CN104411835B

CN104411835B - 用于结直肠癌的诊断性基因标记系列

Info

Publication number: CN104411835B
Application number: CN201380033710.8A
Authority: CN
Inventors: P·莫里; L·拉普因忒; S·派德森
Original assignee: Clinical Genomics Co Ltd; Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Current assignee: Clinical Genomics Co Ltd; Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Priority date: 2012-05-11
Filing date: 2013-05-10
Publication date: 2019-12-20
Anticipated expiration: 2033-05-10
Also published as: EP4001436B1; CA2872867C; AU2019201294B2; EP3594366A1; CN104411835A; DK2847355T3; BR112014028122A2; JP6742726B2; DK4001436T3; WO2013166558A1; ES2749514T3; US11254985B2; US20150141275A1; CA3083314C; AU2013258880B2; DK3594366T3; JP2018198600A; JP6975807B2; BR112014028122B1; MX368034B

Abstract

本发明一般地涉及一种筛查肿瘤初起、初起倾向性和/或进展的方法。更具体地，本发明涉及一种通过筛选一系列基因标记的甲基化水平的变化，筛查肿瘤初起、初起倾向性和/或进展的方法。本发明的方法用于一系列应用中，所述应用包括但不限于涉及诊断和/或监测结直肠肿瘤(如结直肠腺癌)的那些应用。

Description

用于结直肠癌的诊断性基因标记系列

发明领域

背景技术

结直肠癌包括结肠、直肠和盲肠中的癌性生长物。世界范围每年655,000例死亡，它是美国第4位最常见的癌症形式并且是西方世界癌症死亡的第3位主导原因。结直肠癌源自结肠中的腺瘤息肉。这些蕈型生长物通常是良性的，但是一些生长物随时间推移形成癌。通常借助结肠镜检查诊断局限化结肠癌。

限于结肠壁内部的侵袭性癌(I期和II期)是用手术可治愈的。如果不治疗，它们扩散至局部淋巴结(III期)，其中至多73％通过手术和化疗可治愈。转移至远离部位的癌(IV期)通常不是可治愈的，不过化疗可以延长存活，并且在罕见情况下，手术和化疗一起彻底作用于患者直至治愈(Markowitz和Bertagnolli，2009，N.Engl.J.Med.361(25):2449-60)。将放射用于直肠癌。

结直肠癌的前奏是腺瘤。腺瘤是上皮源良性肿瘤或肿瘤，其源自腺组织或显示清晰界定的腺结构。一些腺瘤显示可识别的组织成分，如纤维组织(纤维腺瘤)和上皮结构，而其他腺瘤，如支气管腺瘤，产生可能引起临床综合征的活性化合物。

腺瘤可以进展变成侵袭性肿瘤并随后称作腺癌。因此，将腺癌定义为源自腺结构的恶性上皮肿瘤，所述腺结构是身体许多器官的组成部分。术语“腺癌”也适用于显示腺状生长样式的肿瘤。这些肿瘤可以根据它们产生的物质细分，例如分泌黏液的腺癌和浆液性腺癌，或根据其细胞微观排列成的样式细分，例如乳头状和滤泡状腺癌。这些癌瘤可以是实体的或囊性的(囊腺癌)。每种器官可以产生显示多种组织学类型的肿瘤，例如卵巢可以产生粘液腺癌和囊腺癌。

不同器官中的腺瘤表现不同。通常，癌瘤在腺瘤内部存在(即癌灶已经在良性病灶内部形成)的总几率是大约5％。然而，这与腺瘤的大小相关。例如，在大肠(特别是结肠和直肠)中，在小于1厘米的腺瘤中，癌几乎不出现在腺瘤内部。这种形成在大于4厘米的腺瘤中估计占40至50％并且显示某种组织病理学变化如绒毛状变化或高等级异型增生。异型增生程度更高的腺瘤具有更高的癌瘤发生率。在任何给定的结直肠腺瘤中，器官中现在或未来存在癌的预测物包括从管状至绒毛状形态的尺寸(尤其大于9mm)变化程度、存在高等级异型增生和称作“锯齿状腺瘤”的形态学变化。在任何给定的个体中，额外特征：年龄渐增、家族性发生结直肠腺瘤或癌、男性性别或多个腺瘤预测了器官中未来增加的癌风险-所谓癌风险因素。除了存在腺瘤及其尺寸之外，这些因素中没有一个经客观地定义并且就所讨论特征的精确定义而言，除数目和尺寸之外的全部那些特征均受观察者误差和混淆影响。因为这类因素可能难以评估和限定，所以它们作为当前或未来癌风险的预测物的价值是不精确的。

一旦零星腺瘤已经形成，则新腺瘤出现的几率在26个月内是大约30％。

结直肠癌的症状取决于肿瘤在肠中位置和是否已经转移。不过，许多症状可能在其他疾病中也出现，因此，症状可能不令人信服地诊断结直肠癌。

如果肿瘤位于更靠近肛门，则局部症状更有可能出现。可能存在排便习惯变化(在另一种病因不存在的情况下新出现的便秘或腹泻)、排便未尽感和粪便直径缩减。里急后重和粪便形状的变化均是直肠癌的特征。下胃肠道出血，包括粪便中排出鲜红色血液，可以指示结直肠癌，黏液存在增加也可以指示结直肠癌。沥青样大便(具有柏油外观的黑色粪便)正常情况下在上胃肠道出血(如来自十二指溃疡)时出现，但当病患位于大肠起始端时，有时在结直肠癌中出现。

大到足以充满整个肠腔的肿瘤可以导致肠道阻塞。这种情况以便秘、腹痛、腹胀和呕吐为特征。这偶尔导致阻塞性和胀气性肠穿孔并引起腹膜炎。

当结直肠癌已经变成更晚期时，这种疾病的某些局部影响出现。当抚触腹部时，更可能感知到巨大肿瘤，并且可能在体检上被医生感知。这种疾病可以侵入其他器官，并且可以在尿道或阴道分泌物造成出血或空气。

如果肿瘤已经造成慢性潜隐性出血，则缺铁性贫血可能发生。这可以体验为乏力、心悸并因脸色苍白而引人注目。结直肠癌也可以导致体重减轻，通常归因于食欲下降。

更不寻常的构造性症状是不明原因发热和几种副肿瘤综合征之一。最常见的副肿瘤综合征是血栓形成，通常是深静脉血栓形成。

结直肠癌最常见地扩散至肝脏。这可能察觉不到，但是肝脏中的巨大种植物可以造成黄疸和腹痛(归因于胆囊拉伸)。如果肿瘤种植物阻塞胆管，则黄疸可以伴发胆道阻塞的其他特征，如灰白粪便。

结直肠癌可以经过许多年形成显影并且结直肠癌的早期检测大大改善预后。甚至些许尝试执行结直肠癌筛查方法也可以产生癌死亡减少。尽管如此，结直肠癌筛查率仍低。目前存在可用于这个目的的几种不同检验：

·数字式直肠检查：医生将润滑的戴手套的手指插入直肠中以触摸异常区域。这种方法仅探测直肠远端部分中大到足以感知的肿瘤，但是用作初筛检验。

·粪便潜血检验：一项针对粪便中血液的检验。两种类型的检验法可以用于检测粪便中的潜血，即基于愈创木脂的检验(化学检验)和免疫化学检验。免疫化学检验的灵敏度优于化学检验的灵敏度，而特异性并未不可接受地降低(Weitzel JN(1999年12月)，"Genetic cancer risk assessment.Putting it all together(遗传性癌症风险评估.综合考虑)".Cancer 86(11Suppl):2483-92)。

·内窥镜法：

o乙状结肠镜法：将照明探头(乙状结肠镜)插入直肠和下结肠以检查息肉和其他畸形。

o结肠镜法：将称作结肠镜的照明探头插入直肠和整个结肠以寻找可能由癌引起的息肉和其他畸形。结肠镜法具有以下优点：如果在这个术式期间找到息肉，可以立即移除它们。也可以取得组织用于活组织检查。

·钡灌肠双重造影(DCBE)：首先，取得过夜制备物以清洁结肠。施用含有硫酸钡的灌肠剂，随后将空气喷注入结肠，使其鼓胀。结果是在结肠内衬上于X射线胶片上可见到的钡薄层。以这种方式可以检出癌或前癌息肉。这项技术可能错过(较不常见的)扁平息肉。

·虚拟结肠镜法将(上文)钡灌肠双重造影中的X射线胶片替换为专用计算机断层成像并且需要专用工作站软件，以便放射科医师解读。在针对息肉的灵敏度方面，这项技术接近于结肠镜法。然而，仍必须通过标准结肠镜法移除任何息肉。

·标准计算机轴向断层成像是一种X射线方法，所述方法可以用来确定癌扩散程度，但灵敏度不足以用于筛查。在出于其他原因所进行的CAT扫描中发现一些癌。

·血液检验：针对升高水平的某些蛋白质测量患者的血液可以指示肿瘤负荷。具体而言，血液中高水平的癌胚抗原(CEA)可以指示腺癌转移。尽管这些检验经常是假阳性或假阴性的并且不推荐用于筛查，但它们可以用于评估疾病复发。CA19-9和CA 242生物标记可以指示e-选择素相关的转移风险，帮助跟踪治疗进展并评估疾病复发。最近，一种用于检测血浆中Septin 9基因的甲基化序列测定法也已经可用于辅助诊断结直肠癌。

·正电子发射断层摄影术(PET)是一种立体扫描技术，其中将放射性糖注射至患者中，糖积存在具有高代谢活动的组织中，并且通过测量来自糖的辐射发射形成图像。因为癌细胞经常具有很高的代谢速率，所以这项技术可以用来区分良性肿瘤和恶性肿瘤。PET不用于筛查并且(仍)不用于结直肠癌病例的例行病情检查。

·粪便DNA检验是一项筛查结直肠癌的新兴技术。恶变前腺瘤和癌从它们的细胞中散播DNA标记，所述DNA标记在消化过程期间不降解并且在粪便中保持稳定。捕获，随后PCR，将DNA扩增至分析可检测的水平。

·高C-反应蛋白水平作为风险标记

尽管存在这些检验，但诊断仍是问题。大部分更敏感的检验具有相当的侵入性且昂贵，并且因此患者吞咽意愿低。因此持续需要开发简单和更有信息的诊断方案或诊断辅助措施以能够针对更可能已经形成腺瘤或癌瘤的人指导结肠镜法。简单和精确的筛查检验将使得建立适用性广泛得多的筛查系统成为可能。

为此目的，最近已经在已经形成大肠肿瘤的个体中鉴定到就它们的表达水平而言受调节的遗传标记。这些标记中的一些就它们的表达水平而言上调，而其他下调。但是，大多数这些标记共有的特征和遗传标记表达水平总体上作为诊断物的用途在于，它们经常仅显示中度水平的灵敏度和特异性。迫切寻求开发提供高水平灵敏度和特异性的诊断方案。

在导致本发明的工作中，已经出乎意料地确定，实际上确定基因标记BCAT1、IKZF1、IRF4、GRASP和CAHM，尽管各自分别是就诊断结直肠瘤形成发展而言显示用途的众多基因标记之一，但整体地能够比单独或与其他不相关基因标记一起分析这些基因标记中任一者时实现显著更高的灵敏度水平或特异性。更具体的讲，可以如此涉及筛查这5个特定标记中任何两种或更多种标记的甲基化水平增加，从而实现先前不可实现的特异性或灵敏度水平。

考虑到在差异性基因表达分析研究中已经证实在瘤形成中显示受调节的表达水平的基因标记的巨大数目，如下鉴定是出乎意料和未预料到的：5个特定标记可以相对这些标记单独或相对于其他标记组实际上总体提供改善的诊断结果。

发明简述

遍及整个说明书和后续权利要求书，除非上下文另外要求，否则词汇“包含”及其变化形式如“包括”及“包含有”应理解为表示包括所陈述的整数或步骤或者所陈述的整数或步骤组，但不排除任何其它整数或步骤或任何其它整数或步骤组。

如本文所用，术语“源自”应当理解为表示，特定的整体或整体群组已经起源于指定的物种，但是不必然已经从指定的来源直接获得。除非上下文另外清楚地说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指称。

除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

主题说明书含有核苷酸序列信息，所述核苷酸序列信使用在参考文献后提供的程序PatentIn 3.5准备。每个核苷酸序列在序列表中由数字指示符<210>后接序列标识符(例如<210>1、<210>2等)来确定。序列的长度、类型(DNA等)和每个序列的来源生物由分别以数字指示符域<211>、<212>和<213>提供的信息指示。本说明书中提到的核苷酸序列由指示符SEQ ID NO:后接序列标识符确定(例如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2等)。本说明书中提到的序列标识符与序列表中以数字指示符域<400>提供的信息相关，所述数字指示符域后接序列标识(例如<400>1、<400>2等)。即，如本说明书中详述的SEQ ID NO:1与序列表中显示为<400>1的序列相关。

本发明的一个方面涉及一种筛查个体中大肠肿瘤初起或初起倾向性或监测大肠肿瘤的方法，所述方法包括在来自所述个体的生物样品中评估DNA区域的甲基化状态，所述DNA区域选自：

(i)由Hg19坐标中任何两个或多个限定的区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(1)chr12:24962958..25102393

(2)chr7:50344378...50472798

(3)chr6:391739..411443；

(4)chr12:52400748..52409671；和

(5)chr6:163834097..163834982；或

(ii)以下任何两个或多个的基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1(2)IKZF1(3)IRF4(4)GRASP和(5)CAHM

其中相对于对照水平而言组(i)和/或(ii)的至少之一DNA区域的较高甲基化水平指示有大肠肿瘤或大肠瘤形成状态初起的倾向性。

在另一个方面，所述方法涉及鉴定其中任一个所述DNA区域显示出更高甲基化水平的生物样品。

在另一个方面，所述方法涉及鉴定其中两个或更多个所述DNA区域显示出更高甲基化水平的生物样品。

在又一个方面，提供一种筛查个体中大肠肿瘤初起或初起倾向性或监测大肠肿瘤的方法，所述方法包括在来自所述个体的生物样品中评估如下区域的甲基化状态：

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(1)chr12:24962958..25102393；和

(2)chr7:50344378...50472798；

和任选地(3)chr6:391739..411443、(4)chr12:52400748..52409671和(5)chr6:163834097..163834982中的一个或多个；或

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1；和

(2)IKZF1；

和任选地(3)IRF4、(4)GRASP和(5)CAHM中的一个或多个，

在这个方面的一个实施方案中，受筛选的基因标记系是：

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(1)chr12:24962958..25102393

(2)chr7:50344378...50472798；和

(3)chr6:391739..411443；或

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1、(2)IKZF1和(3)IRF4。

在这个方面的另一个实施方案中，受筛选的基因标记系是：

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(1)chr12:24962958..25102393

(2)chr7:50344378...50472798和

(4)chr12:52400748..52409671；或

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1、2)IKZF1；和(4)GRASP。

在这个方面的又一个实施方案中，受筛选的基因标记系是：

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(1)chr12:24962958..25102393

(2)chr7:50344378...50472798和

(5)chr6:163834097..163834982；或

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1、(2)IKZF1和(5)CAHM。

在这个方面的再一个实施方案中，受筛选的基因标记系是：

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(1)chr12:24962958..25102393

(2)chr7:50344378...50472798

(3)chr6:391739..411443；和

(4)chr12:52400748..52409671；或

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1、(2)IKZF1、(3)IRF4和(4)GRASP。

在这个方面的另外又一个实施方案中，受筛选的基因标记系是：

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(1)chr12:24962958..25102393

(2)chr7:50344378...50472798

(3)chr6:391739..411443；和

(5)chr6:163834097..163834982；或

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1、(2)IKZF1、(3)IRF4和(5)CAHM。

在这个方面的又一个实施方案中，受筛选的基因标记系是：

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(1)chr12:24962958..25102393

(2)chr7:50344378...50472798

(4)chr12:52400748..52409671；和

(5)chr6:163834097..163834982；或

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1、(2)IKZF1、(4)GRASP和(5)CAHM。

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(1)chr12:24962958..25102393

(2)chr7:50344378...50472798

(3)chr6:391739..411443

(4)chr12:52400748..52409671；和

(5)chr6:163834097..163834982；或

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1、(2)IKZF1、(3)IRF4、(4)GRASP和(5)CAHM。

在另一个实施方案，提供一种筛查个体中大肠肿瘤初起或初起倾向性或监测大肠肿瘤的方法，所述方法包括在来自所述个体的生物样品中评估如下区域的甲基化状态：

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(1)chr12:24962958..25102393；和

(5)chr6:163834097..163834982；

和任选地(2)chr7:50344378...50472798、(3)chr6:391739..411443和(4)chr12:52400748..52409671中的一个或多个；或

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1；和

(5)CAHM；

和任选地(2)IKZF1、(3)IRF4和(4)GRASP中的一个或多个，

在又一个实施方案，提供一种筛查个体中大肠肿瘤初起或初起倾向性或监测大肠肿瘤的方法，所述方法包括在来自所述个体的生物样品中评估如下区域的甲基化状态：

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(2)chr7:50344378..50472798；和

(5)chr6:163834097..163834982；

和任选地(1)chr12:24962958..25102393、(3)chr6:391739..411443和(4)chr12:52400748..52409671中的一个或多个；或

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(2)IKZF1；和

(5)CAHM；

和任选地(1)BCAT1、(3)IRF4和(4)GRASP中的一个或多个，

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(1)chr12:24962958..25102393；和

(3)chr6:391739..411443；

和任选地(2)chr7:50344378...50472798、(4)chr12:52400748..52409671和(5)chr6:163834097..163834982中的一个或多个；或

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1；和

(3)IRF4；

和任选地(2)IKZF1、(4)GRASP和(5)CAHM中的一个或多个，

在另外又一个实施方案，提供一种筛查个体中大肠肿瘤初起或初起倾向性或监测大肠肿瘤的方法，所述方法包括在来自所述个体的生物样品中评估如下区域的甲基化状态：

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(1)chr12:24962958..25102393；和

(4)chr12:52400748..52409671；

和任选地(2)chr7:50344378...50472798、(3)chr6:391739..411443和(5)chr6:163834097..163834982中的一个或多个；或

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1；和

(4)GRASP；

和任选地(2)IKZF1、(3)IRF4和(5)CAHM中的一个或多个，

在另外再一个实施方案，提供一种筛查个体中大肠肿瘤初起或初起倾向性或监测大肠肿瘤的方法，所述方法包括在来自所述个体的生物样品中评估如下区域的甲基化状态：

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(2)chr7:50344378..50472798；和

(3)chr6:391739..411443；

和任选地(1)chr12:24962958..25102393、(4)chr12:52400748..52409671和(5)chr6:163834097..163834982中的一个或多个；或

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(2)IKZF1；和

(3)IRF4；

和任选地(1)BCAT1、(4)GRASP和(5)CAHM中的一个或多个，

在仍又一个实施方案，提供一种筛查个体中大肠肿瘤初起或初起倾向性或监测大肠肿瘤的方法，所述方法包括在来自所述个体的生物样品中评估如下区域的甲基化状态：

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(2)chr7:50344378..50472798；和

(4)chr12:52400748..52409671；

和任选地(1)chr12:24962958..25102393、(3)chr6:391739..411443和(5)chr6:163834097..163834982中的一个或多个；或

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(2)IKZF1；和

(4)GRASP；

和任选地(1)BCAT1、(3)IRF4和(5)CAHM中的一个或多个，

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(3)chr6:391739..411443；和

(4)chr12:52400748..52409671；

和任选地(1)chr12:24962958..25102393、(2)chr7:50344378...50472798和(5)chr6:163834097..163834982中的一个或多个；或

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(3)IRF4；和

(4)GRASP；

和任选地(1)BCAT1、(2)IKZF1和(5)CAHM中的一个或多个，

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(3)chr6:391739..411443；和

(5)chr6:163834097..163834982；

和任选地(1)chr12:24962958..25102393、(2)chr7:50344378...50472798和(4)chr12:52400748..52409671中的一个或多个；或

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(3)IRF4；和

(5)CAHM；

和任选地(1)BCAT1、(2)IKZF1和(4)GRASP中的一个或多个，

下文参考其中找到已经确定显示特殊用途的亚区域的基因和染色体区域列出这些亚区域：

(1)BCAT亚区域chr12:25101992-25102093(SEQ ID NO:1或相应的负链)和chr12:25101909-25101995(SEQ ID NO:2或相应的负链)

(2)IKZF1亚区域chr7:50343867-50343961(SEQ ID NO:3或相应的负链)和chr7:50343804-5033895(SEQ ID NO:4或相应的负链)

(3)IRF4亚区域chr6:392036-392145(SEQ ID NO:5或相应的负链)

(4)GRASP亚区域：chr12:52399672-52399922、chr12:52400821-52401051(SEQ IDNO:6或相应的负链)、chr12:52401407-52401664(SEQ ID NO:7或相应的负链)chr12:52400866-52400973和Chr12:52401107-52401664。

(5)CAHM亚区域：chr6:163834295-163834500(SEQ ID NO:8或相应的负链)、chr6:163834621-163834906、chr6:163834393-163834455和chr6:163834393-163834519。

如果本发明的方法包括分析GRASP的甲基化，则主题残基是：

或在对侧DNA链上第n+1位置处的相应胞嘧啶。

如果本发明的方法包括分析CAHM的甲基化，则主题残基是：

或在对侧DNA链上第n+1位置处的相应胞嘧啶。

如果本发明的方法包括分析IKZF1的甲基化，则主题残基是：

或在对侧DNA链上第n+1位置处的相应胞嘧啶。

如果本发明的方法包括分析IRF4的甲基化，则主题残基是：

或在对侧DNA链上第n+1位置处的相应胞嘧啶。

本发明的另一个方面涉及一种筛查个体中大肠肿瘤初起或初起倾向性或监测大肠肿瘤的方法，所述方法包括在来自所述个体的生物样品中评估DNA区域的表达水平，所述DNA区域选自：

(1)chr12:24962958..25102393

(2)chr7:50344378...50472798

(3)chr6:391739..411443；或

(4)chr12:52400748..52409671；和

(5)chr6:163834097..163834982；或

(ii)以下任何两个或多个的基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1(2)IKZF1(3)IRF4(4)GRASP和(5)CAHM

其中相对于对照水平而言组(i)和/或(ii)的至少一个DNA区域的较低表达水平指示有大肠肿瘤或瘤形成状态初起倾向性。

附图简述

图1描述GRASP的基因组序列。

图2描述CAHM的基因组序列。

图3描述IRF4的基因组序列。

图4描述BCAT1的基因组序列。

图5描述IKZF1的基因组序列。

发明详述

本发明部分地基于以下确定：一系列基因标记的甲基化模式的改变可以在整体检验时比这些标记中任一标记单独检验或与除本文中指定的那些标记之外的标记一起检验时提供更高水平的诊断特异性或诊断灵敏度。这项研究结果因此现在已经促进开发基于评估基因标记BCAT1、IKZF1、CAHM、GRASP和IRF4中两个或更多个标记的甲基化而诊断、预测或监测大肠肿瘤的改进检验法。

根据本发明，已经确定某些特定基因系列(panel)就其甲基化水平的差异性变化而言受到调节，这取决于所讨论细胞是否具有肿瘤性或不具有肿瘤性。应当理解将所讨论的基因在本文中通过提到它们的名称和它们的染色体坐标来描述。染色体坐标与2009年2月发布的人类基因组数据库Hg19版(本文中称作“Hg19坐标”)一致。

因此，本发明的一个方面涉及一种筛查个体中大肠肿瘤初起或初起倾向性或监测大肠肿瘤的方法，所述方法包括在来自所述个体的生物样品中评估DNA区域的甲基化状态，所述DNA区域选自：

(1)chr12:24962958..25102393

(2)chr7:50344378...50472798

(3)chr6:391739..411443；

(4)chr12:52400748..52409671；和

(5)chr6:163834097..163834982；或

(ii)以下任何两个或多个的基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1(2)IKZF1(3)IRF4(4)GRASP和(5)CAHM

在一个实施方案中，所述方法涉及鉴定其中任一个所述DNA区域显示出更高甲基化水平的生物样品。

在另一个实施方案中，所述方法涉及鉴定其中两个或更多个所述DNA区域显示出更高甲基化水平的生物样品。

在不将本发明限于任一项理论或作用模式的情况下，本文中所指明的一系列DNA区域(标记)不仅相对于现有技术方法提供改进的诊断结果，另外还使开发下述筛查方法成为可能，所述筛查方法可以设计成专注于提供高水平的诊断特异性或高水平的诊断灵敏度。如本领域技术人员将理解，在诊断学的语境下，“灵敏度”限定正确鉴定的阳性结果的比例，即，正确鉴定为具有所讨论疾病的个体的百分数。然而，“特异性”限定正确鉴定的阴性结果的比例，即，正确鉴定为不具有所讨论疾病的个体的百分数。

在本发明的上下文中，已经确定可以将筛查患者样品的指定标记系列的甲基化状态设计成提供显示高水平特异性的诊断结果或显示高水平灵敏度的诊断结果。

在寻求高水平灵敏度的情况下，将筛查方法设计成鉴定其中标记系列的任一标记相对于对照水平显示甲基化增加的样品。即，并不要求全部标记均显示过度甲基化以将结果确定为阳性。在寻求更高水平灵敏度的情况下，特异性水平内在地降低。但是，如果需要追求更高水平的特异性(这可能降低灵敏度水平)，则将所述方法设计成鉴定其中DNA区域系列的两个或更多个区域显示甲基化增加的样品。

因此，如果本发明涉及所述方法的实施方案，其中指定系列的“任一个”DNA区域(标记)显示更高水平的甲基化，则将这些实施方案设计成实现下述结果，所述结果基于该系列中任一个标记过度甲基化显示增加的灵敏度。应当理解它不必要每份样品中均过度甲基化的相同标记。相反，单纯地在于形成该系列的部分的标记之一过度甲基化。还应当理解相对某些样品，该系列的两个或更多个标记可以过度甲基化。然而，应当理解这些样品落于本发明的这个实施方案范围内，因为这个实施方案不排除其中多个标记过度甲基化的情况，但是在其范围内部仅包括其中少至一个标记过度甲基化的全部那些样品。总体上，这些数据将提供增加的灵敏度，但提供降低的特异性。

如果本发明涉及所述方法的实施方案，其中指定系列的“两个或更多个”DNA区域(标记)显示更高水平的甲基化，则将这些实施方案设计成实现更高水平的特异性。这借助以下事实实现：确定指定标记系列的至少两个(如果不是更多个)标记过度甲基化。

对“大肠”的指称应当理解为指称源自大肠的8个解剖区域之一的细胞，所述区域始于回肠的末端区域，这些区域是：

(i)盲肠；

(ii)升结肠；

(iii)横结肠；

(iv)降结肠；

(v)乙状结肠；

(vi)直肠；

(vii)脾曲；和

(viii)肝曲。

对“肿瘤(neoplasm)”的指称应当理解为指称包含肿瘤细胞的病灶、肿瘤(tumour)或其他包囊化或未包囊化的团块或其他形式的生长物。“肿瘤细胞”应当理解指显示异常生长的细胞。术语“生长”应当以其最广泛的意义理解并且包括增殖。在这方面，异常细胞生长的例子是细胞的失控增殖。另一个例子是细胞中凋亡失败，因此延长其常规寿命。肿瘤细胞可以是良性细胞或恶性细胞。在一个优选实的施方案中，主题肿瘤是腺瘤或腺癌。不使本发明限于任一理论或作用模式，腺瘤通常是上皮源良性肿瘤，其源自上皮组织或显示清晰界定的上皮结构。这些结构物可以采取腺状外观。它可能在腺瘤内部包含恶性细胞群体，如随良性腺瘤或良性肿瘤病灶进展成恶性腺癌而发生。

优选地，所述肿瘤细胞是腺瘤或腺癌并且甚至更优选地是结直肠腺瘤或腺癌。

对“DNA区域”的指称应当理解为指称基因组DNA的特定区段。这些DNA区域通过提到基因名称或一组染色体坐标来指定。这些基因名称和染色体坐标均将是本领域技术人员熟知并理解的。如前文中详述，染色体坐标对应于基因组的Hg19版。通常，一个基因可以通过参考其名称常规地确定，其中可以借助所述名称常规地获得其序列和染色体位置，或通过参考其染色体坐标常规地确定，其中也可以借助所述染色体坐标常规地获得基因名称及其序列。

对以上详述的每个基因DNA区域的指称应当理解为指称这些分子的全部形式及其片段或变体。如本领域技术人员将领会，已知一些基因显示个体间等位变异或单核苷酸多态性。SNP包括不定尺寸的插入和缺失和简单序列重复序列，如二核苷酸和三核苷酸重复序列。变体包括来自相同区域的核酸序列，所述的相同区域相对于本文所述的DNA区域共有至少90％、95％、98％、99％序列同一性即具有一个或多个缺失、添加、置换、倒转序列等。因而，本发明应当理解为扩展至这类变体，其中就本发明的诊断应用而言，尽管如下事实：实际核酸序列之间的少量遗传性变异可能在个体之间存在，但是所述变体实现相同的结果。本发明因此应当理解为扩展至全部形式的DNA，它们源自任何其他的突变、多态性变异或等位变异。

应当理解，作为检验主体的“个体”可以是任何的人类或非人类哺乳动物。非人类哺乳动物的例子包括灵长类、家畜动物(例如马、牛、羊、猪、驴)、实验室试验动物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠)、伴侣动物(例如犬、猫)和圈养野生动物(例如鹿、狐)。

优选地，哺乳动物是人。

已经鉴定的基因系列在大肠肿瘤细胞中相对于相应的非肿瘤细胞显示增加的甲基化。在一些情况下，将这种增加的甲基化定位至DNA区域内部的一些特定CpG位点，而在其他情况下，在广泛类型的CpG位点内观察到它。然而，虽然来自全部基因的特定区域显示增加的甲基化并且因此是有用的诊断标记，但正是将这些特定标记作为一个系列分析才在灵敏度和特异性方面提供了独立和非常显著的改进，这可能胜过单独分析这些标记可能可获得的改进。甚至当相对于使用已知显示甲基化增加作为大肠肿瘤初起标记的其他标记可获得的灵敏度和特异性考虑时，这种改进也是显著的。因此，本发明的方法现在提供一种实现比迄今已经可实现的更高水平灵敏度和特异性的手段。

在一个方面，提供一种筛查个体中大肠肿瘤初起或初起倾向性或监测大肠肿瘤的方法，所述方法包括在来自所述个体的生物样品中评估如下区域的甲基化状态：

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(1)chr12:24962958..25102393；和

(2)chr7:50344378...50472798；

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1；和

(2)IKZF1；

和任选地(3)IRF4、(4)GRASP和(5)CAHM中的一个或多个，

在这个方面的一个实施方案中，受筛选的基因标记系是：

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(1)chr12:24962958..25102393

(2)chr7:50344378...50472798；和

(3)chr6:391739..411443；或

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1、(2)IKZF1和(3)IRF4。

在这个方面的另一个实施方案中，受筛选的基因标记系是：

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(1)chr12:24962958..25102393

(2)chr7:50344378...50472798和

(3)chr12:52400748..52409671；或

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1、2)IKZF1；和(4)GRASP。

在这个方面的又一个实施方案中，受筛选的基因标记系是：

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(1)chr12:24962958..25102393

(2)chr7:50344378...50472798和

(5)chr6:163834097..163834982；或

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1、(2)IKZF1和(5)CAHM。

在这个方面的再一个实施方案中，受筛选的基因标记系是：

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(1)chr12:24962958..25102393

(2)chr7:50344378...50472798

(3)chr6:391739..411443；和

(3)chr12:52400748..52409671；或

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1、(2)IKZF1、(3)IRF4和(4)GRASP。

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(1)chr12:24962958..25102393

(2)chr7:50344378...50472798

(3)chr6:391739..411443；和

(5)chr6:163834097..163834982；或

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1、(2)IKZF1、(3)IRF4和(5)CAHM。

在这个方面的又一个实施方案中，受筛选的基因标记系是：

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(1)chr12:24962958..25102393

(2)chr7:50344378...50472798

(4)chr12:52400748..52409671；和

(5)chr6:163834097..163834982；或

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1、(2)IKZF1、(4)GRASP和(5)CAHM。

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(1)chr12:24962958..25102393

(2)chr7:50344378...50472798

(3)chr6:391739..411443

(4)chr12:52400748..52409671；和

(5)chr6:163834097..163834982；或

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1、(2)IKZF1、(3)IRF4、(4)GRASP和(5)CAHM。

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(1)chr12:24962958..25102393；和

(5)chr6:163834097..163834982；

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1；和

(5)CAHM；

和任选地(2)IKZF1、(3)IRF4和(4)GRASP中的一个或多个，

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(2)chr7:50344378..50472798；和

(5)chr6:163834097..163834982；

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(2)IKZF1；和

(5)CAHM；

和任选地(1)BCAT1、(3)IRF4和(4)GRASP中的一个或多个，

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(1)chr12:24962958..25102393；和

(3)chr6:391739..411443；

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1；和

(3)IRF4；

和任选地(2)IKZF1、(4)GRASP和(5)CAHM中的一个或多个，

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(1)chr12:24962958..25102393；和

(4)chr12:52400748..52409671；

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1；和

(4)GRASP；

和任选地(2)IKZF1、(3)IRF4和(5)CAHM中的一个或多个，

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(2)chr7:50344378..50472798；和

(3)chr6:391739..411443；

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(2)IKZF1；和

(3)IRF4；

和任选地(1)BCAT1、(4)GRASP和(5)CAHM中的一个或多个，

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(2)chr7:50344378..50472798；和

(4)chr12:52400748..52409671；

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(2)IKZF1；和

(4)GRASP；

和任选地(1)BCAT1、(3)IRF4和(5)CAHM中的一个或多个，

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(3)chr6:391739..411443；和

(4)chr12:52400748..52409671；

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(3)IRF4；和

(4)GRASP；

和任选地(1)BCAT1、(2)IKZF1和(5)CAHM中的一个或多个，

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(3)chr6:391739..411443；和

(5)chr6:163834097..163834982；

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(3)IRF4；和

(5)CAHM；

和任选地(1)BCAT1、(2)IKZF1和(4)GRASP中的一个或多个，

根据这些方面和实施方案，在又一个实施方案中，所述对照水平是非肿瘤水平。

另外，在另一个实施方案中，所述大肠组织优选地是结直肠组织。

在又一个实施方案中，肿瘤是恶性的，如癌瘤。

在又一个实施方案中，肿瘤是非恶性的，如腺瘤。

就筛查这些基因区域的甲基化而言，应当理解可以将测定法设计成筛查本文中列出的特定区域(其对应于基因的“正”链)或互补“负”链。完全在本领域技术人员能力范围内的是选择哪条链分析和基于本文提供的染色体坐标靶向这条链。在一些情况下，可以建立筛查两条链的测定法。

应当理解可以仅筛查指定系列的标记或可以选择额外筛查其他标记，如其他DNA过度甲基化标记、其他RNA表达水平标记或其他蛋白质标记。这些其他标记可以例如提供与所讨论患者的健康状态相关的额外信息。

不使本发明限于任一理论或作用模式，虽然测量这些DNA区域范围内的甲基化水平可诊断大肠瘤形成状况，但是已经确定分立的亚区域在这方面是特别有用，因为这些亚区域含有高密度的CpG二核苷酸，所述的CpG二核苷酸经常在大肠瘤形成(如结直肠癌)中过度甲基化。这项研究结果使这些亚区域成为特别有用的分析靶，因为它既简化筛查过程，原因是需要分析更短的更清晰限定的DNA区域，又进一步在于以下事实：与分析作为一个整体的DNA区域时本来将获得的结果相比，来自这些区域的结果将相对于存在或不存在过度甲基化而提供明显更确定的结果。这项研究结果因此既简化筛查过程，又增加大肠瘤形成诊断的灵敏度和特异性。

(1)IKZF1亚区域chr7:50343867-50343961(SEQ ID NO:3或相应的负链)和chr7:50343804-5033895(SEQ ID NO:4或相应的负链)

(3)IRF4亚区域chr6:392036-392145(SEQ ID NO:5或相应的负链)

(5)CAHM亚区域：chr6:163834295-163834500(SEQ ID NO:8、chr6:163834621-163834906、chr6:163834393-163834455和chr6:163834393-163834519。

不使本发明限于任一理论或作用模式，技术人员可以筛查每个基因标记的一个或多个亚区域。

在一个实施方案中，对选择的每个基因标记的检验甲基化标记亚区域：

(1)由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或相应负链限定的BCAT亚区域；

(2)由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或相应负链限定的IKZF1亚区域；

(3)由SEQ ID NO:5或相应负链限定的IRF4亚区域；

(4)由SEQ ID NO:6或7或相应负链限定的GRASP亚区域；和

(5)由SEQ ID NO:8或相应负链限定的CAHM亚区域。

不使本发明限于任一理论或作用模式，DNA甲基化普遍存在于细菌、植物和动物中。DNA甲基化是一种类型的DNA化学修饰，所述化学修饰经过多轮细胞分裂是稳定的，但是不涉及生物的基础性DNA序列变化。染色质修饰和DNA修饰是表观遗传学的两个重要特征并且在细胞分化过程中发挥作用，允许细胞即便含有相同的基因组物质但仍稳定维持不同的特征。在真核生物中，DNA甲基化仅在胞嘧啶的嘧啶环的编号5碳处发生。在哺乳动物中，DNA甲基化大多在CpG二核苷酸的编号5碳处发生。CpG二核苷酸占据大约1％人类基因组。

70-80％的全部CpG是甲基化的。CpG可以成簇地群集，称作“CpG岛”，其存在于许多基因的5'调节区中并且经常是非甲基化的。在许多疾病过程如癌症中，基因启动子和/或CpG岛获得异常的过度甲基化，这与可遗传的转录性沉默相关。DNA甲基化可以按两种方式影响基因的转录。首先，DNA的甲基化本身可以物理地阻碍转录蛋白与基因结合，因此阻断转录。其次，甲基化DNA可以被称作甲基-CpG-结合结构域蛋白(MBD)的蛋白质结合。MBD蛋白随后向基因座召集额外的蛋白质，如组蛋白脱乙酰酶和可以修饰组蛋白的其他染色质重塑蛋白，从而形成紧凑无活性的染色质，称作沉默染色质。DNA甲基化和染色质结构之间的这种联系非常重要。具体而言，甲基-CpG-结合蛋白2(MeCP2)的丢失已经在Rett综合征中显示意义并且甲基-CpG结合结构域蛋白2(MBD2)介导癌症中过度甲基化基因的转录性沉默。

在人类中，DNA甲基化的过程由3种酶即DNA甲基转移酶1、3a和3b(DNMT1、DNMT3a、DNMT3b)实施。认为DNMT3a和DNMT3b是在发育中早期建立DNA甲基化样式的从头甲基转移酶。DNMT1是提出的维护甲基转移酶，该酶在DNA复制期间负责将DNA甲基化样式拷贝至子代链。DNMT3L是与其他DNMT3同源但没有催化活性的蛋白质。相反，DNMT3L通过以下方式辅助从头甲基转移酶：增加它们与DNA结合的能力并刺激它们的活性。最后，已经将DNMT2鉴定为“神秘”DNA甲基转移酶同源物，其含有全部DNA甲基转移酶共同的全部10个序列基序；然而，DNMT2可能不使DNA甲基化，反而已经显示使小RNA甲基化。

“甲基化状态”应当因此理解为指甲基化在DNA区域内部一个特定核苷酸或多个核苷酸处的存在、不存在和/或其量。特定DNA序列(例如，如本文所述的DNA区域)的甲基化状态可以表示这个序列中每个碱基的甲基化状态，或可以表示这个序列中碱基对亚集的甲基化状态(例如，胞嘧啶的或一种或多种特定限制性酶识别序列的甲基化状态)，或可以表示这个序列内部关于区域甲基化密度的信息，而不提供该序列中何处发生甲基化的精确信息。甲基化状态可以任选地由“甲基化值”代表或表示。可以例如通过对采用甲基化依赖限制性酶进行限制酶切消化后存在的完整DNA的量定量，产生甲基化值。在这个例子中，如果DNA中的特定序列使用定量PCR定量，则与模拟处理的对照大致相等的模板DNA的量表示该序列未高度甲基化，而比模拟处理的样品中出现的模板量明显更少的模板量表示这个序列中存在甲基化DNA。因此，例如来自上述例子的值(即，甲基化值)代表甲基化状态并且因此可以用作甲基化状态的定量指示物。当需要将样品中序列的甲基化状态与阈值比较时，这特别有用。

本发明的方法基于生物样品的特定DNA区域的甲基化水平与这些DNA区域的对照甲基化水平比较。“对照水平”是“正常水平”，所述正常水平是无肿瘤性的相应大肠细胞或细胞群体的DNA区域的甲基化水平或可以从中分离DNA用于分析的另一种生物样品中的甲基化水平。

可以使用源自作为检验主体的相同个体的非肿瘤组织确定正常(或“非肿瘤性”)甲基化水平。然而，将理解，这可能对于所涉及个体而言相当有侵入性，并且因此可能更便利的是相对于标准结果分析检验结果，其中所述标准结果反映了从所讨论患者之外的个体中获得的单个或综合结果。后一种形式的分析实际上是优选的分析方法，因为它使设计试剂盒成为可能，其中所述试剂盒需要采集和分析作为目的检验样品的单一生物样品。提供正常甲基化水平的标准结果可以由本领域技术人员本来熟知的任何适合手段计算。例如，可以就本发明基因的甲基化水平评估一群正常组织，从而提供全部未来检验样品针对其进行分析的标准值或值范围。也应当理解，正常水平可以从来自特定队列的受试者确定并相对于源自这个队列的检验样品使用。因此，可以确定许多的标准值或范围，它们对应于在多个特征如年龄、性别、种族性或健康状态方面不同的队列。所述“正常水平”可以是分立的水平或水平范围。相对于正常水平，主题基因的甲基化水平增加表示组织具有肿瘤性。

术语“甲基化”应当理解为意指在核酸(例如基因组DNA)的区域内存在因DNA甲基转移酶的作用而向一个胞嘧啶碱基或多个碱基添加的甲基。如本文所述，存在本领域技术人员已知的几种方法用于确定核酸的甲基化水平或程度。

“更高水平”意指与对照样品相比，在诊断的受试者中存在更高数目的甲基化CpG二核苷酸，即，在特定CpG位点处甲基化的DNA分子的比例更高或在受试者中存在更高数目的独立甲基化CpG位点。应当理解术语“增强”和“增加”与术语“更高”互换使用。

相对于检测“更高水平”的甲基化，应当理解在一些情况下正常/对照水平将实际上对应于不存在任何可检测的甲基化，而肿瘤水平将本身对应于甲基化的存在。在这种情况下，诊断方法相对简单，因为仅需要筛查甲基化的单纯存在(即，仅定性评估)，而不是相对于对照甲基化水平评估甲基化水平，所述分析必然涉及定量措施。在不以任何方式限制本发明的情况下，观察到在血液衍生的样品中，例如，在一些标记的背景下，瘤形成开始时该标记的甲基化变化是从不可检测水平的甲基化转变正存在可检测的甲基化。在这些情况下，能够进行一种相对简单的定性评估，其中仅需求筛查检验样品以确定甲基化的存在或不存在。在本文提供的定义的背景下，对“更高水平”的指称涵盖标记的甲基化水平相对增加或甲基化开始，其中二者先前均不明了。如前文中详述，对照水平可以对每位患者重新评估或可以存在全部检验样品针对其进行评估的标准结果。在已知甲基化不存在于目的标记上的情况下，仅需要筛查甲基化的存在或不存在，因为对照水平是不存在甲基化并且“更高水平”因而是存在任何量的甲基化。

本发明不受被视为诊断出受试者中瘤形成的甲基化残基的精确数目限制，因为患者样品之间将出现一些变异。本发明也不受甲基化残基的定位限制。

然而，也已经鉴定到这些亚区域内经历过度甲基化的许多特定胞嘧啶残基。因此，在另一个实施方案中，可以使用一种筛查方法，所述筛查方法尤其涉及评估这些残基或在对侧DNA链上位置n+1内的一个或多个相应胞嘧啶的甲基化状态。

为此目的，表1中详述已经在这方面鉴定到的胞嘧啶残基。本领域技术人员应当理解，这些独立残基通过参考Hg19进行编号，其中所述Hg19也对应于本文中列出的特定亚区域的编号并且当为每个亚区域编号的坐标应用于序列表中提供的相应亚区域序列时可以进一步确定。应当理解已经在亚区域DNA的背景下鉴定这些残基。然而，在这些亚区域自身之外但在衍生这些亚区域的较大DNA区域范围内部存在过度甲基化的其他残基。因此，这些指定的残基代表一个特别有用的独立胞嘧啶残基亚集，其中所述胞嘧啶残基在本文公开的DNA区域和亚区域的背景范围内经历过度甲基化。这些独立残基根据它们在其中出现的DNA区域如下分组。这些DNA区域通过参考Hg19染色体坐标和基因区域名称确定。

如果本发明的方法包括分析GRASP的甲基化，则主题残基是：

或在对侧DNA链上第n+1位置处的相应胞嘧啶。

如果本发明的方法包括分析CAHM的甲基化，则主题残基是：

或在对侧DNA链上第n+1位置处的相应胞嘧啶。

如果本发明的方法包括分析IKZF1的甲基化，则主题残基是：

或在对侧DNA链上第n+1位置处的相应胞嘧啶。

如果本发明的方法包括分析IRF4的甲基化，则主题残基是：

或在对侧DNA链上第n+1位置处的相应胞嘧啶。

本发明的检测方法可以对任何适合的生物样品进行。为此目的，对“生物样品”的指称应当理解为指称生物材料的任何样品，其源自动物，如但不限于细胞材料、生物流体(例如血液)、粪便、组织活组织检查标本、手术标本或已经导入动物身体中并且随后取出的流体(如，例如，从灌肠洗液抽回的溶液)。根据本发明方法检验的生物样品可以直接进行检验或可能在检验之前需要某种形式的处理。例如，活组织检查样品或手术样品可能在检验之前需要匀浆或它可能需要切片用于原位检验各个基因的定性表达水平。可选地，细胞样品可能在检验之前需要透化。另外，如果生物样品不处于液体形式，(如果要求这类形式用于检验)，可能需要添加试剂，如缓冲液，以便使样品移动。

如果目的DNA区域存在于生物样品中，则可以直接检验生物样品或可以在检验之前分离生物样品中存在的其他全部或一些核酸。在又一个例子中，可以在分析之前部分纯化或否则富集样品。例如，如果生物样品包含非常多样的细胞群体，则可能需要富集特定目的亚群。在检验之前处理靶细胞群体或源自其中的分子(例如，病毒失活)处于本发明的范围内。也应当理解，生物样品可以新鲜收获或它可以在检验之前已经贮存(例如通过冷冻)或否则在检验之前处理(如通过进行培养)。

哪种类型样品最合适根据本文中公开的方法检验的选择将取决于情况的性质。优选地，所述样品是粪便(粪便)样品、灌肠洗液、手术切除物、组织活组织检查样品或血液样品(例如全血、血清或血浆)。

更优选地，所述生物样品是血液样品、活组织检查样品或粪便样品。

如本文中详述，将本发明设计成筛查位于大肠中的肿瘤细胞或细胞群体。因此，对“细胞或细胞群体”的指称应当理解为指称单个细胞或细胞群。所述细胞群可以是弥散细胞群、细胞悬液、包囊化细胞群或采取组织形式的细胞群。

对肿瘤(如腺瘤或腺癌)“初起”的指称应当理解为指称显示异型增生的个体的一个或多个细胞。在这方面，腺瘤或腺癌可以充分形成，以至一团不良细胞已经形成。可选地，腺瘤或腺癌可以处在极早阶段，在于仅相对少的异常细胞分裂已经在诊断时出现。本发明也扩展至评估个体形成肿瘤(如腺瘤或腺癌)的倾向性。不以任何方式限制本发明，改变的甲基化水平可以表示该个体出现瘤形成(如未来形成一种腺瘤或腺癌或另一种腺瘤或腺癌)的倾向性。

虽然优选的方法是出于诊断瘤形成发展或其倾向性的目的评估甲基化水平，但是可以在某些情况下需要检测所述甲基化水平的相反变化，例如，以监测涉及调节瘤形成状况(如腺瘤或腺癌发展)的治疗性或预防性疗法的有效性。例如，其中升高的甲基化水平表示个体已经形成以腺瘤或腺癌发展为特征的病状，而筛查到开始一种治疗性治疗方案后甲基化水平下降可以用来表示成功清除肿瘤细胞。在另一个例子中，可以使用这种方法以检验肿瘤切除边缘处的组织，以便确定测定是否已经移除肿瘤的全部边缘。

本发明方法因此可以用于疾病风险的诊断、预后、分类、预测、检测疾病复发、选择许多类型瘤形成的疗法和监测瘤形成。可以检测处于任何进展阶段的癌，如原发性癌、转移性癌和复发性癌。

本发明提供下述方法，所述方法用于确定哺乳动物(例如，人)是否具有大肠瘤形成、取自哺乳动物的生物样品是否含有肿瘤细胞或源自肿瘤细胞的DNA、评估哺乳动物形成肿瘤的风险或可能性、监测抗癌疗法的功效或在患有癌症的哺乳动物中选择适宜的抗癌治疗。这类方法基于确定肿瘤细胞在本文所述的DNA区域具有与正常细胞不同的甲基化状态。因此，通过确定细胞在如本文所述的DNA区域中是否含有差异性甲基化的序列，可以测定细胞是肿瘤性的。

本发明的方法可以用来评价已知或疑似具有瘤形成的个体或作为常规临床试验，即，在并不必然疑似具有瘤形成的个体中进行评价。可以进行其他诊断测定法以证实个体中瘤形成的状态。

另外，本发明的方法可以用来评估治疗过程的功效。例如，可以在患有癌症的哺乳动物中随时间推移通过监测本文所述的序列的DNA甲基化，评估抗癌疗法的功效。例如，与从治疗之前或治疗早期的哺乳动物取得的样品中的水平相比，从治疗后的哺乳动物取得的生物样品中本发明的任何诊断性序列的甲基化减少或不存在表示有效治疗。

本发明方法因此用作一次性试验或用作据认为存在瘤形成发展风险的那些个体的持续监测或用作涉及抑制或减慢瘤形成发展的治疗性或预防性治疗方案的有效性的监测。在这些情况下，确定任何一种或多种类型的生物样品中甲基化水平的调节是个体状态或当前使用的治疗性或预防性方案的有效性的有价值指示物。因而，本发明的方法应当理解为扩展至监测个体中甲基化水平相对于其正常水平(如本文中限定)或相对于从所述个体的生物样品所确定的一个或多个早期甲基化水平的增加或下降。

用于检测瘤形成的方法可以包含检测癌相关的一个或多个其他多核苷酸或多肽序列。因此，通过本发明方法检测甲基化可以单独或与用于诊断或预测瘤形成的其他筛查方法组合使用。

可以在本发明方法中使用用于检测DNA甲基化的任何方法。许多方法可用于原代组织样品中或患者样品如血液、尿粪便或唾液中检测在特定基因座处差异性甲基化的DNA(综述见Kristensen和Hansen Clin Chem.55:1471-83,2009；Ammerpohl等人,BiochimBiophys Acta.1790:847-62,2009；Shames等人,Cancer Lett.251:187-98,2007；Clark等人,Nat Protoc.1:2353-64,2006)。为了分析靶基因中DNA甲基化的比例或程度，DNA正常情况下用亚硫酸氢钠处理，并且使用将与甲基化状态无关地扩增DNA的引物和PCR条件扩增目的区域。随后可以通过测序(包括焦磷酸测序法)、限制性酶消化(COBRA)或通过解链曲线分析法评估整体扩增子或各个CpG位点的甲基化。可选地，可以使用基于连接的用于分析特定CpG位点处甲基化的方法。正在开发异常甲基化DNA的检测作为癌症诊断的手段，其中所述异常甲基化DNA从肿瘤中释放并进入体液。这里，在过度甲基化的序列情况下，需要使用允许从未甲基化的正常细胞DNA的背景中选择性扩增甲基化DNA序列的敏感方法。这类方法基于亚硫酸氢盐处理的DNA，例如；包括甲基化选择性PCR(MSP)、重度甲基(Heavymethyl)PCR、HeadloopPCR和辅助物依赖性链反应(Helper-dependent chain reaction)(PCT/AU2008/001475)。

简而言之，在一些实施方案中，用于检测甲基化的方法包括随机剪切或随机片段化基因组DNA、用甲基化依赖或甲基化敏感限制性酶切割DNA并且随后选择性鉴定和/或分析切割或未切割的DNA。选择性鉴定例如可以包括分离切割或未切割的DNA(例如，按大小)并且定量经切割或可选地未经切割目的序列。见，例如，美国专利号7,186,512。可选地，该方法可以包括在限制性酶消化后扩增完整DNA，从而仅扩增在所扩增的区域内未遭限制性酶切割的DNA。见，例如，美国专利申请系列号10/971,986；11/071,013；和10/971,339。在一些实施方案中，可以使用具有基因特异性的引物进行扩增。可选地，可以将衔接子添加至随机片段化的DNA的末端，所述DNA可以用甲基化依赖或甲基化敏感限制性酶消化，可以使用与衔接子序列杂交的引物扩增完整的DNA。在这种情况下，可以进行第二步骤以确定特定基因在扩增的DNA汇集物中的存在、不存在或其量。在一些实施方案中，使用实时定量PCR扩增DNA。

在一些实施方案中，这些方法包括对基因组DNA群体内部的靶序列中的平均甲基化密度定量。在一些实施方式中，所述方法包括：使基因组DNA与甲基化依赖限制酶或甲基化敏感限制性酶在允许基因座中潜在限制性酶切割位点的至少一些拷贝保持未切割的条件下接触；对基因座的完整拷贝定量；并且将扩增产物的量与代表对照DNA的甲基化的量的对照值比较，从而与对照DNA的甲基化密度相比，对基因座中的平均甲基化密度定量。

可以通过以下方式确定DNA的基因座的甲基化的量：提供包含这个基因座的基因组DNA的样品，用甲基化敏感或甲基化依赖的限制性酶切割DNA，并且随后对完整DNA的量定量或对目的DNA基因座处切割的DNA的量定量。完整或切割的DNA的量将取决于含有这个基因座的基因组DNA的初始量、该基因座中甲基化的量和该基因座中在基因组DNA中甲基化的核苷酸的数目(即，份数)。可以通过将完整DNA或切割的DNA的量与对照值比较，确定DNA基因座中甲基化的量，其中所述对照值代表完整DNA或切割的DNA在类似处理的DNA样品中的量。对照值可以代表已知或预测的甲基化核苷酸数目。可选地，对照值可以代表来自另一个(例如，正常、不患病的)细胞中的相同基因座或第二基因座的完整或切割的DNA的量。

通过使用在允许基因座中潜在限制性酶切割位点的至少一些拷贝保持未切割的条件下至少一种甲基化灵敏度或甲基化限制性酶并且随后对剩余完整拷贝定量并且将这个量与对照比较，可以确定基因座的平均甲基化密度。甲基化敏感酶是如果DNA的识别序列未甲基化则切割这种DNA的一种酶，而如果DNA的识别序列甲基化，则甲基化依赖酶切割这种DNA。如果使甲基化敏感限制性酶与DNA基因座的拷贝在允许基因座中潜在限制性酶切割位点的至少一些拷贝保持未切割的条件下接触，则剩余的完整DNA将完全与甲基化密度成正比，并且因此可以与对照比较以便确定样品中基因座的相对甲基化密度。类似地，如果使甲基化依赖限制性酶与DNA基因座的拷贝在允许基因座中潜在限制性酶切割位点的至少一些拷贝保持未切割的条件下接触，则剩余的完整DNA将与甲基化密度成反比，并且因此可以与对照比较以便确定样品中基因座的相对甲基化密度。这类测定法在例如美国专利申请系列号10/971,986中公开。

用于以上方法的试剂盒可以例如包含甲基化依赖限制性酶、甲基化敏感限制性酶、扩增(例如，PCR)试剂、探针和/或引物中的一种或多种。

定量性扩增方法(例如，定量PCR或定量性线性扩增)可以用来在限制酶切消化后对侧翼分布有扩增引物的基因座内部的完整DNA的量定量。定量性扩增方法在例如美国专利号6,180,349；6,033,854；和5,972,602中以及在例如，Gibson等人,Genome Research 6:995-1001(1996)；DeGraves等人,Biotechniques 34(1):106-10,112-5(2003)；Deiman B等人,Mol.Biotechnol.20(2):163-79(2002)中公开。可以“实时”监测扩增。

用于检测DNA甲基化的额外方法可以涉及对亚硫酸氢盐处理DNA之前和之后的基因组测序。见，例如，Frommer等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1827-1831(1992)。当亚硫酸氢钠与DNA接触时，非甲基化胞嘧啶转化成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受修饰。

在一些实施方案中，从亚硫酸氢盐转化的DNA中扩增的PCR产物的限制性酶消化法用来检测DNA甲基化。见，例如，Sadri和Hornsby,Nucl.Acids Res.24:5058-5059(1996)；Xiong和Laird,Nucleic Acids Res.25:2532-2534(1997)。

在一些实施方案中，将甲基化特异性PCR(“MSP”)反应单独或与检测DNA甲基化的其他方法组合使用。MSP测定法通过亚硫酸氢钠引起DNA的初始修饰，所述亚硫酸氢钠将全部未甲基化胞嘧啶而不将非甲基化胞嘧啶转化成尿嘧啶，并且随后用相对于非甲基化DNA对甲基化DNA特异的引物用扩增。见，Herman等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:9821-9826(1996)；美国专利号5,786,146。

在一些实施方案中，将MethyLight测定法单独或与检测DNA甲基化的其他方法组合使用。(见，Eads等人,Cancer Res.59:2302-2306(1999))。简而言之，在MethyLight方法中，将基因组DNA在亚硫酸氢钠反应中转化(亚硫酸氢盐过程使非甲基化胞嘧啶残基转化成尿嘧啶)。随后使用与CpG二核苷酸杂交的PCR引物进行目的DNA序列的扩增。通过使用仅与因亚硫酸氢盐转化甲基化DNA所产生的序列(或可选地与未甲基化序列)杂交的引物，扩增可以表示与引物杂交的序列的甲基化状态。另外，可以用与序列特异性结合的探针检测扩增产物，所述序列因亚硫酸氢盐处理非甲基化DNA产生。如果需要，引物和探针均可以用来检测甲基化状态。因此，与MethyLight一起使用的试剂盒可以包括亚硫酸氢钠以及区分已经用亚硫酸氢盐处理的甲基化和非甲基化DNA的引物或以可检测方式标记的探针(包括但不限于Taqman或分子信标探针)。其他试剂盒组分例如可以包括扩增DNA所必需的试剂，包括但不限于PCR缓冲液、脱氧核苷酸；和热稳定性聚合酶。

在一些实施方案中，将Ms-SNuPE(甲基化-灵敏型单核苷酸引物延伸)反应单独或与检测DNA甲基化的其他方法组合使用(见，Gonzalgo和Jones,Nucleic Acids Res.25:2529-2531(1997))。Ms-SNuPE技术是一种基于亚硫酸氢盐处理DNA、随后单核苷酸引物延伸而评估特定CpG位点处甲基化差异的定量方法(Gonzalgo和Jones，上文)。简而言之，基因组DNA与亚硫酸氢钠反应以使未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶而留下5-甲基胞嘧啶不变。随后使用对亚硫酸氢盐转化的DNA特异的PCR引物进行所需靶序列的扩增，分离所得到的产物并且用作目的CpG位点处分析甲基化的模板。

用于Ms-SNuPE分析的常见试剂(例如，如可能在基于Ms-SNuPE的常见试剂盒中找到)可以包括但不限于：特定基因(或甲基化DNA序列或CpG岛)的PCR引物；优化的PCR缓冲液和脱氧核苷酸；凝胶提取试剂盒；阳性对照引物；用于特定基因的Ms-SNuPE引物；反应缓冲液(用于Ms-SNuPE反应)；和以可检测方式标记的核苷酸。额外地，亚硫酸氢盐转化试剂可以包括：DNA变性缓冲液；磺化缓冲液；DNA回收试剂或试剂盒(例如，沉淀、超滤、亲和柱)；脱磺酸基缓冲液；和DNA回收组分。

额外的甲基化检测方法包括但不限于甲基化CpG岛扩增法(见，Toyota等人,Cancer Res.59:2307-12(1999))和在例如美国专利公开2005/0069879；Rein等人,NucleicAcids Res.26(10):2255-64(1998)；Olek等人,Nat.Genet.17(3):275-6(1997)；和PCT公开号WO 00/70090中描述的那些。

下文提供与一般描述的这些方法中几种方法相关的更详细信息：

(a)探针或引物设计和/或产生

本文所述的用于诊断瘤形成的几种方法使用一种或多种探针和/或引物。用于设计例如在PCR或杂交中使用的探针和/或引物的方法是本领域已知的并且在例如Dieffenbach和Dveksler(编著)(引自：PCR Primer:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratories,NY,1995)中描述。另外，为多种测定法设计最佳探针和/或引物的几种软件包是公众可获得的，例如从美国马萨诸塞州Cambridge的基因组研究中心(Centerfor Genome Research,Cambridge,Mass.,USA)可获得的Primer 3。

显然，应当在其设计期间考虑探针或引物的可能用途。例如，如果产生探针或引物用于甲基化特异性PCR或连接酶链反应(LCR)测定法，则在3'末端的核苷酸(或在LCR情况下5'末端)应当优选地对应于核酸中的甲基化核苷酸。

评估用于检测与瘤形成相关的序列的探针和/或引物，例如，以便确定不形成发夹、不自我引发或不形成引物二聚体(例如不与检测测定法中所用的另一个探针或引物形成引物二聚体)的那些。另外，经常评估探针或引物(或其序列)以确定它从靶核酸变性的温度(即探针或引物的解链温度或Tm)。用于估计Tm的方法是本领域已知的并且例如在SantaLucia，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:1460-1465，1995或Bresslauer等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:3746-3750,1986中描述。

用于产生/合成本发明探针或引物的方法是本领域已知的。例如，寡核苷酸合成在Gait(编著)(引自：Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IRL Press,Oxford,1984)中描述。例如，探针或引物可以通过生物学合成法(例如通过用限制性核酸内切酶消化核酸)或通过化学合成法获得。对于短序列(至多到约100个核苷酸)，化学合成法是优选的。

对于较长序列，分子生物学中使用的标准复制方法是有用的，例如，对于单链DNA，使用M13，如Messing,Methods Enzymol,101,20-78,1983所述。用于寡核苷酸合成的其他方法例如包括磷酸三酯方法和磷酸二酯方法(Narang等人,Meth.Enzymol 68:90,1979)和支持物上合成法(Beaucage等人,Tetrahedron Letters 22:1859-1862,1981)以及磷酰胺酯技术,Caruthers,M.H.等人,Methods in Enzymology,第154卷,第287-314页(1988)和在"Synthesis and Applications of DNA and RNA,"S.A.Narang,编者,Academic Press,NewYork,1987及其中引用的参考文献中描述的其他方法。例如，包含锁核酸(LNA)的探针如Nielsen等人,Chem.Soc.Perkin Trans.,1:3423,1997；Singh和Wengel,J.Chem.Commun.1247,1998中所述那样合成。同时，包含肽-核酸(PNA)的探针如Egholm等人,Am.Chem.Soc.,114:1895,1992；Egholm等人,Nature,365:566,1993；和Orum等人,Nucl.Acids Res.,21:5332,1993中所述那样合成。

(b)DNA的甲基化敏感性核酸内切酶消化

在一个例子中，使用下述方法确定样品中增加的甲基化，所述方法包括用一定量的甲基化敏感性限制性核酸内切酶在足以消化核酸的条件下处理核酸并且随后检测产生的片段。示例性甲基化灵敏度核酸内切酶例如包括HhaI或HpaII。优选地，测定法包括内对照用与所用甲基化敏感酶具有相同特异性的甲基化不灵敏度酶消化。例如，甲基化酶不灵敏度MspI是甲基化敏感酶HpaII的同裂酶。

杂交分析模式

在一个例子中，通过探针或引物与未消化的核酸的选择性杂交检测核酸的消化。可选地，探针选择性地与消化的和未消化的核酸杂交，但是例如通过电泳促进这两种形式之间的区分。实现与杂交探针的选择性杂交的合适检测方法例如包括DNA印迹法或其他核酸杂交法(Kawai等人,Mol.Cell.Biol.14:7421-7427,1994；Gonzalgo等人,CancerRes.57:594-599,1997)。

基于包含探针的核酸双链体的解链温度(Tm)确定合适的杂交条件。技术人员将明白，虽然某些一般性可能适用，但是应当经验地针对每种探针确定最佳杂交反应条件。优选地，使用短寡核苷酸探针的杂交在低至中等严格性进行。在GC丰富的探针或引物或较长探针或引物情况下，优选高严格性杂交和/或洗涤。高严格性在本文中定义为在约0.1x SSC缓冲液和/或约0.1％(w/v)SDS中或更低盐的浓度和/或在至少65℃的温度或等同条件实施的杂交和/或洗涤。本文中对特定严格性水平的指称包括本领域技术人员已知的使用除SSC之外的洗涤/杂交溶液的等同条件。

根据本发明实施例，针对检验样品和阴性对照样品所产生的片段的差异指示受试者具有瘤形成。类似地，在其中对照样品包含来自肿瘤、癌组织或癌细胞或前癌细胞的数据情况下，检验样品和对照样品之间的相似性，尽管不必然地是绝对同一，表示阳性诊断(即癌症)。

扩增分析模式

在可选的例子中，使用一种扩增系统，例如聚合酶链反应(PCR)、滚环扩增(RCA)，逆聚合酶链反应(iPCR)，原位PCR(Singer-Sam等人,Nucl.Acids Res.18:687,1990)、链置换扩增(SDA)或循环探针技术检测由限制性酶产生的片段。

PCR方法是本领域已知并且例如由McPherson等人,PCR:A Practical Approach.(系列丛书(编者)，D.Rickwood和B.D.Hames),IRL Press Limited,Oxford.第1-253页，1991和Dieffenbach(编著)和Dveksler(编著)(引自：PCR Primer:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratories,NY,1995))描述，所述文献各自通过引用的方式完整并入。总体上，对于PCR，包含至少约18个核苷酸长度和更优选地至少20-30个核苷酸长度的两个非互补性核酸引物分子与核酸模板分子的不同链在它们的相应复性位点处杂交，并且酶促地扩增间插于各复性位点之间的模板的特异性核酸分子拷贝。扩增产物可以例如使用电泳和用结合核酸的可检测标记物检测进行检测。可选地，一个或多个寡核苷酸用可检测标记物(例如荧光团)标记并且例如使用lightcycler(Perkin Elmer,Wellesley,Mass.,USA,Roche Applied Science,Indianapolis,IN,USA)检测扩增产物。

链置换扩增(SDA)利用寡核苷酸引物、DNA聚合酶和限制性核酸内切酶来扩增靶序列。寡核苷酸与靶核酸杂交并且聚合酶用来产生间插于引物复性位点之间的区域的拷贝。拷贝的核酸和靶核酸的双链体随后用特异性识别拷贝核酸的始端处序列的核酸内切酶形成切刻。DNA聚合酶识别切刻的DNA并且产生靶区域的另一个拷贝，与此同时置换先前产生的核酸。SDA的优点是它以等温形式发生，从而促进高通量自动化分析。

循环探针技术使用合成的嵌合引物，所述嵌合引物包含能够与靶序列杂交的DNA-RNA-DNA。一旦与靶序列杂，形成的RNA-DNA双链体成为RNA酶H的靶，从而切割引物。随后检测切割的引物，例如，使用质谱法或电泳检测。

对于在甲基化灵敏度核酸内切酶识别位点侧翼分布或与之毗邻的引物，优选仅在瘤形成时过度甲基化的那些位点侧翼分布的这类引物以确保产生诊断性扩增产物。在这方面，扩增产物仅在限制性位点未受切割，即，它发生甲基化时才产生。因此，检测到扩增产物表示目的CpG二核苷酸是甲基化的。

如技术人员将知晓，扩增产物的精确长度将根据引物之间的距离变动。显然，这种形式的分析可以用来确定多个CpG二核苷酸的甲基化状态，前提是每种二核苷酸处于甲基化灵敏度限制性核酸内切酶位点范围内。在这些方法中，一条或多条引物可以用促进快速检测扩增的核酸的可检测标记物标记，例如，荧光标记物(例如Cy5或Cy3)或放射性同位素(例如³²P)。

通常使用例如，非变性琼脂糖凝胶电泳，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、质谱法、液相色谱(例如HPLC或dHPLC)或毛细管电泳法(例如MALDI-TOF)分析扩增的核酸。高通量检测方法，如，例如基质辅助激光解吸附/电离飞行时间法(MALDI-TOF)、电喷雾电离(ESI)、质谱法(包括串联质谱法，例如LC MS/MS)、生物传感器技术、倏逝光纤技术或DNA芯片技术(例如，WO98/49557；WO 96/17958；Fodor等人,Science767-773,1991；美国专利号5,143,854；和美国专利号5,837,832，所述文献的内容均全部通过引用方式并入本文)特别优选用于本文所述的全部分析模式。可选地，可以使用如本文中和/或例如美国专利号6,174,670中所述的解链曲线分析方法连续监测核酸的扩增，其中所述文献通过引用方式并入本文。

(c)其他分析模式

在一个替代性例子中，通过实施下述方法确定样品中增加的甲基化，所述方法包括用一定量的DNA酶I在足以消化核酸的条件下处理含有核酸的染色质并且随后检测产生的片段。这种分析模式基于以下理解，含有甲基化DNA(例如，过度甲基化的DNA)的染色质比非过度甲基化的DNA具有更紧密的构象，并且因此更不易感于借助DNA酶I的核酸内切酶消化。

根据这种方法，与非甲基化DNA相比，通过DNA酶I消化甲基化DNA产生了不同长度的DNA片段。检测这类不同的DNA片段，例如，使用较早描述的测定法。可选地，基本上如Gregory和Feil,Nucleic Acids Res.,27,e32i-e32iv,1999中描述那样使用PCR-SSCP检测这些DNA片段。在使得PCR-SSCP适应于本发明时，使用在核酸中旁侧分布于或包含一个或多个CpG二核苷酸的扩增引物来扩增DNA酶I产生的片段，其中所述在瘤形成样品抵抗DNA酶I消化但在健康/正常对照或健康/正常检验样品中不抵抗DNA酶I消化。在这种情况下，使用DNA酶I时特定核酸片段的产生诊断出瘤形成，因为这种DNA未高效地降解。相反，来自健康/正常受试者样品的模板DNA被DNA酶I的作用降解，和因此，扩增没有产生独立的扩增产物。PCR-SSCP的替代性方法例如PCR-dHPLC也是本领域已知并且由本发明构思。

(d)非甲基化DNA的选择性诱变

在一个替代性方法中，使用下述方法确定样品中增加的甲基化，所述方法包括用一定量的选择性突变CpG二核苷酸内部非甲基化胞嘧啶残基的化合物在足以诱导诱变的条件下处理核酸。

优选的化合物使胞嘧啶突变成尿嘧啶或胸苷，例如，亚硫酸氢盐，例如，亚硫酸氢钠或亚硫酸氢钾(Frommer等人,1992,上文)。已知通过突变不受甲基化保护的胞嘧啶残基，DNA的亚硫酸氢盐处理区分甲基化胞嘧啶残基与非甲基化胞嘧啶残基，包括不处于CpG二核苷酸内部或位于不经历甲基化的CpG二核苷酸内部的胞嘧啶残基。

基于序列的检测

在一个例子中，通过对突变的DNA测序确定存在一个或多个突变的核苷酸或突变序列的数目。一种形式的分析包括使用本文所述的扩增反应(例如，PCR)扩增突变的核酸。随后将扩增产物直接测序或克隆并且将克隆的产物测序。用于DNA测序的方法是本领域已知并且例如包括双脱氧链终止法或Maxam-Gilbert法(见Sambrook等人,MolecularCloning,A Laboratory Manual(第2版),CSHP,New York 1989)或Zyskind等人,Recombinant DNA Laboratory Manual(Acad.Press,1988))。

由于用化合物(例如，亚硫酸氢盐)处理核酸导致非甲基化胞嘧啶突变成尿嘧啶(并且因此在扩增过程后突变成胸苷)，所以序列的分析确定甲基化核苷酸的存在或不存在。例如，通过将使用对照样品或未用亚硫酸氢盐处理过的样品所获得的序列或目的区域的已知核苷酸序列与处理的样品比较，促进检测核苷酸序列中的差异。与对照或未处理的样品相比，在处理的样品中的胞嘧啶位点处检测到的任何胸腺嘧啶残基可以视为由作为亚硫酸氢盐处理的结果的突变引起。利用对亚硫酸氢盐处理的核酸的测序检测甲基化的合适方法例如在Frommer等人,1992，上文或Clark等人,Nucl.Acids Res.22:2990-2997,1994中描述。

在另一种方法中，使用焦磷酸测序法，例如，如Uhlmann等人,Electrophoresis,23:4072-4079,2002中所述那样检测突变或非突变的核苷酸在亚硫酸氢盐处理的样品中的存在。实质上，这种方法一种形式的使用以下引物的实时测序，其中所述引物杂交与甲基化的胞嘧啶位点相邻或接近的位点。在引物和模板在DNA聚合酶存在的情况下杂交后，根据预定的分配次序独立地添加4种修饰的脱氧核苷酸三磷酸的每一个。仅掺入所添加的与亚硫酸氢盐处理的样品互补的核苷酸并且释放无机焦磷酸盐(PPi)。PPi随后驱动导致可检测水平的光产生的反应。这种方法允许确定与引物的杂交位点毗邻的特定核苷酸的身份。

固相焦磷酸测序方法是本领域已知并且例如在Landegren等人,Genome Res.,8(8):769-776,1998中综述。这类方法使得高通量检测众多CpG二核苷酸的甲基化成为可能。

一种用于测定亚硫酸氢盐处理的核苷酸的序列的相关方法是甲基化灵敏度单核苷酸引物延伸法(Me-SnuPE)或SNaPmeth。合适的方法例如在Gonzalgo和Jones,1997,上文或Uhlmann等人,Electrophoresis,23:4072-4079,2002中描述。使用一种寡核苷酸，其杂交至与甲基化的胞嘧啶的位点毗邻的核酸区域。这种寡核苷酸随后用于采用聚合酶和游离核苷酸二磷酸或双脱氧核苷酸三磷酸的引物延伸操作方案中，其中所述的游离核苷酸二磷酸或双脱氧核苷酸三磷酸对应于亚硫酸氢盐处理后在这个位点处出现的可能碱基二者之一或任一种(即，胸腺嘧啶或胞嘧啶)。优选地，核苷酸用可检测标记物(例如荧光团)标记。在引物延伸后，将未结合的标记的核苷酸二磷酸除去(例如使用大小排阻层析或电泳)或水解(例如使用碱性磷酸酶)，并且检测到标记的核苷酸掺入至这种寡核苷酸，从而显示在该位点存在的碱基。

显然，其他高通量测序方法由本发明所涵盖。这类方法例如包括固相微量测序法(例如，如Southern等人,Genomics,13:1008-1017,1992中描述)或采用FRET的微量测序法(例如，如Chen和Kwok,NucleicAcids Res.25:347-353,1997中描述)。

基于限制性核酸内切酶的分析模式

在一种方法中，基本上如Xiong和Laird，2001，上文中所述，使用联合亚硫酸氢盐限制性分析(COBRA)，检测非突变序列的存在。这种方法利用化合物(例如，亚硫酸氢盐)处理后甲基化核酸和未甲基化核酸之间限制性酶识别位点的差异，所述化合物选择性突变非甲基化胞嘧啶残基。

在亚硫酸氢盐处理后，使用本文所述的扩增反应(例如，PCR)扩增目的区域，所述目的区域包含经甲基化并包含于限制性核酸内切酶识别序列内的一个或多个CpG二核苷酸。扩增产物随后与限制性酶接触，所述限制性酶按足以使切割发生的时间并在这样的条件下在CpG二核苷酸的位点处切割。可以选择限制性位点以指示甲基化的存在或不存在。例如，限制性核酸内切酶TaqI切割序列TCGA，在亚硫酸氢盐处理非甲基化核酸后，序列将是TTGA，并且作为结果，将不受切割。随后使用本领域已知的检测手段(例如，电泳和/或质谱法)检测消化和/或未消化的核酸。核酸的切割或未切割显示受试者中的癌症。显然，这种方法可以用于诊断癌症的阳性读出或阴性读出系统中。

阳性读出分析模式

在一个实施方案中，本发明的分析模式包括阳性读出系统，其中将源自已经例如用亚硫酸氢盐处理的样品的DNA检测为阳性信号。优选地，未检测到或仅微弱检测到来自健康或正常对照受试者的未过度甲基化的DNA。

在一个优选实施方案中，使用以下方法确定受试者样品中增加的甲基化，所述方法包括：

(i)用某个量的选择性突变非甲基化胞嘧啶残基的化合物在足以诱导诱变的条件下处理核酸，从而产生突变的核酸；

(ii)使核酸与包含核苷酸序列的探针或引物在如此条件下杂交，从而出现与非突变核酸的选择性杂交，其中所述核苷酸序列与包含甲基化胞嘧啶残基的序列互补；和

(iii)检测选择性杂交。

在这种情境下，术语“选择性杂交”意指探针或引物与非突变核酸的杂交以较高的频率或速率发生或具有比相同探针或引物与相应的突变序列的杂交更高的最大反应速度。优选地，探针或引物在所用的反应条件下不与携带突变的非甲基化序列杂交。

基于杂交的分析模式

在一个实施方案中，使用DNA印迹、点印迹、狭缝印迹或其他核酸杂交手段检测杂交(Kawai等人,1994,上文；Gonzalgo等人,1997,上文)。在选择适宜探针的条件下，此类分析模式总体上在本文中如上描述并且已作必要的修正情况下适用于目前描述的选择性诱变方案。

优选地，使用连接酶链反应模式来区分突变的和非突变的核酸。连接酶链反应(在EP 320,308和美国专利号4,883,750中描述)使用至少两种寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针以如此方式与靶核酸复性从而它们在靶核酸上靠近。在连接酶链反应测定法中，靶核酸与互补于靶序列的诊断部分(例如，包含一个或多个甲基化CpG二核苷酸的核酸)的第一探针(诊断探针)并且与互补于与诊断部分毗连的核苷酸序列的第二探针(毗连探针)在其中诊断探针保持基本上仅与靶核酸结合的条件下杂交。诊断探针和毗连探针可以具有不同的长度和/或具有不同的解链温度，从而可以调节杂交的严格性以允许它们与靶选择性杂交，其中具有较高解链温度的探针以较高的严格性杂交，并且在洗涤以除去未结合和/或未选择性结合的探针后，具有较低解链温度的其他探针以较低的严格性杂交。随后使诊断探针和毗连探针共价地连接，例如，使用T4DNA连接酶，从而以产生与靶序列互补的较大靶探针，并且通过调整杂交严格性，移除未连接的探针。在这个方面，未曾连接的探针将在比已经连接的探针更低的严格性杂交条件下选择性地杂交。因而，可以增加杂交严格性至这样的严格性，它至少与用来杂交并且优选地以更高的严格性杂交较长探针的严格性同样高，这归因于连接后由较短探针贡献的长度增加。

在另一个例子中，将探针之一或二者均标记，从而可以通过使靶-探针双链体解链、洗脱解离的探针和检验标记物检验靶序列的存在或不存在。在两种探针均标记的情况下，使用不同的配体以允许区分连接和未连接的探针，在这种情况下，相同洗脱物级分中存在两种标记物证实了连接事件。如果靶核酸与固体基质结合例如，在DNA印迹杂交、狭缝印迹、点印迹或微芯片分析模式中，则可以直接确定诊断探针和毗连探针二者的存在。

甲基化特异性微阵列(MSO)也用于区分突变和非突变的序列。合适的方法例如在Adorjan等人,Nucl.Acids Res.,30:e21,2002中描述。MSO使用已经用选择性突变非甲基化胞嘧啶残基的化合物(例如，亚硫酸氢盐)处理的核酸作为扩增突变核酸和非突变核酸的扩增反应的模板。这种扩增用包含可检测标记物(例如，荧光团(例如，Cy3或Cy5))的至少一种引物进行。

为了产生用于检测突变核酸的微阵列，将寡核苷酸点到例如，玻璃载片上，优选地以一定冗余度进行(例如，如Golub等人,Science,286:531-537,1999中所述)。优选地，对于分析的每个CpG二核苷酸，使用两种不同的寡核苷酸。每种寡核苷酸包含了反映CpG二核苷酸的甲基化或非甲基化状态的序列N₂-16CGN₂-16或N₂-16TGN₂-16(其中N是与目的CpG二核苷酸相邻或靠近的核苷酸的数目)。

标记的扩增产物随后与微阵列上的寡核苷酸在能够检测单核苷酸差异的条件下杂交。在洗涤以除去未结合的扩增产物后，使用例如微阵列扫描仪检测杂交。这种方法不仅允许确定大量CpG二核苷酸的甲基化状态，它也是半定量的，从而使得确定所分析的每个CpG二核苷酸处的甲基化程度成为可能。由于在单一样品中可能存在某种程度的甲基化异质性，这种定量可以辅助诊断癌症。

基于扩增的分析模式

在替代性例子中，使用扩增系统检测杂交。在甲基化特异性PCR模式中(MSP；Herman等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:9821-9826,1992)，使用包括扩增亚硫酸氢盐处理的DNA的方法检测杂交。因此，通过使用在中等和/或高严格性条件下与未突变的序列特异性复性的一个或多个探针或引物，使用包含甲基化核苷酸的样品，仅产生扩增产物。提供从亚硫酸氢盐处理的DNA的混合物中选择性扩增甲基化或非甲基化组分的另一种测定法由Cottrell等人,Nucl.Acids Res.32:e10,2003(HeavyMethyl PCR)、Rand等人,Nucl.AcidsRes.33:e127,2005(Headloop PCR)、Rand等人,Epigenetics 1:94-100,2006(亚硫酸氢盐差异性变性PCR)和PCT/AU07/000389(末端特异性PCR)提供。

可以使用本文所述的任何扩增分析模式，例如聚合酶链反应(PCR)、滚环扩增(RCA)、逆聚合酶链反应(iPCR)，原位PCR(Singer-Sam等人,1990,上文)、链置换扩增或循环探针技术。已经开发了用于检测基因突变(Kuppuswamy等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:1143-1147,1991)和定量等位特异性表达的PCR技术(Szabo和Mann,Genes Dev.9:3097-3108,1995；和Singer-Sam等人,PCR Methods Appl.1:160-163,1992)。这类技术使用与PCR产生的模板复性并且正好止于待测定的单核苷酸的5'的内引物。此类模式容易地与如本文以上所述的连接酶链反应组合。实时定量性分析模式的应用也是有用的。在选择适宜引物的条件下，此类分析模式总体上在本文中如上描述并且已作必要的修正情况下适用于目前描述的选择性诱变方案。

甲基化特异性解链曲线分析(基本上如Worm等人,Clin.Chem.,47:1183-1189,2001中所述)也由本发明构思。这种方法利用扩增产物中解链温度的差异，其中使用亚硫酸氢盐处理的甲基化或非甲基化核酸产生所述扩增产物。实质上，在与双链DNA特异性结合的荧光染料(例如，SYBR Green I)存在的情况下进行亚硫酸氢盐处理的样品的非差别性扩增。通过增加扩增产物的温度同时监测荧光，确定解链特性并且因此测定扩增产物的序列。荧光下降反映扩增产物中的至少一个区域解链。荧光下降的温度指示所扩增核酸的核苷酸序列，从而允许在一个或多个CpG二核苷酸的位点处确定核苷酸。作为使用本发明所扩增的核酸的序列

本发明也包括使用实时定量性形式的PCR，例如，TaqMan(Holland等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:7276-7280,1991；Lee等人,Nucleic Acid Res.21:3761-3766,1993)来执行这个实施方案。例如，Eads等人,Nucl.Acids Res.28:E32,2000的MethylLight方法使用改良Taqman测定法以检测CpG二核苷酸的甲基化。基本上，这种方法包括用亚硫酸氢盐处理核酸样品并且使用扩增反应(例如，PCR)扩增包含在肿瘤细胞中甲基化并且在对照样品中不甲基化的一个或多个CpG二核苷酸的核酸。扩增反应在3种寡核苷酸、在目的区域旁侧分布的正向引物和反向引物和在这两个引物之间与一个或多个甲基化CpG二核苷酸的位点杂交的探针存在的情况下进行。探针用5'荧光报道分子和3'猝灭剂双重标记(或反之亦然)。当探针是完整时，猝灭剂染料吸收报道分子的荧光，原因在于它们彼此靠近。与PCR产物复性后，探针由例如Taq DNA聚合酶的5'至3'核酸外切酶活性切割。这种切割从猝灭剂中释放报道分子，从而导致可以用来估计初始模板甲基化水平的增加的荧光信号。通过使用与未突变的核酸(即甲基化核酸)选择性杂交的探针或引物，例如，使用标准曲线，确定甲基化水平。

可选地，不使用需要切割的标记探针，使用例如分子信标探针(见例如，Mhlanga和Malmberg,Methods 25:463-471,2001)。分子信标是具有茎-环结构的单链核酸分子。这种环结构与包围一个或多个CpG二核苷酸的区域互补，其中所述CpG二核苷酸在肿瘤中甲基化并且在对照样品中不甲基化。茎结构通过使彼此互补的位于探针任一侧(环)的两条“臂”复性而形成。荧光部分与一条臂结合，并且当分子信标不与靶序列结合时，抑制任何可检测荧光的猝灭部分与另一条臂结合。一旦环区域与其靶核酸结合，则这些臂分开并且荧光是可检测的。然而，即便一个单碱基错配也显著改变样品中检测到的荧光水平。因而，通过检测到的荧光水平确定特定碱基的存在或不存在。这种测定法促进检测核酸中一个或多个未突变的位点(即甲基化核苷酸)。

将荧光标记的锁核酸(LNA)分子或荧光标记的蛋白质-核酸(PNA)分子用于核苷酸差异的检测(例如，如Simeonov和Nikiforov,Nucleic Acids Research,30(17):1-5,2002中所述)。LNA和PNA分子以高亲和力结合于核酸，特别是DNA。与LNA或PNA探针缀合的荧光团(特别地，罗丹明或六氯荧光素)在探针与靶核酸杂交时以明显更高的水平发荧光。然而，荧光增加的水平不增强至即便单核苷酸错配出现时的相同水平。因而，样品中检测到的荧光度表示在LNA或PNA探针和靶核酸之间存在错配，如在甲基化的CpG二核苷酸中的存在突变胞嘧啶的情况下。优选地，将荧光标记的LNA或PNA技术用来检测在已经例如使用本领域已知和/或本文所述的扩增方法事先扩增的核酸中的至少单碱基变化。

如技术人员将明了，LNA或PNA检测技术使得通过固定LNA或PNA探针至固相支持物而高通量检测一种或多种标记可行，如Orum等人,Clin.Chem.45:1898-1905,1999中所述。

可选地，将实时测定法(例如，所谓HeavyMethyl测定法)(Cottrell等人,2003,上文)用来确定测试样品中核酸的存在或甲基化水平。基本上，这种方法使用以甲基化特异性方式与亚硫酸氢盐处理的核酸结合(即，封闭物在中等至高严格性条件下与未突变的DNA特异性结合)的一个或多个不可延伸性核酸(例如，寡核苷酸)封闭物。使用可以任选地具有甲基化特异性但是在一个或多个封闭物旁侧分布的一条或多条引物，进行扩增反应。在非甲基化核酸(即，非突变的DNA)存在的情况下，封闭物结合并且无PCR产物产生。使用基本上如上文描述的Taqman测定法，确定样品中核酸的甲基化水平。

用选择性突变非甲基化胞嘧啶残基的化合物处理后检测甲基化核酸的其他基于扩增的方法例如包括甲基化单链构象分析法(MS-SSCA)(Bianco等人,Hum.Mutat.,14:289-293,1999)、甲基化特异性变性梯度凝胶电泳(MS-DGGE)(Abrams和Stanton,MethodsEnzymol.,212:71-74,1992)和甲基化特异性变性高效液相色谱(MS-DHPLC)(Deng等人,Chin.J.Cancer Res.,12:171-191,2000)。这些方法的每一种使用不同技术以便基于核苷酸序列和/或二级结构的差异检测扩增产物中的核酸差异。这类方法显然由本发明构思。

与其他扩增分析模式一样，使用一系列方法(包括凝胶电泳、凝胶过滤、质谱法)和在标记引物的情况下通过鉴定扩增产物中的标记物分析扩增产物。在一个备选实施方案中，基本上如Sadri和Hornsby,Nucl.Acids Res.24:5058-5059,1996；以及Xiong和Laird,Nucl.Acids Res.25:2532-2534,1997)所述那样，进行从亚硫酸氢盐转化的DNA中扩增的PCR产物的限制性酶消化以分析形成的产物。

也可以使用高通量检测方法，如，例如基质辅助激光解吸附/电离飞行时间法(MALDI-TOF)、电喷雾电离(ESI)、质谱法(包括串联质谱法，例如LC MS/MS)、生物传感器技术、倏逝光纤技术或DNA芯片技术。

与本文所述的利用杂交和/或扩增检测系统的其他分析模式一样，如本文以上所述的这类方法的组合特别由本发明的基于选择性诱变的分析模式构思。在一个例子中，通过实施以下方法检测增加的甲基化，所述方法包括：

(i)用某个量的选择性突变CpG二核苷酸内部非甲基化胞嘧啶残基的化合物在足以诱导诱变的条件下处理核酸，从而产生突变的核酸；

(ii)使核酸与两个非重叠和非互补引物在如此条件下杂交，从而出现与非突变核酸的杂交，其中所述引物的每一个包含与DNA中包含甲基化胞嘧啶残基的序列互补的核苷酸序列；

(iii)扩增间插于杂交的引物之间的核酸，从而产生由包含引物序列的序列组成的DNA片段。

(iv)使扩增的DNA片段与包含核苷酸序列的探针在如此条件下杂交，从而出现与非突变核酸的杂交，其中所述核苷酸序列与包含甲基化胞嘧啶残基的序列对应或互补；并且检测这种杂交。

阴性读出测定法

在另一个实例中，分析模式包括一种阴性读出系统，其中将源自健康/正常对照样品的减少的DNA甲基化检测为阳性信号，并且优选地未检测到或仅微弱检测到来自肿瘤样品的甲基化DNA。

在一个优选实施方案中，使用以下方法确定减少的甲基化，所述方法包括：

(i)用某个量的选择性突变CpG岛内部非甲基化胞嘧啶残基的化合物在足以诱导诱变的条件下处理核酸，从而产生突变的核酸；

(ii)使核酸与包含核苷酸序列的探针或引物在如此条件下杂交，从而出现与突变核酸的选择性杂交，其中所述核苷酸序列与包含突变的胞嘧啶残基的序列互补；和

(iii)检测选择性杂交。

在这种情境下，术语“选择性杂交”意指探针或引物与突变核酸的杂交以较高的频率或速率发生或具有比相同探针或引物与相应的非突变序列的杂交更高的最大反应速度。优选地，探针或引物在所用的反应条件下不与甲基化序列(或非突变的序列)杂交。

基于杂交的分析模式

在一个实施方案中，使用DNA印迹、点印迹、狭缝印迹或其他核酸杂交手段检测杂交(Kawai等人,1994,上文；Gonzalgo等人,1997,上文)。在选择适宜探针的条件下，此类分析模式总体上在本文中如上描述并且已作必要的修正情况下适用于目前描述的选择性诱变方案。优选地，使用连接酶链反应模式来区分非突变的和突变的核酸。在这个方面，测定法要求和条件是如本文以上对阳性读出测定法所述那样并且已作必要的修正情况下适用于本模式。然而，探针的选择将不同。对于阴性读出测定法，选择与突变序列而不是与非突变序列选择性杂交的一个或多个探针。

优选地，连接酶链反应探针具有包含CpG二核苷酸的3'末端序列和/或5'末端序列，其中所述CpG二核苷酸在健康对照样品中未甲基化，但是在癌症中过度甲基化，从而诊断探针和毗连探针仅在CpG二核苷酸的胞嘧啶突变成胸苷时(例如，在非甲基化胞嘧啶残基的情况下)才能够连接。

如本领域技术人员将明了，上文描述的MSO方法可用于任一种或两种阳性和/或阴性读出测定法。这是因为所描述的测定法检测突变的和非突变的序列，从而促进确定甲基化水平。然而，仅检测甲基化序列或非甲基化序列的测定法由本发明构思。

基于扩增的分析模式

在替代性例子中，使用扩增系统检测杂交，所述扩增系统使用如本文以上对阳性读出测定法所述的任何扩增分析模式，即便使用与突变核酸选择性杂交的引物(和探针，在适用的情况下)。

在使上文描述的HeavyMethyl测定法适应于阴性读出形式时，以甲基化特异性方式与亚硫酸氢盐处理的核酸结合的封闭物在中等至高严格性条件下与突变的DNA特异性结合。使用可以任选地具有甲基化特异性(即仅与突变的核酸结合)但是在一个或多个封闭物旁侧分布的一条或多条引物，进行扩增反应。在甲基化核酸(即，突变的DNA)存在的情况下，封闭物结合并且无PCR产物产生。

在一个例子中，通过实施以下方法检测正常/健康对照受试者中减少的甲基化，所述方法包括：

(i)用一定量的选择性突变非甲基化胞嘧啶残基的化合物在足以引起诱变的条件下处理核酸，从而产生突变的核酸；

(ii)使核酸与两个非重叠和非互补引物在如此条件下杂交，从而出现与突变核酸的杂交，其中所述引物的每一个包含与DNA中包含突变的胞嘧啶残基的序列互补的核苷酸序列；

(iii)扩增间插于杂交的引物之间的核酸，从而产生由包含引物序列的序列组成的DNA片段；

(iv)使扩增的DNA片段与包含核苷酸序列的探针在如此条件下杂交，从而出现与突变核酸的杂交，其中所述核苷酸序列与包含突变的胞嘧啶残基的序列对应或互补；以及

(v)检测这种杂交。

如技术人员将明了，阴性读出测定法优选地包括合适的对照样品以确保阴性结果由甲基化的核酸而不是反应失败引起。

本发明也提供了使用本文所述的方法检测和/或定量本发明诊断性序列或其表达或甲基化的试剂盒。

对于检测甲基化的试剂盒，本发明的试剂盒可以包含与本发明诊断性序列的至少一种杂交的至少一种多核苷酸和用于检测基因甲基化的至少一种试剂。用于检测甲基化的试剂例如包括亚硫酸氢钠、设计成与序列杂交的多核苷酸和/或甲基化敏感或甲基化依赖限制性酶，其中如果本发明的生物标记序列未甲基化，则所述序列是该生物标记序列的产物(例如，含有至少一个C→U转化)。这种试剂盒也可以包含天然或合成性对照DNA序列，其代表序列的甲基化或非甲基化形式。试剂盒可以提供适应于在测定法中使用的分析设备形式的固相支持物。试剂盒还可以在试剂盒中包含可检测标记物，其任选地与多核苷酸(例如，探针)连接。也可以在试剂盒中包括在实施测定法时有用的其他材料，包括试管、移液管等。试剂盒也可以包括这些试剂中一种或多种在本文所述的任何测定法中使用的书面指导。

如本文中详述，过度甲基化与转录性沉默相关。因此，除这些基因增加的甲基化水平提供筛查大肠肿瘤倾向性或大肠肿瘤初起的基础之外，这些基因的表达水平下调也在诊断上有价值。根据本发明的这个方面，对基因“表达产物”或“基因的表达”的指称是对转录产物(如初级RNA或mRNA)或翻译产物如蛋白质的指称。在这方面，可以通过以下方式评估基因表达水平的变化：筛查所产生的表达产物(即RNA或蛋白质)的水平变化、与基因结合的染色质蛋白的变化(例如在氨基酸位置编号9或27处的赖氨酸上甲基化(阻遏性修饰)的组蛋白H3存在)或起到下调表达作用的DNA本身变化(如DNA甲基化的变化)。这些基因和它们的基因表达产物(无论它们是否为RNA转录物)、起下调表达作用的DNA的变化或编码的蛋白质统称为“肿瘤标记”。

因此，本发明的另一个方面涉及一种筛查个体中大肠肿瘤初起或初起倾向性或监测大肠肿瘤的方法，所述方法包括在来自所述个体的生物样品中评估DNA区域的表达水平，所述DNA区域选自：

(1)chr12:24962958..25102393

(2)chr7:50344378...50472798

(3)chr6:391739..411443；或

(4)chr12:52400748..52409671；和

(5)chr6:163834097..163834982；或

(ii)以下任何两个或多个的基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1(2)IKZF1(3)IRF4(4)GRASP和(5)CAHM

本发明的这个方面的方法基于生物样品的肿瘤标记的甲基化水平与这些标记的对照水平比较。“对照水平”可以是“正常水平”，所述正常水平是由无肿瘤性的相应大肠细胞或细胞群体所表达的标记的水平。

如前文中详述，可以使用源自作为检验主体的相同个体的组织确定正常(或“非肿瘤性”)水平。然而，将理解，这可能对于所涉及个体而言相当有侵入性，并且因此可能更便利的是相对于标准结果分析检验结果，其中所述标准结果反映了从所讨论患者之外的个体中获得的单个或综合结果。

更具体地提供一种在个体中筛选大肠肿瘤初起或初起倾向性或监测大肠肿瘤的方法，所述方法包括在来自所述个体的生物样品中评估一种或多种基因或转录物的表达水平，所述基因或转录物选自：

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(1)chr12:24962958..25102393；和

(2)chr7:50344378...50472798；

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1；和

(2)IKZF1；

和任选地(3)IRF4、(4)GRASP和(5)CAHM中的一个或多个，

其中相对于对照水平而言组(i)和/或组(ii)的至少一个DNA区域的较低表达水平指示有瘤形成性大肠肿瘤或瘤形成状态初起倾向性。

优选地，所述对照水平是非肿瘤水平。

在这个方面的一个实施方案中，受筛选的基因标记系是：

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(1)chr12:24962958..25102393

(2)chr7:50344378...50472798；和

(3)chr6:391739..411443；或

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1(2)IKZF1和(3)IRF4。

在这个方面的另一个实施方案中，受筛选的基因标记系是：

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(1)chr12:24962958..25102393

(2)chr7:50344378...50472798；和

(4)chr12:52400748..52409671；或

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1(2)IKZF1和(4)GRASP。

在这个方面的又一个实施方案中，受筛选的基因标记系是：

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(1)chr12:24962958..25102393

(2)chr7:50344378...50472798；和

(5)chr6:163834097..163834982；或

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1(2)IKZF1和(5)CAHM

在这个方面的再一个实施方案中，受筛选的基因标记系是：

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(1)chr12:24962958..25102393

(2)chr7:50344378...50472798

(3)chr6:391739..411443；和

(4)chr12:52400748..52409671；或

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1(2)IKZF1(3)IRF4和(4)GRASP。

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(1)chr12:24962958..25102393

(2)chr7:50344378...50472798

(3)chr6:391739..411443；和

(5)chr6:163834097..163834982；或

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1(2)IKZF1(3)IRF4和(5)CAHM。

在这个方面的又一个实施方案中，受筛选的基因标记系是：

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(1)chr12:24962958..25102393

(2)chr7:50344378...50472798

(4)chr12:52400748..52409671；和

(5)chr6:163834097..163834982；或

(ii)基因区域，包括以下任何一个或多个的上游2kb：

(1)BCAT1(2)IKZF1(4)GRASP和(5)CAHM。

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(1)chr12:24962958..25102393

(2)chr7:50344378...50472798

(3)chr6:391739..411443；或

(4)chr12:52400748..52409671；和

(5)chr6:163834097..163834982；或

(ii)基因区域，包括以下任何一个或多个的上游2kb：

(1)BCAT1(2)IKZF1(3)IRF4(4)GRASP和(5)CAHM。

对“表达”的指称应当理解为指核酸分子的转录和/或翻译。对“RNA”的指称应当理解为包括对任何形式的RNA，如初级RNA或mRNA或不翻译的RNA(例如miRNA等)的指称。不以任何方式限制本发明，导致增加或减少的RNA合成的基因转录调节作用也可以与翻译这些RNA转录物中一些(如mRNA)以产生蛋白质产物相关。因而，本发明也扩展至检测方法学，所述检测方法学涉及筛查肿瘤标记蛋白产物的受调节的水平或模式作为细胞或细胞群体的瘤形成状态的指示物。虽然一种方法将是筛查mRNA转录物和/或相应的蛋白质产物，但是应当理解，本发明在此方面不受限制并且扩展至筛查任何其他形式的肿瘤标记表达产物，例如，初级RNA转录物。

就筛查标记表达的下调而言，本领域技术人员也将熟知，在DNA水平可检测的变化表示基因表达活性的变化并且因此表示表达产物水平的变化。这类变化包括但不限于DNA甲基化的变化。因此，本文中对“筛查表达水平”和比较这些“表达水平”与对照“表达水平”应当理解为指称评估与转录相关的DNA因素，如基因/DNA甲基化样式。这些已经部分地在本文中详述。

本领域技术人员也将已知，染色质结构的变化显示基因表达的变化。基因表达的沉默经常与染色质蛋白的修饰相关，在组蛋白H3的位置9和27的任一个或这两个位置处的赖氨酸甲基化是充分研究的例子，同时活跃染色质以组蛋白H3的赖氨酸9的乙酰化为特征。因此，基因序列与携带阻遏性或活性修饰的染色质的关联可以用来评估基因的表达水平。

对“核酸分子”的指称应当理解为指脱氧核糖核酸分子和核糖核酸分子及其片段。本发明因此扩展至直接筛查生物样品中的mRNA水平或筛查已经从目的mRNA群体逆转录出来的互补性cDNA。设计涉及筛查DNA或RNA的方法学完全在本领域技术人员的能力范围内。如上文详述，本发明的方法也延伸至筛查从主题mRNA或基因组DNA本身翻译的蛋白质产物。

在一个优选的实施方案中，通过参考编码蛋白质产物的基因测量基因表达水平，并且更具体地，在蛋白质水平测量所述表达水平。

在另一个特别优选的实施方案中，通过DNA与携带阻遏性修饰(例如，组蛋白H3的赖氨酸9或27的甲基化)的染色质蛋白的关联评估所述基因表达。

本发明应当理解成包括基于鉴定一种或多种生物样品中蛋白质和/或核酸分子的检测方法。如果一些目的肿瘤标记可以对应于不编码蛋白质产物的基因或基因片段，这可能特别有意义。因此，如果这种情况出现，则将不可能检验蛋白质并且将不得不基于转录表达谱或基因组DNA的改变评估主题标记。

术语“蛋白质”应当理解成包括肽、多肽和蛋白质(包括蛋白质片段)。蛋白质可以是糖基化或非糖基化的，和/或可以含有与该蛋白质融合、连接、结合或要么连接的一系列其他分子，如氨基酸、脂类、糖或其他的肽、多肽或蛋白质。本文中对“蛋白质”的指称包括包含氨基酸序列的蛋白质，以及与其他分子如氨基酸、脂类、糖或其他肽、多肽或蛋白质结合的蛋白质。

由本发明肿瘤标记编码的蛋白质可以处于多聚体形式，这意味两个或更多个分子缔合在一起。在相同的蛋白质分子缔合在一起的情况下，复合物是同型多聚体。同型多聚体的例子是同型二聚体。在至少一种标记蛋白与至少一种非标记蛋白缔合的情况下，则复合物是异多聚体如异二聚体。

对“片段”的指称应当理解为指主题核酸分子或蛋白质的一部分。对于筛查粪便样品中调节的RNA水平而言，这是特别有意义的，因为主题RNA可能已经因肠道环境而降解或片段化。可以因此实际地检测主题RNA分子的片段，其中通过使用适当特异性的探针鉴定所述片段。

虽然优选的方法是出于诊断瘤形成发展或其倾向性目的而检测瘤形成标记的表达产物或DNA变化，但是可以在某些情况下需要检测所述标记水平的相反变化，例如，以监测涉及调节瘤形成状况(如腺瘤或腺癌发展)的治疗性或预防性疗法的有效性。例如，其中减少的主题标记表达表示个体已经形成以腺瘤或腺癌发展为特征的病状，例如，筛查到治疗性治疗方案开始后这些标记的水平增加可以用来表示主题个体病状的逆转或此病状的其他形式的改善。本发明方法因此用作一次性试验(one off test)或用作据认为存在瘤形成发展风险的那些个体的持续监测或用作涉及抑制或减慢瘤形成发展的治疗性或预防性治疗方案的有效性的监测。

可以通过本领域技术人员将熟知的任何适合方法实现评估生物样品中表达的主题肿瘤标记的手段。为此目的，将理解，如果正在检验均一细胞群体(如肿瘤活组织检查样品或已经从不均一起始群体富集的细胞群体)或组织切片，则可以利用广泛类型的技术如原位杂交、借助微阵列评估表达谱、免疫测定法等(下文更详细地描述)来检测一个或多个目的标记的不存在或其表达水平下调。然而，如果正在筛查不均一细胞群体或其中存在不均一细胞群体的体液(如血液样品)，特定标记的不存在或其表达水平减少可能因样品中存在的非肿瘤细胞固有表达标记而不可检测。即，某个亚组细胞的表达水平的减少可能不是可检测的。在这种情况下，检测肿瘤亚群中本发明的一种或多种标记的表达水平减少的更适宜机制是借助间接手段，如检测表观遗传变化。

检测基因表达水平变化的方法(除本文中详述的甲基化分析法之外)，尤其在主题生物样品未遭大量非肿瘤细胞污染的情况下，包括但不限于：

(i)体内检测

可以在施用能够揭示肠组织中改变的标记表达的成像探针或试剂后使用分子成像法。

分子成像法(Moore等人,BBA,1402:239-249,1988；Weissleder等人,NatureMedicine 6:351-355,2000)是分子表达的体内成像，所述分子表达与使用“经典”诊断成像技术如X射线、计算机断层成像(CT)、MRI、正电子发射断层摄影术(PET)或内窥镜目前可视化的宏观特征相关。

(ii)通过荧光原位杂交(FISH)，检测细胞中或通过多项技术如定量性逆转录酶聚合酶链反应(QRTPCR)或竞争性RT-PCR产物的流式细胞术定量，检测来自细胞的提取物中RNA表达的下调(Wedemeyer等人,Clinical Chemistry 48:91398-1405,2002)。

(iii)例如通过阵列技术(Alon等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA:96:6745-6750,1999年6月)评估RNA表达谱。

“微阵列”是一种优选地具有独立区域的线性或多维阵列，每个区域具有在固相支持物表面上形成的限定面积。微阵列上独立区域的密度由单一固相支持物的表面上待检测的靶多核苷酸的总数决定。如本文所用，DNA微阵列是置于芯片或其他表面上的用来扩增或克隆靶多核苷酸的寡核苷酸探针的阵列。由于阵列中每个特定探针组位置是已知，所以靶多核苷酸的身份可以基于它们与微阵列中特定位置结合来确定。

DNA微阵列技术使得对单一固相支持物上的多个靶核酸分的大规模测定成为可能。美国专利号5,837,832(Chee等人)和相关专利申请描述了固定寡核苷酸探针阵列以便杂交并检测样品中的特定核酸序列。从目的组织分离的靶目的多核苷酸与DNA芯片杂交，并且基于靶多核苷酸在独立探针位置处杂交的优选性和程度检测特定序列。阵列的一项重要用途是分析差异性基因表达，其中比较基因在不同细胞或组织(经常是目的组织和对照组织)中的表达谱并且鉴定相应组织之间基因表达的任何差异。这种信息用于鉴定特定组织类型中表达的基因的类型和基于表达谱诊断病症。

(iv)例如通过免疫测定测量细胞提取物中改变的肿瘤标记蛋白水平。

可以通过本领域技术人员熟知的众多合适方法的任一种，检验生物样品中蛋白质性质的肿瘤标记表达产物。合适方法的例子包括但不限于抗体筛查组织切片、活组织检查标本或体液样品。如果使用基于抗体的诊断方法，则可以按许多方式如通过蛋白质印迹、ELISA或流式细胞术确定标记蛋白的存在。当然，这些方法包括非竞争性类型以及在传统竞争性结合分析中的单位点和双位点或“夹心”测定法。这些测定法也包括标记抗体与靶的直接结合。

(v)例如通过免疫组织化学确定细胞表面上蛋白质性质的肿瘤标记的改变表达。

(vi)除上文(iv)和(v)点中详述的那些之外，基于适合的任何功能试验、酶促试验或免疫试验，确定改变的蛋白质表达。

作为常规方法，本领域技术人员可以确定给定方法对特定类型生物样品的适合程度。

本发明的一个相关方面提供一种分子阵列，所述阵列包含多个：

(i)核酸分子或所述核酸分子的功能衍生物、片段、变体或同源物，所述核酸分子包含与下文描述的任何两个或多个肿瘤标记DNA相对应的核苷酸序列或与其显示至少80％同一性的序列；或

(ii)核酸分子或所述核酸分子的功能衍生物、片段、变体或同源物，所述核酸分子包含能够在中等严格性条件下与(i)的任何一个或多个序列杂交的核苷酸序列；或

(iii)核酸探针或寡核苷酸或所述核酸分子的功能衍生物、片段、变体或同源物，所述核酸探针或寡核苷酸包含能够在中等严格性条件下与(i)的任何两个或多个序列杂交的核苷酸序列；或

(iv)能够与(i)的核酸分子编码的任何两种或多种蛋白质结合的探针或其衍生物、片段或同源物，

其中所述(i)-(iii)的标记基因或(iv)的蛋白质的表达水平指示源自大肠的细胞或细胞亚群的瘤形成状态。

优选地，所述同一性百分比是至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

“杂交”指一条核酸链通过碱基配对与互补链结合的过程。杂交反应可能是敏感和有选择性的，从而可以在特定目的序列以低浓度存在的样品中鉴定该序列。严格条件可以由例如预杂交溶液和杂交溶液中盐或甲酰胺的浓度或由杂交温度限定并且是本领域熟知的。例如，可以通过降低盐浓度、增加甲酰胺浓度或升高杂交温度、改变杂交时间增加严格性，如下文详细描述。在替代性方面中，本发明的核酸由它们在多种严格性条件(例如，高、中等和低)下杂交的能力限定，如本文中所述。

本文中对低严格性的指称包括并涵盖至少约0％到至少约15％v/v甲酰胺和至少约1M到至少约2M盐用于杂交条件，和至少约1M到至少约2M盐用于洗涤条件。总体上，低严格性是在约25-30℃至约42℃。可以改变这个温度并且更高的温度用来替代甲酰胺和/或产生替代严格性条件。在需要的情况下，替代严格性条件可以适用于如中等严格性，其包括并涵盖至少约16％v/v到至少约30％v/v甲酰胺和至少约0.5M到至少约0.9M盐用于杂交条件，和至少约0.5M到至少约0.9M盐用于洗涤条件，或高严格性，其包括并涵盖至少约31％v/v到至少约50％v/v甲酰胺和至少约0.01M到至少约0.15M盐用于杂交条件，和至少约0.01M到至少约0.15M盐用于洗涤条件。通常，洗涤在T_m＝69.3+0.41(G+C)％实施(Marmur和Doty,J.Mol.Biol.5:109,1962)。然而，双链体DNA的T_m随错配碱基对数目每增加1％而减少1℃(Bonner和Laskey,Eur.J.Biochem.46:83,1974)。甲酰胺是在这些杂交条件中任选的。因此，特别优选的严格性水平定义如下：低严格性是6x SSC缓冲液，0.1％w/v SDS，在25-42℃；中等严格性是2x SSC缓冲液，0.1％w/v SDS，在范围20℃至65℃的温度；高严格性是0.1x SSC缓冲液，0.1％w/v SDS，在至少65℃温度。

在本发明的核酸由它们在高严格性下杂交的能力限定情况下，这些条件包括约50％甲酰胺，在约37℃至42℃。在一个方面，本发明的核酸由它们在降低的严格性下杂交的能力限定，所述降低的严格性包括在约35％至25％甲酰胺中在约30℃至35℃的条件。可选地，本发明的核酸由它们在高严格性下杂交的能力限定，所述高严格性包括以下条件：在42℃在50％甲酰胺、5X SSPE、0.3％SDS和封闭重复序列的核酸，如cot-1或鲑精DNA(例如，200n/ml剪切和变性的鲑精DNA)中。在一个方面，本发明的核酸由它们在降低的严格性条件下杂交的能力限定，所述降低的严格性条件包括35％甲酰胺在降低的温度35℃。

优选地，将主题探针设计成与这些探针所针对的核酸或蛋白质以使得非特异性反应发生率最小的特异性水平结合。然而，将理解不可能消除全部潜在交叉反应性或非特异性反应性，这是任何基于探针的系统的内在局限性。

就用来检测主题蛋白质的探针而言，它们可以采取任何适合的形式，包括抗体和适配体。

核酸探针或蛋白质探针的文库或阵列提供丰富和高度有价值的信息。另外，这类序列的两种或更多种阵列或概况(使用阵列所获得的信息)是用于比较试验结果集合与参比物(如另一份样品或贮存的校准物)的有用工具。在使用阵列时，各个探针一般地固定在独立的位置处并且允许发生结合反应。与装配的标记集合结合的引物用于制备序列文库或直接检测来自其他生物样品的标记。

基因标记的文库(或当指与文库中至少一些序列相对应的物理分离的核酸时，阵列)显示出高度合乎需要的特性。这些特性与特定病状相关，并且可以表征为调节概况(regulatory profile)。如本文中所称，概况指一组成员(member)，其提供最初衍生所述标记的组织的诊断信息。在许多情况下，概况包含阵列上一系列由沉积的序列制成的点。

总体上通过使用阵列制备特征性患者概况。阵列概况可以与一个或多个其他阵列概况或其他参考概况比较。对比结果可以提供涉及疾病状态、发展状态、疗法接受性的丰富信息和关于患者的其他信息。

本发明的另一个方面提供用于分析生物样品的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包含用于检测一个或多个肿瘤标记的一种或多种剂和用于促进借助所述剂进行检测的试剂。也可以包括其他工具，例如，以便接受生物样品。这种剂可以是任何适合的检测分子。

本发明进一步通过参考以下非限制性实施例来描述。

实施例1

CAHM：过度甲基化的结直肠腺癌

单重性能：

·74正常：0.8pg过度甲基化/mL血浆(95％CI：0.2；1.4)

·73腺瘤：9.1pg过度甲基化/mL血浆(95％CI：-8；27)

·73癌：1788pg过度甲基化/mL血浆(95％CI：231；3344)。

CAHM测定法(阈临界值3pg/mL血浆)对结直肠癌具有55％灵敏度，特异性为93％(图1)。

GRASP：磷脂酰肌醇1相关支架蛋白的通用受体

单重性能：

·34正常：1.3pg过度甲基化/mL血浆(95％CI：0.2；2.5)

·33腺瘤：0.1pg过度甲基化/mL血浆(95％CI：-0.1；0.4)

·33癌：670.8pg过度甲基化/mL血浆(95％CI：-470.7；1812)

使用阈临界值20pg甲基化/mL血浆，GRASP测定法对结直肠癌具有58％灵敏度，特异性为100％(图2)。

IRF4：干扰素调节因子4

单重性能：

·24正常：6pg过度甲基化/mL血浆(95％CI：2.9；9.0)

·23腺瘤：3.7pg过度甲基化/mL血浆(95％CI：-0.4；8.0)

·33癌：5340pg过度甲基化/mL血浆(95％CI：-5369；16049)

使用阈临界值20pg甲基化/mL血浆，IRF4测定法对结直肠癌具有57％灵敏度，特异性为96％(图3)。

BCAT1：胞质支链氨基酸氨基转移酶1

单重性能总结

·14正常：0pg过度甲基化/mL血浆(95％CI：na)

·13腺瘤：0.4pg过度甲基化/mL血浆(95％CI：-0.4；1.3)

·13癌：4088pg过度甲基化/mL血浆(95％CI：-4459；10539)

使用阈临界值3pg甲基化/mL血浆，BCAT1测定法对结直肠癌具有62％灵敏度，特异性为100％(图4)。

IKZF1：IKAROS家族锌指1

单重性能总结

·14正常：0pg过度甲基化/mL血浆(95％CI：na)

·13腺瘤：0pg过度甲基化/mL血浆(95％CI：na)

·13癌：113pg过度甲基化/mL血浆(95％CI：-43；270)

使用阈临界值3pg甲基化/mL血浆，IKZF1测定法对结直肠癌具有54％灵敏度，特异性为100％(图4)。

在相同的14份正常、13份腺瘤和13份癌中测量5个基因的甲基化水平。下表显示当测量其中两个基因的甲基化时临床应用性改善：

合并在这5个基因的任意3个基因中所测量的甲基化水平产生：

CAHM_6pg/mL-GRASP_20pg/mL-IRF4_20pg/mL：77％灵敏度和100％特异性

CAHM_6pg/mL-GRASP_20pg/mL-BCAT_3pg/mL：77％灵敏度和100％特异性

CAHM_6pg/mL-GRASP_20pg/mL-IKZF1_3pg/mL：77％灵敏度和100％特异性

CAHM_6pg/mL-IKZF1_3pg/mL-BCAT_3pg/mL：77％灵敏度和100％特异性

GRASP_20pg/mL-IKZF1_3pg/mL-BCAT_3pg/mL：85％灵敏度和100％特异性

合并来自全部5个基因的甲基化水平产生92％灵敏度和100％特异性：

GRASP、CAHM、IRF4、IKZF1和BCAT1的靶向扩增子序列

CAHM MSP扩增子的野生型DNA序列位于第6号染色体正链上；163,834,393163,834,455(Hg19)

GAAGGAAGCA TTTCGAGCAC GACTGACGCT CCCCTTATTA TTTGCTAAGC CGCTGCGCTC GGG

GRASP MSP扩增子的野生型DNA序列位于第12号染色体正链上；52,400,88652,400,973(Hg19)

cggaagtcgc gcccgccgct ccggtcccga ccccgggacc ccctgccgca gccgccacccctgggccccc agcggacgag ctgtacgc

IKZF1MSP扩增子的野生型DNA序列位于第7号染色体正链上；50,343,86750,343,961(Hg19)

gacgacgcac cctctccgtg tcccgctctg cgcccttctg cgcgccccgc tccctgtaccggagcagcga tccgggaggc ggccgagagg tg

BCAT1MSP扩增子的野生型DNA序列位于第12号染色体负链上；25,101,99225,102,093(Hg19)

gtcttcctgc tgatgcaatc CGctaggtcg cgagtctccg ccgcgagagg gccggtctgcaatccagccc gccacgtgta ctcgccgccg cctcg

IRF4MSP扩增子的野生型DNA序列位于第6号染色体负链上；392,036392,145(Hg19)

tgggtgcctt ggacggcccc gcctcagcca ctcctggggc cccgacagtc cggttagctcatcccgtcca gcttgtggcg accccgtcgc aggagcgcgg agggcaggcg

用来测量血浆标本中整个GRASP、CAHM、IRF4、IKZF1和BCAT1范围内甲基化水平的PCR方案

GRASP、CAHM、IRF4、BCAT1、IKZF1的实时PCR方案

文献目录

Abrams和Stanton,Methods Enzymol.,212:71-74,1992

Adorjan等人,Nucl.Acids Res.,30:e21,2002

Alon等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA:96:6745-6750,June 1999

Ammerpohl等人,Biochim Biophys Acta.1790:847-62,2009

Beaucage等人,Tetrahedron Letters 22:1859-1862,1981

Bianco等人,Hum.Mutat.,14:289-293,1999

Bonner和Laskey,Eur.J.Biochem.46:83,1974

Bresslauer等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:3746-3750,1986

Caruthers,M.H.等人,Methods in Enzymology,Vol.154,第287-314页(1988)

Chen和Kwok,Nucleic Acids Res.25:347-353,1997

Clark等人,Nat Protoc.1:2353-64,2006

Clark等人,Nucl.Acids Res.22:2990-2997,1994

Cottrell等人,Nucl.Acids Res.32:e10,2003

DeGraves等人,Biotechniques 34(1):106-10,112-5(2003)

Deiman B等人,Mol.Biotechnol.20(2):163-79(2002)

Deng等人,Chin.J.Cancer Res.,12:171-191,2000

Dieffenbach(编著)和Dveksler(编著)(引自:PCR Primer:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbour Laboratories,NY,1995

Eads等人,Nucl.Acids Res.28:E32,2000

Egholm等人,Am.Chem.Soc.,114:1895,1992

Egholm等人,Nature,365:566,1993

Fodor等人,Science 767-773,1991

Frommer等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1827-1831(1992)

Gibson等人,Genome Research 6:995-1001(1996)

Golub等人,Science,286:531-537,1999

Gonzalgo&Jones,Nucleic Acids Res.25:2529-2531(1997)

Gonzalgo等人,Cancer Res.57:594-599,1997

Gregory和Feil,Nucleic Acids Res.,27,e32i-e32iv,1999

Havelange等人,Blood 2011,118:2827

Herman等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:9821-9826(1996)

Holland等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:7276-7280,1991

Javierre等人,Mol.Cancer Res.9(8):1139-51,2011

Kawai等人,Mol.Cell.Biol.14:7421-7427,1994

Kibriya等人,BMC 2011,4:50

Kristensen和Hansen Clin Chem.55:1471-83,2009

Kuppuswamy等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:1143-1147,1991

Landegren等人,Genome Res.,8(8):769-776,1998

Lee等人,Nucleic Acid Res.21:3761-3766,1993

Markowitz和Bertagnolli,2009,N.Engl.J.Med.361(25):2449–60

Marmur和Doty,J.Mol.Biol.5:109,1962

Martinez等人,Am.J.Surg Pathol.2012,36:296

McPherson等人,PCR:A Practical Approach.(系列丛书，编者D.Rickwood和B.D.Hames),IRL Press Limited,Oxford.第1-253页,1991

Messing,Methods Enzymol,101,20-78,1983

Mhlanga和Malmberg,Methods 25:463-471,2001

Moore等人,BBA,1402:239-249,1988

Narang等人,Meth.Enzymol 68:90,1979

Nevrivy等人,JBC 2000,275(22):16827-36

Nielsen等人,J.Chem.Soc.Perkin Trans.,1:3423,1997

Olek等人,Nat.Genet.17(3):275-6(1997)

Orum等人,Clin.Chem.45:1898-1905,1999

Orum等人,Nucl.Acids Res.,21:5332,1993

Oster等人,Int.J.Cancer 2011,129:2855

Pathak等人,PLoS One 2011,6:e22628

Rand等人,Epigenetics 1:94-100,2006

Rand等人,Nucl.Acids Res.33:e127,2005

Rein等人,Nucleic Acids Res.26(10):2255-64(1998)

Sadri和Hornsby,Nucl.Acids Res.24:5058-5059(1996)

Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(2nd Ed.,CSHP,NewYork 1989)

Santa Lucia,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:1460-1465,1995

Shames等人,Cancer Lett.251:187-98,2007

Simeonov和Nikiforov,Nucleic Acids Research,30(17):1-5,2002

Singer-Sam等人,Nucl.Acids Res.18:687,1990

Singer-Sam等人,PCR Methods Appl.1:160-163,1992

Singh和Wengel,Chem.Commun.1247,1998

Slattery等人,Carcinogenesis 2011,32:160

Southern等人,Genomics,13:1008-1017,1992

Szabo和Mann,Genes Dev.9:3097-3108,1995

Toyota等人,Cancer Res.59:2307-12(1999)

Uhlmann等人,Electrophoresis,23:4072-4079,2002

Wedemeyer等人,Clinical Chemistry 48:91398-1405,2002

Weissleder等人,Nature Medicine 6:351-355,2000

Weitzel JN(1999年12月),Cancer 86(11Suppl):2483–92

Worm等人,Clin.Chem.,47:1183-1189,2001

Xiong和Laird,Nucleic Acids Res.25:2532-2534(1997)

Yamashita等人,(Cancer Sci.2010,101:1708

Zyskind等人,Recombinant DNA Laboratory Manual,(Acad.Press,1988)

Claims

1.用于评估来自个体的生物样品中DNA区域的甲基化状态的试剂在制备用于筛查所述个体中大肠肿瘤初起或初起倾向性或监测大肠肿瘤的诊断剂中的用途，所述DNA区域选自：

(i)由Hg19坐标中任何两个或更多个限定的区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(1)chr12:24962958..25102393、

(2)chr7:50344378...50472798、

(3)chr6:391739..411443、

(4)chr12:52400748..52409671、和

(5)chr6:163834097..163834982；或

(ii)以下任何两个或更多个的基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1、

(2)IKZF1、

(3)IRF4、

(4)GRASP、和

(5)CAHM，

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述试剂用于在来自所述个体的生物样品中评估以下区域的甲基化状态：

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(1)chr12:24962958..25102393、和

(2)chr7:50344378...50472798、和

任选地下列中的一个或多个：

(3)chr6:391739..411443、

(4)chr12:52400748..52409671、和

(5)chr6:163834097..163834982；或

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1、和

(2)IKZF1、和

任选地下列中的一个或多个：

(3)IRF4、

(4)GRASP、和

(5)CAHM，

3.根据权利要求2所述的用途，其中受筛选的基因标记系是：

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(1)chr12:24962958..25102393、

(2)chr7:50344378...50472798、和

(3)chr6:391739..411443；或

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1、

(2)IKZF1、和

(3)IRF4。

4.根据权利要求2所述的用途，其中受筛选的基因标记系是：

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(1)chr12:24962958..25102393、

(2)chr7:50344378...50472798、和

(4)chr12:52400748..52409671；或

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1、

(2)IKZF1、和

(4)GRASP。

5.根据权利要求2所述的用途，其中受筛选的基因标记系是：

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(1)chr12:24962958..25102393、

(2)chr7:50344378...50472798、和

(5)chr6:163834097..163834982；或

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1、

(2)IKZF1、和

(5)CAHM。

6.根据权利要求2所述的用途，其中受筛选的基因标记系是：

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(1)chr12:24962958..25102393、

(2)chr7:50344378...50472798、

(3)chr6:391739..411443、和

(4)chr12:52400748..52409671；或

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1、

(2)IKZF1、

(3)IRF4、和

(4)GRASP。

7.根据权利要求2所述的用途，其中受筛选的基因标记系是：

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(1)chr12:24962958..25102393、

(2)chr7:50344378...50472798、

(3)chr6:391739..411443、和

(5)chr6:163834097..163834982；或

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1、

(2)IKZF1、

(3)IRF4、和

(5)CAHM。

8.根据权利要求2所述的用途，其中受筛选的基因标记系是：

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(1)chr12:24962958..25102393、

(2)chr7:50344378...50472798、

(4)chr12:52400748..52409671、和

(5)chr6:163834097..163834982；或

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1、

(2)IKZF1、

(4)GRASP、和

(5)CAHM。

9.根据权利要求2所述的用途，其中受筛选的基因标记系是：

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(1)chr12:24962958..25102393、

(2)chr7:50344378...50472798、

(3)chr6:391739..411443、

(4)chr12:52400748..52409671、和

(5)chr6:163834097..163834982；或

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1、

(2)IKZF1、

(3)IRF4、

(4)GRASP、和

(5)CAHM。

10.根据权利要求1所述的用途，其中所述试剂用于在来自所述个体的生物样品中评估以下区域的甲基化状态：

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(1)chr12:24962958..25102393、和

(5)chr6:163834097..163834982、和

任选地下列中的一个或多个：

(2)chr7:50344378...50472798、

(3)chr6:391739..411443、和

(4)chr12:52400748..52409671；或

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1、和

(5)CAHM、和

任选地下列中的一个或多个：

(2)IKZF1、

(3)IRF4、和

(4)GRASP，

其中相对于对照水平而言组(i)和/或(ii)的所述DNA区域的较高甲基化水平指示有大肠肿瘤或大肠瘤形成状态初起的倾向性。

11.根据权利要求1所述的用途，其中所述试剂用于在来自所述个体的生物样品中评估以下区域的甲基化状态：

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(2)chr7:50344378..50472798、和

(5)chr6:163834097..163834982、和

任选地下列中的一个或多个：

(1)chr12:24962958..25102393、

(3)chr6:391739..411443、和

(4)chr12:52400748..52409671；或

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(2)IKZF1、和

(5)CAHM、和

任选地下列中的一个或多个：

(1)BCAT1、

(3)IRF4、和

(4)GRASP，

12.根据权利要求1所述的用途，其中所述试剂用于在来自所述个体的生物样品中评估以下区域的甲基化状态：

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(1)chr12:24962958..25102393、和

(3)chr6:391739..411443、和

任选地下列中的一个或多个：

(2)chr7:50344378...50472798、

(4)chr12:52400748..52409671、和

(5)chr6:163834097..163834982；或

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1、和

(3)IRF4、和

任选地下列中的一个或多个：

(2)IKZF1、

(4)GRASP、和

(5)CAHM，

13.根据权利要求1所述的用途，其中所述试剂用于在来自所述个体的生物样品中评估以下区域的甲基化状态：

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(1)chr12:24962958..25102393、和

(4)chr12:52400748..52409671、和

任选地下列中的一个或多个：

(2)chr7:50344378...50472798、

(3)chr6:391739..411443、和

(5)chr6:163834097..163834982；或

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1、和

(4)GRASP、和

任选地下列中的一个或多个：

(2)IKZF1、

(3)IRF4、和

(5)CAHM，

14.根据权利要求1所述的用途，其中所述试剂用于在来自所述个体的生物样品中评估以下区域的甲基化状态：

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(2)chr7:50344378..50472798、和

(3)chr6:391739..411443、和

任选地下列中的一个或多个：

(1)chr12:24962958..25102393、

(4)chr12:52400748..52409671、和

(5)chr6:163834097..163834982；或

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(2)IKZF1、和

(3)IRF4、和

任选地下列中的一个或多个：

(1)BCAT1、

(4)GRASP、和

(5)CAHM，

15.根据权利要求1所述的用途，其中所述试剂用于在来自所述个体的生物样品中评估以下区域的甲基化状态：

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(2)chr7:50344378..50472798、和

(4)chr12:52400748..52409671、和

任选地下列中的一个或多个：

(1)chr12:24962958..25102393、

(3)chr6:391739..411443、和

(5)chr6:163834097..163834982；或

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(2)IKZF1、和

(4)GRASP、和

任选地下列中的一个或多个：

(1)BCAT1、

(3)IRF4、和

(5)CAHM，

16.根据权利要求1所述的用途，其中所述试剂用于在来自所述个体的生物样品中评估以下区域的甲基化状态：

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(3)chr6:391739..411443、和

(4)chr12:52400748..52409671、和

任选地下列中的一个或多个：

(1)chr12:24962958..25102393、

(2)chr7:50344378...50472798、和

(5)chr6:163834097..163834982；或

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(3)IRF4、和

(4)GRASP、和

任选地下列中的一个或多个：

(1)BCAT1、

(2)IKZF1、和

(5)CAHM，

17.根据权利要求1所述的用途，其中所述试剂用于在来自所述个体的生物样品中评估以下区域的甲基化状态：

(i)由Hg19坐标限定的DNA区域，包括转录起始位点上游的2kb：

(3)chr6:391739..411443、和

(5)chr6:163834097..163834982、和

任选地下列中的一个或多个：

(1)chr12:24962958..25102393、

(2)chr7:50344378...50472798、和

(4)chr12:52400748..52409671；或

(ii)以下基因区域，包括其上游2kb：

(3)IRF4、和

(5)CAHM、和

任选地下列中的一个或多个：

(1)BCAT1、

(2)IKZF1、和

(4)GRASP，

18.根据权利要求1所述的用途，其中所述DNA区域的任一个显示出较高水平的甲基化。

19.根据权利要求1所述的用途，其中所述DNA区域的任意两个或更多个显示出较高水平的甲基化。

20.根据权利要求1所述的用途，其中所述肿瘤是腺瘤或腺癌。

21.根据权利要求1所述的用途，其中所述对照水平是非肿瘤水平。

22.根据权利要求1所述的用途，其中所述瘤形成是结直肠瘤形成。

23.根据权利要求1所述的用途，其中所述生物样品是粪便样品、灌肠洗液、手术切除物、组织活组织检查样品或血液样品。

24.根据权利要求1所述的用途，其中通过筛查针对基因组DNA的改变评估所述水平。

25.根据权利要求24所述的用途，其中所述针对基因组DNA的改变是针对DNA甲基化的变化。

26.根据权利要求1至25之任一项所述的用途，其中在选自以下的一个或多个染色体亚区域中评估所述甲基化：

(1)BCAT亚区域：chr12:25101992～25102093和chr12:25101909～25101995，

(2)IKZF1亚区域：chr7:50343867～50343961和chr7:50343804～5033895，

(3)IRF4亚区域：chr6:392036～392145，

(4)GRASP亚区域：chr12:52399672～52399922、chr12:52400821～52401051、chr12:52401407～52401664、chr12:52400866～52400973和Chr12:52401107～52401664，

(5)CAHM亚区域：chr6:163834295～163834500、chr6:163834621～163834906、chr6:163834393～163834455和chr6:163834393～163834519。

27.根据权利要求26所述的用途，其中所述亚区域选自：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8或相应负链。

28.根据权利要求26所述的用途，所述试剂用于评估一个或多个胞嘧啶残基的甲基化，所述胞嘧啶残基选自：

chr12:52399713、chr12:52399731、chr12:52399749、chr12:52399783、chr12:52399796、chr12:52399808、chr12:52399823、chr12:52399835、chr12:52399891；

chr12:52400847、chr12:52400850、chr12:52400859、chr12:52400866、chr12:52400869、chr12:52400873、chr12:52400881、chr12:52400886、chr12:52400893、chr12:52400895、chr12:52400899、chr12:52400902、chr12:52400907、chr12:52400913、chr12:52400919、chr12:52400932、chr12:52400938、chr12:52400958、chr12:52400962、chr12:52400971、chr12:52400973、chr12:52400976、chr12:52400998、chr12:52401008、chr12:52401010、chr12:52401012、chr12:52401016、chr12:52401019、chr12:52401025、chr12:52401041、chr12:52401044、chr12:52401053、chr12:52401060、chr12:52401064、chr12:52401092、chr12:52401118；

chr12:52401438、chr12:52401448、chr12:52401460、chr12:52401465、chr12:52401474、chr12:52401477、chr12:52401479、chr12:52401483、chr12:52401504、chr12:52401514、chr12:52401523、chr12:52401540、chr12:52401553、chr12:52401576、chr12:52401588、chr12:52401595、chr12:52401599、chr12:52401604、chr12:52401606、chr12:52401634、chr12:52401640、chr12:52401644、chr12:52401659；

chr12:52401160、chr12:52401165、chr12:52401174、chr12:52401177、chr12:52401179、chr12:52401183、chr12:52401204、chr12:52401215、chr12:52401223、chr12:52401240、chr12:52401253、chr12:52401288、chr12:52401295、chr12:52401299、chr12:52401304、chr12:52401334、chr12:52401340、chr12:52401344、chr12:52401359；

chr6:163834330、chr6:163834332、chr6:163834357、chr6:163834373、chr6:163834384、chr6:163834390、chr6:163834392、chr6:163834406、chr6:163834412、chr6:163834419、chr6:163834443、chr6:163834448、chr6:163834452、chr6:163834464、chr6:163834483、chr6:163834653、chr6:163834660、chr6:163834672、chr6:163834675、chr6:163834678、chr6:163834681、chr6:163834815、chr6:163834824、chr6:163834835、chr6:163834840、chr6:163834853、chr6:163834855、chr6:163834858、chr6:163834863、chr6:163834869、chr6:163834872；

chr7:50343869、chr7:50343872、chr7:50343883、chr7:50343889、chr7:50343890、chr7:50343897、chr7:50343907、chr7:50343909、chr7:50343914、chr7:50343934、chr7:50343939、chr7:50343950、chr7:50343959、chr7:50343805、chr7:50343822、chr7:50343824、chr7:50343826、chr7:50343829、chr7:50343831、chr7:50343833、chr7:50343838、chr7:50343847、chr7:50343850、chr7:50343858、chr7:50343864、chr7:50343869、chr7:50343872、chr7:50343890；

chr6:392036、chr6:392047、chr6:392049、chr6:392057、chr6:392060、chr6:392066、chr6:392080、chr6:392094、chr6:392102、chr6:392131；或

在对侧DNA链上第n+1位置处的相应胞嘧啶。

29.根据权利要求1所述的用途，所述试剂用于在来自所述个体的生物样品中评估DNA区域的表达水平，所述DNA区域选自：

(1)chr12:24962958..25102393、

(2)chr7:50344378...50472798、

(3)chr6:391739..411443、

(4)chr12:52400748..52409671、和

(5)chr6:163834097..163834982；或

(ii)以下任何两个或更多个的基因区域，包括其上游2kb：

(1)BCAT1、

(2)IKZF1、

(3)IRF4、

(4)GRASP、和

(5)CAHM，

其中相对于对照水平而言组(i)和/或(ii)的至少一个DNA区域的较低表达水平指示有大肠肿瘤或瘤形成状态初起的倾向性。

30.根据权利要求1所述的用途，其中所述个体是人。