JP2015515862A - 結腸直腸がんのための診断用遺伝子マーカーパネル - Google Patents
結腸直腸がんのための診断用遺伝子マーカーパネル Download PDFInfo
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Abstract
Description
直腸指診:医師は潤滑剤を付け手袋をした指を直腸に挿入し、指の感覚で異常な領域を探す。直腸指診は直腸の末端部分において感じ取れるほどの大きさの腫瘍を検出するのみであるが、最初のスクリーニング検査として有用である。
糞便潜血検査:糞便中の血液を調べる検査。糞便中の潜血を検出するためには2種類の検査、すなわち、グアヤクベース(化学的検査)の検査と免疫化学的検査を使用することが可能である。免疫化学的検査の感度は、特異性が容認できないほど減少することなく、化学的検査よりも優れている(Weitzel JN (December 1999). “Genetic cancer risk assessment. Putting it all together”. Cancer 86 (11 Suppl): 2483-92)。
内視鏡検査:
S字結腸鏡検査:照明付きプローブ(S字結腸鏡検査)が直腸及び結腸下部内に挿入されて、ポリープ及び他の異常について検査する。
結腸内視鏡検査:結腸内視鏡と呼ばれる照明付きプローブが直腸及び全結腸内に挿入されて、がんにより引き起こされることがあるポリープ及び他の異常を探す。結腸内視鏡検査には、その処置中にポリープが見つかった場合には、ポリープを直ちに除去することができるという利点がある。組織を生検のために採取することもできる。
二重造影注腸(DCBE):先ず、一晩置いた調製物を取って結腸を洗浄する。硫酸バリウムを含有する浣腸液を投与し、次に結腸に空気を吹き込み、膨張させる。その結果、結腸の内層全体にバリウムの薄層ができ、これはX線フィルム上で可視になる。がん又は前がん性ポリープはこのようにして検出することが可能である。この技法では(より一般的ではない)平坦なポリープは見逃されることがある。
バーチャル結腸鏡検査は、二重造影注腸におけるX線フィルム(上記)を特殊なコンピュータ断層撮影スキャンで置き換えており、放射線科医が解釈することができるように特殊なワークステーションソフトウェアを必要とする。この技法は、ポリープに対する感度では結腸内視鏡検査に近づいている。しかし、それでも見つかるどんなポリープも標準結腸内視鏡検査により除去しなければならない。
標準コンピュータ体軸断層撮影は、がんの広がりの程度を決定するのに使用することができるX線法であるが、スクリーニングのために使用できるほどの感度はない。一部のがんは、他の理由で実施されるCATスキャンにおいて見つけられる。
血液検査:ある種のタンパク質レベルの上昇について患者の血液を測定することにより、腫瘍量を示すことが可能になる。特に、血液中の癌胎児性抗原(CEA)レベルが高ければ腺癌が転移していることを示すことができる。これらの検査は偽陽性又は偽陰性であることが多く、スクリーニングには推奨されないが、疾患再発を評価するには有用になり得る。CA19−9及びCA242バイオマーカーは、e−セレクチン関連転移リスクを示し、治療進展を追跡するのに役立ち、疾患再発を評価することができる。最近、セプチン9遺伝子のメチル化された配列の血漿中での検出のためのアッセイも利用できるようになって結腸直腸がんの診断に役立っている。
ポジトロン放射形断層撮影(PET)は、3次元走査技術であり、放射性糖が患者に注入され、前記糖は代謝活性が高い組織に集まり、前記糖からの放射線の放出を測定することにより画像が形成される。がん細胞は非常に高い代謝率を有する場合が多いので、これを使用して良性と悪性腫瘍を区別することが可能である。PETはスクリーニングには使用されず、結腸直腸がん症例の定常精密検査には(まだ)用いられない。
糞便DNA検査は、結腸直長がんについてのスクリーニングにおける先端技術である。前悪性アデノーマ及びがんはDNAマーカーをその細胞から放ち、このマーカーは消化過程中分解されず糞便中で安定なままである。捕獲とそれに続くPCRにより、DNAをアッセイのための検出可能レベルにまで増幅させる。
リスクマーカーとしての高いC反応性タンパク質レベル
前記個体由来の生体試料において
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393
(2)chr7:50344378...50472798
(3)chr6:391739..411443;
(4)chr12:52400748..52409671;及び
(5)chr6:163834097..163834982;
のうちのいずれか2つ若しくは3つ以上により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、領域、又は
(ii)(1)BCAT1 (2)IKZF1 (3)IRF4 (4)GRASP及び(5)CAHM
のうちのいずれか2つ若しくは3つ以上の2kb上流を含む、遺伝子領域
から選択されるDNA領域のメチル化状態を評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群(i)及び/又は(ii)のDNA領域の少なくとも1つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示す、前記方法を対象とする。
前記個体由来の生体試料において
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393;及び
(2)chr7:50344378...50472798
並びに場合によって(3)chr6:391739..411443、(4)chr12:52400748..52409671及び(5)chr6:163834097..163834982のうちの1つ若しくは複数
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(1)BCAT1;及び
(2)IKZF1;
並びに場合によって(3)IRF4、(4)GRASP及び(5)CAHM
のうちの1つ若しくは複数の2kb上流を含む、遺伝子領域
のメチル化状態を評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群(i)及び/又は(ii)のDNA領域の少なくとも1つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示す、前記方法が提供される。
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393
(2)chr7:50344378...50472798;及び
(3)chr6:391739..411443
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(1)BCAT1、(2)IKZF1及び(3)IRF4
の2kb上流を含む、遺伝子領域である。
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393
(2)chr7:50344378...50472798;及び
(4)chr12:52400748..52409671
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(1)BCAT1、(2)IKZF1及び(4)GRASP
の2kb上流を含む、遺伝子領域である。
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393
(2)chr7:50344378...50472798;及び
(5)chr6:163834097..163834982
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(1)BCAT1、(2)IKZF1及び(5)CAHM
の2kb上流を含む、遺伝子領域である。
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393
(2)chr7:50344378...50472798
(3)chr6:391739..411443;及び
(4)chr12:52400748..52409671
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(1)BCAT1、(2)IKZF1、(3)IRF4及び(4)GRASP
の2kb上流を含む、遺伝子領域である。
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393
(2)chr7:50344378...50472798
(3)chr6:391739..411443;及び
(5)chr6:163834097..163834982
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(1)BCAT1、(2)IKZF1、(3)IRF4及び(5)CAHM
の2kb上流を含む、遺伝子領域である。
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393
(2)chr7:50344378...50472798
(4)chr12:52400748..52409671;及び
(5)chr6:163834097..163834982
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(1)BCAT1、(2)IKZF1、(4)GRASP及び(5)CAHM
の2kb上流を含む、遺伝子領域である。
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393
(2)chr7:50344378...50472798
(3)chr6:391739..411443
(4)chr12:52400748..52409671;及び
(5)chr6:163834097..163834982
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(1)BCAT1、(2)IKZF1、(3)IRF4、(4)GRASP及び(5)CAHM
の2kb上流を含む、遺伝子領域である。
前記個体由来の生体試料において
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393;及び
(5)chr6:163834097..163834982
並びに場合によって(2)chr7:50344378...50472798、(3)chr6:391739..411443;及び(4)chr12:52400748..52409671のうちの1つ若しくは複数
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(1)BCAT1;及び
(5)CAHM;
並びに場合によって(2)IKZF1、(3)IRF4及び(4)GRASP
のうちの1つ若しくは複数の2kb上流を含む、遺伝子領域
のメチル化状態を評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群(i)及び/又は(ii)のDNA領域の少なくとも1つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示す、前記方法が提供される。
前記個体由来の生体試料において
(i)Hg19座標
(2)chr7:50344378...50472798;及び
(5)chr6:163834097..163834982
並びに場合によって(1)chr12:24962958..25102393、(3)chr6:391739..411443及び(4)chr12:52400748..52409671のうちの1つ若しくは複数
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(2)IKZF1;及び
(5)CAHM;
並びに場合によって(1)BCAT1、(3)IRF4及び(4)GRASP
のうちの1つ若しくは複数の2kb上流を含む、遺伝子領域
のメチル化状態を評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群(i)及び/又は(ii)のDNA領域の少なくとも1つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示す、前記方法が提供される。
前記個体由来の生体試料において
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393;及び
(3)chr6:391739..411443;
並びに場合によって(2)chr7:50344378...50472798、(4)chr12:52400748..52409671及び(5)chr6:163834097..163834982
のうちの1つ若しくは複数
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(1)BCAT1;及び
(3)IRF4;
並びに場合によって(2)IKZF1、(4)GRASP及び(5)CAHM
のうちの1つ若しくは複数の2kb上流を含む、遺伝子領域
のメチル化状態を評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群(i)及び/又は(ii)のDNA領域の少なくとも1つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示す、前記方法が提供される。
前記個体由来の生体試料において
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393;及び
(4)chr12:52400748..52409671;
並びに場合によって(2)chr7:50344378...50472798、(3)chr6:391739..411443及び(5)chr6:163834097..163834982
のうちの1つ若しくは複数
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(1)BCAT1;及び
(4)GRASP;
並びに場合によって(2)IKZF1、(3)IRF4及び(5)CAHM
のうちの1つ若しくは複数の2kb上流を含む、遺伝子領域
のメチル化状態を評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群(i)及び/又は(ii)のDNA領域の少なくとも1つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示す、前記方法が提供される。
前記個体由来の生体試料において
(i)Hg19座標
(2)chr7:50344378...50472798;及び
(3)chr6:391739..411443;
並びに場合によって(1)chr12:24962958..25102393、(4)chr12:52400748..52409671及び(5)chr6:163834097..163834982
のうちの1つ若しくは複数
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(2)IKZF1;及び
(3)IRF4;
並びに場合によって(1)BCAT1、(4)GRASP及び(5)CAHM
のうちの1つ若しくは複数の2kb上流を含む、遺伝子領域
のメチル化状態を評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群(i)及び/又は(ii)のDNA領域の少なくとも1つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示す、前記方法が提供される。
前記個体由来の生体試料において
(i)Hg19座標
(2)chr7:50344378...50472798;及び
(4)chr12:52400748..52409671;
並びに場合によって(1)chr12:24962958..25102393、(3)chr6:391739..411443及び(5)chr6:163834097..163834982
のうちの1つ若しくは複数
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(2)IKZF1;及び
(4)GRASP;
並びに場合によって(1)BCAT1、(3)IRF4及び(5)CAHM
のうちの1つ若しくは複数の2kb上流を含む、遺伝子領域
のメチル化状態を評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群(i)及び/又は(ii)のDNA領域の少なくとも1つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示す、前記方法が提供される。
前記個体由来の生体試料において
(i)Hg19座標
(3)chr6:391739..411443;及び
(4)chr12:52400748..52409671;
並びに場合によって(1)chr12:24962958..25102393、(2)chr7:50344378...50472798及び(5)chr6:163834097..163834982
のうちの1つ若しくは複数
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(3)IRF4;及び
(4)GRASP;
並びに場合によって(1)BCAT1、(2)IKZF1及び(5)CAHM
のうちの1つ若しくは複数の2kb上流を含む、遺伝子領域
のメチル化状態を評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群(i)及び/又は(ii)のDNA領域の少なくとも1つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示す、前記方法が提供される。
前記個体由来の生体試料において
(i)Hg19座標
(3)chr6:391739..411443;及び
(5)chr6:163834097..163834982;
並びに場合によって(1)chr12:24962958..25102393、(2)chr7:50344378...50472798及び(4)chr12:52400748..52409671
のうちの1つ若しくは複数
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(3)IRF4;及び
(5)CAHM;
並びに場合によって(1)BCAT1、(2)IKZF1及び(4)GRASP
のうちの1つ若しくは複数の2kb上流を含む、遺伝子領域
のメチル化状態を評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群(i)及び/又は(ii)のDNA領域の少なくとも1つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示す、前記方法が提供される。
(1)BCATサブ領域:chr12:25101992〜25102093(配列番号1又は対応するマイナス鎖)及びchr12:25101909〜25101995(配列番号2又は対応するマイナス鎖)
(2)IKZF1サブ領域:chr7:50343867〜50343961(配列番号3又は対応するマイナス鎖)及びchr7:50343804〜5033895(配列番号4又は対応するマイナス鎖)
(3)IRF4サブ領域:chr6:392036〜392145(配列番号5又は対応するマイナス鎖)
(4)GRASPサブ領域:chr12:52399672〜52399922、chr12:52400821〜52401051(配列番号6又は対応するマイナス鎖)、chr12:52401407〜52401664(配列番号7又は対応するマイナス鎖)、chr12:52400866〜52400973及びChr12:52401107〜52401664
(5)CAHMサブ領域:chr6:163834295〜163834500(配列番号8又は対応するマイナス鎖)、chr6:163834621〜163834906、chr6:163834393〜163834455及びchr6:163834393〜163834519
前記個体由来の生体試料において
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393
(2)chr7:50344378...50472798
(3)chr6:391739..411443;若しくは
(4)chr12:52400748..52409671;及び
(5)chr6:163834097..163834982;
のうちのいずれか2つ若しくは3つ以上により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、領域、又は
(ii)(1)BCAT1 (2)IKZF1 (3)IRF4 (4)GRASP及び(5)CAHM
のうちのいずれか2つ若しくは3つ以上の2kb上流を含む、遺伝子領域
から選択されるDNA領域の発現のレベルを評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群(i)及び/又は(ii)のDNA領域の少なくとも1つのより低い発現レベルが、大腸新生物又は新生物状態の発症の素因を示す、前記方法を対象とする。
前記個体由来の生体試料において
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393
(2)chr7:50344378...50472798
(3)chr6:391739..411443;若しくは
(4)chr12:52400748..52409671;及び
(5)chr6:163834097..163834982;
のうちのいずれか2つ若しくは3つ以上により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、領域、又は
(ii)(1)BCAT1 (2)IKZF1 (3)IRF4 (4)GRASP及び(5)CAHM
のうちのいずれか2つ若しくは3つ以上の2kb上流を含む、遺伝子領域
から選択されるDNA領域のメチル化状態を評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群(i)及び/又は(ii)のDNA領域の少なくとも1つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示す、前記方法を対象とする。
(i)盲腸
(ii)上行結腸
(iii)横行結腸
(iv)下行結腸
(v)S状結腸
(vi)直腸
(vii)脾弯曲部、及び
(viii)右結腸曲
である領域のうちの1つに由来する細胞への言及として理解されるべきである。
前記個体由来の生体試料において
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393;及び
(2)chr7:50344378...50472798
並びに場合によって(3)chr6:391739..411443、(4)chr12:52400748..52409671及び(5)chr6:163834097..163834982のうちの1つ若しくは複数
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(1)BCAT1;及び
(2)IKZF1;
並びに場合によって(3)IRF4、(4)GRASP及び(5)CAHM
のうちの1つ若しくは複数の2kb上流を含む、遺伝子領域
のメチル化状態を評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群(i)及び/又は(ii)のDNA領域の少なくとも1つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示す、前記方法が提供される。
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393
(2)chr7:50344378...50472798;及び
(3)chr6:391739..411443
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(1)BCAT1、(2)IKZF1及び(3)IRF4
の2kb上流を含む、遺伝子領域である。
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393
(2)chr7:50344378...50472798;及び
(4)chr12:52400748..52409671
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(1)BCAT1、(2)IKZF1及び(4)GRASP
の2kb上流を含む、遺伝子領域である。
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393
(2)chr7:50344378...50472798;及び
(5)chr6:163834097..163834982
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(1)BCAT1、(2)IKZF1及び(5)CAHM
の2kb上流を含む、遺伝子領域である。
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393
(2)chr7:50344378...50472798
(3)chr6:391739..411443;及び
(4)chr12:52400748..52409671
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(1)BCAT1、(2)IKZF1、(3)IRF4及び(4)GRASP
の2kb上流を含む、遺伝子領域である。
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393
(2)chr7:50344378...50472798
(3)chr6:391739..411443;及び
(5)chr6:163834097..163834982
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(1)BCAT1、(2)IKZF1、(3)IRF4及び(5)CAHM
の2kb上流を含む、遺伝子領域である。
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393
(2)chr7:50344378...50472798
(4)chr12:52400748..52409671;及び
(5)chr6:163834097..163834982
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(1)BCAT1、(2)IKZF1、(4)GRASP及び(5)CAHM
の2kb上流を含む、遺伝子領域である。
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393
(2)chr7:50344378...50472798
(3)chr6:391739..411443
(4)chr12:52400748..52409671;及び
(5)chr6:163834097..163834982
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(1)BCAT1、(2)IKZF1、(3)IRF4、(4)GRASP及び(5)CAHM
の2kb上流を含む、遺伝子領域である。
前記個体由来の生体試料において
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393;及び
(5)chr6:163834097..163834982
並びに場合によって(2)chr7:50344378...50472798、(3)chr6:391739..411443;及び(4)chr12:52400748..52409671のうちの1つ若しくは複数
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(1)BCAT1;及び
(5)CAHM;
並びに場合によって(2)IKZF1、(3)IRF4及び(4)GRASP
のうちの1つ若しくは複数の2kb上流を含む、遺伝子領域
のメチル化状態を評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群(i)及び/又は(ii)のDNA領域の少なくとも1つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示す、前記方法が提供される。
前記個体由来の生体試料において
(i)Hg19座標
(2)chr7:50344378...50472798;及び
(5)chr6:163834097..163834982
並びに場合によって(1)chr12:24962958..25102393、(3)chr6:391739..411443及び(4)chr12:52400748..52409671のうちの1つ若しくは複数
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(2)IKZF1;及び
(5)CAHM;
並びに場合によって(1)BCAT1、(3)IRF4及び(4)GRASP
のうちの1つ若しくは複数の2kb上流を含む、遺伝子領域
のメチル化状態を評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群(i)及び/又は(ii)のDNA領域の少なくとも1つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示す、前記方法が提供される。
前記個体由来の生体試料において
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393;及び
(3)chr6:391739..411443;
並びに場合によって(2)chr7:50344378...50472798、(4)chr12:52400748..52409671及び(5)chr6:163834097..163834982
のうちの1つ若しくは複数
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(1)BCAT1;及び
(3)IRF4;
並びに場合によって(2)IKZF1、(4)GRASP及び(5)CAHM
のうちの1つ若しくは複数の2kb上流を含む、遺伝子領域
のメチル化状態を評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群(i)及び/又は(ii)のDNA領域の少なくとも1つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示す、前記方法が提供される。
前記個体由来の生体試料において
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393;及び
(4)chr12:52400748..52409671;
並びに場合によって(2)chr7:50344378...50472798、(3)chr6:391739..411443及び(5)chr6:163834097..163834982
のうちの1つ若しくは複数
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(1)BCAT1;及び
(4)GRASP;
並びに場合によって(2)IKZF1、(3)IRF4及び(5)CAHM
のうちの1つ若しくは複数の2kb上流を含む、遺伝子領域
のメチル化状態を評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群(i)及び/又は(ii)のDNA領域の少なくとも1つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示す、前記方法が提供される。
前記個体由来の生体試料において
(i)Hg19座標
(2)chr7:50344378...50472798;及び
(3)chr6:391739..411443;
並びに場合によって(1)chr12:24962958..25102393、(4)chr12:52400748..52409671及び(5)chr6:163834097..163834982
のうちの1つ若しくは複数
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(2)IKZF1;及び
(3)IRF4;
並びに場合によって(1)BCAT1、(4)GRASP及び(5)CAHM
のうちの1つ若しくは複数の2kb上流を含む、遺伝子領域
のメチル化状態を評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群(i)及び/又は(ii)のDNA領域の少なくとも1つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示す、前記方法が提供される。
前記個体由来の生体試料において
(i)Hg19座標
(2)chr7:50344378...50472798;及び
(4)chr12:52400748..52409671;
並びに場合によって(1)chr12:24962958..25102393、(3)chr6:391739..411443及び(5)chr6:163834097..163834982
のうちの1つ若しくは複数
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(2)IKZF1;及び
(4)GRASP;
並びに場合によって(1)BCAT1、(3)IRF4及び(5)CAHM
のうちの1つ若しくは複数の2kb上流を含む、遺伝子領域
のメチル化状態を評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群(i)及び/又は(ii)のDNA領域の少なくとも1つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示す、前記方法が提供される。
前記個体由来の生体試料において
(i)Hg19座標
(3)chr6:391739..411443;及び
(4)chr12:52400748..52409671;
並びに場合によって(1)chr12:24962958..25102393、(2)chr7:50344378...50472798及び(5)chr6:163834097..163834982
のうちの1つ若しくは複数
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(3)IRF4;及び
(4)GRASP;
並びに場合によって(1)BCAT1、(2)IKZF1及び(5)CAHM
のうちの1つ若しくは複数の2kb上流を含む、遺伝子領域
のメチル化状態を評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群(i)及び/又は(ii)のDNA領域の少なくとも1つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示す、前記方法が提供される。
前記個体由来の生体試料において
(i)Hg19座標
(3)chr6:391739..411443;及び
(5)chr6:163834097..163834982;
並びに場合によって(1)chr12:24962958..25102393、(2)chr7:50344378...50472798及び(4)chr12:52400748..52409671
のうちの1つ若しくは複数
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(3)IRF4;及び
(5)CAHM;
並びに場合によって(1)BCAT1、(2)IKZF1及び(4)GRASP
のうちの1つ若しくは複数の2kb上流を含む、遺伝子領域
のメチル化状態を評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群(i)及び/又は(ii)のDNA領域の少なくとも1つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示す、前記方法が提供される。
(1)BCATサブ領域:chr12:25101992〜25102093(配列番号1又は対応するマイナス鎖)及びchr12:25101909〜25101995(配列番号2又は対応するマイナス鎖)
(2)IKZF1サブ領域:chr7:50343867〜50343961(配列番号3又は対応するマイナス鎖)及びchr7:50343804〜5033895(配列番号4又は対応するマイナス鎖)
(3)IRF4サブ領域:chr6:392036〜392145(配列番号5又は対応するマイナス鎖)
(4)GRASPサブ領域:chr12:52399672〜52399922、chr12:52400821〜52401051(配列番号6又は対応するマイナス鎖)、chr12:52401407〜52401664(配列番号7又は対応するマイナス鎖)、chr12:52400866〜52400973及びChr12:52401107〜52401664
(5)CAHMサブ領域:chr6:163834295〜163834500(配列番号8又は対応するマイナス鎖)、chr6:163834621〜163834906、chr6:163834393〜163834455及びchr6:163834393〜163834519
(1)配列番号1若しくは配列番号2により定義されるBCATサブ領域又は対応するマイナス鎖;
(2)配列番号3若しくは配列番号4により定義されるIKZF1サブ領域又は対応するマイナス鎖;
(3)配列番号5により定義されるIRF4サブ領域又は対応するマイナス鎖;
(4)配列番号6若しくは7により定義されるGRASPサブ領域又は対応するマイナス鎖;及び
(5)配列番号8により定義されるCAHMサブ領域又は対応するマイナス鎖
である。
(a)プローブ又はプライマー設計及び/又は生成
新生物の診断のための本明細書に記載されるいくつかの方法は、1つ又は複数のプローブ及び/又はプライマーを使用する。たとえば、PCR又はハイブリダイゼーションにおいて使用するためのプローブ及び/又はプライマーを設計するための方法は当技術分野では公知であり、たとえば、Dieffenbach and Dveksler (Eds) (In: PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, NY, 1995)に記載されている。さらに、種々のアッセイのための最適プローブ及び/又はプライマーを設計するいくつかのソフトウェアパッケージ、たとえば、the Center for Genome Research、Cambridge、Mass.、USAから入手可能なPrimer3が公開されている。
一例では、試料中のメチル化の増加は、核酸が消化されるのに十分な条件下で一定量のメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ酵素で核酸を処理し、次に生成された断片を検出することを含むプロセスを使用して決定される。例となるメチル化感受性エンドヌクレアーゼには、たとえば、HhaI又はHpaIIが含まれる。好ましくは、アッセイは、用いられるメチル化感受性酵素と同じ特異性を有するメチル化非感受性酵素で消化される内部標準を含む。たとえば、メチル化非感受性酵素MspIは、メチル化感受性酵素HpaIIのイソ制限酵素である。
一例では、核酸の消化は未消化核酸へのプローブ又はプライマーの選択的ハイブリダイゼーションにより検出される。代わりに、プローブは消化された核酸と未消化核酸の両方に選択的にハイブリダイズするが、たとえば、電気泳動により両方の形態の区別を促進する。ハイブリダイゼーションプローブへの選択的ハイブリダイゼーションを達成するのに適切な検出法には、たとえば、サザン又は他の核酸ハイブリダイゼーションが含まれる(Kawai et al., Mol. Cell. Biol. 14:7421-7427, 1994; Gonzalgo et al., Cancer Res. 57:594-599, 1997)。
別の例では、制限酵素により生成される断片は、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ローリングサークル増幅(RCA)、逆ポリメラーゼ連鎖反応(iPCR)、インサイツPCR(Singer-Sam et al., Nucl. Acids Res. 18:687, 1990)、鎖置換増幅(SDA)又はサイクリングプローブ技術などの増幅システムを使用して検出される。
別の例では、試料におけるメチル化の増加は、核酸が消化されるのに十分な条件下で核酸を含有するクロマチンを一定量のデオキシリボヌクレアーゼIで処理し、次に生成された断片を検出することを含むプロセスを実施することにより決定される。このアッセイフォーマットは、メチル化されたDNA、たとえば、高度メチル化されたDNAを含有するクロマチンは、非高度メチル化DNAよりも密に閉ざされた立体構造を有し、結果として、デオキシリボヌクレアーゼIによるエンドヌクレアーゼ消化に感受性が低いという理解に基づいている。
別の方法では、試料中のメチル化の増加は、変異誘発を誘導するのに十分な条件下でCpGジヌクレオチド内の非メチル化シトシン残基を選択的に変異させる一定量の化合物で核酸を処理することを含むプロセスを使用して決定される。
一例では、1つ若しくは複数の変異ヌクレオチドの存在又は変異配列の数は変異DNAの塩基配列決定により決定される。一形態の分析は、本明細書に記載される増幅反応、たとえば、PCRを使用して変異核酸を増幅することを含む。次に、増幅された産物は直接塩基配列決定される又はクローニングされ、クローニングされた産物は塩基配列決定される。DNAを塩基配列決定するための方法は当技術分野では公知であり、たとえば、ジデオキシ連鎖終止法又はマクサムギルバート法が含まれる(Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd Ed., CSHP, New York 1989) 又はZyskind et al., Recombinant DNA Laboratory Manual, (Acad. Press, 1988)参照)。
一方法では、非変異配列の存在は、基本的にXiong and Laird, 2001、上記参照に記載されている組合せ亜硫酸水素塩制限分析(COBRA)を使用して検出される。この方法は、非メチル化シトシン残基を選択的に変異させる化合物、たとえば、亜硫酸水素塩を用いた処理後メチル化された核酸と非メチル化核酸間の制限酵素認識部位の差異を利用する。
一実施形態では、本発明のアッセイフォーマットは、たとえば、亜硫酸水素塩で処理された試料由来のDNAが陽性シグナルとして検出される陽性読出しシステムを含む。好ましくは、健康な又は正常な対照対象由来の非高度メチル化DNAは検出されない又は微弱にしか検出されない。
(i)変異誘発を誘導するのに十分な条件下で非メチル化シトシン残基を選択的に変異させる一定量の化合物で核酸を処理し、それによって変異核酸を生成するステップ、
(ii)非変異核酸への選択的ハイブリダイゼーションが起こるような条件下でメチル化されたシトシン残基を含む配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むプローブ又はプライマーに核酸をハイブリダイズさせるステップ、及び
(iii)選択的ハイブリダイゼーションを検出するステップ
を含むプロセスを使用して決定される。
一実施形態では、ハイブリダイゼーションは、サザン、ドットブロット、スロットブロット又は他の核酸ハイブリダイゼーション手段を使用して検出される(Kawai et al., 1994、上記参照;Gonzalgo et al., 1997、上記参照)。適切なプローブ選択を条件として、そのようなアッセイフォーマットは、本明細書において上に一般的に記載されており、現在記載されている選択的変異誘発アプローチを準用する。
別の例では、ハイブリダイゼーションは、増幅システムを使用して検出される。メチル化特異的PCRフォーマットでは(MSP;Herman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1992)、ハイブリダイゼーションは亜硫酸水素塩処理されたDNAを増幅することを含むプロセスを使用して検出される。したがって、中程度及び/又は高厳密性条件下で非変異配列に特異的にアニールする1つ又は複数のプローブ又はプライマーを使用することにより、増幅産物はメチル化されたヌクレオチドを含む試料のみを使用して生成される。亜硫酸水素塩処理されたDNAの混合物からのメチル化された又は非メチル化成分の選択的増幅のために提供される別のアッセイは、Cottrell et al., Nucl. Acids Res. 32: e10, 2003(HeavyMethyl PCR)、Rand et al. Nucl. Acids Res. 33:e127, 2005(Headloop PCR)、Rand et al. Epigenetics 1:94-100, 2006(Bisulfite Differential Denaturation PCR)及びPCT/AU07/000389(End−specific PCR)により提供される。
(i)変異誘発を誘導するのに十分な条件下でCpGジヌクレオチド内の非メチル化シトシン残基を選択的に変異させる一定量の化合物で核酸を処理し、それによって変異された核酸を生成するステップ、
(ii)非変異核酸へのハイブリダイゼーションが起こるような条件下で、メチル化されたシトシン残基を含むDNAにおける配列に相補的であるヌクレオチド配列をそれぞれが含む2つの非重複及び非相補的プライマーに核酸をハイブリダイズさせるステップ、
(iii)ハイブリダイズされたプライマーに介在する核酸を増幅させ、それによってプライマー配列を含む配列からなるDNA断片を生成するステップ、
(iv)非変異核酸へのハイブリダイゼーションが起こるような条件下でメチル化されたシトシン残基を含む配列に一致する又は相補的であるヌクレオチド配列を含むプローブに増幅されたDNA断片をハイブリダイズさせるステップ、及び前記ハイブリダイゼーションを検出するステップ、
を含むプロセスを実施することによりメチル化の増加が検出される。
別の例では、アッセイフォーマットは、健康な/正常な対照試料由来のDNAのメチル化の減少が陽性シグナルとして検出され、好ましくは、新生物試料由来のメチル化されたDNAが検出されない又は微弱にしか検出されない陰性読出しシステムを含む。
(i)変異誘発を誘導するのに十分な条件下でCpGアイランド内の非メチル化シトシン残基を選択的に変異させる一定量の化合物で核酸を処理し、それによって変異された核酸を生成するステップ、
(ii)変異核酸への選択的ハイブリダイゼーションが起こるような条件下で、変異シトシン残基を含む配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むプローブ又はプライマーに核酸をハイブリダイズさせるステップ、及び
(iii)前記選択的ハイブリダイゼーションを検出するステップ
を含むプロセスを使用して、メチル化の減少は決定される。
一実施形態では、ハイブリダイゼーションは、サザン、ドットブロット、スロットブロット又は他の核酸ハイブリダイゼーション手段を使用して検出される(Kawai et al., 1994、上記参照;Gonzalgo et al., 1997、上記参照)。適切なプローブ選択を条件として、そのようなアッセイフォーマットは、本明細書において上に一般的に記載されており、現在記載されている選択的変異誘発アプローチを準用する。好ましくは、リガーゼ連鎖反応フォーマットを用いて、非変異と変異核酸の区別をする。この点に関して、アッセイ要件及び条件は陽性読出しアッセイについて本明細書において上に記載されている通りであり、現在のフォーマットを準用する。しかし、プローブの選択は異なることになる。陰性読出しアッセイでは、非変異配列ではなく変異配列に選択的にハイブリダイズする1つ又は複数のプローブが選択される。
別の例では、ハイブリダイゼーションは、変異核酸に選択的にハイブリダイズするプライマー(及び適用可能な場合はプローブ)を使用しているのもかかわらず、陽性読出しアッセイのために本明細書において上に記載される任意の増幅アッセイフォーマットを使用する増幅システムを使用して検出される。
(i)変異誘発を誘導するのに十分な条件下で非メチル化シトシン残基を選択的に変異させる一定量の化合物で核酸を処理して、それによって変異核酸を生成するステップ、
(ii)変異核酸へのハイブリダイゼーションが起こるような条件下で、変異シトシン残基を含むDNA中の配列に相補的であるヌクレオチド配列をそれぞれが含む2つの非重複及び非相補的プライマーに核酸をハイブリダイズさせるステップ、
(iii)ハイブリダイズしたプライマーに介在する核酸を増幅させそれによってプライマー配列を含む配列からなるDNA断片を生成するステップ、
(iv)変異核酸へのハイブリダイゼーションが起こるような条件下で、変異シトシン残基を含む配列に一致する又は相補的であるヌクレオチド配列を含むプローブに増幅されたDNA断片をハイブリダイズさせるステップ、並びに
(v)前記ハイブリダイゼーションを検出するステップ
を含むプロセスを実施することにより正常な/健康な対照対象におけるメチル化の減少が検出される。
前記個体由来の生体試料において
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393
(2)chr7:50344378...50472798
(3)chr6:391739..411443;若しくは
(4)chr12:52400748..52409671;及び
(5)chr6:163834097..163834982;
のうちのいずれか2つ若しくは3つ以上により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、領域、又は
(ii)(1)BCAT1 (2)IKZF1 (3)IRF4 (4)GRASP及び(5)CAHM
のうちのいずれか2つ若しくは3つ以上の2kb上流を含む、遺伝子領域
から選択されるDNA領域の発現レベルを評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群(i)及び/又は(ii)のDNA領域の少なくとも1つのより低い発現レベルが、大腸新生物又は新生物状態の発症の素因を示す、前記方法を対象とする。
前記個体由来の生体試料において
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393;及び
(2)chr7:50344378...50472798
並びに場合によって(3)chr6:391739..411443、(4)chr12:52400748..52409671及び(5)chr6:163834097..163834982のうちの1つ若しくは複数
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(1)BCAT1;及び
(2)IKZF1;
並びに場合によって(3)IRF4、(4)GRASP及び(5)CAHM
のうちの1つ若しくは複数の2kb上流を含む、遺伝子領域
から選択される1つ又は複数の遺伝子又は転写物の発現レベルを評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群(i)及び/又は(ii)のDNA領域の少なくとも1つのより低い発現レベルが、新生物大腸新生物又は新生物状態の発症の素因を示す、前記方法が提供される。
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393
(2)chr7:50344378...50472798;及び
(3)chr6:391739..411443
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(1)BCAT1、(2)IKZF1及び(3)IRF4
の2kb上流を含む、遺伝子領域である。
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393
(2)chr7:50344378...50472798;及び
(4)chr12:52400748..52409671
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(1)BCAT1、(2)IKZF1及び(4)GRASP
の2kb上流を含む、遺伝子領域である。
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393
(2)chr7:50344378...50472798;及び
(5)chr6:163834097..163834982
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(1)BCAT1、(2)IKZF1及び(5)CAHM
の2kb上流を含む、遺伝子領域である。
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393
(2)chr7:50344378...50472798
(3)chr6:391739..411443;及び
(4)chr12:52400748..52409671
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(1)BCAT1、(2)IKZF1、(3)IRF4及び(4)GRASP
の2kb上流を含む、遺伝子領域である。
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393
(2)chr7:50344378...50472798
(3)chr6:391739..411443;及び
(5)chr6:163834097..163834982
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(1)BCAT1、(2)IKZF1、(3)IRF4及び(5)CAHM
の2kb上流を含む、遺伝子領域である。
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393
(2)chr7:50344378...50472798
(4)chr12:52400748..52409671;及び
(5)chr6:163834097..163834982
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(1)BCAT1、(2)IKZF1、(4)GRASP及び(5)CAHM
の2kb上流を含む、遺伝子領域である。
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393
(2)chr7:50344378...50472798
(3)chr6:391739..411443
(4)chr12:52400748..52409671;及び
(5)chr6:163834097..163834982
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(1)BCAT1、(2)IKZF1、(3)IRF4、(4)GRASP及び(5)CAHM
の2kb上流を含む、遺伝子領域である。
(i)インビボ検出
分子イメージング(Molecular Imaging)は、腸組織におけるマーカーの変更された発現を明らかにすることができるイメージングプローブ又は試薬の投与に続いて使用し得る。
分子イメージング(Moore et al., BBA, 1402:239-249, 1988; Weissleder et al., Nature Medicine 6:351-355, 2000)は、X線、コンピュータ断層撮影(CT)、MRI、陽電子放射断層撮影(PET)又は内視鏡検査などの「古典的」画像診断法を使用して現在視覚化されているマクロ特徴と相関している分子発現のインビボイメージングである。
(ii)細胞における蛍光インサイツハイブリダイゼーション(FISH)による、又は細胞由来の抽出物における定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(QRTPCR)若しくは競合的RT−PCR産物のフローサイトメトリー定量化などの技術による、RNA発現の下方調節の検出(Wedemeyer et al., Clinical Chemistry 48:9 1398-1405, 2002)。
(iii)たとえば、アレイ技術によるRNAの発現プロファイルの評価(Alon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 96:6745-6750, June 1999)
が含まれるが、これらに限定されない。
(iv)たとえば、免疫アッセイによる細胞抽出物における変更された新生物マーカータンパク質レベルの測定。
生体試料におけるタンパク質性新生物マーカー発現産物についての試験は、当業者に周知であるいくつかの適切な方法のうちのいずれか1つにより実施することが可能である。適切な方法の例には、組織切片、生検標本又は体液試料の抗体スクリーニングが含まれるが、これに限定されない。抗体ベースの診断法が使用される限り、マーカータンパク質の存在は、ウェスタンブロッティング、ELISA又はフローサイトメトリー法によるなどのいくつかの方法で決定し得る。当然、これらには、非競合的種類の並びに従来の競合的結合アッセイにおける単一部位と二部位の両方又は「サンドイッチ」アッセイが含まれる。これらのアッセイは、標的への標識された抗体の直接結合も含まれる。
(V)たとえば、免疫組織化学による細胞表面でのタンパク質新生物マーカーの変更された発現の決定。
(vi)上記のポイント(iv)及び(v)において詳述された試験に加えて、任意の適切な機能試験、酵素試験又は免疫学的試験に基づいた変更されたタンパク質発現の決定、
が含まれるが、これらに限定されない。
(i)上文に記載されている新生物マーカーDNAのいずれか2つ若しくは3つ以上に一致するヌクレオチド配列又はそれに少なくとも80%同一性を示す配列を含む核酸分子又はそのような核酸分子の機能的誘導体、断片、バリアント若しくは相同体、或いは
(ii)中程度厳密性条件の下で(i)の配列のいずれか1つ若しくは複数にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む核酸分子又はそのような核酸分子の機能的誘導体、断片、バリアント若しくは相同体、或いは
(iii)中程度厳密性条件の下で(i)の配列のいずれか2つ若しくは3つ以上にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む核酸プローブ若しくはオリゴヌクレオチド又はそのような核酸分子の機能的誘導体、断片、バリアント若しくは相同体、或いは
(iv)(i)の核酸分子によりコードされるタンパク質のうちのいずれか2つ若しくは3つ以上又はその誘導体、断片若しくは相同体に結合することができるプローブ
のうちの複数を含むアレイであって、
(i)〜(iii)の前記マーカー遺伝子又は(iv)のタンパク質の発現レベルが、大腸由来の細胞又は細胞の亜集団の新生物状態を示す
分子アレイを提供する。
シングルプレックスパフォーマンス:
74正常:0.8pg高度メチル化/mL血漿(95%CI:0.2;1.4)
73腺腫:9.1pg高度メチル化/mL血漿(95%CI:−8;27)
73がん:1788高度メチル化/mL血漿(95%CI:231;3344)
CAHMアッセイ(閾値カット3pg/mL血漿)は結腸直腸がんに対して93%特異性で55%の感度である(図1)。
シングルプレックスパフォーマンス:
34正常:1.3pg高度メチル化/mL血漿(95%CI:0.2;2.5)
33腺腫:0.1pg高度メチル化/mL血漿(95%CI:−0.1;0.4)
33がん:670.8pg高度メチル化/mL血漿(95%CI:−470.7;1812)
GRASPアッセイは、閾値カット20pgメチル化/mL血漿を使用して、結腸直腸がんに対して100%特異性で58%の感度である(図2)。
シングルプレックスパフォーマンス:
24正常:6pg高度メチル化/mL血漿(95%CI:2.9;9.0)
23腺腫:3.7pg高度メチル化/mL血漿(95%CI:−0.4;8.0)
33がん:5340pg高度メチル化/mL血漿(95%CI:−5369;16049)
IRF4アッセイは、閾値カット20pgメチル化/mL血漿を使用して、結腸直腸がんに対して96%特異性で57%の感度である(図3)。
シングルプレックスパフォーマンス要約
14正常:0pg高度メチル化/mL血漿(95%CI:該当なし)
13腺腫:0.4pg高度メチル化/mL血漿(95%CI:−0.4;1.3)
13がん:4088pg高度メチル化/mL血漿(95%CI:−4459;10539)
BCAT1アッセイは、閾値カット3pgメチル化/mL血漿を使用して、結腸直腸がんに対して100%特異性で62%の感度である(図4)。
シングルプレックスパフォーマンス要約
14正常:0pg高度メチル化/mL血漿(95%CI:該当なし)
13腺腫:0pg高度メチル化/mL血漿(95%CI:該当なし)
13がん:113pg高度メチル化/mL血漿(95%CI:−43;270)
IKZF1アッセイは、閾値カット3pgメチル化/mL血漿を使用して、結腸直腸がんに対して100%特異性で54%の感度である(図4)。
CAHM6pg/mL−GRASP20pg/mL−IRF420pg/mL:77%感度及び100%特異性
CAHM6pg/mL−GRASP20pg/mL−BCAT3pg/mL:77%感度及び100%特異性
CAHM6pg/mL−GRASP20pg/mL−IKZF13pgmL:77%感度及び100%特異性
CAHM6pg/mL−IKZF13pg/mL−BCAT3pg/mL:77%感度及び100%特異性
GRASP20pg/mL−IKZF13pg/mL−BCAT3pg/mL:85%感度及び100%特異性
が得られた。
CAHM MSPアンプリコンの野生型DNA配列は染色体6、プラス鎖上に位置している;163,834,393⇒163,834,455(Hg19)
GAAGGAAGCA TTTCGAGCAC GACTGACGCT CCCCTTATTA TTTGCTAAGC CGCTGCGCTC GGG
cggaagtcgc gcccgccgct ccggtcccga ccccgggacc ccctgccgca gccgccaccc ctgggccccc agcggacgag ctgtacgc
gacgacgcac cctctccgtg tcccgctctg cgcccttctg cgcgccccgc tccctgtacc ggagcagcga tccgggaggc ggccgagagg tg
gtcttcctgc tgatgcaatc CGctaggtcg cgagtctccg ccgcgagagg gccggtctgc aatccagccc gccacgtgta ctcgccgccg cctcg
tgggtgcctt ggacggcccc gcctcagcca ctcctggggc cccgacagtc cggttagctc atcccgtcca gcttgtggcg accccgtcgc aggagcgcgg agggcaggcg
Claims (30)
- 個体において大腸新生物の発症若しくは発症の素因についてスクリーニングする又はこれをモニターする方法であって、
前記個体由来の生体試料において
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393
(2)chr7:50344378...50472798
(3)chr6:391739..411443;
(4)chr12:52400748..52409671;及び
(5)chr6:163834097..163834982;
のうちのいずれか2つ若しくは3つ以上により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、領域、又は
(ii)(1)BCAT1 (2)IKZF1 (3)IRF4 (4)GRASP及び(5)CAHM
のうちのいずれか2つ若しくは3つ以上の2kb上流を含む、遺伝子領域
から選択されるDNA領域のメチル化状態を評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群(i)及び/又は(ii)のDNA領域の少なくとも1つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示す、前記方法。 - 前記個体由来の生体試料において
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393;及び
(2)chr7:50344378...50472798
並びに場合によって(3)chr6:391739..411443、(4)chr12:52400748..52409671及び(5)chr6:163834097..163834982のうちの1つ若しくは複数
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(1)BCAT1;及び
(2)IKZF1;
並びに場合によって(3)IRF4、(4)GRASP及び(5)CAHM
のうちの1つ若しくは複数の2kb上流を含む、遺伝子領域
のメチル化状態を評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群(i)及び/又は(ii)のDNA領域の少なくとも1つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示す、請求項1に記載の方法。 - スクリーニングして探る遺伝子マーカーパネルが、
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393
(2)chr7:50344378...50472798;及び
(3)chr6:391739..411443
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(1)BCAT1、(2)IKZF1及び(3)IRF4
の2kb上流を含む、遺伝子領域である、請求項2に記載の方法。 - スクリーニングして探る遺伝子マーカーパネルが、
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393
(2)chr7:50344378...50472798;及び
(4)chr12:52400748..52409671
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(1)BCAT1、(2)IKZF1及び(4)GRASP
の2kb上流を含む、遺伝子領域である、請求項2に記載の方法。 - スクリーニングして探る遺伝子マーカーパネルが、
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393
(2)chr7:50344378...50472798;及び
(5)chr6:163834097..163834982
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(1)BCAT1、(2)IKZF1及び(5)CAHM
の2kb上流を含む、遺伝子領域である、請求項2に記載の方法。 - スクリーニングして探る遺伝子マーカーパネルが、
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393
(2)chr7:50344378...50472798
(3)chr6:391739..411443;及び
(4)chr12:52400748..52409671
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(1)BCAT1、(2)IKZF1、(3)IRF4及び(4)GRASP
の2kb上流を含む、遺伝子領域である、請求項2に記載の方法。 - スクリーニングして探る遺伝子マーカーパネルが、
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393
(2)chr7:50344378...50472798
(3)chr6:391739..411443;及び
(5)chr6:163834097..163834982
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(1)BCAT1、(2)IKZF1、(3)IRF4及び(5)CAHM
の2kb上流を含む、遺伝子領域である、請求項2に記載の方法。 - スクリーニングして探る遺伝子マーカーパネルが、
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393
(2)chr7:50344378...50472798
(4)chr12:52400748..52409671;及び
(5)chr6:163834097..163834982
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(1)BCAT1、(2)IKZF1、(4)GRASP及び(5)CAHM
の2kb上流を含む、遺伝子領域である、請求項2に記載の方法。 - スクリーニングして探る遺伝子マーカーパネルが、
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393
(2)chr7:50344378...50472798
(3)chr6:391739..411443
(4)chr12:52400748..52409671;及び
(5)chr6:163834097..163834982
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(1)BCAT1、(2)IKZF1、(3)IRF4、(4)GRASP及び(5)CAHM
の2kb上流を含む、遺伝子領域である、請求項2に記載の方法。 - 前記個体由来の生体試料において
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393;及び
(5)chr6:163834097..163834982
並びに場合によって(2)chr7:50344378...50472798、(3)chr6:391739..411443;及び(4)chr12:52400748..52409671のうちの1つ若しくは複数
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(1)BCAT1;及び
(5)CAHM;
並びに場合によって(2)IKZF1、(3)IRF4及び(4)GRASP
のうちの1つ若しくは複数の2kb上流を含む、遺伝子領域
のメチル化状態を評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群(i)及び/又は(ii)のDNA領域の少なくとも1つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示す、請求項1に記載の方法。 - 前記個体由来の生体試料において
(i)Hg19座標
(2)chr7:50344378...50472798;及び
(5)chr6:163834097..163834982
並びに場合によって(1)chr12:24962958..25102393、(3)chr6:391739..411443及び(4)chr12:52400748..52409671のうちの1つ若しくは複数
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(2)IKZF1;及び
(5)CAHM;
並びに場合によって(1)BCAT1、(3)IRF4及び(4)GRASP
のうちの1つ若しくは複数の2kb上流を含む、遺伝子領域
のメチル化状態を評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群(i)及び/又は(ii)のDNA領域の少なくとも1つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示す、請求項1に記載の方法。 - 前記個体由来の生体試料において
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393;及び
(3)chr6:391739..411443;
並びに場合によって(2)chr7:50344378...50472798、(4)chr12:52400748..52409671及び(5)chr6:163834097..163834982
のうちの1つ若しくは複数
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(1)BCAT1;及び
(3)IRF4;
並びに場合によって(2)IKZF1、(4)GRASP及び(5)CAHM
のうちの1つ若しくは複数の2kb上流を含む、遺伝子領域
のメチル化状態を評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群(i)及び/又は(ii)のDNA領域の少なくとも1つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示す、請求項1に記載の方法。 - 前記個体由来の生体試料において
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393;及び
(4)chr12:52400748..52409671;
並びに場合によって(2)chr7:50344378...50472798、(3)chr6:391739..411443及び(5)chr6:163834097..163834982
のうちの1つ若しくは複数
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(1)BCAT1;及び
(4)GRASP;
並びに場合によって(2)IKZF1、(3)IRF4及び(5)CAHM
のうちの1つ若しくは複数の2kb上流を含む、遺伝子領域
のメチル化状態を評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群(i)及び/又は(ii)のDNA領域の少なくとも1つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示す、請求項1に記載の方法。 - 前記個体由来の生体試料において
(i)Hg19座標
(2)chr7:50344378...50472798;及び
(3)chr6:391739..411443;
並びに場合によって(1)chr12:24962958..25102393、(4)chr12:52400748..52409671及び(5)chr6:163834097..163834982
のうちの1つ若しくは複数
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(2)IKZF1;及び
(3)IRF4;
並びに場合によって(1)BCAT1、(4)GRASP及び(5)CAHM
のうちの1つ若しくは複数の2kb上流を含む、遺伝子領域
のメチル化状態を評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群(i)及び/又は(ii)のDNA領域の少なくとも1つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示す、請求項1に記載の方法。 - 前記個体由来の生体試料において
(i)Hg19座標
(2)chr7:50344378...50472798;及び
(4)chr12:52400748..52409671;
並びに場合によって(1)chr12:24962958..25102393、(3)chr6:391739..411443及び(5)chr6:163834097..163834982
のうちの1つ若しくは複数
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(2)IKZF1;及び
(4)GRASP;
並びに場合によって(1)BCAT1、(3)IRF4及び(5)CAHM
のうちの1つ若しくは複数の2kb上流を含む、遺伝子領域
のメチル化状態を評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群(i)及び/又は(ii)のDNA領域の少なくとも1つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示す、請求項1に記載の方法。 - 前記個体由来の生体試料において
(i)Hg19座標
(3)chr6:391739..411443;及び
(4)chr12:52400748..52409671;
並びに場合によって(1)chr12:24962958..25102393、(2)chr7:50344378...50472798及び(5)chr6:163834097..163834982
のうちの1つ若しくは複数
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(3)IRF4;及び
(4)GRASP;
並びに場合によって(1)BCAT1、(2)IKZF1及び(5)CAHM
のうちの1つ若しくは複数の2kb上流を含む、遺伝子領域
のメチル化状態を評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群(i)及び/又は(ii)のDNA領域の少なくとも1つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示す、請求項1に記載の方法。 - 前記個体由来の生体試料において
(i)Hg19座標
(3)chr6:391739..411443;及び
(5)chr6:163834097..163834982;
並びに場合によって(1)chr12:24962958..25102393、(2)chr7:50344378...50472798及び(4)chr12:52400748..52409671
のうちの1つ若しくは複数
により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、DNA領域、又は
(ii)(3)IRF4;及び
(5)CAHM;
並びに場合によって(1)BCAT1、(2)IKZF1及び(4)GRASP
のうちの1つ若しくは複数の2kb上流を含む、遺伝子領域
のメチル化状態を評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群(i)及び/又は(ii)のDNA領域の少なくとも1つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示す、請求項1に記載の方法。 - 前記DNA領域のうちのいずれか1つがより高いレベルのメチル化を示す、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記DNA領域のうちのいずれか2つ又は3つ以上がより高いレベルのメチル化を示す、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記新生物細胞が腺腫又は腺癌である、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対照レベルが非新生物レベルである、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記新生物が結腸直腸新生物である、請求項1から21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生体試料が糞便試料、浣腸洗浄水、外科切除、組織生検又は血液試料である、請求項1から22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記発現レベルがゲノムDNAの変化についてスクリーニングすることにより評価される、請求項1から23のいずれか一項に記載の方法。
- ゲノムDNAの前記変化がDNAメチル化の変化である、請求項24に記載の方法。
- 前記メチル化が
(1)BCATサブ領域:chr12:25101992〜25102093(配列番号1又は対応するマイナス鎖)及びchr12:25101909〜25101995(配列番号2又は対応するマイナス鎖)
(2)IKZF1サブ領域:chr7:50343867〜50343961(配列番号3又は対応するマイナス鎖)及びchr7:50343804〜5033895(配列番号4又は対応するマイナス鎖)
(3)IRF4サブ領域:chr6:392036〜392145(配列番号5又は対応するマイナス鎖)
(4)GRASPサブ領域:chr12:52399672〜52399922、chr12:52400821〜52401051(配列番号6又は対応するマイナス鎖)、chr12:52401407〜52401664(配列番号7又は対応するマイナス鎖)、chr12:52400866〜52400973及びChr12:52401107〜52401664
(5)CAHMサブ領域:chr6:163834295〜163834500(配列番号8又は対応するマイナス鎖)、chr6:163834621〜163834906、chr6:163834393〜163834455及びchr6:163834393〜163834519
から選択される1つ又は複数の染色体サブ領域において評価される、請求項1から25のいずれか一項に記載の方法。 - 前記サブ領域が配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7若しくは配列番号8又は対応するマイナス鎖から選択される、請求項26に記載の方法。
- (GRASP)
から選択される1つ又は複数のシトシン残基のメチル化を評価するステップを含む、請求項26又は27に記載の方法。 - 前記個体由来の生体試料において
(i)Hg19座標
(1)chr12:24962958..25102393
(2)chr7:50344378...50472798
(3)chr6:391739..411443;若しくは
(4)chr12:52400748..52409671;及び
(5)chr6:163834097..163834982;
のうちのいずれか2つ若しくは3つ以上により定義される、転写開始部位の2kb上流を含む、領域、又は
(ii)(1)BCAT1 (2)IKZF1 (3)IRF4 (4)GRASP及び(5)CAHM
のうちのいずれか2つ若しくは3つ以上の2kb上流を含む、遺伝子領域
から選択されるDNA領域の発現レベルを評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群(i)及び/又は(ii)のDNA領域の少なくとも1つのより低い発現レベルが、大腸新生物又は新生物状態の発症の素因を示す、請求項1に記載の方法。 - 前記哺乳動物がヒトである、請求項1から29のいずれか一項に記載の方法。
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