probabilidad de que ocurra un nuevo adenoma es aproximadamente del 30 % en 26 meses.

Los síntomas del cáncer colorrectal dependen de la ubicación del tumor en el intestino y de si ha metastatizado. Desafortunadamente, muchos de los síntomas también pueden ocurrir en otras enfermedades y, por lo tanto, los síntomas pueden no ser diagnósticos concluyentes de cáncer colorrectal.

Los síntomas locales son más probables si el tumor se encuentra más cerca del ano. Puede haber un cambio en el hábito intestinal (estreñimiento de nueva aparición o diarrea en ausencia de otra causa), una sensación de defecación incompleta y reducción del diámetro de las heces. El tenesmo y el cambio en la forma de las heces son característicos del cáncer rectal. La hemorragia gastrointestinal inferior, incluido el paso de sangre roja brillante en las heces, puede indicar cáncer colorrectal, al igual que la mayor presencia de moco. La melena, heces negras con aspecto alquitranado, normalmente ocurre en la hemorragia gastrointestinal superior (como la debida a una úlcera duodenal), pero a veces se encuentra en el cáncer colorrectal cuando la enfermedad se encuentra al comienzo del intestino grueso.

Un tumor que es lo suficientemente grande como para llenar toda la luz del intestino puede causar obstrucción intestinal. Esta situación se caracteriza por estreñimiento, dolor abdominal, distensión abdominal y vómitos. Esto ocasionalmente conduce a la perforación intestinal obstruida y distendida, causando peritonitis.

Ciertos efectos locales del cáncer colorrectal ocurren cuando la enfermedad se ha vuelto más avanzada. Es más probable que se note un tumor grande al palpar el abdomen, y un médico puede notarlo durante la exploración física. La enfermedad puede invadir otros órganos y puede causar sangre o aire en la orina o flujo vaginal.

Si un tumor ha causado hemorragia oculta crónica, puede ocurrir anemia por deficiencia de hierro. Esto puede ser experimentado como fatiga, palpitaciones y apreciado como palidez. El cáncer colorrectal también puede conducir a la pérdida de peso, generalmente debido a una disminución del apetito.

Los síntomas constitucionales más inusuales son una fiebre inexplicable y uno de varios síndromes paraneoplásicos. El síndrome paraneoplásico más frecuente es la trombosis, generalmente trombosis venosa profunda.

El cáncer colorrectal se disemina con mayor frecuencia al hígado. Esto puede pasar desapercibido, pero los depósitos grandes en el hígado pueden causar ictericia y dolor abdominal (debido al estiramiento de la cápsula). Si el depósito tumoral obstruye el conducto biliar, la ictericia puede estar acompañada de otras características de obstrucción biliar, como heces pálidas.

El desarrollo del cáncer colorrectal puede durar muchos años y la detección temprana del cáncer colorrectal mejora enormemente el pronóstico. Incluso esfuerzos modestos para implementar métodos de detección del cáncer colorrectal pueden tener como resultado una disminución de las muertes por cáncer. A pesar de ello, las tasas de detección del cáncer colorrectal siguen siendo bajas. Actualmente hay diferentes pruebas disponibles para este propósito:

• Examen rectal digital: El médico inserta un dedo enguantado y lubricado, en el recto para detectar áreas anormales. Solo detecta tumores lo suficientemente grandes como para palparse en la parte distal del recto, pero es útil como prueba de detección inicial.

• Prueba de sangre oculta en heces: una prueba para detectar sangre en heces. Se pueden usar dos tipos de pruebas para detectar sangre oculta en las heces, es decir, la prueba basada en guayacol (prueba química) y la inmunoquímica. La sensibilidad de las pruebas inmunoquímicas es superior a la de las pruebas químicas sin una reducción inaceptable de la especificidad (Weitzel JN (Diciembre de 1999). "Genetic cancer risk assessment. Putting it all together". Cancer 86 (11 Suppl): 2483-92).

• Endoscopia:

◦ Sigmoidoscopia: Se inserta una sonda iluminada (sigmoidoscopio) en el recto y en el colon inferior para verificar si hay pólipos y otras anomalías.

◦ Colonoscopia: Se inserta una sonda iluminada llamada colonoscopio en el recto y en todo el colon para detectar pólipos y otras anomalías que pueden ser causadas por el cáncer. Una colonoscopia tiene la ventaja de que si se encuentran pólipos durante el procedimiento, se pueden extirpar de inmediato. También se puede tomar tejido para biopsia.

• Enema de bario de doble contraste (DCBE): Primero, se toma una preparación durante la noche para limpiar el colon. Se administra un enema que contiene sulfato de bario, luego se insufla aire en el colon, distendiéndolo. El resultado es una capa delgada de bario sobre el revestimiento interno del colon que es visible en las películas radiográficas. De esta manera, se puede detectar un cáncer o un pólipo precanceroso. Esta técnica puede pasar por alto el pólipo plano (menos frecuente).

• Colonoscopia virtual reemplaza las películas radiográficas en el enema de bario de doble contraste (arriba) con una exploración especial de tomografía computarizada y requiere un software especial de estación de trabajo para su interpretación por el radiólogo. Esta técnica se acerca a la colonoscopia en sensibilidad para los pólipos. Sin embargo, cualquier pólipo encontrado aún debe eliminarse mediante colonoscopia estándar.

• La tomografía axial computarizada estándar es un método radiográfico que se puede usar para determinar el grado de propagación del cáncer, aunque no es lo suficientemente sensible como para usarlo para la detección. Algunos cánceres se detectan en las tAc realizadas por otros motivos.

• Análisis de sangre: La medición en la sangre del paciente de niveles elevados de ciertas proteínas puede dar una indicación de la carga tumoral. En particular, altos niveles de antígeno carcinoembrionario (CEA) en la sangre pueden indicar metástasis de adenocarcinoma. Si bien estas pruebas dan frecuentemente falsos positivos o falsos negativos, y no se recomiendan para la detección, pueden ser útiles para evaluar la recurrencia de la enfermedad. Los biomarcadores CA19-9 y CA 242 pueden indicar riesgos metastásicos relacionados con la e-selectina, ayudar a seguir el progreso terapéutico y evaluar la recurrencia de la enfermedad. Recientemente, un ensayo para la detección en plasma de secuencias metiladas del gen Septin 9 también está disponible para facilitar el diagnóstico del cáncer colorrectal.

• Tomografía de emisión de positrones (PET), es una tecnología de exploración tridimensional en la que se inyecta un azúcar radioactivo en el paciente, el azúcar se acumula en los tejidos con alta actividad metabólica y se forma una imagen al medir la emisión de radiación del azúcar. Debido a que las células cancerosas a menudo tienen tasas metabólicas muy altas, esto puede usarse para diferenciar tumores benignos y malignos. La PET no se usa para la detección y (todavía) no está incluida en el estudio de rutina de los casos de cáncer colorrectal.

• La prueba de ADN en heces es una tecnología emergente en la detección del cáncer colorrectal. Los adenomas premalignos y los cánceres liberan marcadores de ADN de sus células que no se degradan durante el proceso digestivo y permanecen estables en las heces. La captura, seguida de PCR amplifica el ADN a niveles detectables para el ensayo.

• Niveles elevados de proteína C-reactiva como marcador de riesgo.

A pesar de la existencia de estas pruebas, el diagnóstico sigue siendo problemático. La mayoría de las pruebas más sensibles son bastante invasivas y caras y, por lo tanto, la aceptación por parte de los pacientes es baja. Por lo tanto, existe una necesidad continua de desarrollar protocolos de diagnóstico o herramientas más simples y más informativos para el diagnóstico que permitan dirigir la colonoscopia a las personas con mayor probabilidad de desarrollar adenomas o carcinomas. Una prueba de detección simple y precisa permitiría establecer sistemas de detección de aplicación mucho más amplia.

Con este fin, se han desarrollado recientemente marcadores genéticos que están modulados, en términos de sus niveles de expresión, en individuos que han desarrollado una neoplasia del intestino grueso. Algunos de estos marcadores están regulados positivamente en términos de su nivel de expresión, mientras que otros están regulados negativamente. Sin embargo, una característica común a la mayoría de estos marcadores, y el uso de niveles de expresión de marcadores genéticos en general como diagnóstico, es que a menudo exhiben solo niveles moderados de sensibilidad y especificidad. El desarrollo de protocolos de diagnóstico que proporcionen altos niveles de sensibilidad y especificidad es objeto de exhaustivas investigaciones.

En el trabajo que conduce a la presente invención, se ha determinado inesperadamente que los marcadores genéticos BCAT1, IKZF1 IRF4, g Ra SP y CAHM, aunque cada uno individualmente es uno de varios marcadores genéticos que se sabe que exhiben utilidad en términos de diagnóstico del desarrollo de neoplasia colorrectal, de hecho, se ha determinado que permiten colectivamente lograr un nivel significativamente más alto de sensibilidad o especificidad que cuando uno cualquiera de estos marcadores genéticos se analiza solo o junto con otros marcadores genéticos no relacionados. Más específicamente, la detección de un aumento en el nivel de metilación de cualquiera de dos o más de estos cinco marcadores específicos puede diseñarse para alcanzar un nivel de especificidad o sensibilidad que no se podía lograr previamente.

Teniendo en cuenta la gran cantidad de marcadores genéticos que, en estudios de análisis de expresión génica diferencial, muestran niveles de expresión modulados en la neoplasia, la identificación de que cinco marcadores específicos pueden de hecho colectivamente proporcionar mejores resultados de diagnóstico respecto a estos marcadores individualmente o a otros grupos de marcadores es inesperado e impredecible.

El documento WO 2012/034170 A1 divulga moléculas de ácido nucleico con respecto a las cuales los cambios en los niveles de metilación del ADN son indicativos del inicio o predisposición al inicio de una neoplasia. Más particularmente, el documento WO 2012/034170 A1 divulga moléculas de ácido nucleico con respecto a las cuales los cambios en los niveles de metilación del ADN son indicativos del inicio y/o progresión de una neoplasia en el intestino grueso, tal como un adenoma o adenocarcinoma. El documento WO 2012/034170 A1 también divulga un método de detección de la aparición, predisposición a la aparición y/o progresión de una neoplasia mediante detección de la modulación en la metilación del ADN de una o más moléculas de ácido nucleico.

Sumario de la invención

A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que se presentan a continuación, a no ser que el contexto requiera lo contrario, la palabra "comprender" y sus variantes, tales como "comprende" o "que comprende", se entenderá que implica la inclusión de un número entero o etapa o de un grupo de números enteros o etapas establecidos, pero no la exclusión de cualquier otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas. Como se usa en el presente documento, el término "derivado de" indica que un número entero o grupo de números enteros en particular se originó a partir de la especie especificada, pero que no necesariamente se obtuvo directamente de la fuente especificada. Además, como se usa en el presente documento, las formas singulares de "uno/a", y "el/la" incluyen las referencias en plural salvo que el contexto indique claramente otra cosa.

Salvo que se defina de otra forma, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la materia a la cual pertenece la presente invención.

La memoria descriptiva objeto contiene información de la secuencia de nucleótidos preparada usando el programa PatentIn Versión 3.5, presentada en el presente documento después de la bibliografía. Cada secuencia de nucleótidos se identifica en la lista de secuencias mediante el indicador numérico <210> seguido del identificador de secuencia (por ejemplo, <210> 1, <210>2, etc). La longitud, el tipo de secuencia (ADN, etc.) y el organismo fuente de cada secuencia se indican mediante la información proporcionada en los campos de indicador numérico <211>, <212> y <213>, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos a las que se hace referencia en la memoria descriptiva se identifican mediante el indicador SEQ ID NO: seguido del identificador de secuencia (por ejemplo, SEQ Id NO: 1, SEQ ID NO: 2, etc.). El identificador de secuencia al que se hace referencia en la memoria descriptiva se correlaciona con la información proporcionada en el campo de indicador numérico <400> en la lista de secuencias, que va seguido por el identificador de secuencia (por ejemplo, <400> 1, <400>2, etc). Es decir, SEQ ID NO: 1 como se detalla en la memoria descriptiva se correlaciona con la secuencia indicada como <400> 1 en la lista de secuencias.

En el presente documento se describe un método para detectar la aparición o predisposición a la aparición o el seguimiento de una neoplasia de intestino grueso en un individuo, comprendiendo dicho método evaluar el estado de metilación de una región de ADN seleccionada entre:

(i) la región, que incluye 2kb en dirección 5' del sitio de inicio de la transcripción, definida por cualquier dos o más de coordenadas Hg19:

(1) chr12:24962958..25102393

(2) chr7:50344378...50472798

(3) chr6:391739..411443;

(4) chr12:52400748..52409671; y

(5) chr6:163834097..163834982; o

(ii) la región génica, que incluye 2kb en dirección 5' de dos cualquiera o más de:

(1) BCAT1 (2) IKZF1 (3) IRF4 (4) GRASP y (5) CAHM

en una muestra biológica de dicho individuo en la que un mayor nivel de metilación de al menos una de las regiones de ADN del grupo (i) y/o (ii) respecto a los niveles de control es indicativo de una neoplasia de intestino grueso o una predisposición a la aparición de un estado neoplásico del intestino grueso.

Un aspecto de la presente invención se refiere a un método para detectar la aparición o predisposición a la aparición o el seguimiento de una neoplasia de intestino grueso en un individuo, comprendiendo dicho método evaluar el estado de metilación de una región génica, que incluye 2kb en dirección 5' de:

(1) BCAT1;

en combinación con una o más de las siguientes regiones, que incluye 2kb en dirección 5' de:

(2) IKZF1;

(3) IRF4;

(4) GRASP; y

(5) CAHM;

en una muestra biológica de dicho individuo en la que un mayor nivel de metilación de al menos una de las regiones de ADN respecto a los niveles de control es indicativo de una neoplasia de intestino grueso o una predisposición a la aparición de un estado neoplásico del intestino grueso.

En otro aspecto, dicho método se refiere a la identificación de muestras biológicas en las cuales una cualquiera de dichas regiones de ADN exhibe un mayor nivel de metilación.

En otro aspecto más, dicho método se refiere a la identificación de muestras biológicas en las cuales dos o más de dichas regiones de ADN exhiben un mayor nivel de metilación.

En otro aspecto adicional, se proporciona un método para detectar la aparición o predisposición a la aparición o el seguimiento de una neoplasia de intestino grueso en un individuo, comprendiendo dicho método evaluar el estado de metilación de:

la región génica, que incluye 2kb en dirección 5' de:

(1) BCAT1; y

(2) IKZF1;

y opcionalmente uno o más de (3) IRF4, (4) GRASP y (5) CAHM

En una realización de este aspecto, el panel de marcadores genéticos que se analiza es: la región génica, que incluye 2kb en dirección 5' de:

(1) BCAT1, (2) IKZF1 y (3) IRF4.

En otra realización de este aspecto, el panel de marcadores genéticos que se analiza es: la región génica, que incluye 2kb en dirección 5' de:

(1) BCAT1, (2) IKZF1; y (4) GRASP.

En otra realización más de este aspecto, el panel de marcadores genéticos que se analiza es: la región génica, que incluye 2kb en dirección 5' de:

(1) BCAT1, (2) IKZF1 y (5) CAHM

En otra realización adicional más de este aspecto, el panel de marcadores genéticos que se analiza es: la región génica, que incluye 2kb en dirección 5' de:

(1) BCAT1, (2) IKZF1, (3) IRF4 y (4) GRASP.

(1) BCAT1, (2) IKZF1, (3) IRF4 y(5) CAHM.

En una realización adicional de este aspecto, el panel de marcadores genéticos que se analiza es: la región génica, que incluye 2kb en dirección 5' de:

(1) BCAT1, (2) IKZF1, (4) GRASP y (5) CAHM.

(1) BCAT1, (2) IKZF1, (3) IRF4, (4) GRASP y (5) CAHM.

En otra realización, se proporciona un método para detectar la aparición o predisposición a la aparición o el seguimiento de una neoplasia de intestino grueso en un individuo, comprendiendo dicho método evaluar el estado de metilación de:

la región génica, que incluye 2kb en dirección 5' de:

(1) BCAT1; y

(5) CAHM;

y opcionalmente uno o más de (2) IKZF1, (3) IRF4 y (4) GRASP

En otra realización se proporciona un método para detectar la aparición o predisposición a la aparición o el seguimiento de una neoplasia de intestino grueso en un individuo, comprendiendo dicho método evaluar el estado de metilación de:

la región génica, que incluye 2kb en dirección 5' de:

(1) BCAT1; y

(3) IRF4;

y opcionalmente uno o más de (2) IKZF1, (4) GRASP y (5) CAHM

En otra realización adicional, se proporciona un método para detectar la aparición o predisposición a la aparición o el seguimiento de una neoplasia de intestino grueso en un individuo, comprendiendo dicho método evaluar el estado de metilación de:

la región génica, que incluye 2kb en dirección 5' de:

(1) BCAT1; y

(4) GRASP;

y opcionalmente uno o más de (2) IKZF1, (3) IRF4 y (5) CAHM

Las subregiones que se ha determinado que exhiben una utilidad particular se enumeran a continuación con referencia al gen y la región cromosómica en la que se encuentran:

(1) subregiones BCAT chr12:25101992-25102093 (SEQ ID NO:1 o la correspondiente hebra minus) y chr12:25101909-25101995 (SEQ ID NO:2 o la correspondiente hebra minus)

(2) subregiones IKZF1: chr7:50343867-50343961 (SEQ ID NO:3 o la correspondiente hebra minus) y chr7:50343804-5033895 (SEQ ID NO:4 o la correspondiente hebra minus)

(3) subregiones IRF4 chr6:392036-392145 (SEQ iD NO:5 o la correspondiente hebra minus)

(4) subregiones GRASP: chr12:52399672-52399922, chr12:52400821-52401051 (SEQ ID NO:6 o la correspondiente hebra minus), chr12:52401407-52401664 (SEQ ID NO:7 o la correspondiente hebra minus) chr12:52400866-52400973 y Chr12:52401107-52401664.

(5) subregiones CAHM: chr6:163834295-163834500 (SEQ ID NO:8 o la correspondiente hebra minus), chr6:163834621-163834906, chr6:163834393-163834455 y chr6:163834393-163834519.

En la medida en que el método de la presente invención incluye analizar la metilación de GRASP, los residuos en cuestión son:

chr12:52399713 chr12:52399731 chr12:52399749 chr12:52399783

chr12:52399796 chr12:52399808 chr12:52399823 chr12:52399835

chr12:52399891

chr12:52400847 chr12:52400850 chr12:52400859 chr12:52400866

chr12:52400869 chr12:52400873 chr12:52400881 chr12:52400886

chr12:52400893 chr12:52400895 chr12:52400899 chr12:52400902

chr12:52400907 chr12:52400913 chr12:52400919 chr12:52400932

chr12:52400938 chr12:52400958 chr12:52400962 chr12:52400971

chr12:52400973 chr12:52400976 chr12:52400998 chr12:52401008

chr12:52401010 chr12:52401012 chr12:52401016 chr12:52401019

chr12:52401025 chr12:52401041 chr12:52401044 chr12:52401053

chr12:52401060 chr12:52401064 chr12:52401092 chr12:52401118

chr12:52401438 chr12:52401448 chr12:52401460 chr12:52401465

chr12:52401474 chr12:52401477 chr12:52401479 chr12:52401483

chr12:52401504 chr12:52401514 chr12:52401523 chr12:52401540

chr12:52401553 chr12:52401576 chr12:52401588 chr12:52401595

chr12:52401599 chr12:52401604 chr12:52401606 chr12:52401634

chr12:52401640 chr12:52401644 chr12:52401659

chr12:52401160 chr12:52401165 chr12:52401174 chr12:52401177

chr12:52401179 chr12:52401183 chr12:52401204 chr12:52401215

chr12:52401223 chr12:52401240 chr12:52401253 chr12:52401288

chr12:52401295 chr12:52401299 chr12:52401304 chr12:52401334

chr12:52401340 chr12:52401344 chr12:52401359

o la correspondiente citosina en la posición n+1 en la hebra opuesta.

En la medida en que el método de la presente invención incluye analizar CAHM, los residuos en cuestión son:

chr6:163834330 chr6:163834332 chr6:163834357

chr6:163834373 chr6:163834384 chr6:163834390

chr6:163834392 chr6:163834406 chr6:163834412

chr6:163834419 chr6:163834443 chr6:163834448

chr6:163834452 chr6:163834464 chr6:163834483

chr6:163834653 chr6:163834660 chr6:163834672

chr6:163834675 chr6:163834678 chr6:163834681

chr6:163834815 chr6:163834824 chr6:163834835

chr6:163834840 chr6:163834853 chr6:163834855

chr6:163834858 chr6:163834863 chr6:163834869

chr6:163834872

o la correspondiente citosina en la posición n+1 en la hebra opuesta.

En la medida en que el método de la presente invención incluye analizar IKZF1, los residuos en cuestión son:

chr7:50343869 chr7:50343872 chr7:50343883

chr7:50343889 chr7:50343890 chr7:50343897

chr7:50343907 chr7:50343909 chr7:50343914

chr7:50343934 chr7:50343939 chr7:50343950

chr7:50343959 chr7:50343805 chr7:50343822

chr7:50343824 chr7:50343826 chr7:50343829

chr7:50343831 chr7:50343833 chr7:50343838

chr7:50343847 chr7:50343850 chr7:50343858

chr7:50343864 chr7:50343869 chr7:50343872

chr7:50343890

o la correspondiente citosina en la posición n+1 en la hebra opuesta.

En la medida en que el método de la presente invención incluye analizar IRF4, los residuos en cuestión son:

chr6:392036 chr6:392047 chr6:392049

chr6:392057 chr6:392060 chr6:392066

chr6:392080 chr6:392094 chr6:392102

chr6:392131

o la correspondiente citosina en la posición n+1 en la hebra opuesta.

En el presente documento también se describe un método para detectar la aparición o predisposición a la aparición o el seguimiento de una neoplasia de intestino grueso en un individuo, comprendiendo dicho método evaluar el nivel de expresión de una región de ADN seleccionada entre:

(1) chr12:24962958..25102393

(2) chr7:50344378...50472798

(3) chr6:391739..411443; o

(4) chr12:52400748..52409671; y

(5) chr6:163834097..163834982; o

(1) BCAT1 (2) IKZF1 (3) IRF4 (4) GRASP y (5) CAHM

en una muestra biológica de dicho individuo en la que un menor nivel de expresión de al menos una de las regiones de ADN del grupo (i) y/o (ii) respecto a los niveles de control es indicativo de una neoplasia de intestino grueso o una predisposición a la aparición de un estado neoplásico.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la secuencia genómica de GRASP.

La Figura 2 muestra la secuencia genómica de CAHM.

La Figura 3 muestra la secuencia genómica de IRF4.

La Figura 4 muestra la secuencia genómica de BCAT1.

La Figura 5 muestra la secuencia genómica de IKZF1.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se basa, en parte, en la determinación de que el cambio en el patrón de metilación de un panel de marcadores genéticos puede proporcionar un mayor nivel de especificidad diagnóstica o sensibilidad diagnóstica cuando se prueban colectivamente que si cualquiera de estos marcadores se prueba aisladamente o junto con marcadores distintos a los especificados en el presente documento. Por lo tanto, este hallazgo ahora ha facilitado el desarrollo de una prueba mejorada para diagnosticar, pronosticar o hacer un seguimiento de las neoplasias del intestino grueso en función de la evaluación de la metilación de dos o más marcadores genéticos BCAT1, IKZF1, CAHM, GRASP e IRF4.

De acuerdo con la presente invención, se ha determinado que ciertos paneles específicos de genes están modulados, en términos de cambios diferenciales en sus niveles de metilación, dependiendo de si la célula en cuestión es neoplásica o no. Debe entenderse que los genes en cuestión se describen en el presente documento tanto por referencia a su nombre como a sus coordenadas cromosómicas. Las coordenadas cromosómicas son consistentes con la versión de la base de datos del genoma humano Hg19 que se publicó en febrero de 2009 (en lo sucesivo denominadas "coordenadas Hg19").

En consecuencia, un aspecto de la presente invención se refiere a un método para detectar la aparición o predisposición a la aparición o el seguimiento de una neoplasia de intestino grueso en un individuo, comprendiendo dicho método evaluar el estado de metilación de:

la región génica, que incluye 2kb en dirección 5' de:

(1) BCAT1;

(2) IKZF1;

(3) IRF4;

(4) GRASP; y

(5) CAHM;

En una realización, dicho método se refiere a la identificación de muestras biológicas en las cuales una cualquiera de dichas regiones de ADN exhibe un mayor nivel de metilación.

En otra realización, dicho método se refiere a la identificación de muestras biológicas en las cuales dos o más de dichas regiones de ADN exhiben un mayor nivel de metilación.

Sin limitar la presente invención a ninguna teoría o modo de acción, el panel de regiones de ADN (marcadores) especificado en el presente documento proporciona no solo un resultado de diagnóstico mejorado en relación con los métodos de la técnica anterior sino que, además, permite el desarrollo de un método de detección que puede diseñarse para centrarse en proporcionar un alto nivel de especificidad diagnóstica o un alto nivel de sensibilidad diagnóstica. Como entenderán los expertos en la materia, en el contexto del diagnóstico "sensibilidad" define la proporción de resultados positivos que se identifican correctamente, es decir, el porcentaje de individuos identificados correctamente que tienen la enfermedad en cuestión. "Especificidad", sin embargo, define la proporción de resultados negativos que se identifican correctamente, es decir, el porcentaje de individuos identificados correctamente que no tienen la enfermedad en cuestión.

En el contexto de la presente invención, se ha determinado que el análisis de una muestra de paciente para determinar el estado de metilación del panel de marcadores especificado puede diseñarse para proporcionar un resultado diagnóstico que muestre un alto nivel de especificidad o un resultado diagnóstico que muestre un alto nivel de sensibilidad.

Cuando se busca un alto nivel de sensibilidad, el método de detección está diseñado para identificar muestras en las cuales uno cualquiera de los marcadores del panel exhibe una metilación incrementada en relación con los niveles de control. Es decir, no se requiere que todos los marcadores exhiban hipermetilación para definir el resultado como positivo. Cuando se busca un mayor nivel de sensibilidad, el nivel de especificidad se reduce inherentemente. Sin embargo, si se desea buscar un mayor nivel de especificidad (lo que puede reducir el nivel de sensibilidad), el método está diseñado para identificar muestras en las que dos o más del panel de regiones de ADN exhiben una mayor metilación.

En consecuencia, en la medida en que la presente invención se refiere a realizaciones del método en las cuales "una cualquiera de" las regiones de ADN (marcadores) del panel especificado exhiben un mayor nivel de metilación, estas realizaciones están diseñadas para lograr resultados que exhiben una mayor sensibilidad basándose en uno cualquiera de los marcadores del panel que están hipermetilados. Debe entenderse que no tiene que ser el mismo marcador el que está hipermetilado en cada muestra. Más bien, se trata simplemente de que uno de los marcadores que forma parte del panel esté hipermetilado. También debe entenderse que en relación con algunas muestras, dos o más de los marcadores del panel pueden estar hipermetilados. Sin embargo, debe entenderse que estas muestras entran dentro del alcance de esta realización de la invención ya que esta realización no excluye la situación en la que múltiples marcadores están hipermetilados, y simplemente se incluyen dentro de su alcance todas aquellas muestras en las que tan solo un marcador está hipermetilado. Estos datos proporcionarán una mayor sensibilidad pero una especificidad reducida. En la medida en que la presente invención se refiere a realizaciones del método en las cuales "dos o más" de

las regiones de ADN (marcadores) del panel especificado exhiben un mayor nivel de metilación, estas realizaciones están diseñadas para lograr un mayor nivel de especificidad. Esto se logra en virtud del hecho de que se determina que al menos dos, si no más, del panel de marcadores especificado están hipermetilados.

La referencia al "intestino grueso" debe entenderse como una referencia a una célula derivada de una de las ocho regiones anatómicas del intestino grueso, regiones que comienzan después de la región terminal del íleon, siendo estas:

(i) el ciego;

(ii) el colon ascendente;

(iii) el colon transverso;

(iv) el colon descendente;

(v) el colon sigmoideo;

(vi) el recto;

(vii) la flexura esplénica; y

(viii) la flexura hepática.

La referencia a "neoplasia" debe entenderse como una referencia a una lesión, tumor u otra masa encapsulada o no encapsulada u otra forma de crecimiento que comprende células neoplásicas. Una "célula neoplásica" debe entenderse como una referencia a una célula que exhibe un crecimiento anormal. El término "crecimiento" debe entenderse en su sentido más amplio e incluye referencias a la proliferación. En este sentido, un ejemplo de crecimiento celular anormal es la proliferación incontrolada de una célula. Otro ejemplo es la apoptosis fallida en una célula, prolongando así su período vital normal. La célula neoplásica puede ser una célula benigna o una célula maligna. En una realización preferida, la neoplasia es cuestión es un adenoma o un adenocarcinoma. Sin limitar la presente invención a ninguna teoría o modo de acción, un adenoma es generalmente un tumor benigno de origen epitelial que se deriva del tejido epitelial o presenta estructuras epiteliales claramente definidas. Estas estructuras pueden adquirir una apariencia glandular. Puede comprender una población de células malignas dentro del adenoma, como ocurre con la progresión de un adenoma benigno o una lesión neoplásica benigna a un adenocarcinoma maligno.

Preferentemente, dicha célula neoplásica es un adenoma o adenocarcinoma y aún más preferiblemente un adenoma o adenocarcinoma colorrectal.

La referencia a "región de ADN" debe entenderse como una referencia a una sección específica de ADN genómico. Estas regiones de ADN se especifican ya sea por referencia a un nombre de gen o a un conjunto de coordenadas cromosómicas. Tanto los nombres de los genes como las coordenadas cromosómicas serán bien conocidos y entendidos por, los expertos en la materia. Como se ha detallado anteriormente en el presente documento, las coordenadas cromosómicas corresponden a la versión Hg19 del genoma. En general, un gen puede identificarse rutinariamente por referencia a su nombre, a través del cual pueden obtenerse rutinariamente tanto sus secuencias como su ubicación cromosómica, o por referencia a sus coordenadas cromosómicas, a través de las cuales también pueden obtenerse rutinariamente tanto el nombre del gen como su secuencia.

La referencia a cada una de las regiones de genes/ADN detalladas anteriormente debe entenderse como una referencia a todas las formas de estas moléculas y a fragmentos o variantes de las mismas. Como entenderán los expertos en la materia, se sabe que algunos genes exhiben variación alélica entre individuos o polimorfismos de un solo nucleótido. Los SNP abarcan inserciones y deleciones de tamaños variables y repeticiones de secuencias simples, como las repeticiones de dinucleótidos y trinucleótidos. Las variantes incluyen secuencias de ácido nucleico de la misma región que comparten al menos 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de identidad de la secuencia, es decir, que tienen una más deleciones, adiciones, sustituciones, secuencias invertidas etc. con respeto a las regiones de ADN descritas en el presente documento. En consecuencia, debe entenderse que la presente invención abarca tales variantes que, en términos de las presentes aplicaciones de diagnóstico, logran el mismo resultado a pesar del hecho de que pueden existir variaciones genéticas menores entre las secuencias de ácido nucleico reales entre individuos. Por lo tanto, debe entenderse que la presente invención abarca todas las formas de ADN que surgen de cualquier otra mutación, variación polimórfica o alélica.

Debe entenderse que el "individuo" que es sujeto de prueba puede ser cualquier mamífero humano o no humano. Los ejemplos de mamíferos no humanos incluyen primates, animales de granja (por ejemplo, caballos, ganado bovino, ovejas, cerdos, burros), animales de ensayos de laboratorio (por ejemplo, ratones, ratas, conejos, conejillo de Indias), animales de compañía (por ejemplo, perros, gatos) y animales salvajes cautivos (por ejemplo, ciervos, zorros).

Preferentemente el mamífero es un ser humano.

El panel de genes que se ha identificado demuestra un aumento de la metilación en las células neoplásicas del intestino grueso respecto a las células no neoplásicas. Este aumento de la metilación está, en algunos casos, localizado en unos pocos sitios CpG específicos dentro de la región del ADN, mientras que en otros casos se observa en una amplia variedad de sitios CpG. Sin embargo, aunque regiones específicas de todos los genes exhiben una mayor metilación y, por lo tanto, son marcadores de diagnóstico útiles, es el análisis de estos marcadores específicos como un panel lo que ha proporcionado una mejora independiente y muy significativa respecto a la sensibilidad y la especificidad que podrían obtenerse de estos marcadores. analizados individualmente. Esta mejora también es significativa incluso cuando se considera frente a la sensibilidad y especificidad que se pueden obtener utilizando otros marcadores que se sabe que muestran un aumento de la metilación como marcador del inicio de una neoplasia de intestino grueso. En consecuencia, el método de la presente invención ha proporcionado ahora un medio para lograr un mayor nivel de sensibilidad y especificidad que el que se ha podido alcanzar hasta la fecha.

En un aspecto, se proporciona un método para detectar la aparición o predisposición a la aparición o el seguimiento de una neoplasia de intestino grueso en un individuo, comprendiendo dicho método evaluar el estado de metilación de:

la región génica, que incluye 2kb en dirección 5' de:

(1) BCAT1; y

(2) IKZF1;

y opcionalmente uno o más de (3) IRF4, (4) GRASP y (5) CAHM

(1) BCAT1, (2) IKZF1 y (3) IRF4.

(1) BCAT1, (2) IKZF1; y (4) GRASP.

(1) BCAT1, (2) IKZF1 y (5) CAHM

(1) BCAT1, (2) IKZF1, (3) IRF4 y (4) GRASP.

(1) BCAT1, (2) IKZF1, (3) IRF4 y(5) CAHM.

(1) BCAT1, (2) IKZF1, (4) GRASP y (5) CAHM.

(1) BCAT1, (2) IKZF1, (3) IRF4, (4) GRASP y (5) CAHM.

la región génica, que incluye 2kb en dirección 5' de:

(1) BCAT1; y

(5) CAHM;

y opcionalmente uno o más de (2) IKZF1, (3) IRF4 y (4) GRASP

la región génica, que incluye 2kb en dirección 5' de:

(1) BCAT1; y

(3) IRF4;

y opcionalmente uno o más de (2) IKZF1, (4) GRASP y (5) CAHM

En otra realización adicional, se proporciona un método para detectar la aparición o predisposición a la aparición o el seguimiento de una neoplasia de intestino grueso en un individuo, comprendiendo dicho método evaluar el estado de metilación de: la región génica, que incluye 2kb en dirección 5' de:

(1) BCAT1; y

(4) GRASP;

y opcionalmente uno o más de (2) IKZF1, (3) IRF4 y (5) CAHM

De acuerdo con estos aspectos y realizaciones, en otra realización más dicho nivel de control es un nivel no neoplásico.

Adicionalmente, en otra realización, dicho tejido de intestino grueso es preferiblemente tejido colorrectal.

En otra realización más, la neoplasia es maligna, tal como un carcinoma.

En una realización adicional, la neoplasia no es maligna, tal como un adenoma.

En términos de detección de la mutilación de estas regiones genéticas, debe entenderse que los ensayos pueden diseñarse para detectar las regiones específicas enumeradas aquí (que corresponden a la hebra "plus" del gen) o a la hebra complementaria "minus". Está dentro de la habilidad del experto en la materia elegir qué hebra analizar y dirigirse a esa hebra basándose en las coordenadas cromosómicas proporcionadas en el presente documento. En algunas circunstancias, se pueden establecer ensayos para analizar ambas hebras.

Debe entenderse que se puede analizar el panel de marcadores especificado exclusivamente o se puede optar por analizar adicionalmente otros marcadores, como otros marcadores de hipermetilación de ADN, otros marcadores del nivel de expresión de ARN u otros marcadores de proteínas. Estos otros marcadores pueden, por ejemplo, proporcionar información adicional en relación con el estado de salud del paciente en cuestión.

Sin limitar la presente invención a ninguna teoría o modo de acción, aunque la medición de los niveles de metilación en estas regiones de ADN es diagnóstico de una afección neoplásica del intestino grueso, se ha determinado que subregiones discretas son particularmente útiles en este sentido ya que estas subregiones contienen un alta densidad de dinucleótidos CpG que frecuentemente están hipermetilados en las neoplasias de intestino grueso, como los cánceres colorrectales. Este hallazgo convierte a estas subregiones en un objetivo particularmente útil para el análisis, ya que simplifica el proceso de detección debido a que es una región de ADN más corta y más claramente definida la que requiere análisis y, además, el hecho de que los resultados de estas regiones proporcionarán un resultado significativamente más definitivo en relación con la presencia, o no, de hipermetilación que la que se obtendría si el análisis se realizara en toda la región del ADN. Por lo tanto, este hallazgo simplifica el proceso de detección y aumenta la sensibilidad y la especificidad del diagnóstico de neoplasia del intestino grueso.

(5) subregiones CAHM: chr6:163834295-163834500 (SEQ ID NO:8), chr6:163834621-163834906, chr6:163834393-163834455 y chr6:163834393-163834519.

Sin limitar la presente invención a ninguna teoría o modo de acción, el experto en la materia puede analizar una o más subregiones para cada marcador genético.

En una realización, las subregiones del marcador de metilación analizadas para cada marcador genético son:

(1) La subregión BCAT definida por la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:2 o la correspondiente hebra minus;

(2) La subregión IKZF1 definida por la SEQ ID NO:3 o la SEQ ID NO:4 o la correspondiente hebra minus;

(3) La subregión IRF4 definida por la SEQ ID NO:5 o la correspondiente hebra minus;

(4) La subregión GRASP definida por la SEQ ID NO:6 o 7 o la correspondiente hebra minus; y

(5) La subregión CAHM definida por la SEQ ID NO:8 o la correspondiente hebra minus.

Sin limitar la presente invención a ninguna teoría o modo de acción, la metilación del ADN es universal en bacterias, plantas y animales. La metilación del ADN es un tipo de modificación química del ADN que es estable durante rondas de división celular pero que no implica cambios en la secuencia de ADN subyacente del organismo. Las modificaciones de la cromatina y el ADN son dos características importantes de la epigenética y juegan un papel en el proceso de diferenciación celular, permitiendo que las células mantengan de manera estable diferentes características a pesar de contener el mismo material genómico. En los organismos eucariotas, la metilación del ADN ocurre solo en el carbono número 5 del anillo de pirimidina de la citosina. En los mamíferos, la metilación del ADN ocurre principalmente en el carbono número 5 de la citosina de un dinucleótido CpG. Los dinucleótidos CpG comprenden aproximadamente 1 % del genoma humano.

El 70-80 % de todos los CpG están metilados. Los CpG se pueden agrupar en grupos llamados "islas de CpG" que están presentes en las regiones reguladoras 5' de muchos genes y con frecuencia no están metiladas. En muchos procesos patológicos como el cáncer, los promotores de genes y/o las islas de CpG adquieren hipermetilación anormal, que se asocia con silenciamiento transcripcional heredable. La metilación del a Dn puede afectar a la transcripción de genes de dos maneras. Primero, la metilación del ADN puede impedir físicamente la unión de las proteínas transcripcionales al gen, bloqueando así la transcripción. En segundo lugar, el ADN metilado puede unirse a proteínas conocidas como proteínas de dominio de unión a metil-CpG (MBD). Las proteínas MBD reclutan después proteínas adicionales al locus, como las histona desacetilasas y otras proteínas de remodelación de la cromatina que pueden modificar las histonas, formando así una cromatina inactiva compacta, denominada cromatina silenciosa. Este vínculo entre la mutilación del ADN y la estructura de la cromatina es muy importante. En particular, la pérdida de la proteína de unión a metil-CpG 2 (MeCP2) se ha implicado en el síndrome de Rett y la proteína de dominio de unión a metil-CpG 2 (MBD2) media el silenciamiento transcripcional de genes hipermetilados en el cáncer.

En los seres humanos, el proceso de metilación del ADN se lleva a cabo mediante tres enzimas, la ADN metiltransferasa 1,3a y 3b (DNMT1, DNMT3a, DNMT3b). Se cree que la DNMT3a y la DNMT3b son las metiltransferasas de novoque establecen patrones de metilación del ADN en etapas tempranas del desarrollo. La DNMT1 es la metiltransferasa de mantenimiento propuesta que es responsable de copiar los patrones de metilación del ADN en las hebras hijas durante la replicación del ADN. La DNMT3L es una proteína que es homóloga a las otras DNMT3 pero no tiene actividad catalítica. En cambio, La DNMT3L ayuda a las metiltransferasas de novo aumentando su capacidad de unirse al ADN y estimular su actividad. Por último, la DNMT2 ha sido identificada como un homólogo de metiltransferasa de ADN "enigmática", que contiene los 10 motivos de secuencia comunes a todas las metiltransferasas de ADN; sin embargo, la DNMT2 puede que no metile ADN, ya que se ha demostrado que metila un ARN pequeño.

Por lo tanto, el "estado de metilación" debe entenderse como una referencia a la presencia, ausencia y/o cantidad de metilación en un nucleótido o nucleótidos particulares, dentro de una región de ADN. El estado de metilación de una secuencia de ADN particular (por ejemplo, la región de ADN como se describe en el presente documento) puede indicar el estado de metilación de cada base en la secuencia o puede indicar el estado de metilación de un subconjunto de los pares de bases (por ejemplo, de citosinas o el estado de metilación de una o más secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción específicas) dentro de la secuencia, o puede indicar información con respecto a la densidad de metilación regional dentro de la secuencia sin proporcionar información precisa de en qué parte de la secuencia se produce la metilación. El estado de metilación puede representarse o indicarse opcionalmente mediante un "valor de metilación". Se puede generar un valor de metilación, por ejemplo, cuantificando la cantidad de ADN intacto presente después de la digestión de restricción con una enzima de restricción dependiente de la metilación. En este ejemplo, si una secuencia particular en el ADN se cuantifica usando PCR cuantitativa, una cantidad de ADN molde aproximadamente igual a un control tratado simulado indica que la secuencia no está altamente metilada mientras que una cantidad de molde sustancialmente menor que la que ocurre en la muestra tratada simulada indica la presencia de ADN metilado en la secuencia. En consecuencia, un valor, es decir, un valor de metilación, por ejemplo del ejemplo descrito anteriormente, representa el estado de metilación y, por lo tanto, puede usarse como un indicador cuantitativo del estado de metilación. Esto es de uso particular cuando es deseable comparar el estado de metilación de una secuencia en una muestra con un valor umbral.

El método de la presente invención se basa en la comparación del nivel de metilación de regiones de ADN específicas de una muestra biológica con los niveles de metilación de control de estas regiones de ADN. El "nivel de control" es el "nivel normal", que es el nivel de metilación de la región de ADN de una población de células o células del intestino grueso correspondiente que no es neoplásica o en otra muestra biológica de la que se puede aislar el ADN para el ensayo.

El nivel de metilación normal (o "no neoplásico") puede determinarse utilizando tejidos no neoplásicos derivados del mismo individuo que es el sujeto de la prueba. Sin embargo, se apreciará que esto puede ser bastante invasivo para el individuo en cuestión y, por lo tanto, es probable que sea más conveniente analizar los resultados de la prueba en relación con un resultado estándar que refleje los resultados individuales o colectivos obtenidos de individuos distintos del paciente en cuestión. Esta última forma de análisis es, de hecho, el método preferido de análisis ya que permite el diseño de kits que requieren la recolección y análisis de una sola muestra biológica, siendo una muestra de prueba de interés. Los resultados estándar que proporcionan el nivel normal de metilación pueden calcularse por cualquier medio adecuado que sea conocido por el experto en la materia. Por ejemplo, se puede evaluar una población de tejidos normales en términos del nivel de metilación de los genes de la presente invención, proporcionando así un valor estándar o rango de valores contra los cuales se analizan todas las muestras de prueba futuras. También debe entenderse que el nivel normal puede determinarse a partir de los sujetos de una cohorte específica y para su uso con respecto a las muestras de prueba derivadas de esa cohorte. En consecuencia, puede determinarse una serie de valores estándar o rangos que corresponden a cohortes que difieren con respecto a características tales como edad, género, etnia o estado de salud. Dicho "nivel normal" puede ser un nivel discreto o un rango de niveles. Un aumento en el nivel de metilación de los genes en cuestión en relación con los niveles normales es indicativo de que el tejido es neoplásico.

El término "metilación" se entenderá como la presencia de un grupo metilo añadido por la acción de una enzima ADN metil transferasa a una base o bases de citosina en una región de ácido nucleico, por ejemplo, ADN genómico. Como se describe en el presente documento, existen varios métodos conocidos por los expertos en la materia para determinar el nivel o grado de metilación de un ácido nucleico.

Por "nivel mayor" se entiende que hay un mayor número de dinucleótidos CpG metilados en el sujeto diagnosticado que en una muestra de control, es decir, o la proporción de moléculas de ADN metiladas en un sitio CpG particular es mayor o hay un número mayor de sitios CpG individuales metilados en el sujeto. Debe entenderse que los términos "mejorado" y "aumentado" se usan indistintamente con el término "mayor".

En relación con la detección de un "nivel mayor" de mutilación, debe entenderse que, en algunas situaciones, el nivel normal/control corresponderá de hecho a la ausencia de cualquier metilación detectable, mientras que el nivel neoplásico corresponderá a la presencia de metilación, per se. En esta situación, el método de diagnóstico es relativamente simple ya que solo se necesita detectar la mera presencia de metilación (es decir, solo una evaluación cualitativa), en lugar de evaluar los niveles de metilación respecto a un nivel de metilación de control, cuyo análisis necesariamente implica una medida de cuantificación. Sin limitar la presente invención de ninguna manera, se observa en muestras derivadas de sangre, por ejemplo, que en el contexto de algunos marcadores, el cambio en la metilación de ese marcador al inicio de la neoplasia es un cambio de niveles indetectables de metilación a presencia de metilación detectable. En estas situaciones, se permite una evaluación cualitativa relativamente simple en la que solo se necesita analizar una muestra de prueba para determinar la presencia o no de metilación. En el contexto de las definiciones proporcionadas en el presente documento, la referencia a "nivel mayor" abarca tanto un aumento relativo en el nivel de metilación de un marcador como el inicio de la metilación donde anteriormente no se apreciaba. Como se ha detallado anteriormente en el presente documento, el nivel de control puede evaluarse nuevamente para cada paciente o puede haber un resultado estándar en comparación con el cual se evalúan todas las muestras de prueba. Cuando se sabe que la metilación no está presente en el marcador de interés, solo se necesita detectar la presencia o no de metilación, ya que el nivel de control es la ausencia de metilación y el "nivel mayor" es la presencia de cualquier cantidad de metilación.

La presente invención no está limitada por un número preciso de residuos metilados que se consideran diagnósticos de neoplasia en un sujeto, porque entre las muestras de pacientes existirá cierta variación. La presente invención tampoco está limitada por la ubicación del residuo metilado.

No obstante, también se han identificado varios residuos de citosina específicos que sufren hipermetilación dentro de estas subregiones. En otra realización, por lo tanto, se puede emplear un método de detección que se dirige específicamente a evaluar el estado de metilación de uno o más de estos residuos o la citosina correspondiente en la posición n+1 en la hebra de ADN opuesta.

Con este fin, se detallan en la Tabla 1 los residuos de citosina que se han identificado en este sentido. El experto en la materia entenderá que estos residuos individuales están numerados por referencia a Hg19, que también corresponde a la numeración de las subregiones específicas enumeradas anteriormente y que se pueden identificar adicionalmente cuando se aplica la numeración de coordenadas para cada subregión a las secuencias de las subregiones correspondientes que se proporcionan en la lista de secuencias. Debe entenderse que estos residuos se han identificado en el contexto del ADN de la subregión. Sin embargo, hay otros residuos que están hipermetilados fuera de las propias subregiones, pero dentro de la región de ADN más grande de la que derivan las subregiones. En consecuencia, estos residuos especificados representan un subconjunto particularmente útil de residuos de citosina individuales que sufren hipermetilación dentro del contexto de las regiones y subregiones de ADN divulgadas en el presente documento. Estos residuos individuales se agrupan a continuación de acuerdo con la región de ADN dentro de la cual ocurren. Estas regiones de ADN se identifican por referencia tanto a las coordenadas cromosómicas de Hg19 como al nombre de la región del gen.

chr12:52399713 chr12:52399731 chr12:52399749 chr12:52399783

chr12:52399796 chr12:52399808 chr12:52399823 chr12:52399835

chr12:52399891

chr12:52400847 chr12:52400850 chr12:52400859 chr12:52400866

chr12:52400869 chr12:52400873 chr12:52400881 chr12:52400886

chr12:52400893 chr12:52400895 chr12:52400899 chr12:52400902

chr12:52400907 chr12:52400913 chr12:52400919 chr12:52400932

chr12:52400938 chr12:52400958 chr12:52400962 chr12:52400971

chr12:52400973 chr12:52400976 chr12:52400998 chr12:52401008

chr12:52401010 chr12:52401012 chr12:52401016 chr12:52401019

chr12:52401025 chr12:52401041 chr12:52401044 chr12:52401053

chr12:52401060 chr12:52401064 chr12:52401092 chr12:52401118

chr12:52401438 chr12:52401448 chr12:52401460 chr12:52401465

chr12:52401474 chr12:52401477 chr12:52401479 chr12:52401483

chr12:52401504 chr12:52401514 chr12:52401523 chr12:52401540

chr12:52401553 chr12:52401576 chr12:52401588 chr12:52401595

chr12:52401599 chr12:52401604 chr12:52401606 chr12:52401634

chr12:52401640 chr12:52401644 chr12:52401659

chr12:52401160 chr12:52401165 chr12:52401174 chr12:52401177 chr12:52401179 chr12:52401183 chr12:52401204 chr12:52401215 chr12:52401223 chr12:52401240 chr12:52401253 chr12:52401288 chr12:52401295 chr12:52401299 chr12:52401304 chr12:52401334 chr12:52401340 chr12:52401344 chr12:52401359

o la correspondiente citosina en la posición n+1 en la hebra opuesta.

chr6:163834330 chr6:163834332 chr6:163834357

chr6:163834373 chr6:163834384 chr6:163834390

chr6:163834392 chr6:163834406 chr6:163834412

chr6:163834419 chr6:163834443 chr6:163834448

chr6:163834452 chr6:163834464 chr6:163834483

chr6:163834653 chr6:163834660 chr6:163834672

chr6:163834675 chr6:163834678 chr6:163834681

chr6:163834815 chr6:163834824 chr6:163834835

chr6:163834840 chr6:163834853 chr6:163834855

chr6:163834858 chr6:163834863 chr6:163834869

chr6:163834872

o la correspondiente citosina en la posición n+1 en la hebra opuesta.

chr7:50343869 chr7:50343872 chr7:50343883

chr7:50343889 chr7:50343890 chr7:50343897

chr7:50343907 chr7:50343909 chr7:50343914

chr7:50343934 chr7:50343939 chr7:50343950

chr7:50343959 chr7:50343805 chr7:50343822

chr7:50343824 chr7:50343826 chr7:50343829

chr7:50343831 chr7:50343833 chr7:50343838

chr7:50343847 chr7:50343850 chr7:50343858

chr7:50343864 chr7:50343869 chr7:50343872

chr7:50343890

o la correspondiente citosina en la posición n+1 en la hebra opuesta.

chr6:392036 chr6:392047 chr6:392049

chr6:392057 chr6:392060 chr6:392066

chr6:392080 chr6:392094 chr6:392102

chr6:392131

o la correspondiente citosina en la posición n+1 en la hebra opuesta.

El método de detección de la presente invención se puede realizar en cualquier muestra biológica adecuada. Con este fin, la referencia a "muestra biológica" debe entenderse como una referencia a cualquier muestra de material biológico derivado de un animal como, aunque no de forma limitativa, material celular, biofluidos (por ej., sangre), heces, muestras para biopsia de tejidos, muestras quirúrgicas o fluidos que se introdujeron en el cuerpo de un animal y posteriormente se eliminaron (como, por ejemplo, la solución recuperada de un lavado con enema). La muestra biológica que se prueba de acuerdo con el método de la presente divulgación puede probarse directamente o puede requerir alguna forma de tratamiento antes de su uso. Por ejemplo, una biopsia o muestra quirúrgica puede requerir homogeneización antes de la prueba o puede requerir un corte para la prueba in situ de los niveles de expresión cualitativa de genes individuales. Como alternativa, una muestra celular puede requerir permeabilización antes de la prueba. Además, en la medida en que la muestra biológica no esté en forma líquida, (si tal forma es requerida para la prueba) puede requerir la adición de un reactivo, como un tampón, para movilizar la muestra. En la medida en que la región de ADN de interés esté presente en una muestra biológica, la muestra biológica se puede analizar directamente o, de lo contrario, se puede aislar todo o parte del ácido nucleico presente en la muestra biológica antes de la prueba. En otro ejemplo más, la muestra puede purificarse parcialmente o enriquecerse de otro modo antes del análisis. Por ejemplo, en la medida en que una muestra biológica comprenda una población celular muy diversa, puede ser deseable enriquecer una subpoblación de particular interés. Está dentro del alcance de la presente invención que la población de células objetivo o las moléculas derivadas de las mismas sean tratadas antes de la prueba, por ejemplo, mediante la inactivación de virus vivos. También debe entenderse que la muestra biológica puede ser recién cosechada o puede haber sido almacenada (por ejemplo, por congelación) antes de la prueba o tratada de otra manera antes de la prueba (como por ejemplo mediante cultivo). La elección del tipo de muestra que es más adecuada para la prueba de acuerdo con el método divulgado en el presente documento dependerá de la naturaleza de la situación. Preferentemente, dicha muestra es una muestra fecal, lavado con enema, resección quirúrgica, biopsia para tejido o muestra de sangre (por ejemplo, sangre entera, suero o plasma).

Más preferentemente, dicha muestra biológica es una muestra de sangre, muestra de biopsia o muestra de heces. Como se ha detallado anteriormente en el presente documento, la presente invención está diseñada para detectar una célula o población celular neoplásica, que se localiza en el intestino grueso. En consecuencia, la referencia a "célula o población celular" debe entenderse como una referencia a una célula individual o un grupo de células. Dicho grupo de células puede ser una población difusa de células, una suspensión celular, una población encapsulada de células o una población de células que adoptan la forma de tejido.

La referencia a la "aparición" de una neoplasia, tal como un adenoma o un adenocarcinoma, debe entenderse como una referencia a una o más células de ese individuo que presentan displasia. En este sentido, el adenoma o el adenocarcinoma pueden estar bien desarrollados porque se ha desarrollado una masa de células displásicas. Como alternativa, el adenoma o el adenocarcinoma pueden estar en un estadio muy temprano en el que solo se han producido relativamente pocas divisiones celulares anormales en el momento del diagnóstico. La presente invención también abarca la evaluación de la predisposición de un individuo al desarrollo de una neoplasia, tal como un adenoma o adenocarcinoma. Sin limitar la presente invención de ninguna manera, los niveles de metilación modificados pueden ser indicativos de la predisposición de ese individuo a desarrollar una neoplasia, como el desarrollo futuro de un adenoma o adenocarcinoma u otro adenoma o adenocarcinoma.

Aunque el método preferido es evaluar los niveles de metilación con el fin de diagnosticar el desarrollo de neoplasia o la predisposición a la misma, la detección de cambios inversos en los niveles de dicha metilación puede ser deseable en ciertas circunstancias, por ejemplo, para controlar la efectividad del tratamiento terapéutico o profiláctico dirigido a modular una afección neoplásica, como el desarrollo de un adenoma o adenocarcinoma. Por ejemplo, cuando los niveles elevados de metilación indican que un individuo ha desarrollado una afección caracterizada por el desarrollo de adenoma o adenocarcinoma, la detección de una disminución en los niveles de metilación posteriormente al inicio de un régimen de tratamiento terapéutico puede utilizarse para indicar la eliminación exitosa de la células neoplásicas. En otro ejemplo, este método se puede usar para analizar el tejido en los márgenes de una resección tumoral para determinar si se ha extirpado el margen completo del tumor.

El presente método puede usarse por lo tanto en el diagnóstico, pronóstico, clasificación, predicción del riesgo de enfermedad, detección o recurrencia de la enfermedad, selección del tratamiento de diversos tipos de neoplasias y el seguimiento de neoplasias. Un cáncer se puede detectar en cualquier estadio de progresión, tal como cánceres primarios, metastásicos y recurrentes.

La presente invención proporciona métodos para determinar si un mamífero (por ejemplo, un ser humano) tiene una neoplasia del intestino grueso, si una muestra biológica tomada de un mamífero contiene células neoplásicas o ADN derivado de células neoplásicas, estimando el riesgo o la probabilidad de un mamífero de desarrollar una neoplasia, controlando la eficacia del tratamiento antineoplásico o seleccionando el tratamiento antineoplásico apropiado en un mamífero con cáncer. Dichos métodos se basan en la determinación de que las células neoplásicas tienen un estado de metilación diferente que las células normales en las regiones de ADN descritas en el presente documento. En consecuencia, al determinar si una célula contiene o no secuencias metiladas diferencialmente en las regiones de ADN como se describe en el presente documento, es posible determinar que una célula es neoplásica.

El método de la invención puede usarse para evaluar individuos conocidos o sospechosos de tener una neoplasia o como una prueba clínica de rutina, es decir, en un individuo que no necesariamente se sospecha que tiene una neoplasia. Se pueden realizar más ensayos de diagnóstico para confirmar el estado de la neoplasia en el individuo. Además, los presentes métodos pueden usarse para evaluar la eficacia de un ciclo de tratamiento. Por ejemplo, la eficacia de un tratamiento contra el cáncer se puede evaluar controlando la metilación del ADN de las secuencias descritas en el presente documento a lo largo del tiempo en un mamífero que tiene cáncer. Por ejemplo, una reducción o ausencia de metilación en cualquiera de las secuencias de diagnóstico de la invención en una muestra biológica tomada de un mamífero después de un tratamiento, en comparación con un nivel en una muestra tomada del mamífero antes, o en una fase inicial, del tratamiento, indica un tratamiento eficaz.

El método de la presente invención es útil, por lo tanto, como una prueba única o como seguimiento continuo de aquellos individuos que se cree que corren el riesgo de desarrollar neoplasia o como seguimiento de la efectividad de los regímenes de tratamiento terapéuticos o profilácticos dirigidos a inhibir o ralentizar de otro modo el desarrollo de la neoplasia. En estas situaciones, la cartografía de la modulación de los niveles de metilación en una o más clases de muestras biológicas es un indicador valioso del estado de un individuo o la efectividad de un régimen terapéutico o profiláctico que está actualmente en uso. En consecuencia, el método de la presente invención debe entenderse que abarca el seguimiento de aumentos o disminuciones en los niveles de metilación en un individuo respecto a su nivel normal (como se definió anteriormente en el presente documento), o respecto a uno o más niveles de metilación anteriores determinados a partir de una muestra biológica de dicho individuo.

Los métodos para detectar la neoplasia pueden comprender la detección de una o más secuencias de polinucleótidos o polipéptidos asociados con el cáncer. En consecuencia, la detección de metilación por el método de la invención se puede usar sola o en combinación con otros métodos de detección para el diagnóstico o pronóstico de neoplasia.

Cualquier método para detectar la metilación del ADN puede usarse en los métodos de la presente invención. Hay varios métodos disponibles para la detección de ADN metilado diferencialmente en loci específicos en muestras de tejido primario o en muestras de pacientes como sangre, orina, heces o saliva (revisado en Kristensen and Hansen Clin Chem. 55:1471-83, 2009; Ammerpohl et al. Biochim Biophys Acta. 1790:847-62, 2009; Shames et al. Cancer Lett. 251:187-98, 2007; Clark et al. Nat Protoc. 1:2353-64, 2006). Para el análisis de la proporción o extensión de la metilación del ADN en un gen objetivo, el ADN normalmente se trata con bisulfito de sodio y las regiones de interés se amplifican utilizando cebadores y condiciones de PCR que se amplificarán independientemente del estado de metilación del ADN. La metilación del amplicón global o de los sitios CpG individuales se puede evaluar mediante secuenciación, incluida la pirosecuenciación, la digestión con enzimas de restricción (COBRA) o el análisis de la curva de fusión. Como alternativa, se pueden usar métodos basados en la ligadura para el análisis de la metilación en sitios CpG específicos. La detección de ADN metilado aberrantemente liberado de tumores y en fluidos corporales se está desarrollando como un medio de diagnóstico del cáncer. Aquí, en el caso de secuencias hipermetiladas, es necesario utilizar métodos sensibles que permitan la amplificación selectiva de la secuencia de ADN metilada de a partir de ADN celular normal de referencia que no está metilado. Tales métodos basados en ADN tratado con bisulfito, por ejemplo; incluyen PCR selectiva de metilación (MSP), PCR Heavymethyl, PCR Headloop y reacción en cadena dependiente de facilitador (PCT/AU2008/001475).

En resumen, en algunas realizaciones, los métodos para detectar la metilación incluyen el cizallamiento aleatorio o la fragmentación aleatoria del ADN genómico, cortar el ADN con una enzima de restricción dependiente de metilación o sensible a la metilación y posteriormente identificar selectivamente y/o analizar el ADN cortado o sin cortar. La identificación selectiva puede incluir, por ejemplo, separar ADN cortado y sin cortar (por ejemplo, por tamaño) y cuantificar una secuencia de interés que se cortó o, como alternativa, que no se cortó. Véase, por ejemplo, patente de los EE. UU. n.° 7.186.512. Como alternativa, el método puede abarcar la amplificación del ADN intacto después de la digestión de la enzima de restricción, por lo tanto amplificando solo el ADN que no fue escindido por la enzima de restricción en el área amplificada. Véase, por ejemplo, la solicitud de patente de los EE. UU. con número de serie 10/971.986; 11/071.013; y 10/971.339. En algunas realizaciones, la amplificación puede realizarse usando cebadores que son específicos del gen. Como alternativa, se pueden agregar adaptadores a los extremos del ADN fragmentado al azar, el ADN se puede digerir con una enzima de restricción dependiente de metilación o sensible a la metilación, el ADN intacto se puede amplificar usando cebadores que hibridan con las secuencias del adaptador. En este caso, se puede realizar una segunda etapa para determinar la presencia, ausencia o cantidad de un gen particular en un grupo amplificado de ADN. En algunas realizaciones, el ADN se amplifica usando PCR cuantitativa en tiempo real.

En algunas realizaciones, los métodos comprenden cuantificar la densidad media de metilación en una secuencia objetivo dentro de una población de ADN genómico. En algunas realizaciones, el método comprende poner en contacto el ADN genómico con una enzima de restricción dependiente de la metilación o una enzima de restricción sensible a la metilación en condiciones que permitan que al menos algunas copias de los posibles sitios de escisión de la enzima de restricción en el locus permanezcan sin escindir; cuantificar copias intactas del locus; y comparar la cantidad de producto amplificado con un valor de control que representa la cantidad de metilación del ADN de control, cuantificando así la densidad de metilación promedio en el locus en comparación con la densidad de metilación del ADN de control.

La cantidad de metilación de un locus de ADN se puede determinar proporcionando una muestra de ADN genómico que comprenda el locus, escindiendo el ADN con una enzima de restricción que sea sensible a la metilación o dependiente de la metilación, y luego cuantificando la cantidad de ADN intacto o cuantificando la cantidad de ADN cortado en el locus de ADN de interés. La cantidad de ADN intacto o cortado dependerá de la cantidad inicial de ADN genómico que contiene el locus, la cantidad de mutilación en el locus y el número (es decir, la fracción) de nucleótidos en el locus que están metilados en el ADN genómico. La cantidad de metilación en un locus de ADN se puede determinar comparando la cantidad de ADN intacto o ADN cortado con un valor de control que representa la cantidad de ADN intacto o ADN cortado en una muestra de ADN tratada de manera similar. El valor de control puede representar un número conocido o previsto de nucleótidos metilados. Como alternativa, el valor de control puede representar la cantidad de ADN intacto o cortado del mismo locus en otra célula (por ejemplo, normal, no enferma) o en un segundo locus.

Al usar al menos una enzima de restricción sensible a la metilación o dependiente de la metilación en condiciones que permitan que al menos algunas copias de los posibles sitios de escisión de la enzima de restricción en el locus permanezcan sin escindir y, posteriormente, cuantificando las copias intactas restantes y comparando la cantidad con un control, se puede determinar la densidad media de metilación de un locus. Una enzima sensible a la metilación es aquella que corta el ADN si su secuencia de reconocimiento no está metilada, mientras que una enzima dependiente de la metilación corta el ADN si su secuencia de reconocimiento está metilada. Si la enzima de restricción sensible a la metilación se pone en contacto con copias de un locus de ADN en condiciones que permitan que al menos algunas copias de los posibles sitios de escisión de la enzima de restricción en el locus permanezcan sin escindir, entonces el ADN intacto restante será directamente proporcional a la densidad de metilación y, por lo tanto, se puede comparar con un control para determinar la densidad relativa de metilación del locus en la muestra. Análogamente, si una enzima de restricción dependiente de la metilación se pone en contacto con copias de un locus de ADN en condiciones que permitan que al menos algunas copias de los posibles sitios de escisión de la enzima de restricción en el locus permanezcan sin escindir, entonces el ADN intacto restante será inversamente proporcional a la densidad de metilación y, por lo tanto, se puede comparar con un control para determinar la densidad relativa de metilación del locus en la muestra. Dichos ensayos se divulgan en, por ejemplo, la solicitud de patente de los EE. UU. con número de serie 10/971.986.

Los kits de los métodos anteriores pueden incluir, por ejemplo, una o más enzimas de restricción dependientes de la metilación, enzimas de restricción sensibles a la metilación, reactivos de amplificación (por ejemplo, PCR), sondas y/o cebadores.

Los métodos de amplificación cuantitativa (por ejemplo, PCR cuantitativa o amplificación lineal cuantitativa) se pueden usar para cuantificar la cantidad de ADN intacto dentro de un locus flanqueado por cebadores de amplificación después de la digestión de restricción. Los métodos de amplificación cuantitativa se divulgan en, por ejemplo, patentes de los EE. UU. números 6.180.349; 6.033.854; y 5.972.602, así como en, por ejemplo, Gibson et al., Genome Research 6:995-1001 (1996); DeGraves, et al., Biotechniques 34(1):106-10, 112-5 (2003); Deiman B, et al., Mol. Biotechnol. 20(2):163-79 (2002). Las amplificaciones se pueden seguir en "tiempo real".

Los métodos adicionales para detectar la metilación del ADN pueden implicar la secuenciación genómica antes y después del tratamiento del ADN con bisulfito. Véase, por ejemplo, Frommer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1827-1831 (1992). Cuando el bisulfito de sodio se pone en contacto con el ADN, la citosina no metilada se convierte en uracilo, mientras que la citosina metilada no se modifica.

En algunas realizaciones, la digestión con enzimas de restricción de productos de PCR amplificados a partir de ADN convertido con bisulfito se usa para detectar la metilación del ADN. Véase, por ejemplo, Sadri & Hornsby, Nucl. Acids Res. 24:5058-5059 (1996); Xiong & Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534 (1997).

En algunas realizaciones, una reacción de PCR específica de metilación ("MSP") se usa sola o en combinación con otros métodos para detectar la metilación del ADN. Un ensayo de MSP implica la modificación inicial del ADN por bisulfito de sodio, convirtiendo todas las citosinas no metiladas, pero no las metiladas, en uracilo, y la posterior amplificación con cebadores específicos de ADN metilado frente a ADN no metilado. Véase, Herman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826 (1996); patente de los EE. UU. n.° 5.786.146.

En algunas realizaciones, se una un ensayo MethyLight solo o en combinación con otros métodos para detectar la metilación del ADN (véase, Eads et al., Cancer Res. 59:2302-2306 (1999)). En resumen, en el proceso MethyLight, el ADN genómico se convierte en una reacción de bisulfito de sodio (el proceso de bisulfito convierte los residuos de citosina no metilados en uracilo). La amplificación de una secuencia de ADN de interés se realiza utilizando cebadores de PCR que se hibridan con dinucleótidos CpG. Al usar cebadores que hibridan solo con secuencias que resultan de la conversión con bisulfito del ADN metilado, (o como alternativa con secuencias no metiladas) la amplificación puede indicar el estado de metilación de secuencias donde los cebadores hibridan. Asimismo, el producto de amplificación se puede detectar con una sonda que se une específicamente a una secuencia resultante del tratamiento con bisulfito de un ADN no metilado. Si se desea, se pueden usar cebadores y sondas para detectar el estado de metilación. Por tanto, los kits para usar con MethyLight pueden incluir bisulfito de sodio, así como cebadores o sondas marcadas de forma detectable (incluidas, aunque sin limitación, Taqman o sondas de baliza molecular) que distinguen entre ADN metilado y no metilado que ha sido tratado con bisulfito. Otros componentes del kit pueden incluir, por ejemplo, reactivos necesarios para la amplificación de ADN, incluidos, aunque de forma no limitativa, tampones de PCR, desoxinucleótidos; y una polimerasa termoestable.

En algunas realizaciones, se usa una reacción Ms-SNuPE (extensión de cebador de nucleótido único sensible a la mutilación) sola o en combinación con otros métodos para detectar la mutilación del ADN (véase Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531 (1997)). La técnica Ms-SNuPE es un método cuantitativo para evaluar las diferencias de metilación en sitios CpG específicos basada en el tratamiento con bisulfito del ADN, seguido de la extensión del cebador de un solo nucleótido (Gonzalgo y Jones, supra). En resumen, el ADN genómico se hace reaccionar con bisulfito de sodio para convertir la citosina no metilada en uracilo, dejando la 5-metilcitosina sin cambios. La amplificación de la secuencia objetivo deseada se realiza a continuación usando cebadores de PCR específicos de ADN convertido con bisulfito, y el producto resultante se aísla y se usa como molde para el análisis de metilación en el sitio o sitios CpG de interés.

Los reactivos típicos (por ejemplo, como se pueden encontrar en un kit típico basado en Ms-SNuPE) para el análisis Ms-SNuPE pueden incluir, pero sin limitación: cebadores de PCR para un gen específico (o secuencia de ADN con metilación alterada o isla de CpG); tampones de PCR optimizados y desoxinucleótidos; kit de extracción de gel; cebadores de control positivo; cebadores de Ms-SNuPE para un gen específico; tampón de reacción (para la reacción Ms-SNuPE); y nucleótidos marcados de forma detectable. Además, los reactivos de conversión de bisulfito pueden incluir: tampón de desnaturalización de ADN; tampón de sulfonación; reactivos o kit de recuperación de ADN (por ejemplo, precipitación, ultrafiltración, columna de afinidad); tampón de desulfonación; y componentes de recuperación de ADN.

Los métodos de detección de metilación adicionales incluyen, aunque no de forma limitativa, amplificación de la isla de CpG metilada (véase, Toyota et al., Cancer Res. 59:2307-12 (1999)) y los descritos en, por ejemplo, publicación de patente de los EE. UU. 2005/0069879; Rein, et al. Nucleic Acids Res. 26 (10): 2255-64 (1998); Olek, et al. Nat. Genet. 17(3): 275-6 (1997); y publicación PCT número WO 00/70090.

A continuación se proporciona información más detallada en relación con varios de estos métodos generalmente descritos:

(a) Diseño y/o producción de sonda o cebador

Varios métodos descritos en el presente documento para el diagnóstico de una neoplasia usan una o más sondas y/o cebadores. Los métodos para diseñar sondas y/o cebadores para su uso en, por ejemplo, PCR o hibridación son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Dieffenbach and Dveksler (Eds) (En: PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, NY, 1995). Asimismo, varios paquetes de software están disponibles públicamente para diseñar sondas y/o cebadores óptimos para una variedad de ensayos, por ej., Primer 3, disponible en el Centro de Investigación del Genoma, Cambridge, ^{m A . ,} EE. UU.

Claramente, el uso potencial de la sonda o cebador debe considerarse durante su diseño. Por ejemplo, si la sonda o el cebador se producen para usar en un ensayo de PCR específico de metilación o reacción en cadena de la ligasa (LCR), el nucleótido en el extremo 3' (o 5' en el caso de la LCR) debe corresponder preferiblemente a un nucleótido metilado en un ácido nucleico.

Las sondas y/o cebadores útiles para la detección de una secuencia asociada con una neoplasia se evalúan, por ejemplo, para determinar aquellas que no forman horquillas, autocebantes o las que forman dímeros de cebador (por ejemplo, con otra sonda o cebador utilizado en un ensayo de detección). Asimismo, una sonda o cebador (o la secuencia de los mismos) a menudo se evalúa para determinar la temperatura a la que se desnaturaliza a partir de un ácido nucleico objetivo (es decir, la temperatura de fusión de la sonda o cebador, o Tm). Los métodos para estimar la Tm son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Santa Lucia, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 1460-1465, 1995 o Bresslauer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 3746-3750, 1986.

Los métodos para producir/sintetizar una sonda o cebador de la presente invención son conocidos en la técnica. Por ejemplo, la síntesis de oligonucleótidos se describe, en Gait (Ed) (En: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1984). Por ejemplo, se puede obtener una sonda o cebador por síntesis biológica (por ejemplo, por digestión de un ácido nucleico con una endonucleasa de restricción) o por síntesis química. Para secuencias cortas (hasta aproximadamente 100 nucleótidos) es preferible la síntesis química.

Para secuencias más largas, los métodos de replicación estándar empleados en biología molecular son útiles, tales como, por ejemplo, el uso de M13 para ADN monocatenario como se describe por Messing, Methods Enzymol, 101, 20-78, 1983. Otros métodos para la síntesis de oligonucleótidos incluyen, por ejemplo, los métodos del fosfotriéster y fosfodiéster (Narang, et al. Meth. Enzymol 68: 90, 1979) y síntesis sobre un soporte (Beaucage, et al. Tetrahedron Letters 22:1859-1862, 1981) así como la técnica del fosforamidato, Caruthers, M. H., et al., Methods in Enzymology, Vol. 154, págs. 287-314 (1988), y otros descritos en "Synthesis and Applications of DNA and RNA". S. A. Narang, editor, Academic Press, Nueva York, 1987, y las referencias citadas en los mismos. Las sondas que comprenden ácido nucleico bloqueado (LNA) se sintetizan como se describe, por ejemplo, en Nielsen et al. J. Chem. Soc. Perkin Trans., 1:3423, 1997; Singh and Wengel, Chem. Commun. 1247, 1998. Mientras que, las sondas que comprenden ácido nucleico peptídico (PNA) se sintetizan como se describe, por ejemplo, en Egholm et al., Am. Chem. Soc., 114:1895, 1992; Egholm et al., Nature, 365:566, 1993; y Orum et al., Nucl. Acids Res., 21: 5332, 1993.

(b) Digestión de ADN con endonucleasa sensible a metilación

En un ejemplo, el aumento de la metilación en una muestra se determina usando un proceso que comprende tratar el ácido nucleico con una cantidad de una enzima endonucleasa de restricción sensible a la metilación en condiciones suficientes para que el ácido nucleico sea digerido y luego detectar los fragmentos producidos. Los ejemplos de endonucleasas sensibles a la metilación incluyen, por ejemplo, Hhal o HpaII. Preferentemente, los ensayos incluyen controles internos que se digieren con una enzima insensible a la metilación que tiene la misma especificidad que la enzima sensible a la metilación empleada. Por ejemplo, la enzima insensible a la metilación MspI es un isoesquizómero de la enzima sensible a la metilación HpaII.

Formatos de ensayo de hibridación

En un ejemplo, la digestión del ácido nucleico se detecta por hibridación selectiva de una sonda o cebador con el ácido nucleico no digerido. Como alternativa, la sonda hibrida selectivamente tanto con ácido nucleico digerido como no digerido pero facilita la diferenciación entre ambas formas, por ejemplo, por electroforesis. Los métodos de detección adecuados para lograr la hibridación selectiva con una sonda de hibridación incluyen, por ejemplo, el método Southern u otra hibridación de ácido nucleico (Kawai et al., Mol. Cell. Biol. 14:7421-7427, 1994; Gonzalgo et al., Cancer Res. 57:594-599, 1997).

Las condiciones de hibridación adecuadas se determinan basándose en la temperatura de fusión (Tm) del dúplex de ácido nucleico que comprende la sonda. El experto en la materia sabrá que las condiciones óptimas de la reacción de hibridación deben determinarse empíricamente para cada sonda, aunque pueden aplicarse algunas generalidades. Preferentemente, las hibridaciones que emplean sondas oligonucleotídicas cortas se realizan con rigurosidad baja a media. En el caso de una sonda o cebador rico en GC o una sonda o cebador más largo, se prefiere una hibridación y/o lavado de alta rigurosidad. En el presente documento se define una alta rigurosidad como una hibridación y/o lavado realizado en aproximadamente 0,1 x tampón SSC y/o aproximadamente SDS 0,1 % (p/v), o una concentración de sal más baja, y/o a una temperatura de al menos 65 °C, o condiciones equivalentes. La referencia en el presente documento a un nivel particular de rigurosidad abarca condiciones equivalentes que usan soluciones de lavado/hibridación distintas de SSC conocidas por los expertos en la materia.

De acuerdo con el presente ejemplo, una diferencia en los fragmentos producidos para la muestra de prueba y una muestra de control negativo es indicativa de que el sujeto tiene una neoplasia. Análogamente, en los casos en que la muestra de control comprende datos de un tumor, tejido canceroso o una célula cancerosa o una célula precancerosa, la similitud, aunque no necesariamente la identidad absoluta, entre la muestra de prueba y la muestra de control es indicativa de un diagnóstico positivo (es decir cáncer).

Formatos de ensayo de amplificación

En un ejemplo alternativo, los fragmentos producidos por la enzima de restricción se detectan utilizando un sistema de amplificación, tal como, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación por círculo rodante (RCA), reacción en cadena de la polimerasa inversa (iPCR), PCR in situ (Singer-Sam et al., Nucl. Acids Res.

18:687, 1990), amplificación por desplazamiento de hebra (SDA) o tecnología de sonda cíclica.

Los métodos de PCR son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, por McPherson et al., PCR: A Practical Approach, (serie eds, D. Rickwood y B. D. Hames), IRL Press Limited, Oxford, págs. 1-253, 1991 y por Dieffenbach (ed) y Dveksler (ed) (En: PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratories, ^{N y ,} 1995, cuyos contenidos se incorporan en su totalidad a modo de referencia. Generalmente, para la PCR, dos moléculas cebadoras de ácido nucleico no complementarias que comprenden al menos aproximadamente 18 nucleótidos de longitud, y más preferiblemente al menos 20-30 nucleótidos de longitud se hibridan con diferentes hebras de una molécula molde de ácido nucleico en sus respectivos sitios de hibridación, y las copias de la molécula de ácido nucleico específicas del molde que intervienen en los sitios de hibridación se amplifican enzimáticamente. Los productos de amplificación pueden detectarse, por ejemplo, usando electroforesis y detección con un marcador detectable que se une a ácidos nucleicos. Como alternativa, uno o más de los oligonucleótidos se marcan con un marcador detectable (por ejemplo, un fluoróforo) y el producto de amplificación se detecta usando, por ejemplo, un ciclador de luz (Perkin Elmer, Wellesley, MA., EE. UU., Roche Applied Science, Indianápolis, IN, EE. UU.).

La amplificación por desplazamiento de hebra (SDA) utiliza cebadores oligonucleotídicos, una ADN polimerasa y una endonucleasa de restricción para amplificar una secuencia objetivo. Los oligonucleótidos se hibridan con un ácido nucleico objetivo y la polimerasa se usa para producir una copia de la región que interviene en los sitios de hibridación del cebador. Los dúplex del ácido nucleico copiado y el ácido nucleico objetivo se cortan con una endonucleasa que reconoce específicamente una secuencia al comienzo del ácido nucleico copiado. La ADN polimerasa reconoce el ADN cortado y produce otra copia de la región objetivo al mismo tiempo que desplaza el ácido nucleico generado previamente. La ventaja de la SDA es que ocurre en un formato isotérmico, lo que facilita el análisis automatizado de alto rendimiento.

La tecnología Cycling Probe utiliza un cebador sintético quimérico que comprende ADN-ARN-ADN que es capaz de hibridarse con una secuencia objetivo. Tras la hibridación con una secuencia objetivo, el dúplex de ARN-ADN formado es un objetivo para la ARNasaH, escindiendo así el cebador. El cebador escindido se detecta a continuación, por ejemplo, mediante espectrometría de masas o electroforesis.

Para los cebadores que flanquean o son adyacentes a un sitio de reconocimiento de endonucleasa sensible a la metilación, se prefiere que dichos cebadores flanqueen solo aquellos sitios que están hipermetilados en la neoplasia para asegurar que se produzca un producto de amplificación de diagnóstico. En este sentido, solo se producirá un producto de amplificación cuando el sitio de restricción no se escinda, es decir, si está metilado. En consecuencia, la detección de un producto de amplificación indica que el o los dinucleótidos CpG de interés están metilados.

Como sabrá el experto en la materia, la longitud precisa del producto amplificado variará dependiendo de la distancia entre los cebadores. Claramente, esta forma de análisis puede usarse para determinar el estado de metilación de una pluralidad de dinucleótidos CpG, siempre que cada dinucleótido esté dentro de un sitio de endonucleasa de restricción sensible a la metilación. En estos métodos, uno o más de los cebadores pueden marcarse con un marcador detectable para facilitar la detección rápida del ácido nucleico amplificado, por ejemplo, un marcador fluorescente (por ejemplo Cy5 o Cy3) o un radioisótopo (por ejemplo 32P).

Los ácidos nucleicos amplificados generalmente se analizan usando, por ejemplo, electroforesis en gel de agarosa no desnaturalizante, electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante, espectrometría de masas, cromatografía líquida (por ejemplo, HPLC o dHPLC) o electroforesis capilar. (por ejemplo, MALDI-TOF). Los métodos de detección de alto rendimiento, tales como, por ejemplo, tiempo de vuelo de ionización/desorción láser asistido por matriz (MALDI-TOF), ionización por electropulverización (ESI), espectrometría de masas (incluyendo espectrometría de masas en tándem, por ejemplo, LC MS/MS), tecnología de biosensores, tecnología de fibra óptica evanescente o tecnología de chip de Ad N (por ejemplo, WO98/49557; WO 96/17958; Fodor et al., Science 767-773, 1991; patente de los EE.UU. n.° 5.143.854; y patente de los EE.UU. n.° 5.837.832, cuyos contenidos se incorporan en el presente documento como referencia), son especialmente preferidos para todos los formatos de ensayo descritos en el presente documento. Como alternativa, la amplificación de un ácido nucleico puede controlarse continuamente usando un método de análisis de curva de fusión como se describe en este documento y/o en, por ejemplo, patente de los EE.UU. n.° 6.174.670, que se incorpora en el presente documento por referencia.

(c) Otros formatos de ensayo

En un ejemplo alternativo, el aumento de la metilación en una muestra se determina realizando un proceso que comprende tratar el ácido nucleico que contiene cromatina con una ADNasal en condiciones suficientes para que el ácido nucleico sea digerido y luego detectar los fragmentos producidos. Este formato de ensayo se basa en el conocimiento de que la cromatina que contiene ADN metilado, por ejemplo, ADN hipermetilado, tiene una conformación más cerrada que el ADN no hipermetilado y, como consecuencia, es menos susceptible a la digestión de endonucleasa por la ADNasa I.

De acuerdo con este método, se producen fragmentos de ADN de diferentes longitudes por digestión con ADNasa I del ADN metilado en comparación con el ADN no metilado. Tales fragmentos de ADN diferentes se detectan, por ejemplo, usando un ensayo descrito anteriormente. Como alternativa, los fragmentos de ADN se detectan usando PCR-SSCP esencialmente como se describe, por ejemplo, en Gregory and Feil, Nucleic Acids Res., 27, e32i, e32iv, 1999. Al adaptar la PCR-SSCP a la presente invención, los cebadores de amplificación que flanquean o comprenden uno o más dinucleótidos CpG en un ácido nucleico que son resistentes a la digestión por ADNasa I en una muestra de neoplasia pero no resistentes a la digestión por ADNasa I en un control sano/normal o en una muestra de prueba sana/normal se utilizan para amplificar los fragmentos generados por la ADNasa I. En este caso, la producción de un fragmento de ácido nucleico específico usando ADNasa I es diagnóstico de neoplasia, porque el ADN no se degrada de manera eficiente. Por el contrario, el molde de ADN de una muestra de sujeto sano/normal se degrada por la acción de la ADNasa I y, como consecuencia, la amplificación no produce un producto de amplificación discreto. Los métodos alternativos a la PCR-SSCP, tales como, por ejemplo, la PCR-dHPLC también se conocen en la técnica y se contemplan en la presente invención.

(d) Mutagénesis selectiva de ADN no metilado

En un método alternativo, el aumento de la metilación en una muestra se determina usando un proceso que comprende tratar el ácido nucleico con una cantidad de un compuesto que muta selectivamente un residuo de citosina no metilado dentro de un dinucleótido CpG en condiciones suficientes para inducir mutagénesis.

Los compuestos preferidos mutan la citosina en uracilo o timidina, tales como, por ejemplo, una sal o bisulfito, por ejemplo, bisulfito sódico o bisulfito potásico (Frommer et al., 1992, supra). Se sabe que el tratamiento del ADN con bisulfito distingue residuos de citosina metilados de no metilados, mutando los residuos de citosina que no están protegidos por metilación, incluidos los residuos de citosina que no están dentro de un dinucleótido CpG o que están situados dentro de un dinucleótido CpG que no está sujeto a metilación.

Detección basada en la secuencia

En un ejemplo, la presencia de uno o más nucleótidos mutados o el número de secuencias mutadas se determina secuenciando el ADN mutado. Una forma de análisis comprende amplificar el ácido nucleico mutado usando una reacción de amplificación descrita en el presente documento, por ejemplo, PCR. El producto amplificado se secuencia o clona directamente y el producto clonado se secuencia. Los métodos de secuenciación del ADN son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, el método de terminación de la cadena didesoxi o el método de Maxam-Gilbert (véase Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2a Ed., CSHP, Nueva York 1989) o Zyskind et al., Recombinant DNA Laboratory Manual, (Acad. Press, 1988)).

Como el tratamiento del ácido nucleico con un compuesto, tal como, por ejemplo, bisulfito, da como resultado que las citosinas no metiladas se muten a uracilo (y, por lo tanto, a timidina después de un proceso de amplificación), el análisis de la secuencia determina la presencia o ausencia de un nucleótido metilado. Por ejemplo, la comparación de la secuencia obtenida usando una muestra de control o una muestra que no ha sido tratada con bisulfito, o la secuencia de nucleótidos conocida de la región de interés con una muestra tratada facilita la detección de diferencias en la secuencia de nucleótidos. Cualquier residuo de timina detectado en el sitio de una citosina en la muestra tratada en comparación con una muestra control o no tratada puede considerarse causado por una mutación como resultado del tratamiento con bisulfito. Los métodos adecuados para la detección de la metilación mediante la secuenciación de ácido nucleico tratado con bisulfito se describen, por ejemplo, en Frommer et al., 1992, supra o Clark et al., Nucl. Acids Res. 22, 2990-2997, 1994.

En otro método, la presencia de un nucleótido mutado o no mutado en una muestra tratada con bisulfito se detecta mediante pirosecuenciación, tal como, por ejemplo, se describe en Uhlmann et al., Electrophoresis, 23, 4072-4079, 2002. Esencialmente, este método es una forma de secuenciación en tiempo real que utiliza un cebador que se hibrida con un sitio adyacente o cercano al sitio de una citosina que está metilada. Después de la hibridación del cebador y el molde en presencia de una ADN polimerasa, cada uno de los cuatro desoxinucleótidos trifosfatos modificados se agrega por separado de acuerdo con un orden de dispensación predeterminado. Solo se añade un nucleótido que es complementario a la muestra tratada con bisulfito y se libera pirofosfato inorgánico (PPi). El PPi impulsa a continuación una reacción que da como resultado la producción de niveles detectables de luz. Tal método permite la determinación de la identidad de un nucleótido específico adyacente al sitio de hibridación del cebador. Los métodos de pirosecuenciación en fase sólida se conocen en la técnica y se revisan en, por ejemplo, Landegren et al., Genome Res., 8(8): 769-776, 1998. Tales métodos permiten la detección de alto rendimiento de la metilación de varios dinucleótidos CpG.

Un método relacionado para determinar la secuencia de un nucleótido tratado con bisulfito es la extensión del cebador de un solo nucleótido sensible a la metilación (Me-SnuPE) o SNaPmeth. Se describen métodos adecuados, por ejemplo, en Gonzalgo and Jones, 1997, supra, o Uhlmann et al., Electrophoresis, 23, 4072-4079, 2002. Se usa un oligonucleótido que hibrida con la región de un ácido nucleico adyacente al sitio de una citosina que está metilada. Este oligonucleótido se usa a continuación en un protocolo de extensión de cebador con una polimerasa y un nucleótido difosfato o didesoxinucleótido trifosfato libre que corresponde a una o cualquiera de las posibles bases que ocurren en este sitio después del tratamiento con bisulfito (es decir, timina o citosina). Preferentemente, el nucleótido-difosfato está marcado con un marcador detectable (por ejemplo, un fluoróforo). Después de la extensión del cebador, se eliminan los nucleótidos difosfatos marcados no unidos, por ejemplo, usando cromatografía de exclusión por tamaño o electroforesis, o se hidrolizan, usando, por ejemplo, fosfatasa alcalina, y se detecta la incorporación del nucleótido marcado al oligonucleótido, indicando la base que está presente en el sitio.

Claramente, la presente invención abarca otros métodos de secuenciación de alto rendimiento. Tales métodos incluyen, por ejemplo, minisecuenciación en fase sólida (como se describe, por ejemplo, en Southern et al., Genomics, 13:1008-1017, 1992 o minisecuenciación con FRET (como se describe, por ejemplo, en Chen and Kwok, Nucleic Acids Res. 25:347-353, 1997).

Formato de ensayo basado en endonucleasa de restricción

En un método, la presencia de una secuencia no mutada se detecta usando el análisis combinado de restricción de bisulfito (COBRA) esencialmente como se describe en Xiong y Laird, 2001, supra. Este método aprovecha las diferencias en los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción entre el ácido nucleico metilado y no metilado después del tratamiento con un compuesto que muta selectivamente un residuo de citosina no metilado, por ejemplo, bisulfito.

Después del tratamiento con bisulfito, una región de interés que comprende uno o más dinucleótidos CpG que están metilados y se incluyen en una secuencia de reconocimiento de endonucleasa de restricción se amplifica usando una reacción de amplificación descrita en el presente documento, por ejemplo, PCR. El producto amplificado se pone a continuación en contacto con la enzima de restricción que escinde en el sitio del dinucleótido CpG durante un tiempo y en condiciones suficientes para que se produzca la escisión. Se puede seleccionar un sitio de restricción para indicar la presencia o ausencia de metilación. Por ejemplo, la endonucleasa de restricción Taql escinde la secuencia TCGA, después del tratamiento con bisulfito de un ácido nucleico no metilado, la secuencia será TTGA y, como consecuencia, no se escindirá. El ácido nucleico digerido y/o no digerido se detecta luego usando un medio de detección conocido en la técnica, tal como, por ejemplo, electroforesis y/o espectrometría de masas. La escisión o no escisión del ácido nucleico es indicativa de cáncer en un sujeto. Claramente, este método puede emplearse en un sistema de lectura positiva o negativa para el diagnóstico de cáncer.

Formato de ensayo de lectura positiva

En una realización, el formato de ensayo de la invención comprende un sistema de lectura positiva en el que el ADN de una muestra que ha sido tratada, por ejemplo, por ejemplo, con bisulfito, se detecta como una señal positiva. Preferentemente, el ADN no hipermetilado de un sujeto control sano o normal no se detecta o solo se detecta débilmente.

En una realización preferida, el aumento de la metilación en una muestra objeto se determina usando un proceso que comprende:

(i) tratar el ácido nucleico con una cantidad de un compuesto que muta selectivamente un residuo de citosina no metilado en condiciones suficientes para inducir mutagénesis produciendo así un ácido nucleico mutado;

(ii) hibridar un ácido nucleico con una sonda o cebador que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria con una secuencia que comprende un residuo de citosina metilado en condiciones tales que se produce la hibridación selectiva con el ácido nucleico no mutado; y

(iii) detectar la hibridación selectiva.

En este contexto, la expresión "hibridación selectiva" significa que la hibridación de una sonda o cebador con el ácido nucleico no mutado ocurre a una frecuencia o velocidad más alta, o tiene una velocidad de reacción máxima más alta, que la hibridación de la misma sonda o cebador con la secuencia mutada correspondiente. Preferentemente, la sonda o cebador no se hibrida con la secuencia no metilada que porta la(s) mutación(es) en las condiciones de reacción utilizadas.

Formato de ensayo basado en la hibridación

En una realización, la hibridación se detecta usando transferencia Southern, inmunotransferencia, transferencia por ranuras u otros medios de hibridación de ácidos nucleicos (Kawai et al., 1994, supra; Gonzalgo et al., 1997, supra). Sujeto a la selección de sonda apropiada, tales formatos de ensayo se describen generalmente en el presente documento y se aplican con los cambios debidos al enfoque de mutagénesis selectiva actualmente descrito.

Preferentemente, se emplea un formato de reacción en cadena de la ligasa para distinguir entre un ácido nucleico mutado y no mutado. La reacción en cadena de la ligasa (descrita en la patente EP 320.308 y en patente de los EE.UU. n.° 4.883.750, utiliza al menos dos sondas de oligonucleótidos que se unen a un ácido nucleico objetivo de tal manera que se yuxtaponen en el ácido nucleico objetivo. En un ensayo de reacción en cadena de la ligasa, el ácido nucleico objetivo se hibrida con una primera sonda que es complementaria con una porción diagnóstica de la secuencia objetivo (la sonda de diagnóstico) por ejemplo, un ácido nucleico que comprende uno o más dinucleótidos CpG metilados, y con una segunda sonda que es complementaria con una secuencia de nucleótidos contigua a la porción diagnóstica (la sonda contigua), en condiciones en las que la sonda de diagnóstico permanece unida sustancialmente solo al ácido nucleico objetivo. Las sondas de diagnóstico y contiguas pueden ser de diferentes longitudes y/o tener diferentes temperaturas de fusión de modo que la rigurosidad de la hibridación se pueda ajustar para permitir su hibridación selectiva con el objetivo, en las que la sonda que tiene la temperatura de fusión más alta se hibrida con una rigurosidad más alta y, después del lavado para eliminar la sonda no unida y/o no unida selectivamente, la otra sonda que tiene la temperatura de fusión más baja se hibrida con una rigurosidad más baja. La sonda de diagnóstico y la sonda contigua se unen covalentemente tal como, por ejemplo, usando ADN ligasa de T4, para producir una sonda objetivo más grande que sea complementaria con la secuencia objetivo, y las sondas que no están ligadas se eliminan modificando la rigurosidad de la hibridación. A este respecto, las sondas que no se han ligado se hibridarán selectivamente en condiciones de hibridación de menor rigurosidad que las sondas que se han ligado. En consecuencia, la rigurosidad de la hibridación puede aumentarse a una rigurosidad que sea al menos tan alta como la rigurosidad utilizada para hibridar la sonda más larga, y preferentemente a una rigurosidad más alta debido a la mayor longitud aportada por la sonda más corta después de la ligadura.

En otro ejemplo, una o ambas sondas se marcan de tal manera que la presencia o ausencia de la secuencia objetivo se puede probar fundiendo el dúplex objetivo-sonda, eluyendo la sonda disociada y probando el marcador(es). Cuando ambas sondas están marcadas, se usan diferentes ligandos para permitir la distinción entre las sondas ligadas y no ligadas, en cuyo caso la presencia de ambos marcadores en la misma fracción de eluato confirma el evento de ligadura. Si el ácido nucleico objetivo se une a una matriz sólida, por ejemplo, en un formato de hibridación Southern, transferencia por ranuras, inmunotransferencia, o formato de ensayo de microchip, se puede determinar directamente la presencia de las sondas de diagnóstico y contiguas.

Las micromatrices específicas de metilación (MSO) también son útiles para diferenciar entre una secuencia mutada y no mutada. Se describe un método adecuado, por ejemplo, en Adorjan et al. Nucl. Acids Res., 30: e21.2002. Las MSO usan ácido nucleico que ha sido tratado con un compuesto que muta selectivamente un residuo de citosina no metilado (por ejemplo, bisulfito) como molde para una reacción de amplificación que amplifica tanto el ácido nucleico mutante como el no mutado. La amplificación se realiza con al menos un cebador que comprende un marcador detectable, tal como, por ejemplo, un fluoróforo, por ejemplo, Cy3 o Cy5.

Para producir una micromatriz para la detección de ácido nucleico mutado, se depositan oligonucleótidos, por ejemplo, en un portaobjetos de vidrio, preferentemente, con un grado de redundancia (por ejemplo, como se describe en Golub et al., Science, 286:531-537, 1999). Preferentemente, para cada dinucleótido CpG analizado se usan dos oligonucleótidos diferentes. Cada oligonucleótido comprende una secuencia N2-16CGN2-16 o N2-16TGN2-16 (en la que N es un número de nucleótidos adyacentes o yuxtapuestos al dinucleótido CpG de interés) que refleja el estado metilado o no metilado de los dinucleótidos CpG.

Los productos de amplificación marcados se hibridan a continuación con los oligonucleótidos de la micromatriz en condiciones que permiten la detección de diferencias de un solo nucleótido. Después del lavado para eliminar el producto de amplificación sin unir, la hibridación se detecta usando, por ejemplo, un escáner de micromatriz. Este método no solo permite la determinación del estado de metilación de un gran número de dinucleótidos CpG, sino que también es semicuantitativo, lo que permite la determinación del grado de metilación en cada dinucleótido CpG analizado. Como puede haber algún grado de heterogeneidad de metilación en una sola muestra, dicha cuantificación puede facilitar el diagnóstico del cáncer.

Formato de ensayo basado en la amplificación

En un ejemplo alternativo, la hibridación se detecta usando un sistema de amplificación. En formatos de PCR específicos de metilación (MSP; Herman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1992), la hibridación se detecta mediante un proceso que comprende amplificar el ADN tratado con bisulfito. En consecuencia, al usar una o más sondas o cebadores que hibridan específicamente con la secuencia no mutada en condiciones de rigurosidad moderada y/o alta, un producto de amplificación solo se produce usando una muestra que comprende un nucleótido metilado. Los ensayos alternativos que proporcionan la amplificación selectiva del componente metilado o no metilado de una mezcla de ADN tratado con bisulfito son proporcionados por Cottrell et al., Nucl. Acids Res. 32: e10, 2003 (PCR HeavyMethyl), Rand et al. Nucl. Acids Res. 33:e127, 2005 (PCR Headloop), Rand et al. Epigenetics 1:94-100, 2006 (PCR de desnaturalización diferencial con bisulfito) y PCT/AU07/000389 (PCR específica de extremos).

Se puede usar cualquier formato de ensayo de amplificación descrito en el presente documento, tal como, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación por círculo rodante (RCA), reacción en cadena de la polimerasa inversa (iPCR), pCr in situ (Singer-Sam et al., 1990, supra), amplificación por desplazamiento de hebra (SDA) o tecnología de sonda cíclica. Se han desarrollado técnicas de PCR para la detección de mutaciones genéticas (Kuppuswamy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1143-1147, 1991) y la cuantificación de expresión específica alélica (Szabo and Mann, Genes Dev. 9: 3097-3108, 1995; y Singer-Sam et al., PCR Methods Appl. 1: 160-163, 1992). Dichas técnicas usan cebadores internos, que hibridan con un molde generado por PCR y terminan inmediatamente en 5' del nucleótido único a analizar. Tal formato se combina fácilmente con la reacción en cadena de la ligasa como se describe en el presente documento. El uso de un formato de ensayo cuantitativo en tiempo real también es útil. Sujeto a la selección de cebadores apropiados, tales formatos de ensayo se describen generalmente en el presente documento y se aplican con los cambios debidos al enfoque de mutagénesis selectiva actualmente descrito.

El análisis de la curva de fusión específica de la metilación (esencialmente como se describe en Worm et al., Clin. Chem., 47:1183-1189, 2001) también se contempla en la presente invención. Este proceso aprovecha la diferencia en la temperatura de fusión en los productos de amplificación producidos usando ácido nucleico metilado o no metilado tratado con bisulfito. En esencia, la amplificación no discriminatoria de una muestra tratada con bisulfito se realiza en presencia de un tinte fluorescente que se une específicamente al ADN bicatenario (por ejemplo, SYBR Green I). Al aumentar la temperatura del producto de amplificación mientras se controla la fluorescencia, se determinan las propiedades de fusión y, por lo tanto, la secuencia del producto de amplificación. Una disminución en la fluorescencia refleja la fusión de al menos un dominio en el producto de amplificación. La temperatura a la que disminuye la fluorescencia es indicativa de la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico amplificado, lo que permite determinar el nucleótido en el sitio de uno o más dinucleótidos CpG. Como la secuencia de los ácidos nucleicos amplificados usando la presente invención.

La presente invención también abarca el uso de formas cuantitativas de PCR en tiempo real, tales como, por ejemplo, TaqMan (Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:7276-7280, 1991; Lee et al., Nucleic Acid Res.

21:3761-3766, 1993) para llevar a cabo esta realización. Por ejemplo, el método MethylLight de Eads et al., Nucl. Acids Res. 28: E32, 2000 usa un ensayo TaqMan modificado para detectar la metilación de un dinucleótido CpG. Esencialmente, este método comprende tratar una muestra de ácido nucleico con bisulfito y amplificar el ácido nucleico que comprende uno o más dinucleótidos CpG que se metilan en una célula neoplásica y no en una muestra de control usando una reacción de amplificación, por ejemplo, PCR. La reacción de amplificación se realiza en presencia de tres oligonucleótidos, un cebador directo e inverso que flanquean la región de interés y una sonda que híbrida entre los dos cebadores con el sitio del uno o más dinucleótidos CpG metilados. La sonda tiene doble marcaje con un indicador fluorescente 5' y un inactivador 3' (o viceversa). Cuando la sonda está intacta, el colorante inactivador absorbe la fluorescencia del indicador debido a su proximidad. Tras la hibridación con el producto de PCR, la muestra se escinde mediante la actividad exonucleasa 5' a 3' de, por ejemplo, la ADN polimerasa Taq. Esta escisión libera al indicador del inactivador, lo que da como resultado una señal de fluorescencia aumentada que puede usarse para estimar el nivel de metilación del molde inicial. Al usar una sonda o cebador que hibrida selectivamente con ácido nucleico no mutado (es decir, ácido nucleico metilado) se determina el nivel de metilación, por ejemplo, usando una curva patrón.

Como alternativa, en lugar de usar una sonda marcada que requiere escisión, se usa una sonda, tal como, por ejemplo, una baliza molecular (véase, por ejemplo, Mhlanga and Malmberg, Methods 25:463-471,2001). Las balizas moleculares son moléculas de ácido nucleico monocatenario con una estructura de tallo y bucle. La estructura del bucle es complementaria a la región que rodea el uno o más dinucleótidos CpG que están metilados en una muestra neoplásica y no en una muestra de control. La estructura del tallo se forma por hibridación de dos "brazos" complementarios entre sí, que están a cada lado de la sonda (bucle). Un resto fluorescente está unido a un brazo y un resto inactivador que suprime cualquier fluorescencia detectable cuando la baliza molecular no está unida a una secuencia objetivo está unida al otro brazo. Tras la unión de la región del bucle a su ácido nucleico objetivo, los brazos se separan y se puede detectar la fluorescencia. Sin embargo, incluso un emparejamiento erróneo de una sola base altera significativamente el nivel de fluorescencia detectado en una muestra. En consecuencia, la presencia o ausencia de una base particular está determinada por el nivel de fluorescencia detectado. Tal ensayo facilita la detección de uno o más sitios no mutados (es decir, nucleótidos metilados) en un ácido nucleico.

Las moléculas de ácido nucleico bloqueado (LNA) o de ácido nucleico proteico (PNA) marcado fluorescentemente son útiles para la detección de diferencias entre nucleótidos (por ejemplo, como se describe en Simeonov and Nikiforov, Nucleic Acids Research, 30(17): 1-5, 2002). Las moléculas de LNA y PNA se unen, con alta afinidad, al ácido nucleico, en particular, al ADN. Los fluoróforos (en particular, la rodomina o la hexaclorofluoresceína) conjugados con la sonda de LNA o PNA fluorescen a un nivel significativamente mayor tras la hibridación de la sonda con el ácido nucleico objetivo. Sin embargo, el nivel de aumento de la fluorescencia no aumenta al mismo nivel cuando se produce un emparejamiento erróneo en un único nucleótido. En consecuencia, el grado de fluorescencia detectado en una muestra es indicativo de la presencia de un emparejamiento erróneo entre la sonda de LNA o PNA y el ácido nucleico objetivo, tal como, en presencia de una citosina mutada en un dinucleótido CpG metilado. Preferentemente, la tecnología de LNA o PNA marcado fluorescentemente se usa para detectar al menos un cambio de una sola base en un ácido nucleico que se ha amplificado previamente usando, por ejemplo, un método de amplificación conocido en la técnica y/o descrito en el presente documento.

Como sabrá el experto en la materia, la tecnología de detección de LNA o PNA es susceptible de una detección de alto rendimiento de uno o más marcadores inmovilizando una sonda de LNA o PNA en un soporte sólido, como se describe en Orum et al., Clin. Chem. 45, 1898-1905, 1999.

Como alternativa, un ensayo en tiempo real, tal como, por ejemplo, el denominado ensayo HeavyMethyl (Cottrell et al., 2003, supra) se utiliza para determinar la presencia o el nivel de metilación del ácido nucleico en una muestra de prueba. Esencialmente, este método usa uno o más bloqueadores de ácido nucleico no extensible (por ejemplo, oligonucleótido) que se unen al ácido nucleico tratado con bisulfito de una manera específica de la metilación (es decir, el bloqueador o bloqueadores se unen específicamente al ADN no mutado en condiciones de rigurosidad moderada a alta). Se realiza una reacción de amplificación usando uno o más cebadores que pueden ser opcionalmente específicos de metilación pero que flanquean el uno o más bloqueadores. En presencia de ácido nucleico no metilado (es decir, ADN no mutado), el bloqueador o bloqueadores se unen y no se produce ningún producto de PCR. Usando un ensayo TaqMan esencialmente como se describe anteriormente, se determina el nivel de metilación de ácido nucleico en una muestra.

Otros métodos basados en amplificación para detectar ácido nucleico metilado después del tratamiento con un compuesto que muta selectivamente un residuo de citosina no metilado incluyen, por ejemplo, análisis de conformación monocatenaria específica de metilación (MS-SSCA) (Bianco et al., Hum. Mutat., 14:289-293, 1999),electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante específica de metilación (MS-DGGE) (Abrams and Stanton, Methods Enzymol., 212:71-74, 1992) y cromatografía líquida de alto rendimiento desnaturalizante específica de metilación (MS-DHPLC) (Deng et al. Chin. J. Cancer Res., 12:171-191, 2000). Cada uno de estos métodos usa diferentes técnicas para detectar diferencias en el ácido nucleico en un producto de amplificación basado en diferencias en la secuencia de nucleótidos y/o la estructura secundaria. Dichos métodos están claramente contemplados por la presente invención.

Al igual que sucede con otros formatos de ensayo basados en la amplificación, el producto de amplificación se analiza utilizando una serie de procedimientos, incluyendo electroforesis en gel, filtración en gel, espectrometría de masas y, en el caso de cebadores marcados, identificando el marcaje en el producto de amplificación. En una realización alternativa, la digestión con enzimas de restricción de productos de PCR amplificados a partir de ADN convertido con bisulfito se realiza esencialmente como se describe por Sadri and Hornsby, Nucl. Acids Res. 24:50585059, 1996; y Xiong and Laird, Nucl. Acids Res. 25:2532-2534, 1997), para analizar el producto formado.

Los métodos de detección de alto rendimiento, tales como, por ejemplo, tiempo de vuelo de ionización/desorción láser asistido por matriz (MALDI-TOF), ionización por electropulverización (ESI), espectrometría de masas (incluyendo espectrometría de masas en tándem, por ejemplo, LC MS/MS), tecnología de biosensores, tecnología evanescente de fibra óptica o tecnología de chip de ADN, también se pueden emplear.

Al igual que con los otros formatos de ensayo descritos en el presente documento que utilizan sistemas de detección de hibridación y/o amplificación, las combinaciones de tales procesos como los descritos anteriormente en el presente documento se contemplan particularmente en los formatos de ensayo basados en mutagénesis selectiva. En un ejemplo, el aumento de metilación se detecta realizando un proceso que comprende:

(i) tratar el ácido nucleico con una cantidad de un compuesto que muta selectivamente un residuo de citosina no metilado dentro de un dinucleótido CpG en condiciones suficientes para inducir mutagénesis produciendo así un ácido nucleico mutado;

(ii) hibridar el ácido nucleico con dos cebadores no solapantes y no complementarios cada uno de los cuales comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria con una secuencia en el ADN que comprende un residuo de citosina metilado en condiciones tales que se produce la hibridación con el ácido nucleico no mutado;

(iii) amplificar el ácido nucleico que interviene en los cebadores hibridados produciendo así un fragmento de ADN que consiste en una secuencia que comprende una secuencia de cebador;

(iv) hibridar el fragmento de ADN amplificado con una sonda que comprende una secuencia de nucleótidos que corresponde o es complementaria de una secuencia que comprende un residuo de citosina metilado en condiciones tales que se produce la hibridación con el ácido nucleico no mutado; y detectar la hibridación.

Ensayos de lectura negativa

En otro ejemplo, el formato del ensayo comprende un sistema de lectura negativa en el que la metilación reducida de ADN de una muestra de control sana/normal se detecta como una señal positiva y preferentemente, el ADN metilado de una muestra neoplásica no se detecta o solo se detecta débilmente.

En una realización preferida, la metilación reducida se determina usando un proceso que comprende:

(i) tratar el ácido nucleico con una cantidad de un compuesto que muta selectivamente un residuo de citosina no metilado dentro de una isla de CpG en condiciones suficientes para inducir mutagénesis produciendo así un ácido nucleico mutado;

(ii) hibridar el ácido nucleico con una sonda o cebador que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria con una secuencia que comprende el residuo de citosina mutado en condiciones tales que se produce la hibridación selectiva con el ácido nucleico mutado; y

(iii) detectar la hibridación selectiva.

En este contexto, la expresión "hibridación selectiva" significa que la hibridación de una sonda o cebador con el ácido nucleico mutado ocurre a una frecuencia o velocidad más alta, o tiene una velocidad de reacción máxima más alta, que la hibridación de la misma sonda o cebador con la secuencia no mutada correspondiente. Preferentemente, la sonda o cebador no se hibrida con la secuencia metilada (o secuencia no mutada) en las condiciones de reacción utilizadas.

Formato de ensayo basado en la hibridación

En una realización la hibridación se detecta usando transferencia Southern, inmunotransferencia, transferencia por ranuras u otros medios de hibridación de ácidos nucleicos (Kawai et al., 1994, supra; Gonzalgo et al., 1997, supra). Sujeto a la selección de sonda apropiada, tales formatos de ensayo se describen generalmente en el presente documento y se aplican con los cambios debidos al enfoque de mutagénesis selectiva actualmente descrito. Preferentemente, se emplea un formato de reacción en cadena de la ligasa para distinguir entre un ácido nucleico no mutado y mutado. A este respecto, los requisitos y las condiciones del ensayo son los descritos anteriormente en el presente documento para ensayos de lectura positiva y se aplican con los cambios debidos al presente formato. Sin embargo, la selección de sondas será diferente. Para los ensayos de lectura negativa, se seleccionan una o más sondas que hibridan selectivamente con la secuencia mutada en lugar de la secuencia no mutada.

Preferentemente, la(s) sonda(s) de la reacción en cadena de la ligasa tienen secuencias 3'-terminal y/o 5'-terminal que comprenden un dinucleótido CpG que no está metilado en una muestra de control sana, pero que está hipermetilado en el cáncer, de modo que la sonda de diagnóstico y las sondas contiguas solo pueden ligarse cuando la citosina del dinucleótido CpG está mutada a timidina, por ejemplo, en el caso de un residuo de citosina no metilado.

Como sabrá el experto en la materia, el método MSO descrito anteriormente se puede utilizar en ensayos de lectura positiva y/o negativa. Esto se debe a que el ensayo descrito detecta tanto secuencias mutadas como no mutadas, lo que facilita la determinación del nivel de metilación. Sin embargo, la invención contempla un ensayo que detecta solo secuencias metiladas o no metiladas.

Formato de ensayo basado en la amplificación

En un ejemplo alternativo, la hibridación se detecta usando un sistema de amplificación usando cualquier formato de ensayo de amplificación como se describe en el presente documento para un ensayo de lectura positiva, aunque usando cebadores (y sondas cuando corresponda) que hibridan selectivamente con un ácido nucleico mutado. Al adaptar el ensayo HeavyMethyl descrito anteriormente a un formato de lectura negativa, los bloqueadores que se unen al ácido nucleico tratado con bisulfito de una manera específica de metilación se unen específicamente al ADN mutado en condiciones de rigurosidad moderada a alta. Se realiza una reacción de amplificación usando uno o más cebadores que pueden ser opcionalmente específicos de metilación (es decir, solo se unen al ácido nucleico mutado) pero que flanquean el uno o más bloqueadores. En presencia de ácido nucleico metilado (es decir, ADN mutado), los bloqueadores se unen y no se produce ningún producto de PCR.

En un ejemplo, la metilación reducida en el sujeto de control normal/sano se detecta realizando un proceso que comprende:

(i) tratar el ácido nucleico con una cantidad de un compuesto que muta selectivamente restos de citosina no metilados en condiciones suficientes para inducir mutagénesis produciendo así un ácido nucleico mutado;

(ii) hibridar el ácido nucleico con dos cebadores no solapantes y no complementarios cada uno de los cuales comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria con una secuencia en el ADN que comprende un residuo de citosina mutado en condiciones tales que se produce la hibridación con el ácido nucleico mutado; (iii) amplificar el ácido nucleico que interviene en los cebadores hibridados produciendo así un fragmento de ADN que consiste en una secuencia que comprende una secuencia de cebador;

(iv) hibridar el fragmento de ADN amplificado con una sonda que comprende una secuencia de nucleótidos que corresponde o es complementaria con una secuencia que comprende un residuo de citosina mutado en condiciones tales que se produce la hibridación con el ácido nucleico mutado; y

(v) detectar la hibridación.

Como sabrá el experto en la materia, un ensayo de lectura negativa preferentemente incluye una muestra de control adecuada para asegurar que el resultado negativo sea debido a un ácido nucleico metilado y no por un fallo de la reacción.

También se divulgan kits para la detección y/o cuantificación de las secuencias de diagnóstico de la invención, o la expresión o metilación de las mismas usando los métodos descritos en el presente documento.

Para los kits para detección de la metilación, los kits de la invención pueden comprender al menos un polinucleótido que hibrida con al menos una de las secuencias de diagnóstico de la invención y al menos un reactivo para la detección de la metilación génica. Los reactivos para la detección de la metilación incluyen, por ejemplo, bisulfito sódico, polinucleótidos diseñados para hibridar con la secuencia que es el producto de una secuencia de biomarcador de la invención si la secuencia de biomarcador no está metilada (por ejemplo, contiene al menos una conversión C^- U), y/o una enzima de restricción sensible a la metilación o dependiente de la metilación. Los kits también pueden incluir secuencias de ADN de control naturales o sintéticas que representan formas metiladas o no metiladas de la secuencia. Los kits pueden proporcionar soportes sólidos en forma de un aparato de ensayo que está adaptado para usar en el ensayo. Los kits pueden comprender además marcadores detectables, opcionalmente unidos a un polinucleótido, por ejemplo, se usa una sonda, en el kit. En los kits también se pueden incluir otros materiales útiles en la realización de los ensayos, incluyendo tubos de ensayo, pipetas de transferencia y similares. Los kits también pueden incluir instrucciones escritas para el uso de uno o más de estos reactivos en cualquiera de los ensayos descritos en el presente documento.

Como se ha detallado anteriormente en el presente documento, la hipermetilación se asocia con silenciamiento transcripcional. En consecuencia, además del aumento en el nivel de metilación de estos genes que proporciona una base sobre la cual detectar la predisposición a o aparición de una neoplasia del intestino grueso, la regulación negativa en el nivel de expresión de estos genes también es diagnósticamente valiosa. De acuerdo con este aspecto de la presente divulgación, la referencia a un "producto de expresión" génica o "expresión de un gen" es una referencia a un producto de transcripción (tal como ARN primario o ARNm) o a un producto de traducción tal como proteína. En este sentido, se pueden evaluar los cambios en el nivel de expresión de un gen mediante la detección de cambios en el nivel del producto de expresión que se produce (es decir, ARN o proteína), los cambios en las proteínas de la cromatina con las que está asociado el gen, por ejemplo, la presencia de histona H3 metilada en la lisina en la posición de aminoácido número 9 o 27 (modificaciones represivas) o cambios en el propio ADN que actúan para regular negativamente la expresión, tales como cambios en la metilación del ADN. Estos genes y sus productos de expresión génica, ya sean transcritos de ARN, cambios en el ADN que actúan para regular negativamente la expresión o proteínas codificadas, se denominan colectivamente "marcadores neoplásicos".

En consecuencia, en el presente documento se describe un método para detectar la aparición o predisposición a la aparición o el seguimiento de una neoplasia de intestino grueso en un individuo, comprendiendo dicho método evaluar el nivel de expresión de una región de ADN seleccionada entre:

(1) chr12:24962958..25102393

(2) chr7:50344378...50472798

(3) chr6:391739..411443; o

(4) chr12:52400748..52409671; y

(5) chr6:163834097..163834982; o

(1) BCAT1 (2) IKZF1 (3) IRF4 (4) GRASP y (5) CAHM

El método se basa en la comparación del nivel de los marcadores neoplásicos de una muestra biológica con los niveles de control de estas regiones de ADN. El "nivel de control" puede ser o un "nivel normal", que es el nivel de marcador expresado por la correspondiente célula o población celular del intestino grueso que no es neoplásica. Como se ha detallado anteriormente en el presente documento, el nivel normal (o "no neoplásico") puede determinarse utilizando tejidos derivados del mismo individuo que es el sujeto de la prueba. Sin embargo, se apreciará que esto puede ser bastante invasivo para el individuo en cuestión y, por lo tanto, es probable que sea más conveniente analizar los resultados de la prueba en relación con un resultado estándar que refleje los resultados individuales o colectivos obtenidos de individuos distintos del paciente en cuestión.

Se divulga más particularmente un método para detectar la aparición o predisposición a la aparición o el seguimiento de una neoplasia de intestino grueso en un individuo, comprendiendo dicho método evaluar el nivel de expresión de uno o más genes o transcritos seleccionados de:

(i) las regiones de ADN, que incluye 2kb en dirección 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas Hg19:

(1) chr12:24962958..25102393; y

(2) chr7:50344378...50472798;

y opcionalmente uno o más de (3) chr6:391739..411443, (4) chr12:52400748..52409671 y (5) chr6:163834097..163834982; o

(ii) la región génica, que incluye 2kb en dirección 5' o:

(1) BCAT1; y

(2) IKZF1;

y opcionalmente uno o más de (3) IRF4, (4) GRASP y (5) CAHM en una muestra biológica de dicho individuo en la que un menor nivel de expresión de al menos una de las regiones de ADN del grupo (i) y/o grupo (ii) respecto a los niveles de control es indicativo de una neoplasia de intestino grueso o una predisposición a la aparición de un estado neoplásico.

Preferentemente, dicho nivel de control es un nivel no neoplásico.

En una realización de este aspecto, el panel de marcadores genéticos que se analiza es:

(1) chr12:24962958..25102393

(2) chr7:50344378...50472798; y

(3) chr6:391739..411443; o

(ii) la región génica, que incluye 2kb en dirección 5' de:

(1) BCAT1 (2) IKZF1 y (3) IRF4.

En otra realización de este aspecto, el panel de marcadores genéticos que se analiza es:

(1) chr12:24962958..25102393

(2) chr7:50344378...50472798; y

(4) chr12:52400748..52409671; o

(ii) la región génica, que incluye 2kb en dirección 5' de:

(1) BCAT1 (2) IKZF1 y (4) GRASP.

En otra realización más de este aspecto, el panel de marcadores genéticos que se analiza es:

(1) chr12:24962958..25102393

(2) chr7:50344378...50472798; y

(5) chr6:163834097..163834982; o

(ii) la región génica, que incluye 2kb en dirección 5' de:

(1) BCAT1 (2) IKZF1 y (5) CAHM

En otra realización adicional más de este aspecto, el panel de marcadores genéticos que se analiza es:

(1) chr12:24962958..25102393

(2) chr7:50344378...50472798

(3) chr6:391739..411443; y

(4) chr12:52400748..52409671; o

(ii) la región génica, que incluye 2kb en dirección 5' de:

(1) BCAT1 (2) IKZF1 (3) IRF4 y (4) GRASP.

(1) chr12:24962958..25102393

(2) chr7:50344378...50472798

(3) chr6:391739..411443; y

(5) chr6:163834097..163834982; o

(ii) la región génica, que incluye 2kb en dirección 5' de:

(1) BCAT1 (2) IKZF1 (3) IRF4 y (5) CAHM.

En una realización adicional de este aspecto, el panel de marcadores genéticos que se analiza es:

(1) chr12:24962958..25102393

(2) chr7:50344378...50472798

(4) chr12:52400748..52409671; y

(5) chr6:163834097..163834982; o

(ii) la región génica, que incluye 2kb en dirección 5' de una cualquiera o más de:

(1) BCAT1 (2) IKZF1 (4) GRASP y (5) CAHM.

(1) chr12:24962958..25102393

(2) chr7:50344378...50472798

(3) chr6:391739..411443; o

(4) chr12:52400748..52409671; y

(5) chr6:163834097..163834982; o

(1) BCAT1 (2) IKZF1 (3) IRF4 (4) GRASP y (5) CAHM.

Como se ha detallado anteriormente en el presente documento, la presente invención está diseñada para detectar una célula o población celular neoplásica, que se localiza en el intestino grueso. En consecuencia, la referencia a "célula o población celular" debe entenderse como una referencia a una célula individual o un grupo de células. Dicho grupo de células puede ser una población difusa de células, una suspensión celular, una población encapsulada de células o una población de células que adoptan la forma de tejido.

La referencia a "expresión" debe entenderse como una referencia a la transcripción y/o traducción de una molécula de ácido nucleico. La referencia a "ARN" debe entenderse que abarca la referencia a cualquier forma de ARN, tal como ARN primario o ARNm o ARN no traducido (por ejemplo, miARN, etc.). La modulación de la transcripción génica que conduce a una síntesis de ARN aumentada o disminuida también puede correlacionarse con la traducción de algunos de estos transcritos de ARN (como el ARNm) para producir un producto proteico. En consecuencia, la presente divulgación también abarca la metodología de detección que se dirige a la detección de niveles o patrones modulados de los productos proteicos marcadores neoplásicos como un indicador del estado neoplásico de una célula o población celular. Aunque un método es detectar transcritos de ARNm y/o el producto proteico correspondiente, debe entenderse que la presente divulgación no está limitada en este sentido y abarca la detección de cualquier otra forma de producto de expresión de marcador neoplásico como, por ejemplo, un transcrito primario de ARN.

En términos de detección de la regulación negativa de la expresión de un marcador, los expertos en la materia también sabrán que los cambios que son detectables a nivel de ADN son indicativos de cambios en la actividad de la expresión génica y, por lo tanto, cambios en los niveles del producto de expresión. Dichos cambios incluyen aunque no de forma limitativa, cambios en la metilación del ADN. En consecuencia, la referencia en el presente documento a "detección del nivel de expresión" y la comparación de estos "niveles de expresión" con los "niveles de expresión" control debe entenderse como una referencia para evaluar los factores de ADN que están relacionados con la transcripción, tales como los patrones de metilación del gen/ADN. Estos se han descrito, en parte, anteriormente con detalle en el presente documento.

Los expertos en la materia también sabrán que los cambios en la estructura de la cromatina son indicativos de cambios en la expresión génica. El silenciamiento de la expresión génica a menudo se asocia con la modificación de las proteínas de la cromatina, siendo la metilación de lisinas en cualquiera o en ambas posiciones 9 y 27 de la histona H3 ejemplos bien estudiados, mientras que la cromatina activa está marcada por la acetilación de la lisina 9 de la histona H3. Por lo tanto, la asociación de secuencias de genes con cromatina que porta modificaciones represivas o activas puede usarse para hacer una evaluación del nivel de expresión de un gen.

La referencia a "molécula de ácido nucleico" debe entenderse como una referencia tanto a las moléculas de ácido desoxirribonucleico como a las moléculas de ácido ribonucleico y fragmentos de las mismas. Por lo tanto, la presente divulgación abarca tanto a la detección directa de los niveles de ARNm en una muestra biológica como la detección del ADNc complementario que se ha transcrito inversamente de una población de ARNm de interés. Está dentro de la habilidad de los expertos en la materia diseñar una metodología dirigida a la detección de ADN o ARN. Como se ha detallado anteriormente, el método de la presente divulgación también abarca la detección del producto proteico traducido del ARNm en cuestión o del propio ADN genómico.

En una realización preferida, el nivel de expresión génica se mide por referencia a genes que codifican un producto proteico y, más particularmente, dicho nivel de expresión se mide a nivel de proteína.

En otra realización particularmente preferida, dicha expresión génica se evalúa mediante la asociación de ADN con proteínas de la cromatina que llevan modificaciones represivas, por ejemplo, metilación de las lisinas 9 o 27 de la histona H3.

Debe entenderse que la presente divulgación abarca métodos de detección basados en la identificación de proteínas y/o moléculas de ácido nucleico en una o más muestras biológicas. Esto puede ser de particular importancia en la medida en que algunos de los marcadores neoplásicos de interés pueden corresponder a genes o fragmentos de genes que no codifican un producto proteico. En consecuencia, en la medida en que esto ocurra, no sería posible analizar una proteína y el marcador en cuestión debería evaluarse en función de los perfiles de expresión de la transcripción o los cambios en el ADN genómico.

Debe entenderse que el término "proteína" abarca péptidos, polipéptidos y proteínas (incluidos fragmentos de proteínas). La proteína puede estar glicosilada o no glicosilada y/o puede contener una serie de moléculas fusionadas, enlazadas, unidas o de otro modo asociadas con la proteína, tal como aminoácidos, lípidos, hidratos de carbono u otros péptidos, polipéptidos o proteínas. La referencia en el presente documento a una "proteína" incluye una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos así como una proteína asociada con otras moléculas tales como aminoácidos, lípidos, hidratos de carbono u otros péptidos, polipéptidos o proteínas.

Las proteínas codificadas por los marcadores neoplásicos de la presente divulgación pueden estar en forma multimérica, lo que significa que dos o más moléculas están asociadas entre sí. Cuando las mismas moléculas de proteína están asociadas entre sí, el complejo es un homomultímero. Un ejemplo de un homomultímero es un homodímero. Cuando al menos una proteína marcadora está asociada con al menos una proteína no marcadora, entonces el complejo es un heteromultímero tal como un heterodímero.

La referencia a un "fragmento" debe entenderse como una referencia a una porción de la molécula de ácido nucleico o proteína en cuestión. Esto es particularmente relevante con respecto a la detección de niveles de ARN modulados en muestras de heces, ya que es probable que el ARN en cuestión se haya degradado o fragmentado de otro modo debido al entorno del intestino. Por lo tanto, en realidad se pueden detectar fragmentos de la molécula de ARN en cuestión, cuyos fragmentos se identifican en virtud del uso de una sonda específica adecuada.

Aunque el método preferido es detectar el producto de expresión o los cambios en el ADN de los marcadores neoplásicos con el fin de diagnosticar el desarrollo de la neoplasia o la predisposición a la misma, la detección de cambios inversos en los niveles de dichos marcadores puede ser deseable en ciertas circunstancias, por ejemplo, para controlar la efectividad del tratamiento terapéutico o profiláctico dirigido a modular una afección neoplásica, como el desarrollo de un adenoma o adenocarcinoma. Por ejemplo, cuando la expresión reducida de los marcadores en cuestión indica que un individuo ha desarrollado una afección caracterizada por el desarrollo de adenoma o adenocarcinoma, por ejemplo, la detección de un aumento en los niveles de estos marcadores posteriormente al inicio de un régimen terapéutico puede utilizarse para indicar reversión u otra forma de mejora de la afección del individuo en cuestión. El método de la presente divulgación es útil, por lo tanto, como una prueba única o como seguimiento continuo de aquellos individuos que se cree que corren el riesgo de desarrollar neoplasia o como seguimiento de la efectividad de los regímenes de tratamiento terapéuticos o profilácticos dirigidos a inhibir o ralentizar de otro modo el desarrollo de la neoplasia.

Los medios para evaluar los marcadores de neoplasia expresados en cuestión en una muestra biológica se pueden lograr mediante cualquier método adecuado, que sería bien conocido por los expertos en la materia. Con este fin, se apreciaría que en la medida en que se esté examinando una población celular homogénea (como una biopsia tumoral o una población celular que se ha enriquecido a partir de una población inicial heterogénea) o un corte de tejido, se puede utilizar una amplia variedad de técnicas, tal como hibridación in situ, evaluación de perfiles de expresión mediante micromatrices, inmunoensayos y similares (descritos con más detalle más adelante en el presente documento) para detectar la ausencia de o la regulación negativa del nivel de expresión de uno o más marcadores de interés. Sin embargo, en la medida en que se esté examinando una población celular heterogénea o un fluido corporal en el que se encuentran poblaciones heterogéneas de células, como una muestra de sangre, la ausencia o reducción en el nivel de expresión de un marcador particular puede ser indetectable debido a la expresión inherente del marcador por las células no neoplásicas que están presentes en la muestra. Es decir, una disminución en el nivel de expresión de un subgrupo de células puede no ser detectable. En esta situación, un mecanismo más apropiado para detectar una reducción en una subpoblación neoplásica de los niveles de expresión de uno o más marcadores de la presente divulgación es a través de medios indirectos, tales como la detección de cambios epigenéticos.

Los métodos para detectar cambios en los niveles de expresión génica (además de los análisis de metilación descritos anteriormente en detalle), particularmente cuando la muestra biológica del sujeto no está contaminada con un gran número de células no neoplásicas, incluyen, pero sin limitación:

(i) detección in vivo.

La imagen molecular se puede usar después de la administración de sondas o reactivos de imagen capaces de revelar la expresión alterada de los marcadores en los tejidos intestinales.

Molecular imaging (Moore et al., BBA, 1402:239-249, 1988; Weissleder et al., Nature Medicine 6:351-355, 2000) es la imagen in vivo de la expresión molecular que se correlaciona con las características macroestructurales visualizadas actualmente usando técnicas de diagnóstico por imagen "clásicas" como rayos X, tomografía computarizada (CT), MRI, tomografía por emisión de positrones (PET) o endoscopia.

(ii) Detección de la regulación negativa de la expresión de ARN en las células por hibridación in situ fluorescente (FISH), o en extractos de las células mediante tecnologías como la Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (QRTPCR) o clasificación por citometría de flujo de productos de RT-PCR competitivos (Wedemeyer et al., Clinical Chemistry 48:91398-1405, 2002).

(iii) Evaluación de los perfiles de expresión de ARN, por ejemplo por tecnología de matrices (Alon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 96:6745-6750, junio de 1999).

Una "micromatriz" es una matriz lineal o multidimensional de regiones preferentemente discretas, teniendo cada una un área definida, formada sobre la superficie de un soporte sólido. La densidad de las regiones discretas de una micromatriz se determina por el número total de polinucleótidos objetivo a detectar sobre la superficie de un único soporte en fase sólida. Como se usa en el presente documento, una micromatriz de ADN es una matriz de sondas de oligonucleótidos colocadas en un chip u otras superficies utilizadas para amplificar o clonar polinucleótidos objetivo. Como la posición de cada grupo particular de sondas en la matriz es conocida, las identidades de los polinucleótidos objetivo se pueden determinar dependiendo de su unión a una posición determinada de la micromatriz.

La tecnología de micromatrices de ADN permite realizar un ensayo a gran escala de una pluralidad de moléculas de ácido nucleico objetivo en un único soporte de fase sólida. La patente de los EE.UU. n.° 5.837.832, (Chee et al.) y las solicitudes de patentes relacionadas describen la inmovilización de una matriz de sondas de oligonucleótidos para la hibridación y detección de secuencias específicas de ácido nucleico en una muestra. Los polinucleótidos objetivo de interés aislados de un tejido de interés se hibridan con el chip de ADN y las secuencias específicas se detectan en función de la preferencia de los polinucleótidos objetivo y el grado de hibridación en ubicaciones de sonda discretas. Un uso importante de las matrices es en el análisis de la expresión génica diferencial, donde se compara el perfil de expresión de genes en diferentes células o tejidos, a menudo un tejido de interés y un tejido de control, y se identifica cualquier diferencia en la expresión génica entre los tejidos respectivos. Dicha información es útil para la identificación de los tipos de genes expresados en un tipo de tejido particular y el diagnóstico de afecciones en función del perfil de expresión.

(iv) Medición de los niveles de proteína marcadora neoplásica alterada en extractos celulares, por ejemplo, mediante inmunoensayo.

El análisis del producto de expresión del marcador neoplásico proteico en una muestra biológica se puede realizar por cualquiera de varios métodos adecuados que son bien conocidos por los expertos en la materia. Los ejemplos de métodos adecuados incluyen, aunque no de forma limitativa, la detección de anticuerpos de cortes de tejido, muestras de biopsia o muestras de fluidos corporales. En la medida en que se utilizan métodos de diagnóstico basados en anticuerpos, la presencia de la proteína marcadora puede determinarse de varias maneras, como mediante procedimientos de transferencia Western, ELISA o citometría de flujo. Estos, por supuesto, incluyen ensayos de un solo sitio y de dos sitios o "sándwich" de los tipos no competitivos, así como en los ensayos de unión competitiva tradicionales. Estos ensayos también incluyen la unión directa de un anticuerpo marcado a un objetivo.

(v) Determinación de la expresión alterada de marcadores neoplásicos de proteínas en la superficie celular, por ejemplo por inmunohistoquímica.

(vi) Determinación de la expresión de proteínas alteradas en función de cualquier prueba funcional, prueba enzimática o prueba inmunológica adecuadas además de las detalladas en los puntos (iv) y (v) anteriores.

Un experto en la materia podría determinar fácilmente, como parte del procedimiento de rutina, la idoneidad de aplicar un método dado a un tipo particular de muestra biológica.

Un aspecto relacionado de la presente divulgación proporciona una matriz molecular, matriz que comprende una pluralidad de:

(i) moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos que corresponde a dos cualquiera o más del ADN marcador neoplásico descrito anteriormente en el presente documento o una secuencia que exhibe al menos un 80 % de identidad con la misma o un derivado funcional, fragmento, variante u homólogo de dicha molécula de ácido nucleico; o

(ii) moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos capaz de hibridarse con una cualquiera o más de las secuencias de (i) en condiciones de rigurosidad media o un derivado funcional, fragmento, variante u homólogo de dichas moléculas de ácido nucleico; o

(iii) sondas de ácido nucleico u oligonucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos capaz de hibridarse con dos cualquiera o más de las secuencias de (i) en condiciones de rigurosidad media o un derivado funcional, fragmento, variante u homólogo de dicha molécula de ácido nucleico; o

(iv) sondas capaces de unirse a dos cualquiera o más de las proteínas codificadas por las moléculas de ácido nucleico de (i) o un derivado, fragmento u, homólogo de las mismas

en donde el nivel de expresión de dichos genes marcadores de (i)-(iii) o proteínas de (iv) es indicativo del estado neoplásico de una célula o subpoblación celular derivada del intestino grueso.

Preferentemente, dicho porcentaje de identidad es al menos 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %.

"Hibridación" se refiere al proceso mediante el cual una cadena de ácido nucleico se une con una cadena complementaria mediante emparejamiento de bases. Las reacciones de hibridación pueden ser sensibles y selectivas para que se pueda identificar una secuencia particular de interés incluso en muestras en las que está presente a bajas concentraciones. Las condiciones rigurosas se pueden definir, por ejemplo, por las concentraciones de sal o formamida en las soluciones de prehibridación e hibridación, o por la temperatura de hibridación, y son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, la rigurosidad se puede aumentar reduciendo la concentración de sal, aumentando la concentración de formamida o aumentando la temperatura de hibridación, alterando el tiempo de hibridación, como se describe con detalle, más adelante. En aspectos alternativos, los ácidos nucleicos de la divulgación se definen por su capacidad para hibridar en diversas condiciones rigurosas (por ejemplo, alta, media y baja), como se expone en el presente documento.

La referencia en el presente documento a una rigurosidad baja incluye y abarca formamida desde al menos aproximadamente 0 hasta a al menos aproximadamente 15% v/v y sal para hibridación desde al menos aproximadamente 1 M hasta al menos aproximadamente 2 M y sal para las condiciones de lavado desde al menos aproximadamente 1 M hasta a al menos aproximadamente 2 M. Generalmente, la baja rigurosidad es desde aproximadamente 25-30 °C hasta aproximadamente 42 °C. La temperatura puede alterarse y usarse temperaturas más altas para reemplazar la formamida y/o para proporcionar condiciones de restricción alternativas. Se pueden aplicar condiciones de rigurosidad alternativas cuando sea necesario, tales como rigurosidad media, que incluye y abarca formamida desde al menos aproximadamente 16 % v/v hasta al menos aproximadamente 30 % v/v y sal para hibridación desde al menos aproximadamente 0,5 M hasta al menos aproximadamente 0,9 M y sal para las condiciones de lavado desde al menos aproximadamente 0,5 M hasta al menos aproximadamente 0,9 M, o rigurosidad alta, que incluye y abarca formamida desde al menos aproximadamente 31 % v/v hasta al menos aproximadamente 50 % v/v y sal para hibridación desde al menos aproximadamente 0,01 M hasta al menos aproximadamente 0,15 M y sal para las condiciones de lavado desde al menos aproximadamente 0,01 M hasta al menos aproximadamente 0,15 M. En general, el lavado se lleva a cabo a una Tm = 69,3 0,41 (G+C)% (Marmur and Doty, J. Mol. Biol. 5:109, 1962). Sin embargo, la Tm de un dúplex de ADN disminuye en 1 °C con cada incremento de 1 % en el número de pares de bases con emparejamiento erróneo (Bonner and Laskey, Eur. J. Biochem. 46:83, 1974). La formamida es opcional en estas condiciones de hibridación. En consecuencia, los niveles de rigurosidad particularmente preferidos se definen como sigue: rigurosidad baja es 6 x tampón SSC, SDS 0,1 % p/v a 25-42 °C; rigurosidad moderada es 2 x tampón SSC, SDS 0,1 % p/v a una temperatura dentro del intervalo de 20 °C a 65 °C; rigurosidad alta es 0,1 x tampón SSC, SDS 0,1 % p/v a una temperatura de al menos 65 °C.

Cuando los ácidos nucleicos de la divulgación se definen por su capacidad para hibridar en condiciones de rigurosidad alta, estas condiciones comprenden aproximadamente formamida 50 % a una temperatura desde aproximadamente 37 °C hasta 42 °C. En un aspecto, los ácidos nucleicos de la divulgación se definen por su capacidad para hibridar en condiciones de rigurosidad reducidas que comprenden condiciones desde aproximadamente formamida 35 % hasta 25 % a una temperatura desde aproximadamente 30 °C hasta 35 °C. Como alternativa, los ácidos nucleicos de la divulgación se definen por su capacidad para hibridar en condiciones de rigurosidad alta a 42 °C en formamida 50 %, 5X SSPE, SDS 0,3 % y una secuencia repetitiva de bloqueo del ácido nucleico, tal como cot-1 o ADN de esperma de salmón (por ejemplo, 200 n/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado). En un aspecto, los ácidos nucleicos de la divulgación se definen por su capacidad para hibridar en condiciones de rigurosidad reducidas que comprenden formamida 35 % a una temperatura reducida de 35 °C.

Preferentemente, las sondas en cuestión están diseñadas para unirse al ácido nucleico o proteína a la que se dirigen con un nivel de especificidad que minimiza la incidencia de reactividad no específica. Sin embargo, se apreciará que puede no ser posible eliminar toda la reactividad cruzada potencial o la reactividad no específica, siendo esto una limitación inherente de cualquier sistema basado en sonda.

En términos de las sondas que se utilizan para detectar las proteínas en cuestión, estas pueden adoptar cualquier forma adecuada, incluidos anticuerpos y aptámeros.

Una biblioteca o conjunto de sondas de ácidos nucleicos o proteínas proporciona una información rica y muy valiosa. Además, dos o más matrices o perfiles (información obtenida del uso de una matriz) de tales secuencias son herramientas útiles para comparar un conjunto de resultados de prueba con una referencia, como otra muestra o calibrador almacenado. Al usar una matriz, las sondas individuales normalmente se inmovilizan en ubicaciones separadas y se les permite reaccionar en reacciones de unión. Los cebadores asociados con conjuntos ensamblados de marcadores son útiles para preparar bibliotecas de secuencias o para detectar directamente marcadores de otras muestras biológicas.

Una biblioteca (o matriz, cuando se refiere a ácidos nucleicos separados físicamente correspondientes a al menos algunas secuencias en una biblioteca) de marcadores genéticos presenta propiedades muy deseables. Estas propiedades están asociadas con condiciones específicas y pueden caracterizarse como perfiles reguladores. Un perfil, como se denomina aquí, se refiere a un conjunto de miembros que proporciona información de diagnóstico del tejido del que se derivaron originalmente los marcadores. Un perfil en muchos casos comprende una serie de puntos en una matriz hecha de secuencias depositadas.

Generalmente se prepara un perfil característico del paciente mediante el uso de una matriz. Un perfil de matriz se puede comparar con uno o más de otros perfiles de matriz u otros perfiles de referencia. Los resultados comparativos pueden proporcionar abundante información sobre el estado de la enfermedad, estado de desarrollo, receptividad a la terapia y otra información sobre el paciente.

Otro aspecto de la presente invención proporciona un kit de diagnóstico para analizar muestras biológicas que comprende uno o más agentes para detectar uno o más marcadores y reactivos neoplásicos útiles para facilitar la detección por dichos agentes. También se pueden incluir medios adicionales, por ejemplo, para recibir una muestra biológica. El agente puede ser cualquier molécula de detección adecuada.

La presente invención se describe además en referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLO 1

CAHM: Adenocarcinoma colorrectal hipermetilado

Resultados singleplex:

• 74 normales: 0,8 pg hipermetilado/ml de plasma (IC, 95 %: 0,2; 1,4)

• 73 adenomas: 9,1 pg hipermetilado/ml de plasma (IC, 95 %: -8; 27)

• 73 cánceres: 1788 pg hipermetilado/ml de plasma (IC, 95 %: 231; 3344).

El ensayo CAHM (umbral de corte de 3pg/ml de plasma) tiene una sensibilidad del 55 % para el cáncer colorrectal con una especificidad del 93 % (Figura 1).

GRASP: Receptor general para la proteína de soporte asociada a fosfoinosítidos 1.

Resultados singleplex:

• 34 normales: 1,3 pg hipermetilado/ml de plasma (IC, 95 %: 0,2; 2,5)

• 33 adenomas: 0,1 pg hipermetilado/ml de plasma (IC, 95 %: -0,1; 0,4)

• 33 cánceres: 670,8 pg hipermetilado/ml de plasma (IC, 95 %: -470,7; 1812)

El ensayo GRASP tiene una sensibilidad del 58 % para el cáncer colorrectal con una especificidad del 100 % usando un umbral de corte de 20pg metilado/ml de plasma (Figura 2).

IRF4: Factor regulador de interferón 4

Resultados singleplex:

• 24 normales: 6 pg hipermetilado/ml de plasma (IC, 95 %: 2,9; 9,0)

• 23 adenomas: 3,7 pg hipermetilado/ml de plasma (IC, 95 %: -0,4; 8,0)

• 33 cánceres: 5340 pg hipermetilado/ml de plasma (IC, 95 %: -5369; 16049)

El ensayo IRF4 tiene una sensibilidad del 57 % para el cáncer colorrectal con una especificidad del 96 % usando un umbral de corte de 20pg metilado/ml de plasma (Figura 3).

BCAT1: Aminoácido transaminasa de cadena ramificada 1, citosólica

Resumen de los resultados singleplex

• 14 normales: 0 pg hipermetilado/ml de plasma (IC, 95 %: na)

• 13 adenomas: 0,4 pg hipermetilado/ml de plasma (IC, 95 %: -0,4; 1,3)

• 13 cánceres: 4088 pg hipermetilado/ml de plasma (IC, 95 %: -4459; 10539)

El ensayo BCAT1 tiene una sensibilidad del 62 % para el cáncer colorrectal con una especificidad del 100 % usando un umbral de corte de 3pg metilado/ml de plasma (Figura 4).

IKZF1: Dedo de cinc de la familia IKAROS 1 Resumen de los resultados singleplex

• 14 normales: 0 pg hipermetilado/ml de plasma (IC, 95 %: na)

• 13 adenomas: 0 pg hipermetilado/ml de plasma (IC, 95 %: na)

• 13 cánceres: 113 pg hipermetilado/ml de plasma (IC, 95 %: -43; 270)

El ensayo IKZF1 tiene una sensibilidad del 54 % para el cáncer colorrectal con una especificidad del 100 % usando un umbral de corte de 3pg metilado/ml de plasma (Figura 4).

Los niveles de metilación de los cinco genes se midieron en los mismos 14 normales, 13 adenomas y 13 cánceres. La siguiente tabla demuestra la mejora en la utilidad clínica cuando se mide la metilación en DOS de los genes:

La combinación de los niveles de metilación medidos en cualquiera de los tres de los cinco genes dio como resultado:

77 % de sensibilidad y 100 % de

CAHM6pg/ml - GRASP20pg/ml - IRF420pg/ml: especificidad

77 % de sensibilidad y 100 % de

CAHM6pg/ml - GRASP20pg/ml - BCAT3pg/ml: especificidad

77 % de sensibilidad y 100 % de

CAHM6pg/ml - GRASP20pg/ml - IKZF13pg/ml: especificidad

77 % de sensibilidad y 100 % de

CAHM6pg/ml - IKZF13pg/ml - BCAT3pg/ml: especificidad

GRASP20pg/ml - IKZF13pg/ml - BCAT3pg/ml: 85 % de sensibilidad 100 % de especificidad

La combinación de los niveles de metilación de los cinco genes da como resultado un 92 % de sensibilidad y un 100 % de especificidad: Secuencias de amplicones para GRASP dirigidos, CAHM, IRF4, IKZF1 y BCAT1

La secuencia de ADN de tipo silvestre del amplicón por MSP para CAHM está localizada en el cromosoma 6, hebra plus; 163,834,393 ^ 163,834,455 (Hgl9)

GAÁGGAAGCA TTTCGAGCAC GACTGACGCT CCCCTTATTA TTTGCTAAGC

CGCTGCGCTC GGG

La secuencia de ADN de tipo silvestre del amplicón por MSP para GRASP está localizada en el cromosoma 12, hebra plus; 52,400,886 ^ 52,400,973 (Hgl9)

cggaagtcgc gcccgccgct ccggtcccga ccccgggacc ccctgccgca gccgccaccc ctgggccccc

agcggacgag ctgtacgc

La secuencia de ADN de tipo silvestre del amplicón por MSP para IKZF1 está localizada en el cromosoma 7, hebra plus; 50,343,867 ^ 50,343,961 (Hg19)

gacgacgcac cctctccgtg tcccgctctg cgcccttctg cgcgccccgc tccctgtacc ggagcagcga tccgggaggc

ggccgagagg tg

La secuencia de ADN de tipo silvestre del amplicón por MSP para BCAT1 está localizada en el cromosoma 12, hebra minus; 25,101,992 ^ 25,102,093 (Hg19)

gtcttcctgc tgatgcaatc CGctaggtcg cgagtctccg ccgcgagagg gccggtctgc aatccagccc gccacgtgta

ctcgccgccg cctcg

La secuencia de ADN de tipo silvestre del amplicón por MSP para IRF4 está localizada en el cromosoma 6, hebra minus; 392,036 ^ 392,145 (Hg19)

tgggtgcctt ggacggcccc gcctcagcca ctcctggggc cccgacagtc cggttagctc atcccgtcca gcttgtggcg

accccgtcgc aggagcgcgg agggcaggcg

Protocolos de PCR usados para medir los niveles de metilación en GRASP, CAHM, IRF4, IKZF1 y BCAT1 en muestras de plasma

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para detectar la aparición o predisposición a la aparición o el seguimiento de una neoplasia de intestino grueso en un individuo, comprendiendo dicho método evaluar el estado de mutilación de:

la región génica, que incluye 2kb en dirección 5' de:

(1) BCAT1;

(2) IKZF1;

(3) IRF4;

(4) GRASP; y

(5) CAHM;

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1 en el que dicho método comprende evaluar el estado de metilación de:

la región génica, que incluye 2kb en dirección 5' de:

(1) BCAT1; y

(2) IKZF1;

y opcionalmente uno o más de (3) IRF4, (4) GRASP y (5) CAHM;

3. El método de acuerdo con la reivindicación 2 en el que dicho método comprende evaluar el estado de metilación de:

(a) la región génica, que incluye 2kb en dirección 5' de:

(1) BCAT1, (2) IKZF1 y (3) IRF4;

(b) la región génica, que incluye 2kb en dirección 5' de:

(1) BCAT1, (2) IKZF1; y (4) GRASP;

(c) la región génica, que incluye 2kb en dirección 5' de:

(1) BCAT1, (2) IKZF1 y (5) CAHM;

(d) la región génica, que incluye 2kb en dirección 5' de:

(1) BCAT1, (2) IKZF1, (3) IRF4 y (4) GRASP;

(e) la región génica, que incluye 2kb en dirección 5' de:

(1) BCAT1, (2) IKZF1, (3) IRF4 y (5) CAHM;

(f) la región génica, que incluye 2kb en dirección 5' de:

(1) BCAT1, (2) IKZF1, (4) GRASP y (5) CAHM; y

(g) la región génica, que incluye 2kb en dirección 5' de:

(1) BCAT1, (2) IKZF1, (3) IRF4, (4) GRASP y (5) CAHM.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 1 en el que dicho método comprende evaluar el estado de metilación de:

(a) la región génica, que incluye 2kb en dirección 5' de:

(1) BCAT1; y (5) CAHM;

y opcionalmente uno o más de (2) IKZF1, (3) IRF4 y (4) GRASP;

(b) la región génica, que incluye 2kb en dirección 5' de:

(1) BCAT1; y

(3) IRF4;

y opcionalmente uno o más de (2) IKZF1, (4) GRASP y (5) CAHM;

(c) la región génica, que incluye 2kb en dirección 5' de:

(1) BCAT1; y

(4) GRASP;

y opcionalmente uno o más de (2) IKZF1, (3) IRF4 y (5) CAHM;

5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que una cualquiera de una de dichas regiones de ADN presenta un mayor nivel de metilación.

6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dos cualquiera o más de dichas regiones de ADN presenta un mayor nivel de metilación.

7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en el que dicha neoplasia es un adenoma o un adenocarcinoma.

8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en el que dicho nivel de control es un nivel no neoplásico.

9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicha neoplasia es una neoplasia colorrectal.

10. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en el que dicha muestra de fluido biológico es una muestra fecal, lavado con enema, resección quirúrgica, tejido para biopsia o muestra de sangre.

11. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en el que dicha metilación se evalúa en una o más subregiones cromosómicas seleccionadas de:

(1) subregiones BCAT1 chr12:25101992-25102093 (SEQ ID NO:1 o la correspondiente hebra minus) y chr12:25101909-25101995 (SEQ ID NO:2 o la correspondiente hebra minus);

(2) subregiones IKZF1: chr7:50343867-50343961 (SEQ ID NO:3 o la correspondiente hebra minus) y chr7:50343804-50343895 (SEQ ID NO:4 o la correspondiente hebra minus);

(3) subregiones IRF4 chr6:392036-392145 (SEQ ID NO:5 o la correspondiente hebra minus);

(4) subregiones GRASP: chr12:52399672-52399922, chr12:52400821-52401051 (SEQ ID NO:6 o la correspondiente hebra minus), chr12:52401407-52401664 (SEQ ID NO:7 o la correspondiente hebra minus) chr12:52400866-52400973 y Chr12:52401107-52401664; y

12. El método de acuerdo con la reivindicación 11 en el que dicha subregión se selecciona de SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.4, SEQ ID NO.5, SEQ ID NO.6, SEQ ID NO.7 o SEQ ID NO.8 o las correspondientes hebras minus.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, comprendiendo dicho método evaluar la metilación de uno o más residuos de citosina seleccionados de:

(GRASP)

chr12:52399713 chr12:52399731 chr12:52399749 chr12:52399783 chr12:52399796 chr12:52399808 chr12:52399823 chr12:52399835 chr12:52399891

chr12:52400847 chr12:52400850 chr12:52400859 chr12:52400866 chr12:52400869 chr12:52400873 chr12:52400881 chr12:52400886 chr12:52400893 chr12:52400895 chr12:52400899 chr1:52400902 chr12:52400907 chr12:52400913 chr12:52400919 chr12:52400932 chr12:52400938 chr12:52400958 chr12:52400962 chr12:52400971 chr12:52400973 chr12:52400976 chr12:52400998 chr12:52401008 chr12:52401010 chr12:52401012 chr12:52401016 chr12:52401019 chr12:52401025 chr12:52401041 chr12:52401044 chr12:52401053

chr12:52401060 chr12:52401064 chr12:52401092 chr12:52401118

chr12:52401438 chr12:52401448 chr12:52401460 chr12:52401465 chr12:52401474 chr12:52401477 chr12:52401479 chr12:52401483 chr12:52401504 chr12:52401514 chr12:52401523 chr12:52401540 chr12:52401553 chr12:52401576 chr12:52401588 chr12:52401595 chr12:52401599 chr12:52401604 chr12:52401606 chr12:52401634 chr12:52401640 chr12:52401644 chr12:52401659

(CAHM)

chr6:163834330 chr6:163834332 chr6:163834357

chr6:163834373 chr6:163834384 chr6:163834390

chr6:163834392 chr6:163834406 chr6:163834412

chr6:163834419 chr6:163834443 chr6:163834448

chr6:163834452 chr6:163834464 chr6:163834483

chr6:163834653 chr6:163834660 chr6:163834672

chr6:163834675 chr6:163834678 chr6:163834681

chr6:163834815 chr6:163834824 chr6:163834835

chr6:163834840 chr6:163834853 chr6:163834855

chr6:163834858 chr6:163834863 chr6:163834869

chr6:163834872

(IKZF1)

chr7:50343869 chr7:50343872 chr7:50343883

chr7:50343889 chr7:50343890 chr7:50343897

chr7:50343907 chr7:50343909 chr7:50343914

chr7:50343934 chr7:50343939 chr7:50343950

chr7:50343959 chr7:50343805 chr7:50343822

chr7:50343824 chr7:50343826 chr7:50343829

chr7:50343831 chr7:50343833 chr7:50343838

chr7:50343847 chr7:50343850 chr7:50343858

chr7:50343864 chr7:50343869 chr7:50343872

chr7:50343890

(IRF4)

chr6:392036 chr6:392047 chr6:392049

chr6:392057 chr6:392060 chr6:392066

chr6:392080 chr6:392094 chr6:392102

chr6:392131

o la correspondiente citosina en la posición n+1 en la hebra opuesta.

14. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dicho mamífero es un ser humano.

FIGURA 1

>hgl9_refGene_NM_181711 range=chrl2:52398748-524096715rpad=0 3'pad=0 strand=+ repeatMasking=none

GRASP reside en la hebra plus, por lo tanto, en lo siguiente» la hebra superior es la secuencia 5'-3' representativa de GRASP.

AMARILLO: subregiones de interés de las que se dan la conversión de tres bisulfitos y ensayos de metilación específicos como ejemplos de diseños dirigidos a ambas hebras Fuente VERDE: subregión de interés dada como un ejemplo de un amplicón de PCR de enzimas de restricción (hhal/HbalI) sensibles a la metilación

1 CCCACCCCCCACAGATGCTGTCTGTCAGGAGCAGGCAACAGACGGTCCTGGGGTCCATCT

1 GGGTGGGGGGTGTCTACGACAGACAGTCCTCGTCCGTTGTCTGCCAGGACCCCAGGTAGA

61 GTGCTAATGCTTCACAATAGAGTCCCATGTTTCCCCACTGACACCCCCTCGGCCCCTCAG

61 CACGATTACGAAGTGTTATCTCAGGGTACAAAGGGGTGACTGTGGGGGAGCCGGGGAGTC

121 CTGATGGCCACTTGGTGGTGCCAAGGCGGGAGGTGGGAGGAGGGAGAAGAAGGCACTAAG

121 GACTACCGGTGAACCACCACGGTTCCGCCCTCCACCCTCCTCCCTCTTCTTCCGTGATTC

181 AGAGCTACCTCTTAGCTCCTGGCAGTCCTCAATCCñCCCCGGCCCCCCACCCAACñAGCñ

181 TCTCGATGGAGAATCGAGGACCGTCAGGAGTTAGGTGGGGCCGGGGGGTGGGTTGTTCGT

241 TCCTGCCATCTGGACTTGTGCAATCACTGAGGGGCGGAAAAGCACCCTCTTCCACCCACA

241 AGGACGGTAGACCTGAACACGTTAGTGACTCCCCGCCTT'TTCGTGGGAGAAGGTGGGTGT

301 CCTCTTGTAGGGGATGGGGGCCTAGAGGACTGGGGGTGGGGAGGAGAACACAGAGTCAAG

301 GGAGAACATCCCCTACCCCCGGATCTCCTGACCCCCACCCCTCCTCTTGTGTCTCAGTTC

361 GAGACTAGAGAAGAAGACTGAGCCAGGCGCAAGAACTGAGACAGGCAGGAGGCAGAAAGT

361 CTCTGATCTCTTCTTCTGACTCGGTCCGCGTTCTTGACTCTGTCCGTCCTCCGTCTTTCA

421 CTTTCCTGGCCTCGCAGGTGGACGTGGCCATTGCCCCTCTGTGCTCCTTATGGCACGTGT

421 GAAAGGACCGGAGCGTCCACCTGCfiCCGGTAACGGGGAGACACGAGGAATACGGTGCACA

481 CTAACACAGCACATGTGCAAGGTACCACTCCCTACCAGGCCAAGAGCCTCTGTAACCCCA

481 GATTGTGTCGTGTACACGTTCCATGGTGAGGGATGGTCCGGTTCTCGGAGACATTGGGGT

541 GTGCCCAGCCAGTACCTGGCACACAGCAGGGCTTAAATGTTGGACAACATCACAGAGTGG

541 CACGGGTCGGTCATGGACCGTGTGTCGTCCCGAATTTACAACCTGTTGTAGTGTCTCACC

601 TTAGATTGCAGGCTCTGGAACCAGGCTGCCTGGCTTTGAATCTCAGCTCTGCCGCTGAGT

601 AATCTAACGTCCGAGACCTTGGTCCGACGGACCGAAACTTAGAGTCGAGACGGCGACTCA

661 GACTTAGGGCAAATTACTTATCTTCTCTGGGCCTCAGTTTCCTCATCTGTAAGGGAGGAT

661 CTGAATCCCGTTTAATGAATAGAAGAGACCCGGAGTCñAAGGAGTAGACATTCCCTCCTA

721 AATGGTGCTTATTTCGTAGGGTTGTTATGAAGACCAAGTGAGTTAATGCATGTATGTAAA

721 TTACCACGAATAAAGCATCCCAACAATACTTCTGGTTCACTCAATTACGTACATACATTT

781 AGGACACACAGAACAAACAGTGTGCATAGCACATGCTAAGTGCTCAATAAATGTTAACTG

781 TCCTGTGTGTCTTGTTTGTCACACGTATCGTGTACGATTCACGAGTTATTTACAATTGAC

841 TGAAGGCATAACAGATTTGGGAAGACTGGGGGAGGAGGGAGGGGACAGACAAGGGCACCG

841 ACTTCCGTATTGTCTAAACCCTTCTGACCCCCTCCTCCCTCCCCTGTCTGTTCCCGTGGC

901 CATTGCCGCCTCTGCTTCTTGGCCGATGGGTGTTGGGACATGGAGTCCCCAGCCTGTGCT

901 gtaacggcggagacgaagaaccggctacccacaaccctgtacctcaggggtcggacacga

961 gctgacgccctgtggtggctagccgctctttagacaccagacgctgccttccacttcctc

961 CGACTGCGGGACACGACCGATCGGCGAGAAATCTGTGGTCTGCGACGGAAGGTGAAGGAG

1021 CTCTCACTTCTTATTCGGGCACCACTGACGACAGAGACTTCGGCTGGGCCATTCCCGCCT

1021 GAGAGTGAAGAATAAGCCCGTGGTGACTGCTGTCTCTGAAGCCGACCCGGTAAGGGCGGA

FIGURA 1 (cont.)

1081 CTCCTACCGCCTGGCAGCCATGGTAACAGCCTGGGGGATGGTCCCTAAGATGGGGTCñGA 1081 GAGGATGGCGGACCGTCGGTACCA'ITGTCGGACCCCCTACCAGGGATTCTACCCCAGTCT 1141 GAACGGCTGAGCATGGCCATCCCCCCAGCCCTGAñCTCCCACTCAGCCTGGGCTCATCCC 1141 cttgccgactcgtaccggtaggggggtcgggactigagggtgagtcggacccgagtaggg 1201 AACCTCCTGAGTCAAGTCCACAGTAAGCGTCTGTCTCCTGGGAAGGGGGATCTGACCCCG 1201 ttggaggactcagttcaggtgtcattcgcagacagaggacccttccccctagactggggc 1261 gcatcaggagctgaggaaaggtgttgccagcagggatcactcaagccccttggaggggac 1261 cgtagtcctcgactcctttccacaacggtcgtgcctagtgagttcggggaacctcccctg 1321 aggccagaactaagcctactgctttcagggtttccacctcttcccttcttcctagaogtg 1321 TCCGGTCTTGATTCGGATGACGAAAGTCCCAAAGGTGGAGAAGGGAAGAAGGATCTGCAC 1381 CGAACAGGGGGCAGCCTCTTTCAGCTCTTCTGGGGCAGCTGCGTCAAGGGAAAATCCTGG 1381 GCTTGTCCCCCGTCGGAGAAAGTCGAGAAGACCCCGTCGACGCAGTTCCCTTTTAGGACC 1441 gccctctccctccctgggggcttctgcgcagtgagttcagggagtctcctccctcctcca 1441 CGGGAGAGGGAGGGACCCCCGAAGACGCGTCACTCAAGTCCCTCagaggagggaggaggt 1501 TCGGGCCTCCACCCCTACTCCÍ'GCGCAGCCCCGCTGCCGCTCTCCCTGCCCTGGAGTCTC 1501 agcccggaggtggggatgaggacgcgtcggggcgacggcgagagggacgggacctcagag 1561 ctgcagccccttggatctccgtgactctccctacctccccgactccccaggcttcttaca 1561 GACGTCGGGGAACCTAGAGGCACTGAGAGGGATGGAGGGGCTGAGGGGTCCGAAGAATGT 1621 GTGACCTCTTACCGTGCCCCACTCCATGAATCGCCAGAGCTATTCGTCCCTAAATTTCAA 1621 CACTGGAGAATGGCACGGGGTGAGGTACTTAGCGGTCTCGATAAGCAGGGATTTAAAGTT 1681 ACCTTGCGCAATGTCCCTTCACAGACCCCTCCAGGTATCACGCAGCCCCGAGCCCCGAGC 1681 TGGAACGCGTTACAGGGAAGTGTCTGGGGAGGTCCATAGTGCGTCGGGGCTCGGGGCTCG 1741 CCCGCCCCGGGGGCCTCATCCOGCCCCTTCGCGTCCGCGGCTCGTTTTCCCCCñCTGAGC 1741 GGGCGGGGCCCCCGGAGTAGGGCGGGGAAGCGCAGGCGCCGAGCAAAAGGGGGTGACTCG 1801 gcccagctcocgcagtttccccggccgtcgagcgccgtgggcgggggtccagggcggcgg 1801 cgggtcgagggcgtcaaaggggccggcagctcgcggcacccgccccgaggtcccgccgcc 1861 cgcctcgcggggagggtcctccgtgctgggggcgaggccacccgaggcagctccccgccc 1861 GCGGAGCGCCCCTCCCAGGAGGCACGACCCCCGCTCCGGTGGGCTCCGTCGAGGGGCGGG 1921 GCCCCCAACCCCGCCCCGCTCTCGGAGCCTATAAAGGGAGGCGACCCGCGGCCCGCCCGG 1921 CGGGGGTTGGGGCGGGGCGAGAGCCTCGGATATTTCCCTCCGCTGGGCGCCGGGCGGGCC 1981 CTGGCATCCCCCAGCCGCCGCCAGCCCCGCCGAGGGGAGCCAGCGCCGTCTCTGAGGGGC 1981 GACCGTAGGGGGTCGGCGGCGGTCGGGGCGGCTCCCCTCGGTCGCGGCAGAGACTCCCCG 2041 gtccggcgccggagccatgaocctccgccgactcaggaagctgcaGcagaaggaggaggc 2041 CAGGOCGCGGCCTCGGTACTGGGAGGCGGCTGAGTCCTTCGÁCGTCGTCTTCCTCCTCCG 2101 GGCGGCCACCCCGGACCCCGCCGCCCGGACTCCCGAC'rCGGAAGTCGCGCCCGCCGCTCC 2101 ccgccggtggggcctggggcggcgggcctgagggctgagccttcagcgcgggcggcgagg 2161 ggtcccgaccccgggaccccctgccgcagccgccacccctgggcccccagcggacgagct 2161 ccagggctggggccctgggggacggcgtcggcggtggggacccgggggtcgcctgctcga 2221 GTACGCGGCGCTGGAGGACTATCAC'CCTGCCGAGCTGTACCGCGCGCTCGCCGTGTCCGG 2221 catgcgccgcgacctcctgatagtgggacggctcgacatggcgcgcgagcggcacaggcc 2281 gggcaccctgccccgccgaaaggtgcgtcccccgcccgccttcaggatctgctcagcccc 2281 cccgtgggacggggcggctttccacgcagggggcgggcggaagtcctagacgagtcgggg 2341 tctccgactccctacagggcctgctgactccgcagtgccctctcctcggcgtccgcggag 2341 AGAGGCTGAGGGATGTCCCGGACGACTGAGGCGTCACGGGAGAGGAGCCGCAGGCGCCTC FIGURA 1 (cont.)

2401 ICCCCCACCTTCTTCCCCGGCCCGCTGGGTGCCTCGACTCCCCGCGXTCCCCGCTGCTGC 2401 A&GGGGTGGAAGAAGGGGCCGGGCGACCCACGGAGCTGAGGGGCGCAAGGGGCGACGACG 2461 GAAGGCCGTGGCCCTCGCCTGCACACCGCGCCCAGGCTCGGTGGCTCTTAACTCCGCGCC 2461 CTTCCGGCACCGGGAGCGGACGTGTGGCGCGGGTCCGAGCCACCGAGAATTGAGGCGCGG 2521 CCATGCACGCCCCCTCTCTCCCTCCTTGACTCCTCCCAGCACCCCCCTTCTCCTACCCGC 2521 GGTACGTGCGGGGGAGAGAGGGAGGAACTGAGGAGGGTCGTGGGGGGAAGAGGATGGGCG 2581 TCCATCTGGCTTTCTGCCCCCCATGCCCCGCCTCCCCGTGGCCAGGTGTCCTGGGTCCCC 2581 AGGTAGACCGAAAGACGGGGGGTACGGGGCGGAGGGGCACCGGTCCACAGGACCCAGGGG 2641 AGGAGCCCCTCGCCCGAGGGACAGAGACAGCCCCAGGCAAGTTGAAGGTCCGAGAGCCCC 2641 ICCTCGGGGAGCGGGClCCCrGXCTCIGXCGGGGXCCGTTCAACTTCCAGGCTCTCGGGG 2701 CGGTGGGAGAAGCGGGCCGGTGGCTGCGCCGCGTGCGTTCTCACTCTGAGGAAGTGCGTG 2701 GCCACCCTCTTCGCCCGGCCACCGACGCGGCGCACGCAAGAGTGAGACTCCTTCACGCAC 2761 GGGAGCCGCTGACTCCGGATAGCACACCCTTCCGAGGGGACTCCCCGATTCCTGGGCTGG 2761 CCCTCGGCGACTGAGGCCTATCGTGTGGGAAGGCTCCCCTGAGGGGCTAAGGACCCGACC 2821 GGGCCTGCCGCCTGGCCCCACGTCTGACGTACGGGGCGCGAGGGCCACTGCTCCCTGGAC 2821 CCCGGACGGCGGACCGGGGTGCAGACTGCATGCCCCGCGCTCCCGGTGACGAGGGACCTG 2881 TTCTGTCGGAACCGGACGCAGTGGGAGGGGTCGCAGGGCGCCCGCGGGGCAGGAAGGATG 2881 AAGACAGCCTTGGCCTGCGTCACCCTCCCCAGCGTCCCGCGGGCGCCCGGTCCTTCCTAC 2941 CGGGCCGCGCCCACCTCTGAGTCCCCTCTGCCAGCCTCTrCCTCTGGCCCCAGGAGACCT 2941 GCCCGGCGCGGGTGGAGACTCAGGGGñGACGGTCGGAGAAGGAGACCGGGGTCCTCTGGA 3001 GAGGCTCAGAACCTACACAACACCAGGÍ’I’AAGAAGAGGGGCCTGGTGGCCTTTCCTCACC 3001 CTCCGAGTCTTGGA'rGTGTTGTGG'rCCAATTCTTCTCCCCGGACCACCGGAAAGGAGTGG 3061 CAGCCGCCCTCCTTCGCCCCGGCCCCCAGCTAGCCCCCACACAATGAACAGCTTGTTGAG 3061 GTCGGCGGGAGGAAGCGGGGCCGGGGGTCGATCGGGGGTGTGTTACTTGTCGAACAACTC 3121 AATTTGCATTTTATGAAAATCATGTTGAAAGACAAAGGGGTCTCTCTGTGCTGCCCAGTC 3121 TTAAACGTAAAATACTTTTAGTACAACTTTCTGTTTCCCCAGAGAGACACGACGGGTCAG 3181 CTTCCTCCCTGGCCGTTTGGGAACTGTCCCCACCCCTGAGGCCAATCTGGTTCTGAACCT 3181 GAAGCAGGGACCGGCAAACCCTTGACñGGGGTGGGGACTCCGGTTAGACCAAGACTTGGA 3241 TCTCTTCCTTGCCTTGGGCAGCTTTGGGGGAGGGTTAGCAAAGGCACAGAACAGAAAGGC 3241 AGAGAAGGAACGGAACCCGTCGAAACCCCCTCCCAATCGTTTCCGTGTCTTGTCTTTCCG 3301 CCTGGGCTGTGCAGGCTCCAAAGAAAAGGGCTGCTCTGGGACTGGACCTCCTCCCAGGAC 3301 GGACCCGACACGTCCGAGGTTTCTTTTCCCGACGAGACCCTGACCTGGAGGAGGGTCCTG 3361 CAAAAAGTTAGGGAGGGTGAGAGACTACTTTAGTTTATCAAGGACCCTGAAGAGACAGGA 3361 GTTTTTCAATCCCTCCCACTCTCTGATGAAATCAAATAGXTCCTGGGACTTCTCTGTCCT 3421 ACCTXCAXCTCTCATCCTTCCICCACACCCCCCACCACCACCCCTAAAGAACTCCCAGTC 3421 TGGAAGTAGAGAGTAGGAAGGAGGTGTGGGGGGXGGTGGTGGGGATTTCTTGAGGGTCAG 3481 tcggxccxttagxgagacttgctgacaagtttgacatctaagatgttttgtcccagaaag 3481 AGCCAGGAAATCACTCTGAACGACTGTTCAAACXGTAGATXCTACAAAACAGGGTCTTTC 3541 CACAAAATAXATGGCAATGGAGAGAGAGACCCAGGTATAGCTGGGCACAGCTGGTCACCT 3541 GTGTXXTATATACCGTXACCTCTCTCTCTGGGTCCATATCGACCCGXGTCGACCAGTGGA 3601 GCAGCXGGGAXCCACAACTGGXCCXXGAAACGGCCTGTACCTTAGGAGACCXGGCACCIC 3601 CGTCGACCCXAGGTGTIGACCAGGAACTTXGCCGGACAXGGAATCCXCTGGACCGXGGAG 3661 TGACCCCACATICTGGCTGGGATXGCCAGCCCXXCGGGACAGGGTCCCTGACCCCAGCCC 3661 actggggxgiaagaccgacccxaacggxcgggaagccctgtcccagggactggggtcggg