MX2014013684A - Papel de marcador de gen de diagnostico para cancer colorrectal. - Google Patents

Papel de marcador de gen de diagnostico para cancer colorrectal.

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Abstract

La presente invención se refiere en términos generales a un método de tamizaje para el inicio, predisposición al inicio y/o avance de un neoplasma. De manera más particular, la presente invención se refiere a un método de tamizaje para el inicio, predisposición al inicio y/o avance de un neoplasma mediante tamizaje respecto a cambios en los niveles de metilación de un panel de marcadores de gen incluyendo BCAT1, IKZF1, IRF4, GRASP y/o CAHM. El método de la presente invención es útil en una gama de aplicaciones incluyendo, pero sin limitarse a, aquellas relacionadas con la diagnosis y/o monitoreo de neoplasmas colorrectales, tal como adenocarcinosis colorrectal.

Description

PANEL DE MARCADOR DE GEN DE DIAGNÓSTICO PARA CÁNCER COLORRECTAL CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en términos generales a un método de tamizaje para el inicio, predisposición al inicio y/o avance de un neoplasma. De manera más particular, la presente invención se refiere a un método de tamizaje para el inicio, predisposición al inicio y/o avance de un neoplasma mediante tamizaje respecto a cambios en los niveles de metilación de un panel de marcadores de gen. El método de la presente invención es útil en una gama de aplicaciones incluyendo, pero sin limitarse a, aquellas relacionadas con la diagnosis y/o monitoreo de neoplasmas colorrectales, tal como adenocarcinosis colorrectal.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El cáncer colorrectal incluye crecimientos cancerosos en el colon, recto y apéndice. Con 655,000 muertes por año en todo el mundo, es la cuarta forma más común de cáncer en los Estados Unidos de Norteamérica y la tercera causa principal de muerte relacionada con cáncer en el mundo occidental. Los cánceres colorrectales surgen de pólipos adenomatosos en el colon. Estos crecimientos con forma de hongo usualmente son benignos, pero algunos se desarrollan como cáncer con el tiempo. El cáncer de colon localizado usualmente se diagnostica a través de colonoscopia.
Los cánceres invasivos que están confinados dentro de la pared del colon (etapas I y II) se pueden curar con cirugía. Si no se tratan, éstos se diseminan hacia los ganglios linfáticos regionales (etapa III), en donde hasta el 73% son curables con cirugía y quimioterapia. El cáncer que se metastatiza hacia sitios distantes (etapa IV) por lo general ya no se puede curar, aunque la quimioterapia puede extender la supervivencia, y en casos raros, la cirugía y quimioterapia juntas han llevado a pacientes hacia una cura (Markowitz y Bertagnolli, 2009, N. Engl . J. Med. 361(25): 2449-60). Con el cáncer rectal se utiliza radiación.
El cáncer colorrectal es precedido por adenomas. Los adenomas son tumores benignos, o neoplasmas, de origen epitelial los cuales se derivan de tejido glandular o exhiben estructuras glandulares claramente definidas. Algunos adenomas muestran elementos tisulares reconocibles, tal como tejido fibroso (fibroadenomas) y estructura epitelial, mientras que otros, tal como los adenomas bronquiales, producen compuestos activos que podrían dar origen a síndromes clínicos.
Los adenomas pueden progresar hasta convertirse en un neoplasma invasivo y entonces son denominados adenocarcinomas. Por consiguiente, los adenocarcinomas son definidos como tumores epiteliales malignos que surgen de estructuras granulares, los cuales son partes constituyentes de muchos órganos del cuerpo. El término adenocarcinoma también se aplica a tumores que muestran un patrón de crecimiento glandular. Estos tumores se pueden sub-clasificar de conformidad con las sustancias que éstos producen, por ejemplo adenocarcinomas secretores de moco y adenocarcinomas serosos, o de conformidad con el arreglo microscópico de sus células en patrones, por ejemplo adenocarcinomas papilares y foliculares. Estos carcinomas pueden ser sólidos o quisticos (cistadenocarcinomas). Cada órgano puede producir tumores que muestren una variedad de tipos histológicos, por ejemplo el ovario puede producir tanto cistadenocarcinoma como adenocarcinoma mucinoso.
Los adenomas en órganos diferentes se comportan de manera diferente. En general, la probabilidad global de que el carcinoma esté presente dentro de un adenoma (es decir un foco de cáncer que se ha desarrollado dentro de una lesión benigna) es de aproximadamente 5%. Sin embargo, esto está relacionado con el tamaño de un adenoma. Por ejemplo, en el intestino grueso (específicamente colon y recto) la ocurrencia de un cáncer dentro de un adenoma es raro en adenomas de menos de 1 cm. Dicho desarrollo se estima en un 40 a 50% en adenomas que son mayores de 4 cm y muestran cierto cambio histopatológico tal como un cambio velloso, o una displasia de alto grado. Los adenomas con grados más altos de displasia tienen una incidencia más alta de carcinoma. En cualquier adenoma colorrectal dado, los pronosticadores de la presencia de cáncer ahora o la ocurrencia futura de cáncer en el órgano incluyen tamaño (especialmente mayor de 9 mm) el grado de cambio de morfología tubular a vellosa, la presencia de displasia de alto grado y el cambio morfológico descrito como "adenoma aserrado". En cualquier individuo dado, las características adicionales de edad cada vez mayor, ocurrencia familiar de adenoma o cáncer colorrectal, género masculino o multiplicidad de adenomas, predicen un riesgo futuro incrementado para cáncer en el órgano -denominados factores de riesgo para cáncer. Excepto por la presencia de adenomas y su tamaño, ninguno de estos está definido objetivamente y todos aparte del número y tamaño están sujetos a error del observador y a confusión en cuanto a la definición precisa de la característica en cuestión. Debido a que dichos factores pueden ser difíciles de evaluar y definir, su valor como pronosticadores de riesgo actual o futuro para cáncer es impreciso.
Una vez que se ha desarrollado un adenoma esporádico, la probabilidad de que se presente un nuevo adenoma es de aproximadamente 30% dentro de 26 meses.
Los síntomas de cáncer colorrectal dependen de la ubicación del tumor en el intestino, y de que éste se haya o no metastatizado. Por desgracia, muchos de los síntomas se pueden presentar también en otras enfermedades, y por lo tanto los síntomas podrían no ser concluyentemente diagnósticos de cáncer colorrectal.
Los síntomas locales son más probables si el tumor se localiza más cerca del ano. Podría haber un cambio en los hábitos del intestino (estreñimiento de inicio nuevo o diarrea en ausencia de otra causa), una sensación de defecación incompleta y reducción en el diámetro de las heces. Tenesmo y cambio en la forma de las heces son ambos característicos del cáncer rectal. El sangrado gastrointestinal inferior, incluyendo el pasaje de sangre brillante en las heces, podría indicar cáncer colorrectal, al igual que lo podría ser la presencia incrementada de moco. La melena, heces negras con un aspecto alquitranado, normalmente se presenta en el sangrado gastrointestinal superior (tal como a partir de una úlcera duodenal), pero algunas veces se encuentra en el cáncer colorrectal cuando la enfermedad está localizada al inicio del intestino grueso.
Un tumor que sea lo suficientemente grande para llenar el lumen completo del intestino podría ocasionar obstrucción del intestino. Esta situación está caracterizada por estreñimiento, dolor abdominal, distensión abdominal y vómito. Esto ocasionalmente lleva a que el intestino obstruido y distendido se perfore y cause peritonitis .
Ciertos efectos locales del cáncer colorrectal ocurren cuando la enfermedad se ha vuelto más avanzada. Un tumor grande es más probable que sea notorio al tacto en el abdomen, y éste podría ser percibido por un médico en un examen físico. La enfermedad podría invadir otros órganos, y podría ocasionar sangre o aire en la orina o en la descarga vaginal.
Si un tumor ha ocasionado sangrado oculto crónico, se puede presentar anemia por deficiencia de hierro. Esto se puede experimentar como fatiga, palpitaciones y ser notado como palidez. El cáncer colorrectal también puede llevar a pérdida de peso, generalmente debido a un apetito disminuido.
Los síntomas constitutivos más inusuales son una fiebre inexplicable y uno de varios síndromes paraneoplásicos. El síndrome paraneoplásico más común es trombosis, usualmente trombosis de vena profunda.
El cáncer colorrectal de manera muy común se disemina hacia el hígado. Esto puede pasar inadvertido, pero depósitos grandes en el hígado pueden causar ictericia y dolor abdominal (debido al estiramiento de la cápsula).
Si el depósito del tumor obstruye el conducto biliar, la ictericia puede estar acompañada por otros rasgos de obstrucción biliar, tal como heces pálidas.
El cáncer colorrectal puede tomar muchos años para que se desarrolle y la detección temprana del cáncer colorrectal mejora en gran medida la prognosis. Los esfuerzos incluso modestos para i plementar métodos de tamizaje de cáncer colorrectal pueden dar como resultado una caída en las muertes por cáncer. A pesar de esto, las tasas de tamizaje para cáncer colorrectal permanecen bajas. Actualmente hay varias pruebas diferentes disponibles para este propósito.
• Examen digital del recto: el médico inserta un dedo con guante lubricado, en el recto para palpar áreas anormales. Este solamente detecta tumores lo suficientemente grandes como para que sean palpados en la parte distal del recto pero es útil como una prueba de tamizaje inicial.
• Prueba de sangre oculta en las heces: una prueba para sangre en las heces. Se pueden utilizar dos tipos de pruebas para detectar sangre oculta en las heces, es decir la basada en guayaco (prueba química) y la inmunoquímica. La sensibilidad del análisis inmunoquímico es superior a la del análisis químico sin una reducción inaceptable en la especificidad (Weitzel JN (diciembre de 1999). "Genetic cáncer risk assessment. Putting it all together". Cáncer 86 (11 Supl.): 2483-92).
• Endoscopia • Sigmoidoscopía: una sonda iluminada (sigmoisdocopio) se inserta en el recto y colon inferior para inspeccionar respecto a pólipos y otras anormalidades.
• Colonoscopía: se inserta una sonda iluminada, llamada colonoscopio, en el recto y el colon completo para buscar pólipos y otras anormalidades que pudieran ser causadas por cáncer. Una colonoscopía tiene la ventaja de que si se encuentran pólipos durante el procedimiento éstos se pueden extirpar inmediatamente. También se puede tomar tejido para biopsia.
• Enema de bario de contraste doble (DCBE): Primero, se toma una preparación nocturna para limpiar el colon. Se administra un enema que contiene sulfato de bario, después se insufla aire en el colon, distendiéndolo. El resultado es una capa fina de bario sobre el revestimiento interior del colon la cual es visible en películas de rayos X. De esta manera se puede detectar un cáncer o un pólipo precanceroso. Esta téenica puede omitir el pólipo plano (menos común).
• Colonoscopía virtual remplaza las películas de rayos X en el enema de bario de contraste doble (anterior) con un barrido de tomografía computarizada especial y requiere software de estación de trabajo especial para que el radiólogo lo interprete. Esta téenica se aproxima a la colonoscopia en la sensibilidad para pólipos. Sin embargo, cualesquiera pólipos encontrados aún deben ser retirados mediante colonoscopia estándar.
• Tomografia axial computarizada estándar es un método de rayos X que se puede utilizar para determinar el grado de diseminación del cáncer, pero no es lo suficientemente sensible para utilizar para el tamizado. Algunos cánceres se encuentran en barridos de CAT efectuados por otras razones.
• Pruebas sanguíneas: La medición de la sangre del paciente respecto a niveles elevados de ciertas proteínas puede dar una indicación de la carga de tumor. En particular, niveles altos de antígeno carcinoembrionario (CEA) pueden indicar metástasis del adenocarcinoma. Aunque estas pruebas son frecuentemente falso positivas o falso negativas, y no son recomendadas para el tamizado, éstas pueden ser útiles para evaluar la recurrencia de la enfermedad. Los biomarcadores CA19-9 y CA 242 pueden indicar riesgos metastásicos relacionados con e-selectina, ayudar a seguir el progreso terapéutico, y evaluar la recurrencia de la enfermedad. Recientemente, también se ha hecho disponible una prueba para la detección en plasma de las secuencias metiladas del gen de Septina 9 para ayudar en la diagnosis de cáncer colorrectal.
• Tomografia por emisión de positrones (PET) es una teenología de barrido tridimensional en la cual se inyecta en el paciente un azúcar radioactivo, el azúcar se recolecta en los tejidos con alta actividad metabólica, y se forma una imagen midiendo la emisión de radiación a partir del azúcar. Debido a que las células de cáncer con frecuencia tienen tasas metabólicas muy altas, esto se puede utilizar para diferenciar tumores benignos y malignos. PET no se utiliza para el tamizado y (todavía) no tiene un lugar en el tratamiento de rutina de los casos de cáncer colorrectal.
• Análisis de ADN en heces es una tecnología emergente en el tamizado para cáncer colorrectal. Los adenomas premalignos y cánceres vierten marcadores de sus células que no son degradados durante el proceso digestivo y permanecen estables en las heces. La captura, seguido por PCR amplifica el ADN hasta niveles detectables para pruebas.
• Niveles altos de proteína reactiva C como marcador de riesgo.
A pesar de la existencia de estas pruebas, la diagnosis sigue siendo problemática. La mayoría de las pruebas más sensibles son bastante invasivas y costosas y por lo tanto la aceptación por parte de los pacientes es baja. Por lo tanto existe una necesidad continua de desarrollar protocolos de diagnóstico más simples y más informativos o auxiliares para diagnóstico que permitan dirigir la colonoscopia a personas con mayor probabilidad de haber desarrollado adenomas o carcinomas. Una prueba de tamizado simple y exacta podría permitir que se establezcan sistemas de tamizado mucho más ampliamente aplicables.
Para este fin, recientemente se han identificado marcadores genéticos que están modulados, en términos de sus niveles de expresión, en individuos que han desarrollado un neoplasma del intestino grueso. Algunos de estos marcadores son regulados en forma positiva en términos de su nivel de expresión, mientras que otros son regulados en forma negativa. Sin embargo, una característica común para la mayoría de estos marcadores, y el uso de niveles de expresión de marcador genético en general como un diagnóstico, es que estos con frecuencia exhiben niveles sólo moderados de sensibilidad y especificidad. Es muy buscado el desarrollo de protocolos de diagnóstico que provean niveles altos de sensibilidad y especificidad.
En el trabajo que llevó a la presente invención, se ha determinado de manera inesperada que los marcadores de gen BCAT1, IKZFl IRF4, GRASP y CAHM, aunque cada uno individualmente es uno de un número de marcadores de gen que se sabe exhiben utilidad en términos de diagnosticar el desarrollo de neoplasia colorrectal, colectivamente permiten de hecho que se logre un nivel significativamente más alto de sensibilidad o especificidad que cuando cualquiera de estos marcadores de gen se analiza ya sea solo o juntos con otros marcadores de gen no relacionados. De manera más especifica, el tamizado respecto a un incremento en el nivel de metilación de cualquiera dos o más de dichos cinco marcadores específicos se puede diseñar de modo tal que se logre un nivel de especificidad o sensibilidad que no se había podido l *ograr previamente.
Llevando en mente el número grande de marcadores de gen los cuales, en estudios de análisis de expresión de gen diferencial, han demostrado exhibir niveles de expresión modulada en neoplasia, la identificación de que cinco marcadores específicos pueden de hecho proveer colectivamente resultados de diagnóstico mejorados con relación a cualquiera de dichos marcadores en forma individual o a otros grupos de marcadores es tanto inesperado como impredecible.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN A través de esta descripción y de las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que la palabra "comprende", y variaciones tales como "comprenden" y "que comprende", implican la inclusión de un número entero o paso o grupo de números enteros o pasos indicados pero no la exclusión de ningún otro número entero o paso o grupo de números enteros o pasos.
Tal como se utiliza en la presente solicitud, el término "derivado a partir de" deberá tomarse para indicar que un número entero o grupo de números enteros particular se ha originado a partir de la especie especificada, pero que no necesariamente se ha obtenido directamente a partir de la fuente especificada. Además, tal como se utiliza en la presente solicitud las formas en singular de "un", "y" y "el (la)" incluyen los referentes en plural a menos que el contexto claramente dicte lo contrario.
A menos que se defina de otra manera, todos los términos téenicos y científicos utilizados en la presente solicitud tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la técnica a la cual pertenece esta invención.
La presente descripción contiene información de secuencia de nucleótido preparada utilizando el programa Patentln Versión 3.5, presentado en la presente solicitud después de la bibliografía. Cada secuencia de nucleótido está identificada en el listado de secuencias por el indicador numérico <210> seguido por el identificador de secuencia (por ejemplo <201>1, <201>2, etc.). La longitud, tipo de secuencia (ADN, etc.) y organismo fuente para cada secuencia se indica mediante la información provista en los campos indicadores numéricos <211>, <212> y <213>, respectivamente. Las secuencias de nucleótido a las que se hace referencia en la descripción se identifican mediante el indicador SEQ ID NO: seguido por el identificador de secuencia (por ejemplo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, etc.). El identificador de secuencia al que se hace referencia en la descripción se correlaciona con la información provista en el campo indicador numérico <400> en el listado de secuencias, el cual es seguido por el identificador de secuencia (por ejemplo, <400>1, <400>2, etc. Es decir SEQ ID NO:l como se detalla en la descripción se correlaciona con la secuencia indicada como <400>1 en el listado de secuencias.
Un aspecto de la presente invención está dirigido a un método de tamizaje para el inicio o predisposición al inicio de o el monitoreo de un neoplasma del intestino grueso en un individuo, dicho método comprende evaluar el estado de metilación de una región de ADN que se selecciona a partir de: (i) la región, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definida por cualesquiera dos o más de las coordenadas de HG19: 1) chrl2:24962958..25102393 (2) chr7:50344378...50472798 (3) chr6:391739..411443; (4) chrl2:52400748..52409671; y (5) chr6:163834097..163834982; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de cualesquiera dos o más de: (1) BCAT1 (2) IKZF1 (3) IRF4 (4) GRASP y (5) CAHM en una muestra biológica proveniente de dicho individuo en el cual un nivel más alto de metilación de por lo menos una de las regiones de ADN del grupo (i) y/o (ii) con relación a los niveles de control es indicativo de un neoplasma del intestino grueso o una predisposición al inicio de un estado neoplásico del intestino grueso.
En otro aspecto dicho método está dirigido a identificar muestras biológicas en las cuales cualquiera de dichas regiones de ADN exhibe un nivel más alto de metilación.
Incluso en otro aspecto dicho método está dirigido a identificar muestras biológicas en las cuales dos o más de dichas regiones de ADN exhiben un nivel más alto de metilación.
Incluso en otro aspecto se provee un método de tamizaje para el inicio o predisposición al inicio de o el monitoreo de un neoplasma del intestino grueso en un individuo, dicho método comprende evaluar el estado de metilación de: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (1) chrl2:24962958..25102393; y (2) chr7:50344378...50472798; y opcionalmente uno o más de (3) chr6:391739. .411443, (4) chrl2:52400748..52409671 y (5) chr6:163834097. .163834982; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de (1) BCAT1; y (2) IKZF1; y opcionalmente uno o más de (3) IRF4, (4) GRASP y (5) CAHM en una muestra biológica proveniente de dicho individuo en el cual un nivel más alto de metilación de por lo menos una de las regiones de ADN del grupo (i) y/o (ii) con relación a los niveles de control es indicativo de un neoplasma del intestino grueso o una predisposición al inicio de un estado neoplásico del intestino grueso.
En una modalidad de este aspecto, el panel de marcador de gen para el que se tamiza es: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (1) chrl2:24962958..25102393 (2) chr7:50344378...50472798; y (3) chr6:391739..411443; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (1) BCAT1, (2) IKZF1 y (3) IRF4.
En otra modalidad de este aspecto, el panel de marcador de gen para el que se tamiza es: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (1) chrl2:24962958..25102393 (2) chr7:50344378...50472798 y (4) chrl2:52400748..52409671; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (1) BCAT1, (2) IKZF1; y (4) GRASP.
Incluso en otra modalidad de este aspecto, el panel de marcador de gen para el que se tamiza es: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (1) chrl2:24962958..25102393 (2) chr7:50344378...50472798 y (5) chr6:163834097..163834982; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (1) BCAT1, (2) IKZF1 y (5) CAH Incluso todavía en otra modalidad de este aspecto, el panel de marcador de gen para el que se tamiza es : (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (1) chrl2:24962958..25102393 (2) chr7:50344378...50472798 (3) chr6:391739..411443; y (4) chrl2:52400748..52409671; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (1) BCAT1, (2) IKZF1, (3) IRF4 y (4) GRASP.
Todavía incluso en otra modalidad de este aspecto, el panel de marcador de gen para el que se tamiza es: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (1) chrl2:24962958..25102393 (2) chr7:50344378...50472798 (3) chr6:391739..411443; y (5) chr6:163834097..163834982; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (1) BCAT1, (2) IKZF1, (3) IRF4 y (5) CAHM.
En una modalidad adicional de este aspecto, el panel de marcador de gen para el que se tamiza es: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (1) chrl2:24962958..25102393 (2) chr7:50344378...50472798 (4) chrl2:52400748..52409671 y (5) chr6:163834097..163834982; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (1) BCAT1, (2) IKZF1, (4) GRASP y (5) CAHM.
Incluso en otra modalidad adicional de este aspecto, el panel de marcador de gen para el que se tamiza es: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (1) chrl2:24962958..25102393 (2) chr7:50344378...50472798 (3) chr6:391739..411443 (4) chrl2:52400748..52409671 y (5) chr6:163834097..163834982; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (1) BCAT1, (2) IKZF1, (3) IRF4, (4) GRASP y (5) CAHM.
En otra modalidad se provee un método de tamizaje para el inicio o predisposición al inicio de o el monitoreo de un neoplasma del intestino grueso en un individuo, dicho método comprende evaluar el estado de metilación de: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (1) chrl2:24962958..25102393; y (5) chr6:163834097..163834982; y opcionalmente uno o más de (2) chr7:50344378...50472798, (3) chr6:391739..41143 ; y (4) chrl2:52400748..52409671; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (1) BCAT1; y (5) CAHM; y opcionalmente uno o más de (2) IKZF1, (3) IRF4 y (4) GRASP en una muestra biológica proveniente de dicho individuo en el cual un nivel más alto de metilación de por lo menos una de las regiones de ADN del grupo (i) y/o (ii) con relación a los niveles de control es indicativo de un neoplasma del intestino grueso o una predisposición al inicio de un estado neoplásico del intestino grueso.
Incluso en otra modalidad se provee un método de tamizaje para el inicio o predisposición al inicio de o el monitoreo de un neoplasma del intestino grueso en un individuo, dicho método comprende evaluar el estado de metilación de: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (2) chr7:50344378..50472798; y (5) chr6:163834097..163834982; y opcionalmente uno o más de (1) chrl2:24962958..25102393, (3) chr6:391739..411443 y (4) chrl2:52400748..52409671; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (2) IKZF1; y (5) CAHM; y opcionalmente uno o más de (1) BCAT1, (3) IRF4 y (4) GRASP en una muestra biológica proveniente de dicho individuo en el cual un nivel más alto de metilación de por lo menos una de las regiones de ADN del grupo (i) y/o (ii) con relación a los niveles de control es indicativo de un neoplasma del intestino grueso o una predisposición al inicio de un estado neoplásico del intestino grueso.
En una modalidad adicional se provee un método de tamizaje para el inicio o predisposición al inicio de o el monitoreo de un neoplasma del intestino grueso en un individuo, dicho método comprende evaluar el estado de metilación de: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (1) chrl2:24962958..25102393; y (3) chr6:391739..411443; y opcionalmente uno o más de (2) chr7:50344378...50472798, (4) chr12:52400748..52409671 y (5) chr6:163834097..163834982; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (1) BCAT1; y (3) IRF4; y opcionalmente uno o más de (2) IKZF1, (4) GRASP y (5) CAHM en una muestra biológica proveniente de dicho individuo en el cual un nivel más alto de metilación de por lo menos una de las regiones de ADN del grupo (i) y/o (ii) con relación a los niveles de control es indicativo de un neoplasma del intestino grueso o una predisposición al inicio de un estado neoplásico del intestino grueso.
Incluso en otra modalidad adicional se provee un método de tamizaje para el inicio o predisposición al inicio de o el monitoreo de un neoplasma del intestino grueso en un individuo, dicho método comprende evaluar el estado de metilación de: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (1) chrl2:24962958..25102393; y (4) chrl2:52400748..52409671; y opcionalmente uno o más de (2) chr7:50344378...50472798, (3) chr6:391739..411443 y (5) chr6:163834097..163834982; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (1) BCAT1; y (4) GRASP; y opcionalmente uno o más de (2) IKZF1, (3) IRF4 y (5) CAHM en una muestra biológica proveniente de dicho individuo en el cual un nivel más alto de metilación de por lo menos una de las regiones de ADN del grupo (i) y/o (ii) con relación a los niveles de control es indicativo de un neoplasma del intestino grueso o una predisposición al inicio de un estado neoplásico del intestino grueso.
Incluso en otra modalidad adicional se provee un método de tamizaje para el inicio o predisposición al inicio de o el monitoreo de un neoplasma del intestino grueso en un individuo, dicho método comprende evaluar el estado de metilación de: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (2) chr7:50344378..50472798; y (3) chr6:391739..411443; y opcionalmente uno o más de (1) chrl2:24962958..25102393, (4) chrl2:52400748..52409671 y (5) chr6:163834097..163834982; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (2) IKZF1; y (3) IRF4; y opcionalmente uno o más de (1) BCAT1, (4) GRASP y (5) CAHM en una muestra biológica proveniente de dicho individuo en el cual un nivel más alto de metilación de por lo menos una de las regiones de ADN del grupo (i) y/o (ii) con relación a los niveles de control es indicativo de un neoplasma del intestino grueso o una predisposición al inicio de un estado neoplásico del intestino grueso.
Todavía incluso en otra modalidad se provee un método de tamizaje para el inicio o predisposición al inicio de o el monitoreo de un neoplasma del intestino grueso en un individuo, dicho método comprende evaluar el estado de metilación de: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (2) chr7:50344378..50472798; y (4) chrl2:52400748..52409671; ____ y opcionalmente uno o más de (1) chrl2:24962958..25102393, (3) chr6:391739..411443 y (5) chr6:163834097..163834982; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (2) IKZF1; y (4) GRASP; y opcionalmente uno o más de (1) BCAT1, (3) IRF4 y (5) CAHM en una muestra biológica proveniente de dicho individuo en el cual un nivel más alto de metilación de por lo menos una de las regiones de ADN del grupo (i) y/o (ii) con relación a los niveles de control es indicativo de un neoplasma del intestino grueso o una predisposición al inicio de un estado neoplásico del intestino grueso.
Incluso todavía en otra modalidad se provee un método de tamizaje para el inicio o predisposición al inicio de o el monitoreo de un neoplasma del intestino grueso en un individuo, dicho método comprende evaluar el estado de metilación de: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (3) chr6:391739..411443; y (4) chrl2:52400748..52409671; y opcionalmente uno o más de (1) chrl2:24962958..25102393, (2) chr7:50344378...50472798 y (5) chr6:163834097..163834982; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (3) IRF4; y (4) GRASP; y opcionalmente uno o más de (1) BCAT1, (2) IKZF1 y (5) CAHM en una muestra biológica proveniente de dicho individuo en el cual un nivel más alto de metilación de por lo menos una de las regiones de ADN del grupo (i) y/o (ii) con relación a los niveles de control es indicativo de un neoplasma del intestino grueso o una predisposición al inicio de un estado neoplásico del intestino grueso.
En otra modalidad se provee un método de tamizaje para el inicio o predisposición al inicio de o el monitoreo de un neoplasma del intestino grueso en un individuo, dicho método comprende evaluar el estado de metilación de: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (3) chr6:391739..411443; y (5) chr6:163834097..163834982; y opcionalmente uno o más de (1) chrl2:24962958..25102393, (2) chr7:50344378...50472798 y (4) chrl2:52400748..52409671; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (3) IRF4; y (5) CAHM; y opcionalmente uno o más de (1) BCAT1, (2) IKZF1 y (4) GRASP en una muestra biológica proveniente de dicho individuo en el cual un nivel más alto de metilación de por lo menos una de las regiones de ADN del grupo (i) y/o (ii) con relación a los niveles de control es indicativo de un neoplasma del intestino grueso o una predisposición al inicio de un estado neoplásico del intestino grueso.
Las subregiones que se ha determinado exhiben utilidad particular se listan a continuación con referencia al gen y región cromosómica dentro de la cual éstas se encuentran : (1) Subregiones de BCAT: chrl2:25101992-25102093 (SEQ ID NO:l o la cadena menos (-) correspondiente) y chrl2:25101909-25101995 (SEQ ID NO:2 o la cadena menos (-) correspondiente) (2) Subregiones de IKZF1: chr7:50343867-50343961 (SEQ ID NO:3 o la cadena menos (-) correspondiente) y chr7:50343804-5033895 (SEQ ID NO:4 o la cadena menos (-) correspondiente) (3) Subregiones de IRF4: chr6:392036-392145 (SEQ ID NO:5 o la cadena menos (-) correspondiente) (4) Subregiones de GRASP: chrl2 :52399672-52399922, chrl2:52400821-52401051 (SEQ ID NO:6 o la cadena menos (-) correspondiente), chrl2:52401407-52401664 (SEQ ID NO:7 o la cadena menos (-) correspondiente) chrl2:52400866-52400973 and Chrl2:52401107-52401664. (5) Subregiones de CAHM: chr6 :163834295-163834500 (SEQ ID NO:8 o la cadena menos (-) correspondiente), chr6:163834621-163834906, chr6:163834393-163834455 y chr6:163834393-163834519.
Hasta el grado en que el método de la presente invención incluya analizar la metilación de GRASP, los presentes residuos son: o una citosina correspondiente en la posición n+1 en la cadena de ADN opuesta.
Hasta el grado en que el método de la presente invención incluya analizar CAHM, los presentes residuos son: o una citosina correspondiente en la posición n+1 en la cadena de ADN opuesta.
Hasta el grado en que el método de la presente invención incluya analizar IKZF1, los presentes residuos son: o una citosina correspondiente en la posición n+1 en la cadena de ADN opuesta.
Hasta el grado en que el método de la presente invención incluya analizar IRF4 los presentes residuos son: o una citosina correspondiente en la posición n+1 en la cadena de ADN opuesta.
Otro aspecto de la presente invención está dirigido a un método de tamizaje para el inicio o predisposición al inicio de o el monitoreo de un neoplasma del intestino grueso en un individuo, dicho método comprende evaluar el nivel de expresión de una región de ADN que se selecciona a partir de: (i) la región, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definida por cualesquiera dos o más de las coordenadas de HG19: (1) chrl2:24962958..25102393 (2) chr7:50344378...50472798 (3) chr6:391739..411443; o (4) chrl2:52400748..52409671; y (5) chr6:163834097..163834982; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: cualesquiera dos o más de: (1) BCAT1 (2) IKZF1 (3) IRF4 (4) GRASP y (5) CAHM en una muestra biológica proveniente de dicho individuo en el cual un nivel más bajo de expresión de por lo menos una de las regiones de ADN del grupo (i) y/o (ii) con relación a los niveles de control es indicativo de un neoplasma del intestino grueso o una predisposición al inicio de un estado neoplásico.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se predica, en parte, en la determinación de que el cambio en el patrón de metilación de un panel de marcadores de gen puede proveer un nivel más alto de cualquiera de especificidad de diagnóstico o sensibilidad de diagnóstico cuando se analiza colectivamente que si cualquiera de dichos marcadores se analizara ya sea en aislamiento o junto con marcadores diferentes de aquellos especificados en la presente solicitud. Este descubrimiento por lo tanto ha facilitado ahora el desarrollo de una prueba mejorada para el diagnóstico, prognosis o monitoreo de neoplasmas del intestino grueso basada en evaluar la metilación de dos o más de los marcadores de gen BCAT1, IKZF1, CAHM, GRASP y IRF4.
De conformidad con la presente invención, se ha determinado que ciertos paneles específicos de genes están modulados, en términos de cambios diferenciales a sus niveles de metilación, dependiendo de que la célula en cuestión sea o no neoplásica. Se debe entender que los genes en cuestión están descritos en la presente solicitud tanto por referencia a su nombre como a sus coordenadas cromosómicas. Sus coordenadas cromosómicas son consistentes con la versión Hgl9 de la base de datos del genoma humano la cual salió a la luz en febrero de 2009 (referida en la presente solicitud como "coordenadas de Hgl9").
Por consiguiente, un aspecto de la presente invención está dirigido a un método de tamizaje para el inicio o predisposición al inicio de o el monitoreo de un neoplasma del intestino grueso en un individuo, dicho método comprende evaluar el estado de metilación de una región de ADN que se selecciona a partir de: (i) la región, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definida por cualesquiera dos o más de las coordenadas de Hgl9: (1) chrl2:24962958..25102393 (2) chr7:50344378...50472798 (3) chr6:391739..411443; (4) chrl2:52400748..52409671; y (5) chr6:163834097..163834982; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de cualesquiera dos o más de: (1) BCAT1 (2) IKZF1 (3) IRF4 (4) GRASP y (5) CAHM en una muestra biológica proveniente de dicho individuo en el cual un nivel más alto de metilación de por lo menos una de las regiones de ADN del grupo (i) y/o (ii) con relación a los niveles de control es indicativo de un neoplasma del intestino grueso o una predisposición al inicio de un estado neoplásico del intestino grueso.
En una modalidad, dicho método está dirigido a identificar muestras biológicas en las cuales cualquiera de dichas regiones de ADN exhibe un nivel más alto de metilación.
En otra modalidad, dicho método está dirigido a identificar muestras biológicas en las cuales dos o más de dichas regiones de ADN exhiben un nivel más alto de metilación.
Sin limitar la presente invención a ninguna teoría o modo de acción, el panel de regiones de ADN (marcadores) especificado en la presente solicitud provee no solamente un resultado de diagnóstico mejorado con relación a los métodos de la téenica antecedente sino que, además, permite el desarrollo de un método de tamizaje el cual se puede diseñar para que se enfoque en proveer ya sea un nivel alto de especificidad de diagnóstico o un nivel alto de sensibilidad de diagnóstico. Como será entendido por el experto en la técnica, en el contexto de diagnósticos "sensibilidad" define la proporción de resultados positivos que se identifican correctamente, es decir, el porcentaje de individuos a los que se les identifica correctamente que tienen la enfermedad en cuestión. Sin embargo, "especificidad" define la proporción de resultados negativos que son identificados correctamente, es decir, el porcentaje de individuos a los que se les identifica correctamente que no tienen la enfermedad en cuestión.
En el contexto de la presente invención se ha determinado que se puede diseñar el tamizado de una muestra de un paciente respecto al estado de metilación del panel de marcadores especificado para proveer ya sea un resultado de diagnóstico que exhiba un nivel alto de especificidad o un resultado de diagnóstico que exhiba un nivel alto de sensibilidad.
En casos en los que se busque un nivel alto de sensibilidad, el método de tamizaje se diseña para identificar muestras en las cuales cualquiera de los marcadores del panel exhibe metilación incrementada con relación a los niveles de control. Es decir, no es necesario que todos los marcadores exhiban hipermetilación para definir el resultado como positivo. En casos en los que se busque un nivel más alto de sensibilidad, el nivel de especificidad se reduce inherentemente. Sin embargo, si se desea buscar un nivel más alto de especificidad (lo cual podría reducir el nivel de sensibilidad) entonces el método se diseña para identificar muestras en las cuales dos o más del panel de regiones de ADN exhiban metilación incrementada.
Por consiguiente, hasta el grado en que la presente invención esté dirigida a modalidades del método en las cuales "cualquiera de" las regiones de ADN (marcadores) del panel especificado exhiba un nivel más alto de metilación, estas modalidades están diseñadas para lograr resultados que exhiban sensibilidad incrementada tomando como base que cualquiera de los marcadores en el panel esté hipermetilado. Se debe entender que no es necesario que sea el mismo marcador el que esté hipermetilado en cada muestra. Más bien, es simplemente que uno de los marcadores que forma parte del panel esté hipermetilado. También se debe entender que con relación a algunas muestras, dos o más de los marcadores del panel pueden estar hipermetilados. Se debe entender que estas muestras no obstante caen dentro del alcance de esta modalidad de la invención debido a que esta modalidad no excluye la situación en la cual marcadores múltiples están hipermetilados sino que simplemente incluye dentro de su alcance todas aquellas muestras en las cuales están hipermetilados tan solo un marcador. En general estos datos proveerán sensibilidad incrementada pero especificidad reducida.
Hasta el grado en que la presente invención esté dirigida a modalidades del método en las cuales "dos o más" de las regiones de ADN (marcadores) del panel especificado exhiban un nivel más alto de metilación, dichas modalidades están diseñadas para lograr un nivel más alto de especificidad. Esto se logra en virtud del hecho que se determina que por lo menos dos, si no es que más, del panel especificado de marcadores están hipermetilados.
La referencia a "intestino grueso" se debe entender como una referencia a una célula derivada de una de las ocho regiones anatómicas del intestino grueso, cuyas regiones comienzan después de la región terminal del íleon, siendo estas: (i) el ciego; (ii) el colon ascendente; (iü ) el colon transverso; (iv) el colon descendente; (v) el colon sigmoideo; (vi) el recto; (vii) el ángulo esplénico; y (viii) el ángulo hepático.
La referencia a "neoplasma" se debe entender como una referencia a una lesión, tumor u otra masa encapsulada o no encapsulada u otra forma de crecimiento que comprende células neoplásicas. Una "célula neoplásica" se debe entender como una referencia a una célula que exhibe crecimiento anormal. El término "crecimiento" se debe entender en su sentido más amplio e incluye referencia a proliferación. En este sentido, un ejemplo de crecimiento celular anormal es la proliferación no controlada de una célula. Otro ejemplo es la apoptosis fallida en una célula, prolongando de esta manera su esperanza de vida usual. La célula neoplásica puede ser una célula benigna o una célula maligna. En una modalidad preferida, el presente neoplasma es un adenoma o un adenocarcinoma. Sin limitar la presente invención a ninguna teoría o modo de acción, un adenoma por lo general es un tumor benigno de origen epitelial el cual se deriva ya sea de tejido epitelial o exhibe estructuras epiteliales claramente definidas. Estas estructuras pueden tener una apariencia glandular. Este puede comprender una población de células malignas dentro del adenoma, tal como ocurre con el avance de un adenoma benigno o lesión neoplásica benigna hasta un adenocarcinoma maligno.
De preferencia, dicha célula neoplásica es un adenoma o adenocarcinoma y de manera incluso más preferida un adenoma o adenocarcinoma colorrectal.
La referencia a "región de ADN" se debe entender como una referencia a una sección específica de ADN genómico. Estas regiones de ADN se especifican ya sea mediante referencia al nombre de un gen o un conjunto de coordenadas cromosó icas. Tanto los nombres de gen como las coordenadas cromosómicas serán bien conocidas, y entendidas, por el experto en la téenica. Como se detalló anteriormente en la presente solicitud, las coordenadas cromosómicas corresponden a la versión Hgl9 del genoma. En general, un gen puede ser identificado en forma acostumbrada mediante referencia a su nombre, a través del cual tanto sus secuencias como ubicación cromosómica se pueden obtener en forma rutinaria, o mediante referencia a sus coordenadas cromosómicas, a través de las cuales también se pueden obtener en forma rutinaria tanto el nombre del gen como su secuencia.
La referencia a cada uno de los genes/regiones de ADN detalladas anteriormente se debe entender como una referencia a todas las formas de estas moléculas y a fragmentos o variantes de las mismas. Como será apreciado por el experto en la técnica, se sabe que algunos genes exhiben variación alélica entre individuos o polimorfismos de nucleótido individual (SNP). Los SNPs abarcan inserciones y deleciones de tamaño variable y repeticiones de secuencias simples, tales como repeticiones de dinucleótido y trinucleótido. Las variantes incluyen secuencias de ácido nucleico provenientes de la misma región que comparten por lo menos 90%, 95%, 98%, 99% de identidad de secuencia, es decir, que tienen una o más deleciones, adiciones, sustituciones, secuencias invertidas etc. con relación a las regiones de ADN descritas en la presente solicitud. Por consiguiente, se debe entender que la presente invención se extiende a dichas variantes las cuales, en términos de las presentes aplicaciones de diagnóstico, logran el mismo resultado a pesar del hecho de que pueden existir entre individuos variaciones genéticas menores entre las secuencias de ácido nucleico reales. Por lo tanto, se debe entender que la presente invención se extiende a todas las formas de ADN que surjan de cualquier otra variación por mutación, polimórfica o alélica.
Se debe entender que el "individuo" que es el sujeto de análisis puede ser cualquier mamífero humano o no humano. Los ejemplos de mamíferos no humanos incluyen primates, animales de cría (por ejemplo caballos, ganado vacuno, ovejas, cerdos, monos), animales de prueba de laboratorio (por ejemplo ratones, ratas, conejos, cobayos), animales de compañía (por ejemplo perros, gatos) y animales silvestres en cautiverio (por ejemplo venados, zorros).
De preferencia el mamífero es un humano.
El panel de genes que ha sido identificado demuestra metilación incrementada en células neoplásicas del intestino grueso con relación a las células neoplásicas correspondientes. Esta metilación incrementada, en algunos casos, está localizada en unos cuantos sitios CpG específicos dentro de la región de ADN aunque en otros casos ésta se observa través de un intervalo amplio de sitios CpG. Sin embargo, aunque las regiones específicas provenientes de todo los genes exhiben metilación incrementada y por lo tanto son marcadores de diagnóstico útiles, es el análisis de estos marcadores específicos como un panel el que ha provisto una mejora independiente y muy significativa con respecto a la sensibilidad y la especificidad se puede obtener a través de estos marcadores son analizados de manera individual. Esta mejora también es significativa aún cuando se considera contra la sensibilidad y especificidad que se pueden obtener utilizando otros marcadores que se sabe exhiben metilación incrementada como un marcador del inicio de un neoplasma del intestino grueso. Por consiguiente, el método de la presente invención provee ahora medios para lograr un nivel más alto de sensibilidad y especificidad que el que se había podido lograr hasta la fecha.
En un aspecto se provee un método de tamizaje para el inicio o predisposición al inicio de o el monitoreo de un neoplasma del intestino grueso en un individuo, dicho método comprende evaluar el estado de metilación de: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (1) chrl2:24962958..25102393; y (2) chr7:50344378...50472798; y opcionalmente uno o más de (3) chr6;391739..411443, (4) chrl2:52400748..52409671 y (5) chr6:163834097..163834982; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (1) BCAT1; y (2) IKZF1; y opcionalmente uno o más de (3) IRF4, (4) GRASP y (5) CAHM en una muestra biológica proveniente de dicho individuo en el cual un nivel más alto de metilación de por lo menos una de las regiones de ADN del grupo (i) y/o (ii) con relación a los niveles de control es indicativo de un neoplasma del intestino grueso o una predisposición al inicio de un estado neoplásico del intestino grueso.
En una modalidad de este aspecto, el panel de marcador de gen para el que se tamiza es: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (1) chrl2:24962958..25102393 (2) chr7:50344378...50472798; y (3) chr6:391739..411443; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (1) BCAT1, (2) IKZF1 y (3) IRF .
En otra modalidad de este aspecto, el panel de marcador de gen para el que se tamiza es: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (1) chrl2:24962958..25102393 (2) chr7:50344378...50472798 y (4) chrl2:52400748..52409671; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (1) BCAT1, (2) IKZF1; y (4) GRASP.
Incluso en otra modalidad de este aspecto, el panel de marcador de gen para el que se tamiza es: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (1) chrl2:24962958..25102393 (2) chr7:50344378...50472798 y (5) chr6:163834097..163834982; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (1) BCAT1, (2) IKZF1 y (5) CAHM Incluso todavía en otra modalidad de este aspecto, el panel de marcador de gen para el que se tamiza es : (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (1) chrl2:24962958..25102393 (2) chr7:50344378...50472798 (3) chr6:391739..411443; y (4) chrl2:52400748..52409671; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (1) BCAT1, (2) IKZF1, (3) IRF4 y (4) GRASP.
Todavía incluso en otra modalidad de este aspecto, el panel de marcador de gen para el que se tamiza es: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (1) chrl2:24962958..25102393 (2) chr7:50344378...50472798 (3) chr6:391739..411443; y (5) chr6:163834097..163834982; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (1) BCATl, (2) IKZF1, (3) IRF4 y (5) CAHM.
En una modalidad adicional de este aspecto, el panel de marcador de gen para el que se tamiza es: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (1) chrl2:24962958..25102393 (2) chr7:50344378...50472798 (4) chrl2:52400748..52409671 y (5) chr6:163834097..163834982; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (1) BCATl, (2) IKZF1, (4) GRASP y (5) CAHM.
Incluso en otra modalidad adicional de este aspecto, el panel de marcador de gen para el que se tamiza es: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (1) chrl2:24962958..25102393 (2) chr7:50344378...50472798 (3) chr6:391739..411443 (4) chrl2:52400748..52409671 y (5) chr6:163834097..163834982; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (1) BCAT1, (2) IKZF1, (3) IRF4, (4) GRASP y (5) CAHM.
En otra modalidad se provee un método de tamizaje para el inicio o predisposición al inicio de o el monitoreo de un neoplasma del intestino grueso en un individuo, dicho método comprende evaluar el estado de metilación de: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (1) chrl2:24962958..25102393; y (5) chr6:163834097..163834982; y opcionalmente uno o más de (2) chr7:50344378...50472798, (3) chr6:391739..411443; y (4) chrl2:52400748..52409671; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (1) BCAT1; y (5) CAHM; y opcionalmente uno o más de (2) IKZF1, (3) IRF4 y (4) GRASP en una muestra biológica proveniente de dicho individuo en el cual un nivel más alto de etilación de por lo menos una de las regiones de ADN del grupo (i) y/o (ii) con relación a los niveles de control es indicativo de un neoplasma del intestino grueso o una predisposición al inicio de un estado neoplásico del intestino grueso.
Incluso en otra modalidad se provee un método de tamizaje para el inicio o predisposición al inicio de o el monitoreo de un neoplasma del intestino grueso en un individuo, dicho método comprende evaluar el estado de metilación de: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (2) chr7:50344378..50472798; y (5) chr6:163834097..163834982; y opcionalmente uno o más de (1) chrl2:24962958..25102393, (3) chr6:391739..411443 y (4) chrl2:52400748..52409671; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (2) IKZF1; y (5) CAHM; y opcionalmente uno o más de (1) BCAT1, (3) IRF4 y (4) GRASP en una muestra biológica proveniente de dicho individuo en el cual un nivel más alto de metilación de por lo menos una de las regiones de ADN del grupo (i) y/o (ii) con relación a los niveles de control es indicativo de un neoplasma del intestino grueso o una predisposición al inicio de un estado neoplásico del intestino grueso.
En una modalidad adicional se provee un método de tamizaje para el inicio o predisposición al inicio de o el onitoreo de un neoplasma del intestino grueso en un individuo, dicho método comprende evaluar el estado de metilación de: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (1) chrl2:24962958..25102393; y (3) chr6:391739..411443; y opcionalmente uno o más de (2) chr7:50344378...50472798, (4) chrl2:52400748..52409671 y (5) chr6:163834097..163834982; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (1) BCAT1; y (3) IRF4; y opcionalmente uno o más de (2) IKZF1, (4) GRASP y (5) CAHM en una muestra biológica proveniente de dicho individuo en el cual un nivel más alto de metilación de por lo menos una de las regiones de ADN del grupo (i) y/o (ii) con relación a los niveles de control es indicativo de un neoplasma del intestino grueso o una predisposición al inicio de un estado neoplásico del intestino grueso.
Incluso en otra modalidad adicional se provee un método de tamizaje para el inicio o predisposición al inicio de o el monitoreo de un neoplasma del intestino grueso en un individuo, dicho método comprende evaluar el estado de metilación de: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (1) chrl2:24962958..25102393; y (4) chrl2:52400748..52409671; y opcionalmente uno o más de (2) chr7:50344378...50472798, (3) chr6:391739.. 11443 y (5) chr6:163834097..163834982; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (1) BCATl; y (4) GRASP; y opcionalmente uno o más de (2) IKZF1, (3) IRF4 y (5) CAHM en una muestra biológica proveniente de dicho individuo en el cual un nivel más alto de metilación de por lo menos una de las regiones de ADN del grupo (i) y/o (ii) con relación a los niveles de control es indicativo de un neoplasma del intestino grueso o una predisposición al inicio de un estado neoplásico del intestino grueso.
Incluso en otra modalidad adicional se provee un método de tamizaje para el inicio o predisposición al inicio de o el monitoreo de un neoplasma del intestino grueso en un individuo, dicho método comprende evaluar el estado de metilación de: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (2) chr7:50344378..50472798; y (3) chr6:391739..411443; y opcionalmente uno o más de (1) chrl2:24962958..25102393, (4) chrl2:52400748..52409671 y (5) chr6:163834097..163834982; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (2) IKZF1; y (3) IRF4; y opcionalmente uno o más de (1) BCAT1, (4) GRASP y (5) CAHM en una muestra biológica proveniente de dicho individuo en el cual un nivel más alto de metilación de por lo menos una de las regiones de ADN del grupo (i) y/o (ii) con relación a los niveles de control es indicativo de un neoplasma del intestino grueso o una predisposición al inicio de un estado neoplásico del intestino grueso.
Todavía incluso en otra modalidad se provee un método de tamizaje para el inicio o predisposición al inicio de o el monitoreo de un neoplasma del intestino grueso en un individuo, dicho método comprende evaluar el estado de metilación de: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (2) chr7:50344378..50472798; y (4) chrl2:52400748..52409671; y opcionalmente uno o más de (1) chrl2:24962958..25102393, (3) chr6:391739..411443 y (5) chr6:163834097..163834982; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (2) IKZF1; y (4) GRASP; y opcionalmente uno o más de (1) BCAT1, (3) IRF4 y (5) CAHM en una muestra biológica proveniente de dicho individuo en el cual un nivel más alto de metilación de por lo menos una de las regiones de ADN del grupo (i) y/o (ii) con relación a los niveles de control es indicativo de un neoplasma del intestino grueso o una predisposición al inicio de un estado neoplásico del intestino grueso.
Incluso todavía en otra modalidad se provee un método de tamizaje para el inicio o predisposición al inicio de o el monitoreo de un neoplasma del intestino grueso en un individuo, dicho método comprende evaluar el estado de metilación de: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (3) chr6:391739..411443; y (4) chrl2:52400748..52409671; y opcionalmente uno o más de (1) chrl2:24962958..25102393, (2) chr7:50344378...50472798 y (5) chr6:163834097..163834982; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (3) IRF4; y (4) GRASP; y opcionalmente uno o más de (1) BCAT1, (2) IKZF1 y (5) CAHM en una muestra biológica proveniente de dicho individuo en el cual un nivel más alto de metilación de por lo menos una de las regiones de ADN del grupo (i) y/o (ii) con relación a los niveles de control es indicativo de un neoplasma del intestino grueso o una predisposición al inicio de un estado neoplásico del intestino grueso.
En otra modalidad se provee un método de tamizaje para el inicio o predisposición al inicio de o el monitoreo de un neoplasma del intestino grueso en un individuo, dicho método comprende evaluar el estado de metilación de: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (3) chr6:391739..411443; y (5) chr6:163834097..163834982; y opcionalmente uno o más de (1) chrl2:24962958..25102393, (2) chr7:50344378...50472798 y (4) chrl2:52400748..52409671; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (3) IRF4; y (5) CAHM; y opcionalmente uno o más de (1) BCAT1, (2) IKZF1 y (4) GRASP en una muestra biológica proveniente de dicho individuo en el cual un nivel más alto de metilación de por lo menos una de las regiones de ADN del grupo (i) y/o (ii) con relación a los niveles de control es indicativo de un neoplasma del intestino grueso o una predisposición al inicio de un estado neoplásico del intestino grueso.
De conformidad con estos aspectos y modalidades, incluso en otra modalidad dicho nivel de control es un nivel no neoplásico.
En una modalidad, dicho método está dirigido a identificar muestras biológicas en las cuales cualquiera de dichas regiones de ADN exhibe un nivel más alto de metilación.
En otra modalidad, dicho método está dirigido a identificar muestras biológicas en las cuales dos o más de dichas regiones de ADN exhiben un nivel más alto de metilación.
Incluso, en otra modalidad, dicho tejido de intestino grueso de preferencia es tejido colorrectal.
Incluso en otra modalidad, el neoplasma es maligno, tal como un carcinoma.
En una modalidad adicional, el neoplasma es no maligno, tal como un adenoma.
En términos de tamizaje para la metilación de estas regiones de gen, se debe entender que las pruebas se pueden diseñar para tamizar ya sea las regiones especificas listadas en la presente irivención (las cuales corresponden a la cadena "más (+)" del gen) o la cadena "menos (-)" complementaria. Esta dentro de la habilidad del experto en la téenica elegir cuál cadena analizar y elegir como blanco dicha cadena tomando como base las coordenadas cromosómicas provistas en la presente solicitud. En algunas circunstancias, se pueden establecer pruebas para tamizar ambas cadenas.
Se debe entender que se puede tamizar para el panel especificado de marcadores en forma exclusiva o se puede elegir tamizar adicionalmente para otros marcadores, tal como otros marcadores de hipermetilación de ADN, otros marcadores de nivel de expresión de ARN u otros marcadores de proteina. Estos otros marcadores pueden proveer, por ejemplo, información adicional con relación al estado de salud del paciente en cuestión.
Sin limitar la presente invención a ninguna teoría o modo de acción, aunque medir los niveles de metilación a través de estas regiones de ADN es diagnóstico de una condición neoplásica del intestino grueso, se ha determinado que las subregiones discretas son particularmente útiles en este sentido debido a que estas subregiones contienen una densidad alta de dinucleótidos CpG los cuales con frecuencia están hiper etilados en neoplasias del intestino grueso, tal como cánceres colorrectales. Este hallazgo hace a estas subregiones un objetivo particularmente útil para análisis debido a que simplifica el procedimiento de tamizado debido a una región de ADN más corta y definida de manera más clara que requiere de análisis y, además, al hecho de que los resultados provenientes de estas regiones van a proveer un resultado significativamente más definitivo con relación a la presencia, o no, de hipermetilación que lo que se obtendría si el análisis se efectúa a través de la región de ADN como un todo. Este hallazgo por lo tanto simplifica tanto el procedimiento de tamizado así como incrementa la sensibilidad y especificidad de la diagnosis de neoplasia de intestino grueso.
Las subregiones que se ha determinado exhiben utilidad particular se listan a continuación con referencia al gen y región cromosómica dentro de la cual éstas se encuentran: (1) Subregiones de BCAT chrl2:25101992-25102093 (SEQ ID NO:l o la cadena menos (-) correspondiente) y chrl2:25101909-25101995 (SEQ ID NO:2 o la cadena menos (-) correspondiente) (2) Subregiones de IKZF1: chr7:50343867-50343961 (SEQ ID NO:3 o la cadena menos (-) correspondiente) y chr7:50343804-5033895 (SEQ ID NO:4 o la cadena menos (-) correspondiente) (3) Subregiones de IRF4: chr6:392036-392145 (SEQ ID NO:5 o la cadena menos (-) correspondiente) (4) Subregiones de GRASP: chrl2 :52399672- 52399922, chrl2:52400821-52401051 (SEQ ID NO:6 o la cadena menos (-) correspondiente), chrl2:52401407-52401664 (SEQ ID NO:7 o la cadena menos (-) correspondiente) chrl2:52400866-52400973 y Chrl2:52401107-52401664. (5) Subregiones de CAHM: chr6:163834295-163834500 (SEQ ID NO:8), chr6:163834621-163834906, chr6:163834393-163834455 y chr6:163834393-163834519.
Sin limitar la presente invención a ninguna teoría o modo de acción, el experto en la téenica puede tamizar una o más subregiones para cada marcador de gen.
En una modalidad, las subregiones de marcador de metilación analizadas para cada marcador de gen seleccionado son: (1) La subregión de BCAT definida por SEQ ID NO:l o SEQ ID NO:2 o la cadena menos (-) correspondiente; (2) La subregión de IKZF1 definida por SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4 o la cadena menos (-) correspondiente; (3) La subregión de IRF4 definida por SEQ ID NO:5 o la cadena menos (-) correspondiente; (4) La subregión de GRASP definida por SEQ ID NO:6 o 7 o la cadena menos (-) correspondientes; y (5) La subregión de CAHM definida por SEQ ID NO:8 o la cadena menos (-) correspondiente.
Sin limitar la presente invención a ninguna teoría o modo de acción, la metilación de ADN es universal en bacterias, plantas, y animales. La metilación de ADN es un tipo de modificación química del ADN que es estable a través de las rondas de división celular pero no implica cambios en la secuencia de ADN subyacente del organismo. Las modificaciones de la cromatina y ADN son dos rasgos importantes de la epigenética y juegan un papel en el proceso de diferenciación celular, que permiten que las células mantengan en forma estable características diferentes a pesar de contener el mismo material genómico. En organismos eucariotas la metilación de ADN ocurre solamente en el carbono número 5 del anillo pirimidina de la citosina. En los mamíferos, la metilación del ADN ocurre en su gran mayoría en el carbono número 5 de las citosina de un dinucleótido CpG. Los dinucleótidos CpG constituyen aproximadamente el 1% del genoma humano. 70-80% de todos los CpGs están metilados. Los CpGs pueden estar agrupados en racimos llamados "islotes de CpG" que están presentes en las regiones reguladoras 5' de muchos genes y frecuentemente están no metilados. En muchos procesos patológicos tales como cáncer, los promotores de gen y/o islotes de CpG adquieren hipermetilación anormal, lo cual está asociado con silencia iento de la transcripción heredable. La metilación del ADN puede impactar la transcripción de los genes en dos formas.
Primera, la etilación de ADN puede por si misma impedir fisicamente la unión de las proteínas de transcripción al gen, bloqueando de esta manera la transcripción. Segunda, el ADN metilado puede ser ligado por proteínas conocidas como proteínas de dominio de unión de Metil-CpG (MBDs). Las proteínas MBD después reclutan proteínas adicionales hacia el locus, tal como histona desacetilasas y otras proteínas de remodelación de la cromatina que pueden modificar las histonas, con lo cual forman cromatina compacta, inactiva denominada cromatina silenciosa. Este vínculo entre la metilación del ADN y la estructura de la cromatina es muy importante. En particular, la pérdida de la Proteína 2 de unión de Metil-CpG (MeCP2) ha sido implicada en el síndrome de Rett y la proteína 2 de dominio de unión de Metil-CpG (MBD2) media el silenciamiento de transcripción de los genes hipermetilados en el cáncer.
En humanos, el proceso de metilación del ADN es efectuado por tres enzimas, ADN metiltransferasa 1, 3a y 3b (DNMT1, DNMT3a, DNMT3b). Se cree que DNMT3a y DNMT3b son las metiltransferasas de novo que establecen los patrones de metilación del ADN temprano en el desarrollo. DNMT1 es la metiltransferasa de mantenimiento propuesta que es la responsable de copiar los patrones de metilación del ADN a las cadenas hijas durante la duplicación del ADN. DNMT3L es una proteína que es homologa a las otras DNMT3s pero no tiene actividad catalítica. En cambio, DNMT3L ayuda a las etiltransferasas de novo incrementando su capacidad para unirse al ADN y estimular su actividad. Por último, DNMT2 ha sido identificada como un homólogo de ADN metilstransferasa "enigmática", que contiene todos los 10 motivos de secuencia comunes a todas las ADN metiltransferasas; sin embargo, DNMT2 podría no metilar al ADN sino en cambio se ha demostrado que metila un ARN pequeño .
"Estado de metilación" por lo tanto se debe entender como una referencia a la presencia, ausencia y/o cantidad de metilación en un nucleótido particular, o nucleótidos, dentro de una región de ADN. El estado de metilación de una secuencia de ADN particular (por ejemplo región de ADN como la descrita en la presente solicitud) puede indicar el estado de metilación de cada base en la secuencia o puede indicar el estado de metilación de un subconjunto de los pares de bases (por ejemplo, de citosinas o el estado de metilación de una o más secuencias de reconocimiento de enzima de restricción específicas) dentro de la secuencia, o puede indicar información referente a la densidad de metilación regional dentro de la secuencia sin proveer información precisa de en qué parte de la secuencia ocurre de la metilación. El estado de metilación puede ser representado opcionalmente o indicado mediante un "valor de metilación". Un valor de metilación se puede generar, por ejemplo, cuantificando la cantidad de ADN intacto presente después de la digestión de restricción con una enzima de restricción dependiente de la metilación. En este ejemplo, si una secuencia particular en el ADN se cuantifica utilizando PCR cuantitativa, una cantidad de ADN de plantilla aproximadamente igual a un control tratado en forma simulada indica que la secuencia no está altamente metilada mientras que una cantidad de plantilla sustancialmente menor en la que ocurre en la muestra tratada en forma simulada indica la presencia de ADN metilado en la secuencia. Por consiguiente, un valor, es decir, un valor de metilación, por ejemplo proveniente del ejemplo descrito anteriormente, representa el estado de metilación y por lo tanto se puede utilizar como un indicador cuantitativo del estado de metilación. Esto es de utilidad particular cuando es deseable comparar el estado de metilación de una secuencia en una muestra con un valor umbral.
El método de la presente invención se predica en la comparación del nivel de metilación de de regiones de ADN especificas de una muestra biológica con los niveles de metilación de control de dichas regiones de ADN. El "nivel de control" es el "nivel normal", el cual es el nivel de metilación de la región de ADN de una célula o población celular del intestino grueso correspondiente que no es neoplásica o en otra muestra biológica a partir de la cual el ADN se puede aislar para análisis.
El nivel de metilación normal (o "no neoplásico") se puede determinar utilizando tejidos no neoplásicos derivados a partir del mismo individuo que es el sujeto de prueba. Sin embargo, se apreciará que esto puede ser bastante invasivo para el individuo en cuestión y por lo tanto es probable que sea más conveniente analizar los resultados de la prueba con relación a un resultado estándar que refleje los resultados individuales o colectivos obtenidos a partir de individuos diferentes al paciente en cuestión. Esta última forma de análisis es de hecho el método preferido de análisis ya que éste permite el diseño de kits que requieren la recolección y análisis de una muestra biológica individual, siendo una muestra de prueba de interés. Los resultados estándar que proveen el nivel de metilación normal se pueden calcular utilizando cualesquiera medios apropiados que serian conocidos por el experto en la téenica. Por ejemplo, se puede evaluar una población de tejidos normales en términos del nivel de metilación de los genes de la presente invención, con lo cual se provee un valor estándar o intervalo de valores contra los cuales se analizan todas las muestras para prueba futuras. También se debe entender que el nivel normal se puede determinar a partir de los individuos de un cohorte especifico y para uso con respecto a las muestras de prueba obtenidas a partir de dicho cohorte. Por consiguiente, se podría determinar un número de valores o intervalos estándar que correspondan a cohortes que difieran respecto a características tales como edad, género, origen étnico o estado de salud. Dicho "nivel normal" puede ser un nivel discreto o un intervalo de niveles. Un incremento en el nivel de metilación de los presentes genes con relación a los niveles normales es indicativo de el tejido es neoplásico.
El término "metilación" deberá entenderse que significa la presencia de un grupo metilo añadido por la acción de una enzima ADN metiltransferasa a una base o bases citosina en una región de ácido nucleico, por ejemplo ADN genómico. Como se describe en la presente solicitud, existen varios métodos conocidos por los expertos en la téenica para determinar el nivel o grado de metilación el ácido nucleico.
Con "nivel más alto" se quiere decir que existe un número más alto de dinucleótidos CpG metilados en el individuo diagnosticado que en una muestra de control, es decir, ya sea que la proporción de moléculas de ADN metiladas en un sitio CpG particular es más alta o que hay un número más alto de sitios CpG separados metilados en el individuo. Se debe entender que los términos "mejorado" e "incrementado" se utilizan de manera intercambiable con el término "más alto".
Con relación a detectar un "nivel más alto" de metilación, se debe entender que en algunas situaciones el nivel normal/de control de hecho corresponderá a la ausencia de cualquier metilación detectable mientras que el nivel neoplásico corresponderá a la presencia de metilación, per se. En esta situación el método de diagnóstico es relativamente sencillo debido a que solamente se necesita tamizar para la mera presencia de metilación (es decir solamente una evaluación cualitativa), en vez de evaluar los niveles de metilación con relación a un nivel de control de metilación, cuyo análisis necesariamente implica una medida de cuantificación. Sin limitar la presente invención en ninguna forma, se observa en muestras obtenidas de sangre, por ejemplo, que en el contexto de algunos marcadores el cambio de metilación de dicho marcador después del inicio de neoplasia es un desplazamiento desde niveles indetectables de metilación hasta la presencia de metilación detectable. En estas situaciones se permite una evaluación cualitativa relativamente simple en la cual solamente se necesita tamizar una muestra de prueba para determinar la presencia o ausencia de metilación. En el contexto de las definiciones provistas en la presente solicitud, la referencia a "nivel más alto" abarca tanto un incremento relativo en el nivel de metilación de un marcador o el inicio de metilación en el cual previamente ninguno era evidente. Como se detalló anteriormente en la presente solicitud, el nivel de control puede ser recién evaluado para cada paciente o puede existir un resultado estándar contra el cual se evalúan todas las muestras de prueba. En casos en que se conozca que la metilación no está presente en el marcador de interés, sólo se necesita tamizar respecto a la presencia o no de metilación debido a que el nivel de control es la ausencia de metilación y el "nivel más alto" es por lo tanto la presencia de cualquier cantidad de metilación.
La presente invención no debe ser limitada por un número preciso de residuos metilados que se consideren son diagnósticos de neoplasia en un individuo, debido a que puede ocurrir algo de variación entre las muestras del paciente. La presente invención tampoco está limitada por el posicionamiento del residuo metilado.
No obstante, también se ha identificado un número de residuos citosina específicos que experimentan hipermetilación dentro de estas subregiones. En otra modalidad, por lo tanto, se puede utilizar un método de tamizaje que esté dirigido específicamente a evaluar el estado de metilación de uno o más de cualquiera de estos residuos o la citosina correspondiente en la posición n+1 en la cadena de ADN opuesta.
Para este fin, en la Tabla 1 se presenta en forma detallada los residuos citosina que han sido identificados en ese sentido. El experto en la téenica apreciará que estos residuos individuales están numerados por referencia a Hgl9, lo cual también corresponde a la numeración de las subregiones especificas listadas anteriormente en la presente solicitud y las cuales también se pueden identificar cuando se aplica la numeración de coordenada para cada subregión a las secuencias de subregión correspondientes las cuales se proveen en el listado de secuencias. Se debe entender que estos residuos han sido identificados en el contexto del ADN de la subregión. Sin embargo, existen otros residuos que están hipermetilados fuera de las subregiones mismas pero dentro de la región de ADN más grande a partir de la cual se derivan las subregiones. Por consiguiente, estos residuos especificados representan un subconjunto particularmente útil de residuos citosina individuales que pueden experimentar hipermetilación dentro del contexto de las regiones y subregiones de ADN descritas en la presente solicitud. Estos residuos individuales se agrupan a continuación de conformidad con la región de ADN dentro de la cual éstos se presentan. Estas regiones de ADN están identificadas por referencia tanto a las coordenadas cromosómicas de Hgl9 como al nombre de la región del gen.
Hasta el grado en que el método de la presente invención incluya analizar la etilación de GRASP, los presentes residuos son: o una citosina correspondiente en la posición n+1 en la cadena de ADN opuesta.
Hasta el grado en que el método de la presente invención incluya analizar CAHM, los presentes residuos son: o una citosina correspondiente en la posición n+1 en la cadena de ADN opuesta.
Hasta el grado en que el método de la presente invención incluya analizar IKZF1, los presentes residuos son: o una citosina correspondiente en la posición n+1 en la cadena de ADN opuesta.
Hasta el grado en que el método de la presente invención incluya analizar IRF4, los presentes residuos son o una citosina correspondiente en la posición n+1 en la cadena de ADN opuesta.
El método de detección de la presente invención se puede efectuar en cualquier muestra biológica apropiada. Para este fin, la referencia a una "muestra biológica" se debe entender como una referencia a cualquier muestra de material biológico derivada a partir de un animal tal como, pero sin limitarse a, material celular, fluidos biológicos (por ejemplo sangre), heces fecales, especímenes para biopsia de tejido, especímenes quirúrgicos o líquido que se haya introducido al interior del cuerpo de un animal y retirado en forma subsiguiente (tal como, por ejemplo, la solución recuperada a partir de un lavado con enema). La muestra biológica que se analiza de conformidad con el método de la presente invención se puede analizar directamente o podría requerir de alguna forma de tratamiento antes del análisis. Por ejemplo, una muestra de biopsia o quirúrgica podría requerir homogenización antes del análisis o ésta podría requerir seccionamiento para análisis in si tu de los niveles de expresión cualitativos de genes individuales. De manera alternativa, una muestra celular podría requerir permeabilización antes del análisis. Además, hasta el grado en que la muestra biológica no esté en forma líquida, (si dicha forma es requerida para el análisis) ésta podría requerir la adición de un reactivo, tal como un amortiguador, para movilizar la muestra.
Hasta el grado en que la región de ADN de interés esté presente en una muestra biológica, la muestra biológica se puede analizar directamente o si no el total o algo del ácido nucleico presente en la muestra biológica se puede aislar antes del análisis. Incluso en otro ejemplo, la muestra se puede purificar parcialmente o de alguna otra manera enriquecer antes del análisis. Por ejemplo, hasta el grado en que una muestra biológica comprenda una población celular muy diversa, sería deseable enriquecer respecto a una subpoblación de interés particular. Está dentro del alcance de la presente invención que la población celular objetivo o moléculas derivadas a partir de las mismas se traten antes del análisis, por ejemplo, inactivación de virus vivos. También se debe entender en la muestra biológica se puede recolectar fresca o ésta se puede almacenar (por ejemplo mediante congelamiento) antes del análisis o de alguna otra manera tratar antes del análisis (tal como sometiendo a cultivo).
La elección de cuál tipo de muestra es la más apropiada para análisis de conformidad con el método descrito en la presente solicitud dependerá de la naturaleza de la situación. De preferencia, dicha muestra es una muestra fecal (heces), lavado de enema, extirpación quirúrgica, biopsia de tejido o muestra de sangre (por ejemplo sangre entera, suero o plasma).
De manera más preferida, dicha muestra biológica es una muestra de sangre, muestra de biopsia o muestras de heces.
Como se detalló anteriormente en la presente solicitud, la presente invención está diseñada para tamizar respecto a una célula o población celular neoplásica, la cual está localizada en el intestino grueso. Por consiguiente, la referencia a "célula o población celular" se debe entender como una referencia a una célula individual o un grupo de células. Dicho grupo de células puede ser una población difusa de células, una suspensión celular, una población encapsuladores células o una población de células que toman la forma de tejido.
La referencia a "inicio" de un neoplasma, tal como adenoma o adenocarcinoma, se debe entender como una referencia a una o más células de dicho individuo que exhiben displasia. En este sentido, el adenoma o adenocarcinoma puede estar bien desarrollado en el sentido de que se ha desarrollado una masa de células displásicas. De manera alternativa, el adenoma o adenocarcinoma puede estar en una etapa muy temprana en el sentido que solamente han ocurrido relativamente pocas divisiones celulares anormales al momento de la diagnosis. La presente invención también se extiende a la evaluación de la predisposición de un individuo al desarrollo de un neoplasma, tal como un adenoma o adenocarcinoma. Sin limitar la presente invención en ninguna forma, los niveles de metilación cambiados pueden ser indicadores de dicha predisposición del individuo a desarrollar una neoplasia, tal como el desarrollo futuro de un adenoma o adenocarcinoma u otro adenoma o adenocarcinoma.
Aunque el método preferido es evaluar los niveles de metilación para propósitos de diagnosticar el desarrollo de neoplasia con la predisposición al mismo, la detección de cambios opuestos en los niveles de dicha metilación podría ser deseada bajo ciertas circunstancias, por ejemplo, para monitorear la efectividad de tratamiento terapéutico o profiláctico dirigido a modular una condición neoplásica, tal como el desarrollo de adenoma o adenocarcinoma. Por ejemplo, en casos en los que niveles elevados de metilación indican que un individuo ha desarrollado una condición caracterizada por el desarrollo de adenoma o adenocarcinoma, se puede utilizar el tamizado respecto a un decremento en los niveles de metilación posteriormente el inicio de un régimen de tratamiento terapéutico para indicar la eliminación satisfactoria de las células neoplásicas. En otro ejemplo, este método se puede utilizar para analizar el tejido en los márgenes de una extirpación de tumor con el fin de determinar si se ha eliminado o no el margen completo del tumor.
Por lo tanto, el presente método se puede utilizar en la diagnosis, prognosis, clasificación, predicción del riesgo de la enfermedad, detección de recurrencia de la enfermedad, selección de tratamiento de un número de tipos de neoplasias y monitoreo de neoplasias. Se puede detectar un cáncer en cualquier etapa de avance, tal como cánceres primarios, metastásicos, y recurrentes.
La presente invención provee métodos para determinar si un mamífero (por ejemplo, un humano) tiene o no una neoplasia del intestino grueso, si una muestra biológica tomada a partir de un mamífero contiene o no células neoplásicas o ADN derivado de las células neoplásicas, estimar el riesgo o probabilidad de un mamífero de desarrollar un neoplasma, monitorear la eficacia del tratamiento anti-cáncer, o seleccionar el tratamiento anti-cáncer apropiado en un mamífero con cáncer. Dichos métodos se basan en la determinación que las células neoplásicas tienen un estado de metilación diferente al de las células normales en las regiones de ADN descritas en la presente solicitud. Por consiguiente, determinando si una célula contiene o no secuencias diferencialmente metiladas en las regiones de ADN como las descritas en la presente solicitud, es posible determinar que una célula es neoplásica.
El método de la invención se puede utilizar para evaluar individuos que se sabe o se sospecha tienen una neoplasia o como una prueba clínica de rutina, es decir, en un individuo del que no necesariamente se sospecha que tiene una neoplasia. Se pueden realizar pruebas de diagnóstico adicionales para confirmar el estado de la neoplasia en el individuo.
Además, los presentes métodos se pueden utilizar para evaluar la eficacia de un curso de tratamiento. Por ejemplo, la eficacia de un tratamiento anti-cáncer se puede evaluar monitoreando la metilación del ADN de las secuencias descritas en la presente solicitud con respecto al tiempo en un mamífero que tiene cáncer. Por ejemplo, una reducción o ausencia de metilación en cualquiera de las secuencias de diagnóstico de la invención en una muestra biológica tomada a partir de un mamífero después de un tratamiento, en comparación con un nivel en una muestra tomada a partir de mamífero antes, o más temprano, el tratamiento, indica tratamiento eficaz.
El método de la presente invención por lo tanto es útil como una prueba de una sola vez o como un monitoreo continuo de aquellos individuos que se cree están en riesgo de desarrollo de neoplasia o como un monitor de la efectividad de regímenes de tratamiento terapéuticos o profilácticos dirigidos a inhibir o de alguna otra manera desacelerar el desarrollo de la neoplasia. En estas situaciones, mapear la modulación de los niveles de metilación en cualquiera de una o más clases de muestras biológicas es un indicador valioso del estado de un individuo o de la efectividad de un régimen terapéutico o profiláctico que actualmente esté en uso. Por consiguiente, se debe entender que el método de la presente invención se extiende a monitorear respecto a incrementos o decrementos en los niveles de metilación en un individuo con relación su nivel normal (como se definió anteriormente en la presente solicitud), o con relación a uno o más niveles de metilación anteriores determinados a partir de una muestra biológica de dicho individuo.
Los métodos para detectar neoplasia pueden comprender la detección de una o más de otras secuencias de polinucleótido o polipéptido asociadas con cáncer. Por consiguiente, la detección de metilación mediante el método de la invención se puede utilizar ya sea sola, o en combinación con otros métodos de tamizaje para la diagnosis o prognosis de neoplasia.
Se puede utilizar cualquier método para detectar metilación del ADN en los métodos de la presente invención. Está disponible un número de métodos para la detección de ADN diferencialmente metilado en loci específicos ya sea en muestras de tejido primario o en muestras del paciente tales como sangre, orina, heces o saliva (revisado en Kristensen y Hansen Clin Chem. 55:1471-83, 2009; Ammerpohl et al . Biochim Biophys Acta . 1790:847-62, 2009; Shames et al . Cáncer Lett . 251:187-98, 2007; Clark et al . Nat Protoc. 1:2353-64, 2006). Para el análisis de la proporción o grado de metilación de ADN en un gen objetivo, el ADN normalmente se trata con bisulfito de sodio y las regiones de interés se amplifican utilizando iniciadores y condiciones de PCR que van a amplificar independientemente del estado de metilación del ADN. La metilación del amplicón global o de sitios de CpG individuales después se puede evaluar mediante determinación de secuencia, incluyendo piro-determinación de secuencia, digestión con enzima de restricción (COBRA) o mediante análisis de la curva de fusión. De manera alternativa se pueden utilizar métodos basados en ligación para el análisis de metilación en sitios de CpG específicos. Se está desarrollando la detección de ADN metilado en forma aberrante liberado de tumores y hacia los fluidos corporales como medios de diagnosis de cáncer. Aqui, en el caso de secuencias hipermetiladas, es necesario utilizar métodos sensibles que permitan la amplificación selectiva de la secuencia de ADN metilada a partir de un fondo de ADN celular normal que no está metilado. Dichos métodos basados en ADN tratado con bisulfito, por ejemplo; incluyen PCR selectiva de metilación (MSP), PCR densa en metilo, PCR de asa en la cabeza (Headloop PCR) y reacción en cadena dependiente de Auxiliar (PCT/AU2008/001475).
Brevemente, en algunas modalidades, los métodos para detectar la metilación incluyen cortar aleatoriamente o fragmentar aleatoriamente el ADN genómico, cortar el ADN con una enzima de restricción dependiente de metilación o sensible a la metilación y después de esto identificar y/o analizar selectivamente el ADN cortado o sin cortar. La identificación selectiva puede incluir, por ejemplo, separar el ADN cortado y no cortado (por ejemplo, mediante tamaño) y cuantificar una secuencia de interés que se cortó o, de manera alternativa, que no se cortó. Véase, por ejemplo, patente E.U.A. No. 7,186,512. De manera alternativa, el método puede abarcar amplificar el ADN intacto después de digestión con enzima de restricción, con lo cual únicamente se amplifica el ADN que no fue cortado por la enzima de restricción en el área amplificada. Véase, por ejemplo, solicitudes de patente E.U.A. Nos. de serie 10/971,986; 11/071,013; y 10/971,339. En algunas modalidades, la amplificación se puede efectuar utilizando iniciadores que sean específicos de gen. De manera alternativa, se pueden agregar adaptadores a los extremos del ADN fragmentado aleatoriamente, el ADN se puede digerir con una enzima de restricción dependiente de metilación o sensible a la metilación, el ADN intacto se puede amplificar utilizando iniciadores que se hibridan a las secuencias adaptadoras. En este caso, se puede efectuar un segundo paso para determinar la presencia, ausencia o cantidad de un gen particular en un combinado amplificado de ADN. En algunas modalidades, el ADN se amplifica utilizando PCR cuantitativa, en tiempo real.
En algunas modalidades, los métodos comprenden cuantificar la densidad de metilación promedio en una secuencia objetivo dentro de una población de ADN genómico. En algunas modalidades, el método comprende poner en contacto el ADN genómico con una enzima de restricción dependiente de la metilación o con una enzima de restricción sensible a la metilación bajo condiciones que permitan que por lo menos algunas copias de los sitios de corte de la enzima de restricción potenciales en el locus permanezcan sin cortar; cuantificar las copias intactas del locus; y comparar la cantidad de producto amplificado con un valor de control que representa la cantidad de metilación del ADN de control, con lo cual se cuantifica la densidad de metilación promedio en el locus en comparación con la densidad de metilación del ADN de control.
La cantidad de metilación de un locus de ADN se puede determinar proveyendo una muestra de ADN genómico que comprenda el locus, cortar el ADN con una enzima de restricción que sea sensible a la metilación o dependiente de la metilación, y después cuantificar la cantidad de ADN intacto o cuantificar la cantidad de ADN cortado en el locus de ADN de interés. La cantidad de ADN intacto o ADN cortado dependerá de la cantidad inicial de ADN genómico que contiene el locus, la cantidad de metilación en el locus, y el número (es decir, la fracción) de nucleótidos en el locus que están metilados en el ADN genómico. La cantidad de metilación en un locus de ADN se puede determinar comparando la cantidad de ADN intacto o ADN cortado con un valor de control que representa la cantidad de ADN intacto o ADN cortado en una muestra de ADN tratada en forma similar. El valor de control puede representar un número conocido o predicho de nucleótidos metilados. De manera alternativa, el valor de control puede representar la cantidad de ADN intacto o cortado del mismo locus en otra célula (por ejemplo, normal, no enferma) o un segundo locus.
Utilizando por lo menos una enzima de restricción sensible a la metilación o dependiente de la metilación bajo condiciones que permitan que por lo menos algunas copias de sitios de corte de enzima de restricción potenciales en el locus permanezcan sin cortar y cuantificando posteriormente las copias intactas remanentes y comparando la cantidad con un control, se puede determinar la densidad de metilación promedio de un locus. Una enzima sensible a la metilación es aquella que corta el ADN si su secuencia de reconocimiento no está metilada mientras que un enzima dependiente de la metilación corta el ADN si su secuencia de reconocimiento está metilada. Si la enzima de restricción sensible a la metilación se pone en contacto con copias de un locus de ADN bajo condiciones que permitan que por lo menos algunas copias de sitios de corte de enzima de restricción potenciales en el locus permanezcan sin cortar, entonces el ADN intacto remanente será directamente proporcional a la densidad de metilación, y por lo tanto se puede comparar con un control para determinar la densidad de metilación relativa del locus en la muestra. De manera similar, si una enzima de restricción dependiente de la metilación se pone en contacto con copias de un locus de ADN bajo condiciones que permitan que por lo menos algunas copias de sitios de corte de enzima de restricción potenciales en el locus permanezcan sin cortar, entonces el ADN intacto remanente será inversamente proporcional a la densidad de metilación, y por lo tanto se puede comparar con un control para determinar la densidad de metilación relativa del locus en la muestra. Dichas pruebas se describen en, por ejemplo, solicitud de patente E.U.A. No. de Serie 10/971,986.
Los kits para los métodos anteriores pueden incluir, por ejemplo, uno o más de enzimas de restricción dependientes de la metilación, enzimas de restricción sensibles a la metilación, reactivos para amplificación (por ejemplo, PCR), sondas y/o iniciadores.
Los métodos de amplificación cuantitativa (por ejemplo, PCR cuantitativa o amplificación lineal cuantitativa) se pueden utilizar para cuantificar la cantidad de ADN intacto dentro de un locus flanqueado por iniciadores de amplificación después de la digestión de restricción. Los métodos de amplificación cuantitativa se describen en, por ejemplo, patentes E.U.A. Nos.6,180,349; 6,033,854; y 5,972,602, asi como en, por ejemplo, Gibson et al . , Genome Research 6:995-1001 (1996); DeGraves, et al . , Biotechniques 34(1):106-10, 112-5 (2003); Deiman B, et al . , Mol . Biotechnol . 20(2):163-79 (2002). Las amplificación de se pueden monitorear en "tiempo real".
Los métodos adicionales para detectar la metilación del ADN pueden implicar determinación de secuencia genómica antes y después del tratamiento del ADN con bisulfito. Véase, por ejemplo, Frommer et al . , Proc .
Na ti . Acad. Sci . USA 89:1827-1831 (1992). Cuando el bisulfito de sodio se pone en contacto con el ADN, la citosina no metilada se convierte en uracilo, mientras que la citosina metilada no se modifica.
En algunas modalidades, la digestión de enzima de restricción de los productos de PCR amplificados a partir de ADN convertido con bisulfito se utiliza para detectar la metilación del ADN. Véase, por ejemplo, Sadri & Hornsby, Nucí . Acids Res. 24:5058-5059 (1996); Xiong & Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534 (1997).
En algunas modalidades, se utiliza una reacción de PCR especifica de metilación ("MSP") sola o en combinación con otros métodos para detectar la metilación del ADN. Una prueba MSP implica modificación inicial del ADN mediante bisulfito de sodio, convertir todas las citosinas no metiladas, pero no las metiladas, en uracilo, y amplificación subsiguiente con iniciadores específicos para ADN metilado contra ADN no metilado. Véase, Hermán et al . Proc. Nati . Acad. Sci . USA 93:9821-9826 (1996); patente E.U.A. No.5,786,146.
En algunas modalidades, se utiliza una prueba "MethyLight" sola o en combinación con otros métodos para detectar la metilación del ADN (véase, Eads et al . , C ncer Res. 59:2302-2306 (1999)). Brevemente, en el procedimiento "MethyLight" el ADN genómico se convierte en una reacción con bisulfito de sodio (el procedimiento con bisulfito convierte los residuos citosina no metilados en uracilo). La amplificación de una secuencia de ADN de interés se efectúa después utilizando iniciadores de PCR que se hibridan a los dinucleótidos CpG. Utilizando iniciadores que se hibridan únicamente a secuencias que resultan de la conversión con bisulfito del ADN metilado, (o de manera alternativa a secuencias no metiladas) la amplificación puede indicar el estado de metilación de las secuencias en las cuales se hibridan los iniciadores. Asimismo, el producto de la amplificación se puede detectar con una sonda que se une específicamente a una secuencia que resulta del tratamiento con bisulfito de un ADN no metilado. Si se desea, se pueden utilizar tanto iniciadores como sondas para detectar el estado de metilación. Por lo tanto, los kits para uso con MethyLight pueden incluir bisulfito de sodio así como iniciadores o sondas marcadas en forma detectable (incluyendo pero sin limitarse a Taqman o sondas de baliza molecular) que distinguen entre ADN metilado y no metilado que haya sido tratado con bisulfito. Otros componentes del kit pueden incluir, por ejemplo, reactivos necesarios para amplificación del ADN incluyendo pero sin limitarse a, amortiguadores para PCR, desoxinucleótidos; y una polimerasa termoestable.
En algunas modalidades, se utiliza una reacción Ms-SNuPE (Extensión de iniciador de nucleótido individual sensible a la metilación) sola o en combinación con otros métodos para detectar la metilación del ADN (véase, Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531 (1997)). La téenica Ms-SNuPE es un método cuantitativo para evaluar las diferencias de metilación en sitios CpG específicos basado en tratamiento del ADN con bisulfito, seguido por extensión del iniciador de nucleótido individual (Gonzalgo & Jones, supra) . Brevemente, el ADN genómico se hace reaccionar con bisulfito de sodio para convertir la citosina no metilada en uracilo al tiempo que se deja la 5-metilcitosina sin cambio. La amplificación de la secuencia objetivo deseada se efectúa después utilizando iniciadores de PCR específicos para el ADN convertido con bisulfito, y el producto resultante se aísla y utiliza como una plantilla para análisis de metilación en el sitio o sitios CpG de interés.
Los reactivos típicos (por ejemplo, como se encontrarían en un kit basado en Ms-SNuPE típico) para el análisis Ms-SNuPE pueden incluir, pero no se limitan a: iniciadores de PCR para gen específico (o secuencia de ADN alterada por metilación o islote de CpG); amortiguadores para PCR optimizados y desoxinucleótidos; kit para extracción en gel; iniciadores de control positivo; iniciadores de Ms-SNuPE para un gen específico; amortiguador para reacción (para la reacción Ms-SNuPE); y nucleótidos marcados en forma detectable. De manera adicional, los reactivos de conversión con bisulfito pueden incluir: amortiguador para desnaturalización del ADN; amortiguador para sulfonación; reactivos o kit para recuperación de ADN (por ejemplo, precipitación, ultrafiltración, columna de afinidad); amortiguador para desulfonación; y componentes para recuperación de ADN.
Los métodos de detección de metilación adicionales incluyen, pero no están limitados a, amplificación de islote de CpG metilado (véase, Toyota et al . r Cáncer Res. 59:2307-12 (1999)) y aquellos descritos en, por ejemplo, publicación de patente E.U.A. 2005/0069879; Rein, et al . Nucleic Acids Res. 26 (10): 2255-64 (1998); Olek, et al . Nat . Genet . 17(3): 275-6 (1997); y Publicación del PCT No. WO 00/70090.
A continuación se provee información más detallada con relación a varios de estos métodos descritos en forma general: (a) Diseño y/o producción de sonda o iniciador Varios métodos descritos en la presente solicitud para la diagnosis de una neoplasia utilizan una o más sondas y/o iniciadores. Los métodos para diseñar sondas y/o iniciadores para uso en, por ejemplo, PCR o hibridación son conocidos en la téenica y se describen, por ejemplo, en Dieffenbach y Dveksler (Eds) (En: PCR Primer: A Laboratory Manual, Coid Spring Harbor Laboratories, NY, 1995). Asimismo, varios paquetes de software están públicamente disponibles que diseñan sondas y/o iniciadores óptimos para una variedad de pruebas, por ejemplo Primer 3 disponible del Centro para Investigación sobre el Genoma, Cambridge, Mass., EE.UU.
Claramente, el uso potencial de la sonda o iniciador debe ser considerado durante su diseño. Por ejemplo, en caso que la sonda o iniciador se produzca para uso en una prueba de reacción en cadena de ligasa (LCR) o PCR especifica de metilación el nucleótido en el extremo 3' (o extremo 5' en el caso de LCR) de preferencia debe corresponder con un nucleótido metilado en un ácido nucleico.
Las sondas y/o iniciadores útiles para detección de una secuencia asociada con una neoplasia se evalúan, por ejemplo, para determinar aquellas que no forman horquillas, se auto-ceban o forman dimeros de iniciador (por ejemplo con otra sonda o iniciador utilizado en una prueba de detección). Asimismo, una sonda o iniciado (o la secuencia del mismo) con frecuencia se evalúa para determinar la temperatura a la cual éste se desnaturaliza a partir de un ácido nucleico objetivo (es decir la temperatura de fusión de la sonda o iniciador, o Tm). Los métodos para calcular Tm son conocidos en la téenica y se describen, por ejemplo, en Santa Lucia, Proc. Nati . Acad. Sci . USA, 95: 1460-1465, 1995 o Bresslauer et al . , Proc. Nati . Acad. Sci . USA, 83: 3746-3750, 1986.
Los métodos para producir/sintetizar una sonda o iniciador de la presente invención son conocidos en la técnica. Por ejemplo, la síntesis de oligonucleótido se describe en Gait (Ed) (En: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1984). Por ejemplo, se puede obtener una sonda o iniciador mediante síntesis biológica (por ejemplo mediante digestión de un ácido nucleico con una endonucleasa de restricción) o mediante síntesis guímica. Para secuencias cortas (de hasta aproximadamente 100 nucleótidos) es preferible la síntesis guímica.
Para las secuencias más largas son útiles los métodos de replicación estándar empleados en biología molecular, tal como, por ejemplo, el uso de M13 para ADN de cadena individual como lo describe Messing, Methods Enzymol, 101, 20-78, 1983. Otros métodos para síntesis de oligonucleótido incluyen, por ejemplo, métodos con fosfotriéster y fosfodiéster (Narang, et al . Meth . Enzymol 68: 90, 1979) y síntesis sobre un soporte (Beaucage, et al . Tetrahedron Letters 22:1859-1862, 1981) así como la técnica con fosforamidato, Caruthers, M. H., et al . , Methods in Enzymology, Vol.154, pp.287-314 (1988), y otros descritos en "Synthesis and Applications of DNA and RNA, " S. A. Narang, editor, Academic Press, New York, 1987, y las referencias citadas en el mismo. Las sondas que comprende ácido nucleico enganchado (LNA) se sintetizan como se describe, por ejemplo, en Nielsen et al . J. Chem . Soc. Perkin Trans. , 1:3423, 1997; Singh y Wengel, Chem . Commun . 1247, 1998. Mientras que, las ondas que comprenden péptido-ácido nucleico (PNA) se sintetizan como se describe, por ejemplo, en Egholm et al . , Am . Chem . Soc. , 114:1895, 1992; Egholm et al . , Nature, 365:566, 1993; y Orum et al . , Nucí .
Acids Res. , 21:5332, 1993. (b) Digestión de ADN con endonucleasa sensible a metilación En un ejemplo, la metilación incrementada en una muestra se determina utilizando un procedimiento que comprende tratar el ácido nucleico con una cantidad de una enzima endonucleasa de restricción sensible a metilación bajo condiciones suficientes para que el ácido nucleico sea digerido y después se detectan los fragmentos producidos. Los ejemplos de endonucleasas sensibles a metilación incluyen, por ejemplo, Hhal o Hpall. De preferencia, las pruebas incluyen controles internos que son digeridos con una enzima insensible a metilación que tenga la misma especificidad que la de la enzima sensible a metilación utilizada. Por ejemplo, la enzima insensible a metilación MspI es un isoesquizómero de la enzima sensible a metilación Hpall.
Formatos de prueba de hibridación En un ejemplo, la digestión del ácido nucleico se detecta mediante hibridación selectiva de una sonda o iniciador al ácido nucleico no digerido. De manera alternativa, la sonda se híbrida selectivamente al ácido nucleico tanto digerido como no digerido pero facilita la diferenciación entre ambas formas, por ejemplo, mediante electroforesis. Los métodos de detección apropiados para lograr la hibridación selectiva a una sonda de hibridación incluyen, por ejemplo, Southern u otra hibridación a ácido nucleico (Kawai et al . , Mol . Cell . Biol . 14:7421-7427, 1994; Gonzalgo et al . , C ncer Res. 57:594-599, 1997).
Las condiciones de hibridación apropiadas se determinan tomando como base la temperatura de fusión (T ) de un dúplex de ácido nucleico que comprende la sonda. El experto en la téenica estará consciente que las condiciones de reacción de hibridación óptimas deben ser determinadas empíricamente para cada sonda, aunque se pueden aplicar algunas generalidades. De preferencia, las hibridaciones que utilizan sondas de oligonucleótido cortas se efectúan a una astringencia baja a media. En el caso de una sonda o iniciador rico en GC o una sonda o iniciador más largo se prefiere una hibridación y/o lavado de astringencia alta. Una astringencia alta se define en la presente solicitud como una hibridación y/o lavado efectuado en solución amortiguadora SSC aproximadamente 0.1 x y/o aproximadamente 0.1% (p/v) SDS, o concentración salina más baja, y/o a una temperatura de por lo menos 65°C, o condiciones equivalentes. La referencia en la presente solicitud a un nivel particular de astringencia abarca condiciones equivalentes utilizando soluciones para lavado/hibridación diferentes de SSC conocidas por los expertos en la téenica.
De conformidad con el presente ejemplo, una diferencia en los fragmentos producidos para la muestra de prueba y una muestra de control negativa es indicativa de que el individuo tiene una neoplasia. De manera similar, en casos en los cuales la muestra de control comprende datos provenientes de un tumor, tejido de cáncer o una célula cancerosa o célula precancerosa, la similitud, aunque no necesariamente identidad absoluta, entre la muestra de prueba y la muestra de control es indicativa de una diagnosis positiva (es decir cáncer).
Formatos de prueba de amplificación En un ejemplo alternativo, los fragmentos producidos por la enzima de restricción se detectan utilizando un sistema de amplificación, tal como, por ejemplo, rreeaacccciióónn en cadena de polimerasa (PCR), amplificación por circulo rodante (RCA), reacción en cadena de polimerasa inversa (iPCR), PCR in situ (Singer-Sam et al . , Nucí . Acids Res. 18:687, 1990), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) o teenología de recielado de sonda .
Los métodos de PCR son conocidos en la técnica y son descritos, por ejemplo, por McPherson et al . , PCR: A Practical Approach. (editores de la serie, D. Rickwood y B. D. Hames), IRL Press Limited, Oxford, pp 1-253, 1991 y por Dieffenbach (ed) y Dveksler (ed) (En: PCR Primer: A Laboratory Manual, Coid Spring Harbour Laboratories, NY, 1995), cuyos contenidos de cada uno se incorporan en su totalidad para referencia. En términos generales, para PCR dos moléculas de iniciador de ácido nucleico no complementarias que comprenden por lo menos aproximadamente 18 nucleótidos de longitud, y de manera más preferida por lo menos 20-30 nucleótidos de longitud se hibridan a cadenas diferentes de una molécula plantilla de ácido nucleico en sus sitios de fijación respectivos, y las copias de la molécula de ácido nucleico específica de la plantilla que se intercalan en los sitios de fijación se amplifican enzimáticamente. Los productos de amplificación se pueden detectar, por ejemplo, utilizando electroforesis y detección con un marcador detectable que liga los ácidos nucleicos. De manera alternativa, uno o más de los oligonucleótidos se marcan con un marcador detectadle (por ejemplo un fluoróforo) y el producto de amplificación se detecta utilizando, por ejemplo, un cielador de luz (lightcycler) (Perkin Elmer, Welleslcy, Mass., EE.UU., Roche Applied Science, Indianapolis, IN, EE.UU.).
La amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) utiliza iniciadores de oligonucleótido, una ADN polimerasa y una endonucleasa de restricción para amplificar una secuencia objetivo. Los oligonucleótidos se hibridan a un ácido nucleico objetivo y la polimerasa se utiliza para producir una copia de la región que intercala los sitios de fijación del iniciador. Los dúplex del ácido nucleico copiados y el ácido nucleico objetivo después se mellan con una endonucleasa que reconoce específicamente una secuencia al comienzo del ácido nucleico copiado. La ADN polimerasa reconoce el ADN mellado y produce otra copia de la región objetivo al mismo tiempo que desplaza el ácido nucleico previamente generado. La ventaja de SDA es que ésta ocurre en un formato isotérmico, con lo cual facilita el análisis automatizado de alto rendimiento.
La teenología de reciclado de sonda utiliza un iniciador sintético quimérico que comprende ADN-ARN-ADN que es capaz de hibridarse a una secuencia objetivo. Después que se híbrida a una secuencia objetivo el dúplex ARN-ADN formado es un objetivo para RNasaH con lo cual se corta el iniciador. El iniciador cortado después se detecta, por ejemplo, utilizando espectrometría de masas o electroforesis .
Para iniciadores que flanquean o están adyacentes a un sitio de reconocimiento de endonucleasa sensible a metilación, se prefiere que dichos iniciadores flanqueen solamente aquellos sitios que están hipermetilados en la neoplasia para asegurar que se produzca un producto de amplificación de diagnóstico. En este sentido, un producto de amplificación sólo será producido cuando el sitio de restricción no esté cortado, es decir, cuando éste está metilado. Por consiguiente, la detección de un producto de amplificación indica que el dinucleótido o dinucleótidos CpG de interés está(n) metilado(s).
Como es sabido por el experto en la téenica, la longitud precisa del producto amplificado varía dependiendo de la distancia entre los iniciadores. Claramente esta forma de análisis se puede utilizar para determinar el estado de metilación de una pluralidad de dinucleótidos CpG con la condición que cada dinucleótido esté dentro de un sitio de endonucleasa de restricción sensible a metilación. En estos métodos, uno o más de los iniciadores puede estar marcado con un marcador detectable para facilitar la detección rápida del ácido nucleico amplificado, por ejemplo, una marca fluorescente (por ejemplo Cy5 o Cy3) o un radioisótopo (por ejemplo 32P).
Los ácidos nucleicos amplificados generalmente se analizan utilizando, por ejemplo, electroforesis en gel de agarosa no desnaturalizante, electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante, espectrometría de masas, cromatografía líquida (por ejemplo HPLC o dHPLC), o electroforesis capilar. (Por ejemplo MALDI-TOF). Los métodos de detección de alto rendimiento, tales como, por ejemplo, ionización/desorción de láser asistida con matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF), ionización por electroaspersión (ESI), espectrometría de masas (incluyendo espectrometría de masas en tándem, por ejemplo LC MS/MS), teenología con biosensor, tecnología de fibra óptica evanescente o tecnología con chip de ADN (por ejemplo, W098/49557; O 96/17958; Fodor et al . r Science ?6?-??3, 1991; patente E.U.A. No. 5,143,854; y patente E.Ü.A. No. 5,837,832, cuyos contenidos se incorporan en la presente solicitud para referencia), son especialmente preferidos para todos los formatos de prueba descritos en la presente solicitud. De manera alternativa, la amplificación de un ácido nucleico se puede monitorear continuamente utilizando un método de análisis de curva de fusión como se describe en la presente solicitud y/o en, por ejemplo, patente E.U.A. No. 6,174,670, la cual se incorpora en la presente solicitud para referencia. (c) Otros formatos de prueba En un ejemplo alternativo, la etilación incrementada en una muestra se determina efectuando un procedimiento que comprende tratar la cromatina que contiene ácido nucleico con una cantidad de ADNasal bajo condiciones suficientes para que el ácido nucleico sea digerido y después detectar los fragmentos producidos. Este formato de prueba se predica en el entendimiento que la cromatina que contiene ADN metilado, por ejemplo, ADN hipermetilado, tiene una conformación más estrechamente cerrada que el ADN no hipermetilado y, como consecuencia, es menos susceptible a digestión de endonucleasa con ADNasal.
De conformidad con este método, los fragmentos de ADN de longitudes diferentes se producen mediante digestión con ADNasa I de ADN metilado en comparación con ADN no metilado. Dichos fragmentos de ADN diferentes se detectan, por ejemplo, utilizando una prueba descrita anteriormente. De manera alternativa, los fragmentos de ADN se detectan utilizando PCR-SSCP esencialmente como se describe, por ejemplo, en Gregory y Feil, Nucleic Acids Res . , 27, e32i-e32iv, 1999. Para adaptar PCR-SSCP a la presente invención, los iniciadores de amplificación que flanquean o que comprenden uno o más dinucleótidos CpG en un ácido nucleico que son resistentes a digestión con ADNasa I en una muestra de neoplasia pero que no son resistentes a digestión con ADNasa I en una muestra sana/normal de control o muestra sana/normal de prueba se utilizan para amplificar los fragmentos generados con ADNasa I. En este caso, la producción de un fragmento de ácido nucleico especifico utilizando ADNasa I es diagnóstico de neoplasia, debido a que el ADN no es degradado eficientemente. En contraste, el ADN de plantilla proveniente de una muestra del individuo sano/normal es degradado por la acción de ADNasa I y, como consecuencia, la amplificación falla para producir un producto de amplificación discreto. Métodos alternativos a PCR-SSCP, tal como por ejemplo, PCR-dHPLC también son conocidos en la téenica y están contemplados por la presente invención. (d) Mutagénesis selectiva de ADN no met Hado En un método alternativo la metilación incrementada en una muestra se determina utilizando un procedimiento que comprende tratar el ácido nucleico con una cantidad de un compuesto que muta selectivamente un residuo citosina no metilado dentro de un dinucleótido CpG bajo condiciones suficientes para inducir la mutagénesis.
Los compuestos preferidos que mutan la citosina a uracilo o timidina, tal como, por ejemplo, una sal de bisulfito, por ejemplo bisulfito de sodio o bisulfito de potasio (Frommer et al . , 1992, supra) . El tratamiento del ADN con bisulfito es conocido porque distingue los residuos citosina metilados de los no metilados, mutando los residuos citosina que no están protegidos por metilación, incluyendo residuos citosina que no están dentro de un dinucleótido CpG o que están posicionados dentro de un dinucleótido CpG que no es sujeto a metilación.
Detección basada en secuencia En un ejemplo, la presencia de uno o más nucleótidos mutados o el número de secuencias mutadas se determina sometiendo a determinación de secuencia el ADN mutado. Una forma de análisis comprende amplificar el ácido nucleico mutado utilizando una reacción de amplificación descrita en la presente solicitud, por ejemplo, PCR. El producto amplificado se somete después directamente a determinación de secuencia o se clona y el producto clonado se somete a determinación de secuencia. Los métodos para determinación de secuencia de ADN son conocidos en la téenica e incluyen por ejemplo el método de terminación de cadena didesoxi o el método de Maxam-Gilbert (véase Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2a Ed., CSHP, New York 1989) o Zyskind et al . , Recombinant DNA Laboratory Manual, (Acad. Press, 1988)).
Debido a que el tratamiento del ácido nucleico con un compuesto, tal como, por ejemplo, bisulfito da como resultado que las citosinas no metiladas se muten a uracilo (y por lo tanto a timidina después de un procedimiento de amplificación), el análisis de la secuencia determina la presencia o ausencia de un nucleótido metilado. Por ejemplo, comparando la secuencia que se obtiene utilizando una muestra de control o una muestra que no ha sido tratada con bisulfito, o la secuencia de nucleótido conocida de la región de interés con una muestra tratada facilita la detección de las diferencias en la secuencia de nucleótido. Cualquier residuo timina detectado en el sitio de una citosina en la muestra tratada en comparación con una muestra de control o no tratada puede ser considerado como causado por mutación como resultado del tratamiento con bisulfito. Los métodos apropiados para la detección de metilación utilizando determinación de secuencia del ácido nucleico tratado con bisulfito se describen, por ejemplo, en Frommer et al., 1992, supra o Clark et al., Nucí . Acids Res. 22:2990-2997, 1994.
En otro método, la presencia de un nucleótido mutado o no mutado en una muestra tratada con bisulfito se detecta utilizando piro-determinación de secuencia, tal como se describe, por ejemplo, en Uhlmann et al., Electrophoresis, 23: 4072-4079, 2002. Esencialmente este método es una forma de determinación de secuencia en tiempo real que utiliza un iniciador que se híbrida a un sitio adyacente o cercano al sitio de una citosina que está metilada. Después de la hibridación del iniciador y la plantilla en presencia de una ADN polimerasa cada uno de los cuatro trifosfatos de desoxinucleótido modificados se agregan por separado de conformidad con un orden de dispensación predeterminado. Solamente se incorpora un nucleótido agregado que es complementario a la muestra tratada con bisulfito y se libera pirofosfato inorgánico (PPi). El PPi después impulsa una reacción que da como resultado la producción de niveles detectables de luz. Dicho método permite la determinación de la identidad de un nucleótido especifico adyacente al sitio de hibridación del iniciador.
Los métodos de piro-determinación de secuencia en fase sólida son conocidos en la téenica y revisados en, por ejemplo, Landegren et al . , Genome Res. , 8(8): 769-776, 1998. Dichos métodos permiten la detección con alto rendimiento de la metilación de un número de dinucleótidos CpG.
Un método relacionado para determinar la secuencia de un nucleótido tratado con bisulfito es extensión de iniciador de nucleótido individual sensible a metilación (Me-SnuPE) o SNaPmeth. Los métodos apropiados se describen, por ejemplo, en Gonzalgo y Jones, 1997, supra, o Uhlmann et al . , Electrophoresis , 23:4072-4079, 2002. Se utiliza un oligonucleótido que se híbrida a la región de un ácido nucleico adyacente al sitio de una citosina que está metilada. Este oligonucleótido se utiliza después en un protocolo de extensión de iniciador con una polimerasa y un difosfato de nucleótido libre o trifosfato de didesoxinucleótido que corresponde a cualquiera de las posibles bases que ocurren en este sitio después del tratamiento con bisulfito (es decir, timina o citosina). De preferencia, el nucleótido-difosfato está marcado con un marcador detectable (por ejemplo un fluoróforo). Después de la extensión del iniciador, los nucleótido-difosfatos marcados no unidos se retiran, por ejemplo, utilizando cromatografía por exclusión de tamaños o electroforesis, o se hidrolizan, utilizando por ejemplo, fosfatasa alcalina, y se detecta la incorporación del nucleótido marcado al oligonucleótido, indicando la base que está presente en el sitio.
Claramente otros métodos de determinación de secuencia de alto rendimiento están abarcados por la presente invención. Dichos métodos incluyen, por ejemplo, mini-determinación de secuencia en fase sólida (como se describe, por ejemplo, en Southern et al., Genomics, 13:1008-1017, 1992), o mini-determinación de secuencia con FRET (como se describe, por ejemplo, en Chen y Kwok, Nucleic Acids Res. 25:347-353, 1997).
Formato de prueba basado en endonucleasa de restricción En un método, la presencia de una secuencia no mutada se detecta utilizando análisis de restricción con bisulfito combinado (COBRA) esencialmente en la forma descrita en Xiong y Laird, 2001, supra . Este método explota las diferencias en los sitios de reconocimiento de enzima de restricción entre el ácido nucleico metilado y el no metilado después de tratamiento con un compuesto que muta selectivamente un residuo citosina no metilado, por ejemplo, bisulfito.
Después del tratamiento con bisulfito se amplifica una región de interés que comprende uno o más dinucleótidos CpG que están metilados y están incluidos en una secuencia de reconocimiento de endonucleasa de restricción utilizando una reacción de amplificación descrita en la presente solicitud, por ejemplo, PCR. El producto amplificado después se pone en contacto con la enzima de restricción que corta en el sitio del dinucleótido CpG durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para que ocurra el corta. Se puede seleccionar un sitio de restricción para indicar la presencia o ausencia de metilación. Por ejemplo, la endonucleasa de restricción Taql corta la secuencia TCGA, después del tratamiento con bisulfito de un ácido nucleico no metilado la secuencia será TTGA y, como consecuencia, no sera cortada. El ácido nucleico digerido y/o no digerido se detecta después utilizando medios de detección conocidos en la téenica, tal como, por ejemplo, electroforesis y/o espectrometría de masas. La escisión o no escisión del ácido nucleico es indicativa de cáncer en un individuo. Claramente, este método se puede utilizar en cualquiera de un sistema de lectura positiva o de lectura negativa para el diagnóstico de un cáncer.
Formato de prueba de lectura positiva En una modalidad, el formato de prueba de la invención comprende un sistema de lectura positiva en el cual el ADN proveniente de una muestra que ha sido tratada, por ejemplo, con bisulfito se detecta como una señal positiva. De preferencia, el ADN no hipermetilado proveniente de un individuo de control sano o normal no es detectado o se detecta sólo débilmente.
En una modalidad preferida, la metilación incrementada en una muestra del individuo se determina utilizando un procedimiento que comprende: (i) tratar el ácido nucleico con una cantidad de un compuesto que muta selectivamente un residuo citosina no metilado bajo condiciones suficientes para inducir mutagénesis con lo cual se produce un ácido nucleico mutado; (ii) hibridar un ácido nucleico a una sonda o iniciador que comprende una secuencia de nucleótido que es complementaria a una secuencia que comprende un residuo citosina metilado bajo condiciones tales que ocurra la hibridación selectiva al ácido nucleico no utado; y (iii) detectar la hibridación selectiva.
En este contexto, el término "hibridación selectiva" significa que la hibridación de una sonda o iniciador al ácido nucleico no mutado ocurre a una frecuencia o tasa más alta, o tiene una velocidad de reacción máxima más alta, que la hibridación de la misma sonda o iniciador a la secuencia mutada correspondiente. De preferencia, la sonda o iniciador no se híbrida a la secuencia no metilada que porta la o las mutaciones bajo las condiciones de reacción utilizadas.
Formato de prueba basada en hibridación En una modalidad, la hibridación se detecta utilizando Southern, dot blot, slot blot u otros medios de hibridación de ácido nucleico (Kawai et al . , 1994, supra; Gonzalgo et al., 1997, supra) . Sujetos a la selección de sonda apropiada, dichos formatos de prueba se describieron en términos generales anteriormente y se aplica cambiando lo que se tenga que cambiar a la estrategia de mutagénesis selectiva descrita en la presente.
De preferencia, se utiliza un formato de reacción en cadena de ligasa para distinguir entre un ácido nucleico mutado y uno no mutado. La reacción en cadena de ligasa (descrita en los documentos EP 320,308 y patente E.U.A. No. 4,883,750)utiliza por lo menos dos sondas de oligonucleótido que se fijan a un ácido nucleico objetivo en tal forma que éstos están yuxtapuestos en el ácido nucleico objetivo. En una prueba de reacción en cadena de ligasa, el ácido nucleico objetivo se híbrida a una primera sonda que es complementaria a una porción de diagnóstico de la secuencia objetivo (la sonda de diagnóstico) por ejemplo, un ácido nucleico que comprende uno o más dinucleótidos CpG metilados, y con una segunda sonda que es complementaria a una secuencia de nucleótido contigua con la porción de diagnóstico (la sonda contigua), bajo condiciones en las cuales la sonda de diagnóstico permanece unida sustancialmente sólo al ácido nucleico objetivo. Las sondas de diagnóstico y contigua pueden ser de longitudes diferentes y/o tener temperaturas de fusión diferentes de modo tal que se pueda ajustar la astringencia de la hibridación para permitir su hibridación selectiva al objetivo, en el cual la sonda que tiene la temperatura de fusión más alta se híbrida a astringencia más alta y, después de lavar para retirar la sonda no unida y/o no unida selectivamente, la otra sonda que tiene la temperatura de fusión más baja se híbrida a astringencia más baja. La sonda de diagnóstico y la sonda contigua se ligan después covalentemente tal como, por ejemplo, utilizando ADN ligasa T4, para de esta manera producir una sonda objetivo más grande que sea complementaria a la secuencia objetivo, y las sondas que no son ligadas se retiran modificando la astringencia de la hibridación. En este sentido, las sondas que no han sido ligadas se hibridarán selectivamente bajo condiciones de hibridación de baja astringencia que las sondas que han sido ligadas. Por consiguiente, la astringencia de la hibridación se puede incrementar hasta una astringencia que sea por lo menos tan alta como la astringencia utilizada para hibridar la sonda más larga, y de preferencia a una astringencia más alta debido a la longitud incrementada aportada por la sonda más corta después de la ligación.
En otro ejemplo, una o ambas sondas se marcan de modo tal que la presencia o ausencia de la secuencia objetivo se puede analizar fundiendo el dúplex objetivo-sonda, eluyendo la sonda disociada, y analizando respecto a la marca o marcas. En casos en los que ambas sondas estén marcadas, se utilizan ligandos diferentes para permitir la distinción entre las sondas ligadas y no ligadas, en cuyo caso la presencia de ambas marcas en la misma fracción de eluato confirma el evento de ligación. Si el ácido nucleico objetivo está unido a una matriz sólida, por ejemplo, en una hibridación Southern, slot blot, dot blot, o formato de prueba de microchip, la presencia tanto de la sonda de diagnóstico como de la sonda contigua se puede determinar directamente.
Los microarreglos específicos de metilación (MSO) también son útiles para diferenciar entre una secuencia mutada y una no mutada. Un método apropiado se describe, por ejemplo, en Adorjan et al . Nucí . Acids Res. , 30: e21, 2002. MSO utiliza ácido nucleico que ha sido tratado con un compuesto que muta selectivamente un residuo citosina no metilado (por ejemplo, bisulfito) como plantilla para una reacción de amplificación que amplifica tanto al ácido nucleico mutante como al ácido nucleico no mutado. La amplificación se efectúa con por lo menos un iniciador que comprende una marca detectable, tal como, por ejemplo, un fluoróforo, por ejemplo, Cy3 o Cy5.
Para producir un microarreglo para detección de ácido nucleico mutado, los oligonucleótidos se aplican como manchas sobre, por ejemplo, un portaobjetos de vidrio, de preferencia, con un grado de redundancia (por ejemplo, como se describe en Golub et al . , Science, 286:531-537, 1999). De preferencia, para cada dinucleótido CpG analizado se utilizan dos oligonucleótidos diferentes. Cada oligonucleótido comprende una secuencia N2-16CGN2-16 o N2- 16TGN2-16 (en las cuales N es un número de nucleótidos adyacentes o yuxtapuestos al dinucleótido CpG de interés) que refleja el estado metilado o no metilado de los dinucleótidos CpG.
Los productos de amplificación marcados se hibridan después a los oligonucleótidos en el microarreglo bajo condiciones que permiten la detección de diferencias de nucleótido individual. Después del lavado para remover el producto de amplificación no unido, la hibridación se detecta utilizando, por ejemplo, un escáner de microarreglo. Este método no solamente permite la determinación del estado de metilación de un número grande de dinucleótidos CpG, éste también es semi-cuantitativo, lo que permite la determinación del grado de metilación en cada dinucleótido CpG analizado. Debido a que podría existir algún grado de heterogeneidad de metilación en una muestra individual, dicha cuantificación puede ayudar en la diagnosis de cáncer.
Formato de prueba basada en amplificación En un ejemplo alternativo, la hibridación se detecta utilizando un sistema de amplificación. En formatos de PCR específicos de metilación (MSP; Hermán et al . Proc. Nati . Acad. Sci . USA 93:9821-9826, 1992), la hibridación se detecta utilizando un procedimiento que comprende amplificar el ADN tratado con bisulfito. Por consiguiente, mediante el uso de una o más sondas o iniciadores que se fijan específicamente a la secuencia no mutada bajo condiciones de astringencia moderadas y/o altas un producto de amplificación se produce solamente utilizando una muestra que comprende un nucleótido metilado. Las pruebas alternativas que proveen amplificación selectiva de cualquiera del componente metilado o el componente no metilado a partir de una mezcla de ADN tratado con bisulfito son provistas por Cottrell et al . , Nucí . Acids Res. 32: elO, 2003 (PCR densa en metilo), Rand et al . Nucí . Acids Res. 33:el27, 2005 (PCR de asa en la cabeza), Rand et al . Epigenetics 1:94-100, 2006 (PCR de desnaturalización diferencial con bisulfito) y PCT/AU07/000389 (PCR específica de extremo).
Se puede utilizar cualquier formato de prueba de amplificación descrito en la presente solicitud, tal como, por ejemplo, reacción en cadena de polimerasa (PCR), amplificación de círculo rodante (RCA), reacción en cadena de polimerasa inversa (iPCR), PCR in situ (Singer-Sam et al . , 1990, supra ) , amplificación por desplazamiento de cadena, o teenología de recielado de sonda. Se han desarrollado técnicas de PCR para detección de mutaciones de gen (Kuppuswamy et al . , Proc . Nati . Acad. Sci . USA 88:1143-1147, 1991) y cuantificación de expresión específica alélica (Szabo and Mann, Genes Dev. 9: 3097- 3108, 1995; y Singer-Sam et al . , PCR Methods Appl . 1: 160- 163, 1992). Dichas téenicas utilizan iniciadores internos, los cuales se fijan a una plantilla generada por PCR y terminan inmediatamente 5' del nucleótido individual a ser analizado. Dicho formato se combina fácilmente con la reacción en cadena de ligasa como se describió anteriormente en la presente solicitud. El uso de un formato de prueba cuantitativa en tiempo real también es útil. Sujetos a la selección de los iniciadores apropiados, dichos formatos de prueba se describieron en términos generales anteriormente en la presente solicitud y se aplican cambiando lo que se tenga que cambiar a la estrategia de mutagénesis selectiva descrita en la presente.
El análisis de curva de fusión especifico de metilación (esencialmente como se describe en Worm et al., Clin . Chem. , 47:1183-1189, 2001) también está contemplado por la presente invención. Este procedimiento explota la diferencia en temperatura de fusión en los productos de amplificación que se producen utilizando ácido nucleico metilado o no metilado tratado con bisulfito. En esencia, se efectúa una amplificación no discriminatoria de una muestra tratada con bisulfito en presencia de un colorante fluorescente que según específicamente al ADN de doble cadena (por ejemplo, SYBR Green I). Incrementando la temperatura del producto de amplificación al tiempo que se monitorea la fluorescencia se determinan las propiedades de fusión y por lo tanto la secuencia del producto de amplificación. Un decremento en la fluorescencia refleja la fusión de por lo menos un dominio en el producto de amplificación. La temperatura a la cual disminuye la fluorescencia es indicativa de la secuencia de nucleótido del ácido nucleico amplificado, con lo cual se permite que el nucleótido en el sitio de uno o más dinucleótidos CpG se pueda determinar. Como la secuencia de los ácidos nucleicos amplificados utilizando la presente invención La presente invención también abarca el uso de formas cuantitativas en tiempo real de PCR, tal como, por ejemplo, TaqMan (Holland et al . , Proc. Nati . Acad. Sci . USA, 88:7276-7280, 1991; Lee et al . , Nucleic Acid Res. 21:3761-3766, 1993) para efectuar esta modalidad. Por ejemplo, el método MethylLight de Eads et al . , Nucí . Acids Res . 28: E32, 2000 utiliza una prueba TaqMan modificada para detectar la metilación de un dinucleótido CpG. Esencialmente, este método comprende tratar una muestra de ácido nucleico con bisulfito y amplificar el ácido nucleico que comprende uno o más de nucleótidos CpG que están metilados en una célula neoplásica y no en una muestra de control utilizando una reacción de amplificación, por ejemplo, PCR. La reacción de amplificación se efectúa en presencia de tres oligonucleótidos, un iniciador sentido y antisentido que flanquea la región de interés y una sonda que se híbrida entre los dos iniciadores al sitio de dichos uno o más dinucleótidos CpG metilados. La sonda está doblemente marcada con un reportero fluorescente 5' y un terminador 3' (o viceversa). Cuando la sonda está intacta, el colorante del terminador absorbe la fluorescencia del reportero debido a su proximidad. Después de fijar al producto de PCR la sonda es cortada por actividad de exonucleasa 5' a 3' de, por ejemplo, ADN polimerasa Taq. Este corte libera al reportero del terminador lo cual resulta en una señal de fluorescencia incrementada que se puede utilizar para calcular el nivel de metilación de plantilla inicial. Mediante el uso de una sonda o iniciador que se híbrida selectivamente al ácido nucleico no mutado (es decir ácido nucleico metilado) se determina el nivel de metilación, por ejemplo, utilizando una curva patrón.
De manera alternativa, en vez de utilizar una sonda marcada que requiere corte, se utiliza una sonda, tal como, por ejemplo, una baliza molecular (véase, por ejemplo, Mhlanga y Malmberg, Methods 25:463-471, 2001). Las balizas moleculares son moléculas de ácido nucleico de cadena individual con una estructura de tallo y asa. La estructura del asa es complementaria a la región que rodea dichos uno o más dinucleótidos CpG que están metilados en una muestra neoplásica y no en una muestra de control. La estructura de tallo se forma fijando dos "brazos" complementarios entre si, los cuales están en cualquier lado de la sonda (asa). Una porción fluorescente se une a un brazo y una porción de extinción que suprime cualquier fluorescencia detectable cuando la baliza molecular no está unida a una secuencia objetivo está unida al otro brazo. Después de la unión de la región de asa a su ácido nucleico objetivo los brazos se separan y la fluorescencia se puede detectar. Sin embargo, incluso un no apareamiento de base individual altera significativamente el nivel de fluorescencia detectado en una muestra. Por consiguiente, la presencia o ausencia de una base particular se determina mediante el nivel de fluorescencia detectada. Dicha prueba facilita la detección de uno o más sitios no mutados (es decir nucleótidos metilados) en un ácido nucleico.
Las moléculas de ácido nucleico enganchado (LNA) marcadas en forma fluorescente o las moléculas de ácido nucleico-proteina (PNA) marcadas en forma fluorescente son útiles para la detección de diferencias de nucleótido (por ejemplo, como se describe en Simeonov y Nikiforov, Nucleic Acids Research, 30(17):1—5, 2002). Las moléculas de LNA y PNA molecules se unen, con alta afinidad, al ácido nucleico, en particular, ADN. Los fluoróforos (en particular, rodomina o hexaclorofluoresceina) conjugados a la sonda de LNA o PNA fluorescen a un nivel significativamente mayor después de la hibridación de la sonda al ácido nucleico objetivo. Sin embargo, el nivel de incremento de la fluorescencia no se incrementa hasta el mismo nivel cuando ocurre incluso un no apareamiento de nucleótido individual. Por consiguiente, el grado de fluorescencia detectado en una muestra es indicativo de la presencia de un no apareamiento entre la sonda de LNA o PNA y el ácido nucleico objetivo, tal como, en presencia de una citosina mutada en un dinucleótido CpG metilado. De preferencia, la teenología de LNA o PNA marcado en forma floreciente se utiliza para detectar por lo menos un cambio de base individual en un ácido nucleico que ha sido amplificado previamente utilizando, por ejemplo, un método de amplificación conocido en la técnica y/o descrito en la presente solicitud.
Como será evidente para el experto en la técnica, la tecnología de detección de LNA o PNA es susceptible a una detección de alto rendimiento de uno o más marcadores inmovilizando una sonda de LNA o PNA a un soporte sólido, como se describe en Orum et al . , Clin . Chem. 45:1898-1905, 1999.
De manera alternativa, una prueba en tiempo real, tal como, por ejemplo, la denominada prueba HeavyMethyl (Cottrell et al . , 2003, supra) se utiliza para determinar la presencia o nivel de metilación de ácido nucleico en una muestra de prueba. Esencialmente, este método utiliza uno o más bloqueadores de ácido nucleico non extendibles (por ejemplo, oligonucleótido) que se unen al ácido nucleico tratado con bisulfito en una manera especifica de metilación (es decir, el bloqueador o bloqueadores se unen específicamente a ADN no mutado bajo condiciones de astringencia moderadas a altas). Se efectúa una reacción de amplificación utilizando uno o más iniciadores que opcionalmente pueden ser específicos de metilación pero que flanquean dichos uno o más bloqueadores. En presencia de ácido nucleico no metilado (es decir, ADN no mutado) el bloqueador o bloqueadores se unen y no se produce producto de PCR. Utilizando una prueba TaqMan esencialmente como se describió supra se determina el nivel de metilación de ácido nucleico en una muestra.
Otros métodos basados en amplificación para detectar ácido nucleico metilado después de tratamiento con un compuesto que muta selectivamente un residuo citosina no metilado incluyen, por ejemplo, análisis de conformación de cadena individual específico de metilación (MS-SSCA) (Bianco et al . , Hum . Mutat . , 14:289-293, 1999), electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante específico de metilación (MS-DGGE) (Abrams y Stanton, Methods Enzymol . , 212:71-74, 1992) y cromatografía líquida de alto desempeño desnaturalizante específica de metilación (MS-DHPLC) (Deng et al . Chin . J. Cáncer Res . , 12:171-191, 2000). Cada uno de estos métodos utiliza téenicas diferentes para detectar diferencias de ácido nucleico en un producto de amplificación tomando como base las diferencias en la secuencia de nucleótidos y/o estructura secundaria. Dichos métodos claramente están contemplados por la presente invención.
Al igual que con otros formatos de prueba basada en amplificación, el producto de amplificación se analiza utilizando una gama de procedimientos, incluyendo electroforesis en gel, filtración en gel, espectrometría de masas, y en el caso de iniciadores marcados, mediante identificación de la marca en el producto de amplificación. En una modalidad alternativa, la digestión con enzima de restricción de los productos de PCR amplificados a partir de ADN convertido con bisulfito se efectúa esencialmente como lo describe Sadri y Hornsby, Nucí . Acids Res. 24:5058-5059, 1996; y Xiong y Laird, Nucí . Acids Res. 25:2532-2534, 1997), para analizar el producto formado.
También se pueden utilizar métodos de detección de alto rendimiento, tales como, por ejemplo, desorción/ionización de láser asistida con matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF), , ionización por electroaspersión (ESI), espectrometría de masas (incluyendo espectrometría de masas en tándem, por ejemplo LC MS/MS), tecnología de biosensor, teenología de fibra óptica evanescente o o tecnología de chip de ADN.
Al igual que con los otros formatos de prueba descritos en la presente solicitud que utilizan sistemas de hibridación y/o de detección de amplificación, las combinaciones de dichos procedimientos como se describieron anteriormente en la presente solicitud están particularmente contemplados por los formatos de prueba basados en mutagénesis selectiva de la presente invención. En un ejemplo, la metílación incrementada se detecta efectuando un procedimiento que comprende: (i) tratar el ácido nucleico con una cantidad de un compuesto que muta selectivamente un residuo citosina no metilado dentro de un dinucleótido CpG bajo condiciones suficientes para inducir mutagénesis con lo cual se produce un ácido nucleico mutado; (ii) hibridar el ácido nucleico a dos iniciadores no complementarios y que no se traslapan cada uno de los cuales comprende una secuencia de nucleótido que es complementaria a una secuencia en el ADN que comprende un residuo citosina metilado bajo condiciones tales que ocurre la hibridación al ácido nucleico no mutado; (iii) amplificar el ácido nucleico que intercala los iniciadores hibridados con lo cual se produce un fragmento de ADN que consiste de una secuencia que comprende una secuencia de iniciador; (iv) hibridar el fragmento de ADN amplificado a una sonda que comprende una secuencia de nucleótido que corresponde o que es complementaria a una secuencia que comprende un residuo citosina metilado bajo condiciones tales que ocurre la hibridación al ácido nucleico no mutado; y detectar la hibridación.
Pruebas de lectura negativa En otro ejemplo, el formato de prueba comprende un sistema de lectura negativa en el cual se detecta metilación reducida de ADN proveniente de una muestra de control sana/normal como una señal positiva y de preferencia, el ADN metilado proveniente de una muestra neoplásica no se detecta o se detecta sólo débilmente.
En una modalidad preferida, la metilación reducida se determina utilizando un procedimiento que comprende: (i) tratar el ácido nucleico con una cantidad de un compuesto que muta selectivamente un residuo citosina no metilado dentro de un islote de CpG bajo condiciones suficientes para inducir mutagénesis con lo cual se produce un ácido nucleico mutado; (ii) hibridar el ácido nucleico a una sonda o iniciador que comprende una secuencia de nucleótido que es complementaria a una secuencia que comprende el residuo citosina mutado bajo condiciones tales que ocurra la hibridación selectiva al ácido nucleico mutado; y (iii) detectar la hibridación selectiva.
En este contexto, el término "hibridación selectiva" significa que la hibridación de una sonda o iniciador al ácido nucleico mutado ocurre a una frecuencia o tasa más alta, o tiene una velocidad de reacción máxima más alta, que la hibridación de la misma sonda o iniciador a la secuencia no mutada correspondiente. De preferencia, la sonda o iniciador no se híbrida a la secuencia metilada (o secuencia no mutada) bajo las condiciones de reacción utilizadas.
Formato de prueba basada en hibridación En una modalidad la hibridación se detecta utilizando Southern, dot blot, slot blot u otros medios de hibridación a ácido nucleico (Kawai et al . , 1994, supra; Gonzalgo et al . , 1997, supra) . Sujetos a la selección de la sonda apropiada, dichos formatos de prueba se describieron en términos generales anteriormente en la presente solicitud y se aplican cambiando lo que se tenga que cambiar a la estrategia de mutagénesis selectiva descrita en la presente solicitud. De preferencia, se emplea un formato de reacción en cadena de ligasa para distinguir entre un ácido nucleico no mutado y uno mutado. En este sentido, los requerimientos y condiciones de la prueba son como se describieron anteriormente en la presente solicitud para las pruebas de lectura positiva y se aplican cambiando lo que se tenga que cambiar al presente formato. Sin embargo la selección de sondas será diferente. Para las pruebas de lectura negativa, se seleccionan una o más sondas que se hibriden selectivamente a la secuencia montada en vez de la secuencia no mutada.
De preferencia, la sonda o sondas de la reacción en cadena de ligasa tienen secuencias 3'-terminales y/o 5'-terminales que comprenden un dinucleótido CpG que no está metilado en una muestra de control sana, pero que está hipermetilado en cáncer, de modo tal que la sonda de diagnóstico y la sonda contigua sean capaces de ser ligadas únicamente cuando la citosina del dinucleótido CpG está mutada a timidina por ejemplo, en el caso de un residuo citosina no metilado.
Como será evidente para el experto en la téenica el método MSO descrito supra es susceptible de cualquiera o ambas de pruebas de lectura positiva y/o negativa. Esto es porque la prueba descrita detecta secuencias tanto mutadas como no mutadas con lo cual facilita determinar el nivel de metilación. Sin embargo, la invención contempla una prueba que detecte solamente secuencias metiladas o no metiladas.
Formato de prueba basada en amplificación En un ejemplo alternativo, la hibridación se detecta utilizando un sistema de amplificación utilizando cualquier formato de prueba de amplificación como los descritos anteriormente en la presente solicitud para prueba de lectura positiva aunque utilizando iniciadores (y sondas en donde sea aplicable) que se hibridan selectivamente a un ácido nucleico mutado.
Para adaptar la prueba HeavyMethyl descrita supra a un formato de lectura negativa, los bloqueadores que se unen al ácido nucleico tratado con bisulfito en una manera especifica de metilación se unen específicamente al ADN mutado bajo condiciones de astringencia moderadas a altas. Se efectúa una reacción de amplificación utilizando uno o más iniciadores que pueden opcionalmente ser específicos de metilación (es decir se unen solamente al ácido nucleico mutado) pero que flanquean dichos uno o más bloqueadores. En presencia de ácido nucleico metilado (es decir, ADN mutado) el o los bloqueadores se unen y no se produce producto de PCR.
En un ejemplo, la metilación reducida en el individuo de control normal/sano se detecta efectuando un procedimiento que comprende: (i) tratar el ácido nucleico con una cantidad de un compuesto que muta selectivamente los residuos citosina no metilados bajo condiciones suficientes para inducir mutagénesis con lo cual se produce un ácido nucleico mutado; (ii) hibridar el ácido nucleico a dos iniciadores no complementarios y que no se traslapan cada uno de los cuales comprende una secuencia de nucleótido que es complementaria a una secuencia en el ADN que comprende un residuo citosina mutado bajo condiciones tales que ocurre la hibridación al ácido nucleico mutado; (iii) amplificar el ácido nucleico que intercala los iniciadores hibridados con lo cual se produce un fragmento de ADN que consiste de una secuencia que comprende una secuencia de iniciador; (iv) hibridar el fragmento de ADN amplificado a una sonda que comprende una secuencia de nucleótido que corresponde o que es complementaria a una secuencia que comprenden un residuo citosina mutado bajo condiciones tales que ocurre la hibridación al ácido nucleico mutado; y (v) detectar la hibridación.
Como será evidente para el experto en la téenica una prueba de lectura negativa de preferencia incluye una muestra de control apropiada para asegurar que el resultado negativo sea ocasionado por el ácido nucleico metilado en vez de una reacción fallida.
Esta invención también provee kits para la detección y/o cuantificación de las secuencias de diagnóstico de la invención, o la expresión o metilación de las mismas utilizando los métodos descritos en la presente solicitud.
Para kits para la detección de metilación, los kits de la invención pueden comprender por lo menos un polinucleótido que se híbrida a por lo menos una de las secuencias de diagnóstico de la invención y por lo menos un reactivo para detección de la metilación del gen. Los reactivos para detección de metilación incluyen, por ejemplo, bisulfito de sodio, polinucleótidos diseñados para que se hibriden a la secuencia que es el producto de una secuencia de biomarcador de la invención si la secuencia de biomarcador no está metilada (por ejemplo, que contenga por lo menos una conversión C-»U), y/o una enzima de restricción sensible a la metilación o dependiente de la metilación. Los kits también pueden incluir secuencias de ADN natural o sintéticas de control que representan las formas metilada o no metilada de la secuencia. Los kits pueden proveer soportes sólidos en forma de un aparato de prueba que está adaptado para uso en la prueba. Los kits también pueden comprender marcas detectables, opcionalmente ligadas a un polinucleótido, por ejemplo, una sonda, en el kit. También se pueden incluir en los kits otros materiales útiles en la ejecución de las pruebas, incluyendo tubos de ensayo, pipetas para transferencia, y similares. Los kits también pueden incluir instrucciones por escrito para el uso de uno o más de dicho reactivos en cualquiera de las pruebas descritas en la presente solicitud.
Como se detalló anteriormente en la presente solicitud, la hipermetilación está asociada con el silenciamiento de la transcripción. Por consiguiente, además del nivel incrementado de metilación de estos genes que provee una base sobre la cual se tamiza respecto a la predisposición a o al inicio de un neoplasma del intestino grueso, la regulación en forma negativa en el nivel de expresión de estos genes también es valiosa desde el punto de vista de diagnóstico. De conformidad con este aspecto de la presente invención, la referencia a un "producto de expresión" de un gen o "la expresión de un gen" es una referencia a cualquiera de un producto de transcripción (tal como ARN primario o ARNm) o a un producto de traducción tal como proteina. En este sentido, se pueden evaluar los cambios al nivel de expresión de un gen ya sea tamizando respecto a cambios al nivel de expresión de producto que se produce (es decir ARN o proteina), cambios a las proteínas de la cromatina con las cuales está asociado el gen, por ejemplo la presencia de histona H3 metilada en la lisina en la posición de aminoácido número 9 ó 27 (modificaciones represoras) o cambios al ADN mismo que actúan para regular en forma negativa la expresión, tal como cambios a la metilación del ADN. Estos genes y sus productos de expresión de gen, ya sea que éstos sean transcritos de ARN, cambios al ADN que actúan para regular en forma negativa la expresión o las proteínas codificadas, son referidos colectivamente como "marcadores neoplásicos".
Por consiguiente, otro aspecto de la presente invención está dirigido a un método de tamizaje para el inicio o predisposición al inicio de o el monitoreo de un neoplasma del intestino grueso en un individuo, dicho método comprende evaluar el nivel de expresión de una región de ADN que se selecciona a partir de: (i) la región, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definida por cualesquiera dos o más de las coordenadas de HG19: (1) chrl2:24962958..25102393 (2) chr7:50344378...50472798 (3) chr6:391739..411443; o (4) chrl2:52400748..52409671; y (5) chr6:163834097..163834982; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de cualesquiera dos o más de: (1) BCAT1 (2) IKZF1 (3) IRF4 (4) GRASP y (5) CAHM en una muestra biológica proveniente de dicho individuo en el cual un nivel más bajo de expresión de por lo menos una de las regiones de ADN del grupo (i) y/o (ii) con relación a los niveles de control es indicativo de un neoplasma del intestino grueso o una predisposición al inicio de un estado neoplásico.
En una modalidad, dicho método está dirigido a identificar muestras biológicas en las cuales cualquiera de dichas regiones de ADN exhibe un nivel más alto de metilación .
En otra modalidad, dicho método está dirigido a identificar muestras biológicas en las cuales dos o más de dichas regiones de ADN exhiben un nivel más alto de metilación .
El método de este aspecto de la presente invención se predica en la comparación del nivel de los marcadores neoplásicos de una muestra biológica con los niveles de control de dichos marcadores. El "nivel de control" puede ser que sea un "nivel normal", el cual es el nivel del marcador expresado por una célula o población celular del intestino grueso correspondiente que no es neoplásica.
Como se delalló anteriormente en la presente solicitud, el nivel normal (o "no neoplásico") se puede determinar utilizando tejidos derivados a partir del mismo individuo que es el sujeto de análisis. Sin embargo, se apreciará que esto puede ser bastante invasivo para el individuo en cuestión y por lo tanto es probable que sea más conveniente analizar los resultados de la prueba con relación a un resultado estándar el cual refleja los resultados individuales o colectivos obtenidos a partir de individuos diferentes al paciente en cuestión.
De manera más particular se provee un método de tamizaje para el inicio o predisposición al inicio de o el monitoreo de un neoplasma del intestino grueso en un individuo, dicho método comprende evaluar el nivel de expresión de uno o más genes o transcritos que se seleccionan a partir de: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (1) chrl2:24962958..25102393; y (2) chr7:50344378...50472798; y opcionalmente uno o más de (3) chr6:391739..411443, (4) chrl2:52400748..52409671 y (5) chr6:163834097..163834982; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' o: (1) BCAT1; y (2) IKZF1; y opcionalmente uno o más de (3) IRF4, (4) GRASP y (5) CAHM en una muestra biológica proveniente de dicho individuo en el cual un nivel más bajo de expresión de por lo menos una de las regiones de ADN del grupo (i) y/o grupo (ii) con relación a los niveles de control es indicativo de un neoplasma del intestino grueso neoplásico o una predisposición al inicio de un estado neoplásico.
De preferencia, dicho nivel de control es un nivel no neoplásico.
En una modalidad de este aspecto, el panel de marcador de gen para el que se tamiza es: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (1) chrl2:24962958..25102393 (2) chr7:50344378...50472798; y (3) chr6:391739..411443; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (1) BCAT1 (2) IKZF1 y (3) IRF4.
En otra modalidad de este aspecto, el panel de marcador de gen para el que se tamiza es: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (1) chrl2:24962958..25102393 (2) chr7:50344378...50472798; y (4) chrl2:52400748..52409671; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (1) BCAT1 (2) IKZF1 y (4) GRASE.
Incluso en otra modalidad de este aspecto, el panel de marcador de gen para el que se tamiza es: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (1) chrl2:24962958..25102393 (2) chr7:50344378...50472798; y (5) chr6:163834097..163834982; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (1) BCAT1 (2) IKZF1 y (5) CAHM Incluso todavía en otra modalidad de este aspecto, el panel de marcador de gen para el que se tamiza es: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (1) chrl2:24962958..25102393 (2) chr7:50344378...50472798 (3) chr6:391739..411443; y (4) chrl2:52400748..52409671; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (1) BCAT1 (2) IKZF1 (3) IRF4 y (4) GRASP.
Todavía incluso en otra modalidad de este aspecto, el panel de marcador de gen para el que se tamiza es: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (1) chrl2:24962958..25102393 (2) chr7:50344378...50472798 (3) chr6:391739..411443; y (5) chr6:163834097..163834982; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (1) BCAT1 (2) IKZF1 (3) IRF4 y (5) CAHM.
En una modalidad adicional de este aspecto, el panel de marcador de gen para el que se tamiza es: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (1) chrl2:24962958..25102393 (2) chr7:50344378...50472798 (4) chrl2:52400748..52409671; y (5) chr6:163834097..163834982; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de cualquiera de uno o más de: (1) BCAT1 (2) IKZF1 (4) GRASP y (5) CAHM.
Incluso en otra modalidad adicional de este aspecto, el panel de marcador de gen para el que se tamiza es : (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (1) chrl2:24962958..25102393 (2) chr7:50344378...50472798 (3) chr6:391739..411443; o (4) chrl2:52400748..52409671; y (5) chr6:163834097..163834982; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de cualquiera de uno o más de: (1) BCAT1 (2) IKZF1 (3) IRF4 (4) GRASP y (5) CAHM.
En una modalidad, dicho método está dirigido a identificar muestras biológicas en las cuales cualquiera de dichas regiones de ADN exhibe un nivel más alto de metilación.
En otra modalidad, dicho método está dirigido a identificar muestras biológicas en las cuales dos o más de dichas regiones de ADN exhiben un nivel más alto de metilación .
Como se detalló anteriormente en la presente solicitud, la presente invención está diseñada para tamizar respecto a una célula o población celular neoplásica, está localizada en el intestino grueso. Por consiguiente, la referencia a "célula o población celular" se debe entender como una referencia a una célula individual o un grupo de células. Dicho grupo de células puede ser una población difusa de células, una suspensión celular, una población encapsula la de células o una población de células que toman forma de tejido.
La referencia a "expresión" se debe entender como una referencia a la transcripción y/o traducción de una molécula de ácido nucleico. La referencia a "ARN" se debe entender que abarca la referencia a cualquier forma de ARN, tal como ARN primario o ARNm o ARN no traducido (por ejemplo miRNAs etc.). Sin limitar la presente invención en ninguna forma, la modulación de la transcripción de gen que lleva a la síntesis incrementada o disminuida de ARN también se puede correlacionar con la traducción de algunos de estos transcritos de ARN (tal como ARNm) para producir un producto de proteína. Por consiguiente, la presente invención también se extiende a la metodología de detección la cual está dirigida a tamizaje para niveles modulados o patrones de los productos de proteína del marcador neoplásico como un indicador del estado neoplásico de una célula o población celular. Aunque un método es tamizar respecto a transcritos de ARNm y/o el producto de proteína correspondiente, se debe entender que la presente invención no está limitada en este sentido y se extiende al tamizaje para cualquier otra forma de producto de expresión de marcador neoplásico tal como, por ejemplo, un transcrito de ARN primario.
En términos de tamizaje para la regulación negativa de la expresión de un marcador también será del conocimiento del experto en la téenica que los cambios que son detectables a nivel de ADN son indicadores de cambios a la actividad de expresión de gen y por lo tanto cambios a los niveles de producto de expresión. Dichos cambios incluyen pero no se limitan a, cambios en la metilación de ADN. Por consiguiente, la referencia en la presente solicitud a "tamizar el nivel de expresión" y la comparación de estos "niveles de expresión" con "niveles de expresión" de control se debe entender como una referencia a evaluar factores del ADN que están relacionados con la transcripción, tal como los patrones de metilación de gen/ADN. Éstos han sido descritos, en parte, anteriormente con detalle en la presente solicitud.
También es sabido por el experto en la técnica que los cambios en la estructura de la cromatina son indicadores de cambios en la expresión de gen. El silenciamiento de la expresión de gen con frecuencia está asociado con modificación de las proteínas de la cromatina, siendo la metilación de las U sinas en cualquiera o ambas posiciones 9 y 27 de la histona H3 ejemplos bien estudiados, mientras que la cromatina activa está marcada por acetilación de la lisina 9 de la histona H3. Por lo tanto la asociación de secuencias de gen con cromatina que porta modificaciones represoras o activas se puede utilizar para hacer una evaluación del nivel de expresión de un gen.
La referencia a "molécula de ácido nucleico" se debe entender como una referencia tanto a moléculas de ácido desoxirribonucleico como a moléculas de ácido ribonucleico y fragmentos de los mismos. La presente invención por lo tanto se extiende tanto a tamizar directamente respecto a niveles de ARNm en una muestra biológica o a tamizar respecto al ADNc complementario que ha sido transcrito en forma inversa partir de una población de ARNm de interés. Está dentro de la habilidad del experto en la téenica diseñar metodología dirigida al tamizaje para cualquiera de ADN o ARN. Como se indicó en forma detallada anteriormente, el método de la presente invención también se extiende al tamizaje respecto al producto de proteína traducido a partir del ARNm del individuo o al ADN genómico mismo.
En una modalidad preferida, el nivel de expresión de gen se mide mediante referencia a genes que codifican para un producto de proteina y, de manera más particular, dicho nivel de expresión se mide a nivel de proteina.
En otra modalidad particularmente preferida, dicha expresión de gen se evalúa mediante la asociación del ADN con proteínas de la cromatina que portan modificaciones represoras, por ejemplo, metilación de las U sinas 9 ó 27 de la histona H3.
Se debe entender que la presente invención abarca métodos de detección basados en identificar proteínas y/o moléculas de ácido nucleico en una o más muestras biológicas. Esto puede ser de significancia particular hasta el grado en que algunos de los marcadores neoplásicos de interés puedan corresponder a genes o fragmentos de gen que no codifican para un producto de proteína. Por consiguiente, hasta el grado en que esto ocurra no sería posible analizar respecto a una proteína y el presente marcador tendría que ser evaluado con base a los perfiles de expresión de transcripción o cambios al ADN genómico.
Se debe entender que el término "proteína" abarca péptidos, polipéptidos y proteínas (incluyendo fragmentos de proteína). La proteína puede estar glucosilada o no glucosilada y/o puede contener una gama de otras moléculas fusionadas, ligadas, unidas o de alguna otra manera asociadas a la proteína tal como aminoácidos, lípidos, carbohidratos u otros péptidos, polipéptidos o proteínas. La referencia en la presente solicitud a una "proteína" incluye una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos así como una proteína asociada con otras moléculas tales como aminoácidos, lípidos, carbohidratos u otros péptidos, polipéptidos o proteínas.
Las proteínas codificadas por los marcadores neoplásicos de la presente invención pueden estar en forma multimérica lo que significa que dos o más moléculas están asociadas entre sí. En casos en que las mismas moléculas de proteína estén asociadas entre sí, el complejo es un homomultímero. Un ejemplo de un ho omultímero es un homodímero. En casos en que por lo menos una proteína marcadora esté asociada con por lo menos una proteína no marcadora, entonces el complejo es un heteromultímero tal como un heterodímero.
La referencia a un "fragmento" se debe entender como una referencia a una porción de la presente molécula de ácido nucleico o proteína. Esto es particularmente relevante con respecto al tamizaje para niveles de ARN modulados en muestras de heces debido a que el presente ARN probablemente haya sido degradado o de alguna otra manera fragmentado debido al entorno del intestino. Por lo tanto en realidad se podrían estar detectando fragmentos de la presente molécula de ARN, cuyos fragmentos se identifican en virtud del uso de una sonda adecuadamente especifica.
Aunque el método preferido es detectar el producto de expresión o cambios en el ADN de los marcadores neoplásicos para los propósitos de diagnosticar el desarrollo de neoplasia o la predisposición a la misma, la detección de cambios contrarios en los niveles de dichos marcadores podría ser deseada bajo ciertas circunstancias, por ejemplo, para monitorear la efectividad de tratamiento terapéutico o profiláctico dirigido a modular una condición neoplásica, tal como el desarrollo de adenoma o adenocarcinoma. Por ejemplo, en casos en los que la expresión reducida de los presentes marcadores indica que un individuo ha desarrollado una condición caracterizada por el desarrollo de adenoma o adenocarcinoma development, por ejemplo, el tamizaje respecto a un incremento en los niveles de dichos marcadores en forma subsiguiente al inicio de un régimen terapéutico podría ser utilizado para indicar la reversión u otra forma de mejoría de la presente condición del individuo. El método de la presente invención por lo tanto es útil como una prueba de una sola vez o como un monitoreo continuo de aquellos individuos que se cree están en riesgo de desarrollo de neoplasia o como un monitoreo de la efectividad de regímenes de tratamiento terapéutico o profiláctico dirigidos a inhibir o de alguna otra manera desacelerar el desarrollo de neoplasia.
Los medios para evaluar los presentes marcadores de neoplasma expresados en una muestra biológica se pueden lograr utilizando cualquier método apropiado, el cual será bien conocido por el experto en la téenica. Para este fin, se apreciará que hasta el grado en que se esté examinando ya sea una población celular homogénea (tal como una biopsia de tumor o una población celular que ha sido enriquecida a partir de una población de inicio heterogénea) o una sección de tejido, se puede utilizar una amplia gama de técnicas tales como hibridación in situ, evaluación de los perfiles de expresión mediante microensayos, inmunoensayos y similares (descritos con mayor detalle más adelante en la presente solicitud) para detectar la ausencia de o la regulación negativa del nivel de expresión de uno o más marcadores de interés. Sin embargo, hasta el grado en que se esté tamizando una población celular heterogénea o un fluido corporal en el cual se encuentran poblaciones heterogéneas de células, tal como una muestra de sangre, la ausencia de o la reducción en el nivel de expresión de un marcador particular podría ser indetectable debido a la expresión inherente del marcador por células no neoplásicas que estén presentes en la muestra un decremento en el nivel de expresión de un subgrupo de células podría no ser detectable. En esta situación, un mecanismo más apropiado para detectar una reducción en una subpoblación neoplásica de los niveles de expresión de uno o más marcadores de la presente invención es a través de medios indirectos, tal como la detección de cambios epigenéticos.
Los métodos para detectar cambios a los niveles de expresión de gen (además de los análisis de metilación descritos anteriormente con detalle en la presente solicitud), particularmente en casos en los que la presente muestra biológica no está contaminada con números elevados de células no neoplásicas, incluyen pero no se limitan a (1) Detección in vivo Se puede utilizar formación de imagen molecular después de la administración de sondas o reactivos para formación de imagen capaces de revelar la expresión alterada de los marcadores en los tejidos intestinales.
La formación de imagen molecular (Moore et al., BBA, 1402:239-249, 1988; Weissleder et al., Nature Medicine 6:351-355, 2000) es la formación de imagen in vivo de la expresión molecular que se correlaciona con las macro-caracteristicas actualmente visualizadas utilizando téenicas de formación de imagen de diagnóstico "clásicas" tales como rayos X, tomografia computarizada (CT), MRI, tomografía por emisión de positrones (PET) o endoscopia. (2) Detección de la regulación negativa de la expresión de ARN en las células mediante hibridación fluorescente in situ (FISH), o en extractos provenientes de las células utilizando teenologías tales como reacción en cadena de polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (QRTPCR) o calificación citométrica de flujo de productos de RT-PCR competitivos (Wedemcyer et al . , Clinical Chemistry 48:91398-1405, 2002). (iii) Evaluación de los perfiles de expresión de ARN, por ejemplo utilizando tecnologías de arreglo (Alón et al., Proc. Nati . Acad. Scí . USA: 96:6745-6750, junio de 1999).
Un "microarreglo" es un arreglo lineal o multidimensional de regiones de preferencia discretas, teniendo cada una un área definida, formado sobre la superficie de un soporte sólido. La densidad de las regiones discretas en un microarreglo se determina mediante los números totales de polinucleótidos objetivo a ser detectados sobre la superficie de un soporte de fase sólida individual. Tal como se utiliza en la presente solicitud, un microarreglo de ADN es un arreglo de sondas de oligonucleótido colocadas sobre un chip u otras superficies utilizadas para amplificar o clonar polinucleótidos objetivo. Debido a que se conoce la posición de cada grupo de sondas particular en el arreglo, se pueden determinar las identidades de los polinucleótidos objetivo tomando como base su unión a una posición particular en el microarreglo.
La teenología de microarreglo de ADN hace posible conducir una prueba a gran escala de una pluralidad de moléculas de ácido nucleico objetivo en un soporte de fase sólida individual. La patente E.U.A. No.5,837,832 (Chee et ai.) y solicitudes de patente relacionadas describen inmovilizar un arreglo de sondas de oligonucleótido para hibridación y detección de secuencias de ácido nucleico especificas en una muestra. Los polinucleótidos objetivo de interés aislados a partir de un tejido de interés se hibridan al chip de ADN y se detectan las secuencias específicas tomando como base la preferencia de los polinucleótidos objetivo y el grado de hibridación en las ubicaciones de sonda discreta. Un uso importante de los arreglos es en el análisis de expresión de gen diferencial, en el cual se compara el perfil de expresión de genes en células o tejidos diferentes, con frecuencia un tejido de interés y un tejido de control, y se identifican cualesquiera diferencias en la expresión de gen entre los tejidos respectivos. Dicha información es útil para la identificación de los tipos de genes expresados en un tipo de tejido particular y la diagnosis de condiciones basada en el perfil de expresión. (iv) Medición de los niveles de proteína marcadora neoplásica alterados en extractos celulares, por ejemplo mediante inmunoensayo.
El análisis respecto al producto de expresión de marcador neoplásico proteinico en una muestra biológica se puede efectuar mediante cualquiera de un número de métodos apropiados que son bien conocidos por los expertos en la téenica. Los ejemplos de métodos apropiados incluyen, pero no se limitan a, tamizaje con anticuerpo de secciones tisulares, especímenes de biopsia o muestras de fluido corporal. Hasta el grado en que se utilicen los métodos de diagnosis basados en anticuerpo, la presencia de la proteína marcadora se puede determinar en un número de formas tal como mediante análisis Western blot, ELISA o procedimientos de cito etría de flujo. Desde luego, estos incluyen pruebas tanto de sitio individual como de sitio doble o "en emparedado" de los tipos no competitivos, así como en las pruebas de unión competitiva tradicionales. Estas pruebas también incluyen la unión directa de un anticuerpo marcado a un objetivo. (v) Determinación de la expresión alterada de marcadores neoplásicos de proteína sobre la superficie celular, por ejemplo mediante inmunohistoquímica. (vi) Determinación de la expresión de proteína alterada tomando como base de cualquier prueba funcional apropiada, prueba enzimática o prueba inmunológica además de aquellas detalladas en los puntos (iv) y (v) anteriores.
Un experto en la téenica podría determinar, como un asunto de procedimiento de rutina, la idoneidad de aplicar un método dado a un tipo particular de muestra biológica .
Un aspecto relacionado de la presente invención provee un arreglo molecular, cuyo arreglo comprende una pluralidad de: (i) moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótido correspondiente a cualesquiera dos o más del ADN del marcador neoplásico descrito anteriormente en la presente solicitud o una secuencia que exhiba por lo menos 80% de identidad con la misma o un derivado, fragmento, variante u homólogo funcional de dicha molécula de ácido nucleico; o (ii) moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótido capaz de hibridarse a cualquiera de una o más de las secuencias de (i) bajo condiciones medias de astringencia o un derivado, fragmento, variante u homólogo funcional de dichas moléculas de ácido nucleico; o (iii) sondas de ácido nucleico u oligonucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótido que se puede hibridar a cualesquiera dos o más de las secuencias de (i) bajo condiciones medias de astringencia o un derivado, fragmento, variante u homólogo funcional de dicha molécula de ácido nucleico; o (iv) sondas que se pueden unir a cualesquiera dos o más de las proteínas codificadas por las moléculas de ácido nucleico de (i) o un derivado, fragmento o, homólogo de las mismas en el cual el nivel de expresión de dichos genes marcadores de (i)-(iii) o proteínas de (iv) es indicativo del estado neoplásico de una célula o subpoblación celular derivar a partir del intestino grueso.
De preferencia, dicho por ciento de identidad es por lo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99%.
"Hibridación" se refiere al proceso mediante el cual una cadena de ácido nucleico se une con una cadena complementaria a través de apareamiento de bases. Las reacciones de hibridación pueden ser sensibles y selectivas de modo tal que se puede identificar una secuencia de interés particular incluso en muestras en las cuales esta está presente en concentraciones bajas. Las condiciones astringentes pueden ser definidas, por ejemplo, mediante las concentraciones de sal o formamida en las soluciones de prehibridación e hibridación, o mediante la temperatura de hibridación, y son bien conocidas en la téenica. Por ejemplo, la astringencia se puede incrementar reduciendo la concentración de sal, incrementando la concentración de formamida, o elevando la temperatura de hibridación, alterando el tiempo de hibridación, como se describe en detalle, más adelante. En aspectos alternativos, los ácidos nucleicos de la invención son definidos por su capacidad para hibridarse bajo diversas condiciones de astringencia (por ejemplo, alta, media, y baja), como se indica en la presente solicitud.
La referencia en la presente solicitud astringencia baja incluye y abarca desde por lo menos aproximadamente 0 hasta por lo menos aproximadamente 15% v/v de formamida y desde por lo menos aproximadamente 1 M hasta por lo menos aproximadamente 2 M de sal para hibridación, y por lo menos aproximadamente 1 M hasta por lo menos aproximadamente 2 M de sal para las condiciones de lavado. En términos generales, la astringencia baja es a temperatura de aproximadamente 25-30°C hasta aproximadamente 42°C. La temperatura se puede alterar y utilizar temperaturas más altas para reemplazar la formamida y/o para dar condiciones de astringencia alternativas. Las condiciones de astringencia alternativas se pueden aplicar en donde sea necesario, tal como astringencia media, la cual incluye y abarca desde por lo menos aproximadamente 16% v/v hasta por lo menos aproximadamente 30% v/v de formamida y desde por lo menos aproximadamente 0.5 M hasta por lo menos aproximadamente 0.9 M de sal para hibridación, y por lo menos aproximadamente 0.5 M hasta por lo menos aproximadamente 0.9 M de sal para condiciones de lavado, o astringencia alta, la cual incluye y abarca desde por lo menos aproximadamente 31% v/v hasta por lo menos aproximadamente 50% v/v de formamida y desde por lo menos aproximadamente 0.01 M hasta por lo menos aproximadamente 0.15 M de sal para hibridación, y por lo menos aproximadamente 0.01 M hasta por lo menos aproximadamente 0.15 M de sal para las condiciones de lavado. En general, el lavado se efectúa a Tm = 69.3 + 0.41 (G+C)% (Marmur y Doty, J. Mol . Biol . 5:109, 1962). Sin embargo, la Tm de un ADN dúplex disminuye en 1°C con cada incremento de 1% en el número de pares de bases no apareadas (Bonner y Laskey, Eur. J. Biochem. 46:83, 1974). La formamida es opcional en estas condiciones de hibridación. Por consiguiente, los niveles particularmente preferidos de astringencia se definen de la siguiente manera: astringencia baja es solución amortiguadora 6 x SSC, 0.1% p/v de SDS a 25-42°C; una astringencia moderada es solución amortiguadora 2 x SSC, 0.1% p/v de SDS a una temperatura en el intervalo de 20°C a 65°C; astringencia elevada es solución amortiguadora 0.1 x SSC, 0.1% p/v de SDS a una temperatura de por lo menos 65°C.
En casos en los que los ácidos nucleico de la invención son definidos por su capacidad para hibridarse bajo condiciones de astringencia alta, estas condiciones comprenden aproximadamente 50% de formamida aproximadamente a 37°C a 42°C. En un aspecto, los ácidos nucleicos de la invención son definidos por su capacidad para hibridarse bajo astringencia reducida que comprende condiciones en aproximadamente 35% a 25% de formamida aproximadamente a 30°C a 35°C. De manera alternativa, los ácidos nucleico de la invención son definidos por su capacidad para hibridarse bajo astringencia alta que comprende condiciones a 42°C en 50% de formamida, 5X SSPE, 0.3% de SDS, y un ácido nucleico bloqueador de secuencia repetitiva, tal como cot-1 o ADN de esperma de salmón (por ejemplo, 200 n/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado). En un aspecto, los ácidos nucleico de la invención son definidos por su capacidad para hibridarse bajo condiciones de astringencia reducida que comprenden 35% de formamida a una temperatura reducida de 35°C.
De preferencia, las presentes sondas están diseñadas para que se unan al ácido nucleico o proteina a la cual éstas están dirigidas con un nivel de especificidad que reduce al mínimo la incidencia de reactividad no específica. Sin embargo, se apreciará que podría no ser posible eliminar toda la reactividad cruzada potencial con la reactividad no específica, siendo esto una limitación inherente de cualquier sistema basado en sonda.
En términos de las sondas que se utilizan para detectar las presentes proteínas, éstas pueden tomar cualquier forma apropiada incluyendo anticuerpos y aptámeros.
Una genoteca o arreglo de sondas de ácido nucleico o proteína provee información rica y altamente valiosa. Además, dos o más arreglos o perfiles (información obtenida a partir del uso de un arreglo) de dichas secuencias son herramientas útiles para comparar un conjunto de resultados de prueba con una referencia, tal como otra muestra o calibrador almacenado. En el uso de un arreglo, las sondas individuales típicamente se inmovilizan en ubicaciones separadas y se deja que reaccionen para las reacciones de unión. Los iniciadores asociados con conjuntos ensamblados de marcadores son útiles ya sea para preparar genotecas de secuencias o detectar directamente marcadores provenientes de otras muestras biológicas.
Una genoteca (o arreglo, cuando se refiere a ácidos nucleico físicamente separados correspondiente a por lo menos algunas secuencias en una genoteca) de marcadores de gen exhibe propiedades altamente deseables. Estas propiedades están asociadas con condiciones específicas, y podrían ser caracterizadas como perfiles reguladores. Un perfil, como se denomina en la presente solicitud se refiere a un conjunto de miembros que provee información de diagnóstico del tejido a partir del cual los marcadores se derivaron originalmente. Un perfil en muchos casos comprende una serie de puntos en un arreglo elaborado a partir de secuencias depositadas.
Un perfil de paciente característico generalmente se prepara mediante el uso de un arreglo. Un perfil de arreglo se puede comparar con uno o más de otros perfiles de arreglo u otros perfiles de referencia. Los resultados comparativos pueden proveer información rica perteneciente a estados patológicos, estado de desarrollo, receptividad a la terapia y otra información acerca del paciente.
Otro aspecto de la presente invención provee un kit de diagnóstico para analizar muestras biológicas que comprenden uno o más agentes para detectar uno o más marcadores neoplásicos y reactivos útiles para facilitar la detección por parte de dichos agentes. También se pueden incluir medios adicionales, por ejemplo, para recibir una muestra biológica. El agente puede ser cualquier molécula de detección apropiada.
La presente invención se describe adicionalmente mediante referencia a los siguientes ejemplos no limitativos.
EJEMPLO 1 CAHM: Adenocarcinoma colorrectal hipermetilado Desempeño uni-plex: • 74 normales: 0.8 mg hipermetilado/ml de plasma (95% CI: 0.2; 1.4) • 73 adenomas: 9.1 pg hipermetilado/ml de plasma (95% CI: -8; 27) • 73 cánceres: 1788 pg hipermetilado/ml de plasma (95% CI: 231; 3344).
La prueba CAHM (corte de umbral de 3pg/ml de plasma) es 55% sensible para cáncer colorrectal con un 93% de especificidad (Figura 1).
GRASP: Proteína de andamio asociada al receptor general para fosfoinosítidos 1.
Desempeño de uní plex: • 34 normales: 1.3 pg hipermetilado/ml de plasma (95% CI: 0.2; 2.5) • 33 adenomas: 0.1 pg hipermetilado/ml de plasma (95% CI: -0.1; 0.4) • 33 cánceres: 670.8 pg hipermetilado/ml de plasma (95% CI: -470.7; 1812) La prueba GRASP es 58% sensible para cáncer colorrectal con un 100% de especificidad utilizando un corte de umbral de 20pg metilado/ml de plasma (Figura 2).
IRF4: Factor Regulador de Interferón 4 Desempeño de uní plex: • 24 normales: 6 mg hipermetilado/ml de plasma (95% CI: 2.9; 9.0) • 23 adenomas: 3.7 pg hipermetilado/ml de plasma (95% CI: -0.4; 8.0) • 33 cánceres: 5340 pg hipermetilado/ml de plasma (95% CI: -5369; 16049) La prueba IRF4 es 57% sensible para cáncer colorrectal con un 96% de especificidad utilizando un corte de umbral de 20pg metilado/ml de plasma (Figura 3).
BCAT1: Transaminasa de aminoácido de cadena ramificada 1, citosólica Resumen de desempeño de uni-plex • 14 normales: 0 pg hipermetilado/ml de plasma (95% CI: na) • 13 adenomas: 0.4 pg hipermetilado/ml de plasma (95% CI: -0.4; 1.3) • 13 cánceres: 4088 pg hipermetilado/ml de plasma (95% CI: -4459; 10539) La prueba de BCAT1 es 62% sensible para cáncer colorrectal con un 100% de especificidad utilizando un corte de umbral de 3pg metilado/ml de plasma (Figura 4).
IKZF1: Dedo de zinc 1 de la familia de IKAROS Resumen de desempeño de uni-plex • 14 normales: 0 mg hipermetilado/ml de plasma (95% CI: na) • 13 adenomas: 0 pg hipermetilado/ml de plasma (95% CI: na) • 13 cánceres: 113 pg hipermetilado/ml de plasma (95% CI: -43; 270) La prueba de IKZF1 es 54% sensible para cáncer colorrectal con un 100% de especificidad utilizando un corte de umbral de 3pg metilado/ml de plasma (Figura 4).
Los niveles de metilación de los cinco genes se miden en los mismos 14 normales, 13 adenomas y 13 cánceres. La tabla a continuación demuestra la mejora en utilidad clínica cuando se mide la metilación en DOS de los genes: Combinar los niveles de metilación medidos en cualesquiera tres de los cinco genes resulta en: CAHM6pg/mL - GRASP20pg/mL - IRF420pg/mL: 77% de sensibilidad y 100% de especificidad CAHM6pg/mL - GRASP20pg/mL - BCAT3pg/mL:77% de sensibilidad y 100% de especificidad CAHM6pg/mL - GRASP20pg/mL - IKZF13pg/mL: 77% de sensibilidad y 100% de especificidad CAHM6pg/mL - IKZF13pg/mL - BCAT3pg/mL: 77% de sensibilidad y 100% de especificidad GRASP20pg/mL - IKZF13pg/mL - BCAT3pg/mL: 85% de sensibilidad y 100% de especificidad Combinar los niveles de metilación provenientes de todos los cinco genes resulta en un 92% de sensibilidad y 100% de especificidad: Secuencias de amplicón elegidas como blanco para GRASP, CAHM, IRF4, IKZF1 y BCAT1 La secuencia de ADN de tipo silvestre del amplicón MSP de CAHM está ubicada en el Cromosoma 6, cadena más (+); 163,834,393 => 163,834,455 (Hgl9) GAAGGAAGCA TTTCGAGCAC GACTGACGCT CCCCTTATTA TTTGCTAAGC CGCTGCGCTC GGG La secuencia de ADN de tipo silvestre del amplicón MSP de GRASP está ubicada en el Cromosoma 12, cadena más (+); 52,400,886 => 52,400,973 (Hgl9) cggaagtcgc gcccgccgct ccggtcccga ccccgggacc ccctgccgca gccgccaccc ctgggccccc agcggacgag ctgtacgc La secuencia de ADN de tipo silvestre del amplicón MSP de IKZF1 está ubicada en el Cromosoma 7, cadena más (+); 50,343,867 => 50,343,961 (Hgl9) gacgacgcac cctctccgtg tcccgctctg cgcccttctg cgcgccccgc tccctgtacc ggagcagcga tccgggaggc ggccgagagg tg La secuencia de ADN de tipo silvestre del amplicón MSP de BCAT1 está ubicada en el Cromosoma 12, cadena menos (-); 25,101,992 => 25,102,093 (Hgl9) gtcttcctgc tgatgcaatc CGctaggtcg cgagtctccg ccgcgagagg gccggtctgc aatccagccc gccacgtgta ctcgccgccg cctcg La secuencia de ADN de tipo silvestre del amplicón MSP de IRF4 está ubicada en el Cromosoma 6, cadena menos (-); 392,036 => 392,145 (Hgl9) tgggtgcctt ggacggcccc gcctcagcca ctcctggggc cccgacagtc cggttagctc atcccgtcca gcttgtggcg accccgtcgc aggagcgcgg agggcaggcg Los protocolos de PCR utilizados para medir los niveles de metilación a través de los especímenes GRASP, CAHM, IRF4, IKZF1 y BCAT1 en plasma _ I ' — ; ! .
NO NO en o en o en en NJ hO en o en O en en co · . - i BIBLIOGRAFIA Abrams y Stanton, Methods Enzymol. , 212:71-74, 1992 Adorjan et al. Nucí. Acids Res., 30: e21, 2002 Alón et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA: 96:6745- 6750, June 1999 Ammerpohl et al. Biochim Biophys Acta. 1790:847- 62, 2009 Beaucage, et al. Tetrahedron Letters 22:1859-1862, 1981 Bianco et al., Hum. Mutat., 14:289-293, 1999 Bonner y Laskey, Eur. J. Biochem. 46:83, 1974 Bresslauer et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 83: 3746-3750, 1986 Caruthers, M. H., et al., Methods in Enzymology, Vol. 154, pp.287-314 (1988) Chen y Kwok, Nucleic Acids Res. 25:347-353, 1997 Clark et al. Nat Protoc. 1:2353-64, 2006 Clark et al., Nucí. Acids Res. 22:2990-2997, 1994 Cottrell et al., Nucí. Acids Res. 32: elO, 2003 DeGraves, et al., Biotechniques 34 (1):106-10, 112-5 (2003) Deiman B, et al., Mol. Biotechnol. 20(2):163-79 (2002) Deng et al. Chin. J. Cáncer Res. 12:171-191, 2000 Dieffenbach (ed) y Dveksler (ed) (In: PCR Primer: A Laboratory Manual, Coid Spring Harbour Laboratories, NY, 1995 Eads et al., Nucí. Acids Res. 28: E32, 2000 Egholm et al., Am. Chem. Soc. , 114:1895, 1992 Egholm et al . , Nature, 365:566, 1993 Fodor et al., Science 767-773, 1991 Frommer et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 89:1827-1831 (1992) Gibson et al., Genome Research 6:995-1001 (1996) Golub et al., Science, 286:531-537, 1999 Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531 (1997) Gonzalgo et al., Cáncer Res. 57:594-599, 1997 Gregory y Feil, Nucleic Acids Res., 27, e32i-e32iv, 1999 Havelange et al., Blood 2011, 118:2827 Hermán et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:9821-9826 (1996) Holland et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88:7276-7280, 1991 Javierre et al., Mol. Cáncer Res. 9(8):1139-51, 2011 Kawai et al., Mol. Cell. Biol. 14:7421-7427, 1994 Kibriya et al., BMC 2011, 4:50 Kristensen y Hansen Clin Chem. 55:1471-83, 2009 Kuppuswamy et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:1143-1147, 1991 Landegren et al., Genome Res., 8(8): 769-776, 1998 Lee et al., Nucleic Acid Res. 21:3761-3766, 1993 Markowitz y Bertagnolli, 2009, N. Engl. J. Med. 361(25): 2449-60 Marmur y Doty, J. Mol. Biol. 5:109, 1962 Martínez et al., Am. J. Surg Pathol. 2012, 36:296 McPherson et al., PCR: A Practical Approach. (series eds, D. Rickwood y B. D. Hames), IRL Press Limited, Oxford, pp 1-253, 1991 Messing, Methods Enzymol, 101, 20-78, 1983 Mhlanga y Malmberg, Methods 25:463-471, 2001 Moore et al., BBA, 1402:239-249, 1988 Narang, et al. Meth. Enzymol 68: 90, 1979 Nevrivy et al. JBC 2000, 275(22):16827-36 Nielsen et al. J. Chem. Soc. Perkin Trans., 1:3423, 1997 Olek, et al. Nat. Genet. 17(3): 275-6 (1997) Orum et al., Clin. Chem. 45:1898-1905, 1999 Orum et al., Nucí. Acids Res., 21:5332, 1993 Oster et al., Int. J. Cáncer 2011, 129:2855 Pathak et al. PLoS One 2011, 6:e22628 Rand et al. Epigenetics 1:94-100, 2006 Rand et al. Nucí. Acids Res. 33:el27, 2005 Rein, et al. Nucleic Acids Res. 26 (10): 2255-64 (1998) Sadri & Hornsby, Nucí. Acids Res. 24:5058-5059 (1996) Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd Ed., CSHP, New York 1989) Santa Lucia, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 95: 1460-1465, 1995 Shames et al. Cáncer Lett. 251:187-98, 2007 Simeonov y Nikiforov, Nucleic Acids Research, 30 (17):1-5, 2002 Singer-Sam et al., Nucí. Acids Res. 18:687, 1990 Singer-Sam et al., PCR Methods Appl. 1: 160-163, 1992 Singh y Wengel, Chem . Commun. 1247, 1998 Slattery et al., Carcinogenesis 2011, 32:160 Southern et al., Genomics, 13:1008-1017, 1992 Szabo y Mann, Genes Dev. 9: 3097-3108, 1995 Toyota et al., Cáncer Res. 59:2307-12 (1999) Uhlmann et al., Electrophoresis, 23:4072-4079, 2002 Wedemcyer et al., Clinical Chemistry 48:9 1398- 1405, 2002 Weissleder et al., Nature Medicine 6:351-355, 2000 (diciembre 1999) Cáncer 86 (11 Suppl): 2483-92 Worm et al., Clin. Chem. , 47:1183-1189, 2001 Xiong & Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534 (1997) Yamashita et al. ( Cáncer Sci. 2010, 101:1708 Zyskind et al., Recombinant DNA Laboratory Manual, (Acad. Press, 1988)

Claims (30)

REIVINDICACIONES
1.- Un método de tamizaje para el inicio o predisposición al inicio de o el monitoreo de un neoplasma del intestino grueso en un individuo, dicho método comprende evaluar el estado de metilación de una región de ADN que se selecciona a partir de: (i) la región, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definida por cualesquiera dos o más de las coordenadas de HG19: (1) chrl2:24962958..25102393 (2) chr7:50344378...50472798 (3) chr6:391739..411443; (4) chrl2:52400748..52409671; y (5) chr6:163834097..163834982; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de cualesquiera dos o más de: (1) BCAT1(2) IKZFl(3) IRF4(4) GRASP y(5) CAHM en una muestra biológica proveniente de dicho individuo en el cual un nivel más alto de metilación de por lo menos una de las regiones de ADN del grupo (i) y/o (ii) con relación a los niveles de control es indicativo de un neoplasma del intestino grueso o una predisposición al inicio de un estado neoplásico del intestino grueso.
2.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho método comprende evaluar el estado de etilación de: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (1) chrl2:24962958..25102393; y (2) chr7:50344378...50472798; y opcionalmente uno o más de (3) chr6:391739..411443, (4) chrl2:52400748..52409671 y (5) chr6:163834097..163834982; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (1) BCAT1; y (2) IKZF1; y opcionalmente uno o más de (3) IRF4 , (4) GRASP y (5) CAHM en una muestra biológica proveniente de dicho individuo en el cual un nivel más alto de metilación de por lo menos una de las regiones de ADN del grupo (i) y/o (ii) con relación a los niveles de control es indicativo de un neoplasma del intestino grueso o una predisposición al inicio de un estado neoplásico del intestino grueso.
3.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el panel de marcador de gen para el que se tamiza es: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (1) chrl2:24962958..25102393 (2) chr7:50344378...50472798; y (3) chr6:391739..411443; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (1) BCAT1, (2) IKZF1 y (3) IRF4.
4.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el panel de marcador de gen para el que se tamiza es: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (1) chrl2:24962958..25102393 (2) chr7:50344378...50472798 y (4) chrl2:52400748..52409671; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (1) BCAT1, (2) IKZF1; y (4) GRASP.
5.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el panel de marcador de gen para el que se tamiza es: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (1) chrl2:24962958..25102393 (2) chr7:50344378...50472798 y (5) chr6:163834097..163834982; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (1) BCAT1, (2) IKZF1 y (5) CAHM
6.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el panel de marcador de gen para el que se tamiza es: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (1) chrl2:24962958..25102393 (2) chr7:50344378...50472798 (3) chr6:391739..411443; y (4) chrl2:52400748..52409671; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (1) BCAT1, (2) IKZF1, (3) IRF4 y (4) GRASP.
7.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el panel de marcador de gen para el que se tamiza es: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (1) chrl2:24962958..25102393 (2) chr7:50344378...50472798 (3) chr6:391739..11443; y (5) chr6:163834097..163834982; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (1) BCAT1, (2) IKZF1, (3) IRF4 y (5) CAHM.
8.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el panel de marcador de gen para el que se tamiza es: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (1) chrl2:24962958..25102393 (2) chr7:50344378...50472798 (4) chrl2:52400748..52409671 y (5) chr6:163834097..163834982; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (1) BCAT1, (2) IKZF1, (4) GRASP y (5) CAHM.
9.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el panel de marcador de gen para el que se tamiza es: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (1) chrl2:24962958..25102393 (2) chr7:50344378...50472798 (3) chr6:391739..411443 (4) chrl2:52400748..52409671 y (5) chr6:163834097..163834982; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (1) BCAT1, (2) IKZF1, (3) IRF4, (4) GRASP y (5) CAHM.
10.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho método comprende evaluar el estado de metilación de: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (1) chrl2:24962958..25102393; y (5) chr6:163834097..163834982; y opcionalmente uno o más de (2) chr7:50344378...50472798, (3) chr6:391739..411443; y (4) chrl2:52400748..52409671; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (1) BCAT1; y (5) CAHM; y opcionalmente uno o más de (2) IKZF1, (3) IRF4 y (4) GRASP en una muestra biológica proveniente de dicho individuo en el cual un nivel más alto de metilación de dichas regiones de ADN del grupo (i) y/o (ii) con relación a los niveles de control es indicativo de un neoplasma del intestino grueso o una predisposición al inicio de un estado neoplásico del intestino grueso.
11.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho método comprende evaluar el estado de metilación de: (1) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (2) chr7:50344378..50472798; y (5) chr6:163834097..163834982; y opcionalmente uno o más de (1) chrl2:24962958..25102393, (3) chr6:391739..411443 y (4) chrl2:52400748..52409671; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (2) IKZF1; y (5) CAHM; y opcionalmente uno o más de (1) BCAT1, (3) IRF4 y (4 ) GRASP en una muestra biológica proveniente de dicho individuo en el cual un nivel más alto de metilación de por lo menos una de las regiones de ADN del grupo (i) y/o (ii) con relación a los niveles de control es indicativo de un neoplasma del intestino grueso o una predisposición al inicio de un estado neoplásico del intestino grueso.
12.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho método comprende evaluar el estado de metilación de: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (1) chrl2:24962958..25102393; y (3) chr6:391739..411443; y opcionalmente uno o más de (2) chr7:50344378...50472798, (4) chrl2:52400748..52409671 y (5) chr6:163834097..163834982; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (1) BCAT1; y (3) IRF4; y opcionalmente uno o más de (2) IKZF1, (4) GRASP y (5) CAHM en una muestra biológica proveniente de dicho individuo en el cual un nivel más alto de metilación de por lo menos una de las regiones de ADN del grupo (i) y/o (ii) con relación a los niveles de control es indicativo de un neoplasma del intestino grueso o una predisposición al inicio de un estado neoplásico del intestino grueso.
13.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho método comprende evaluar el estado de metilación de: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (1) chrl2:24962958..25102393; y (4) chrl2:52400748..52409671; y opcionalmente uno o más de (2) chr7:50344378...50472798, (3) chr6:391739..411443 y (5) chr6:163834097..163834982; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (1) BCAT1; y (4) GRASP; y opcionalmente uno o más de (2) IKZF1, (3) IRF4 y (5) CAHM en una muestra biológica proveniente de dicho individuo en el cual un nivel más alto de metilación de por lo menos una de las regiones de ADN del grupo (i) y/o (ii) con relación a los niveles de control es indicativo de un neoplasma del intestino grueso o una predisposición al inicio de un estado neoplásico del intestino grueso.
14.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho método comprende evaluar el estado de metilación de: (1) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (2) chr7:50344378..50472798; y (3) chr6:391739..411443; y opcionalmente uno o más de (1) chrl2:24962958..25102393, (4) chrl2:52400748..52409671 y (5) chr6:163834097..163834982; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (2) IKZF1; y (3) IRF4; y opcionalmente uno o más de (1) BCATl, (4) GRASP y (5) CAHM en una muestra biológica proveniente de dicho individuo en el cual un nivel más alto de metilación de por lo menos una de las regiones de ADN del grupo (i) y/o (ii) con relación a los niveles de control es indicativo de un neoplasma del intestino grueso o una predisposición al inicio de un estado neoplásico del intestino grueso.
15.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho método comprende evaluar el estado de metilación de: (1) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (2) chr7:50344378..50472798; y (4) chrl2:52400748..52409671; y opcionalmente uno o más de (1) chrl2:24962958..25102393, (3) chr6:391739..411443 y (5) chr6:163834097..163834982; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (2) IKZF1; y (4) GRASP; y opcionalmente uno o más de (1) BCAT1, (3) IRF4 y (5) CAHM en una muestra biológica proveniente de dicho individuo en el cual un nivel más alto de metilación de por lo menos una de las regiones de ADN del grupo (i) y/o (ii) con relación a los niveles de control es indicativo de un neoplasma del intestino grueso o una predisposición al inicio de un estado neoplásico del intestino grueso.
16.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho método comprende evaluar el estado de metilación de: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (3) chr6:391739..11443; y (4) chrl2:52400748..52409671; y opcionalmente uno o más de (1) chrl2:24962958..25102393, (2) chr7:50344378...50472798 y (5) chr6:163834097..163834982; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de (3) IRF4; y (4) GRASP; y opcionalmente uno o más de (1) BCAT1, (2) IKZF1 y (5) CAHM en una muestra biológica proveniente de dicho individuo en el cual un nivel más alto de metilación de por lo menos una de las regiones de ADN del grupo (i) y/o (ii) con relación a los niveles de control es indicativo de un neoplasma del intestino grueso o una predisposición al inicio de un estado neoplásico del intestino grueso.
17.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho método comprende evaluar el estado de metilación de: (i) las regiones de ADN, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definidas por las coordenadas de Hgl9: (3) chr6:391739..411443; y (5) chr6:163834097..163834982; y opcionalmente uno o más de (1) chrl2:24962958..25102393, (2) chr7:50344378...50472798 y (4) chrl2:52400748..52409671; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de: (3) IRF4; y (5) CAH ; y opcionalmente uno o más de (1) BCAT1, (2) IKZF1 y (4) GRASP en una muestra biológica proveniente de dicho individuo en el cual un nivel más alto de metilación de por lo menos una de las regiones de ADN del grupo (i) y/o (ii) con relación a los niveles de control es indicativo de un neoplasma del intestino grueso o una predisposición al inicio de un estado neoplásico del intestino grueso.
18.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque cualquiera de dichas regiones de ADN exhiben un nivel más alto de metilación.
19.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque cualesquiera dos o más de dichas regiones de ADN exhiben un nivel más alto de metilación.
20.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque dicha célula neoplásica es un adenoma o un adenocarcinoma.
21.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque dicho nivel de control es un nivel no neoplásico.
22.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque dicha neoplasia es una neoplasia colorrectal.
23.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, caracterizado porque dicha muestra biológica es una muestra fecal (heces), lavado de enema, extirpación quirúrgica, biopsia de tejido o muestra de sangre.
24.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, caracterizado porque dicho nivel de expresión se evalúa mediante tamizaje respecto a cambios en el ADN genómico.
25.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque dichos cambios en el ADN genómico son cambios en la metilación del ADN.
26.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, caracterizado porque dicha metilación se evalúa en una o más subregiones cromosómicas que se seleccionan a partir de: (1) las subregiones de BCAT chrl2 :25101992-25102093 (SEQ ID NO:l o la cadena menos (-) correspondiente) y chrl2:25101909-25101995 (SEQ ID NO:2 o la cadena menos (-) correspondiente) (2) las subregiones de IKZF1: chr7 :50343867-50343961 (SEQ ID NO:3 o la cadena menos (-) correspondiente) y chr7:50343804-5033895 (SEQ ID NO:4 o la cadena menos (-) correspondiente) (3) las subregiones de IRF4: chr6:392036-392145 (SEQ ID NO:5 o la cadena menos (-) correspondiente) (4) las subregiones de GRASP: chrl2:52399672-52399922, chrl2:52400821-52401051 (SEQ ID NO:6 o la cadena menos (-) correspondiente), chrl2:52401407-52401664 (SEQ ID NO:7 o la cadena menos (-) correspondiente) chrl2:52400866-52400973 y Chrl2:52401107-52401664. (5) las subregiones de CAHM: chr6 :163834295-163834500 (SEQ ID NO:8 o la cadena menos (-) correspondiente), chr6:163834621-163834906, chr6:163834393-163834455 y chr6:163834393-163834519.
27.- El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque dicha subregión se selecciona a partir de SEQ ID NO.l, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.4, SEQ ID NO.5, SEQ ID NO.6, SEQ ID NO.7 o SEQ ID NO.8 o las cadenas menos (-) correspondientes.
28.- El método de conformidad con la reivindicación 26 ó 27, dicho método comprende evaluar la metilación de uno o más residuos citosina que se seleccionan a partir de: (GRASP) (CAHM) ( IKZF1 ) (IRF4) o una citosina correspondiente en la posición n+1 en la cadena de ADN opuesta.
29.- El método de conformidad con la reivindicación 1, dicho método comprende evaluar el nivel de expresión de una región de ADN que se selecciona a partir de: (i) la región, incluyendo 2 kb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, definida por cualesquiera dos o más de las coordenadas de HG19: (1) chrl2:24962958..25102393 (2) chr7:50344378...50472798 (3) chr6:391739..411443; o (4) chrl2:52400748..52409671; y (5) chr6:163834097..163834982; o (ii) la región de gen, incluyendo 2kb hacia el extremo 5' de cualesquiera dos o más de: (1) BCAT1(2) IKZF1(3) IRF4(4) GRASP y (5) CAHM en una muestra biológica proveniente de dicho individuo en el cual un nivel más bajo de expresión de por lo menos una de las regiones de ADN del grupo (i) y/o (ii) con relación a los niveles de control es indicativo de un neoplasma del intestino grueso o una predisposición al inicio de un estado neoplásico.
30.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, caracterizado porque dicho mamífero es un humano.
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