JP6742726B2

JP6742726B2 - 結腸直腸がんのための診断用遺伝子マーカーパネル

Info

Publication number: JP6742726B2
Application number: JP2015510579A
Authority: JP
Inventors: モロイ，ピーター; ラポワント，ローレンス; ピーダーセン，スーザン
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Priority date: 2012-05-11
Filing date: 2013-05-10
Publication date: 2020-08-19
Anticipated expiration: 2033-05-10
Also published as: EP3594366A1; JP2018198600A; WO2013166558A8; CA3152533A1; JP6975807B2; ZA201408120B; AU2021265861B2; CA2872867A1; WO2013166558A1; AU2019201294A1; EP4001436A1; HK1208058A1; DK2847355T3; BR112014028122B1; NZ701527A; CA2872867C; DK3594366T3; EP2847355B1; US20150141275A1; BR112014028122A2

Description

本発明は一般的には、新生物の発症、発症の素因及び／又は進行についてスクリーニングする方法に関する。より詳細には、本発明は、遺伝子マーカーのパネルのメチル化レベルの変化についてスクリーニングすることにより新生物の発症、発症の素因及び／又は進行についてスクリーニングする方法に関する。本発明の方法は、結腸直腸腺癌などの結腸直腸新生物の診断及び／又はモニタリングに関する適用を含むが、これらに限定されない一定範囲の適用に有用である。

結腸直腸がんには、結腸、直腸及び虫垂における癌性成長が含まれる。年あたり世界中で６５５，０００人が死亡しており、結腸直腸がんは合衆国では４番目に一般的な種類のがんであり、西洋世界ではがん関連死の３番目の主因である。結腸直腸がんは結腸において腺腫性ポリープから生じる。これらのキノコ形の成長は通常は良性であるが、一部は時間をかけてがんに成長する。限局性結腸がんは結腸内視鏡検査により診断される。

結腸の壁内に限定される浸潤がん（分類Ｉ及びＩＩ）は手術により治療可能である。前記浸潤がんは、処置されなければ、領域リンパ節まで広がり（分類ＩＩＩ）、そこでは７３％までが手術及び化学療法により治療可能である。遠隔部位へ転移するがん（分類ＩＶ）は通常では治療可能ではないが、化学療法は生存を延長することができ、ごくまれに、手術と化学療法を組み合わせると患者が治癒することがあった（Markowitz and Bertagnolli, 2009, N. Engl. J. Med. 361(25): 2449-60）。直腸がんには放射線が使用される。

結腸直腸がんにはアデノーマが先行する。アデノーマは、腺組織に由来する又は明確に限定された腺構造を示す上皮起源の良性腫瘍又は新生物である。一部のアデノーマは線維組織（線維腺腫）及び上皮構造などの認識可能な組織要素を示すが、気管支腺腫などの他のアデノーマは、臨床症候群を生じることもある活性化合物を生成する。

アデノーマは進行して浸潤新生物になることがあり、その場合は、腺癌と呼ばれる。したがって、腺癌は、身体の多くの器官の構成部分である線維構造から生じる悪性上皮腫瘍と定義される。用語腺癌は、腺成長パターンを示す腫瘍にも適用される。これらの腫瘍は、前記腫瘍が生成する物質、たとえば、粘液分泌及び漿液性腺癌に従って、又はパターンへのその細胞の微細配置、たとえば、乳頭状及び濾胞腺癌に従って、細分類され得る。これらのカルシノーマは、固形の場合もあれば嚢胞性（嚢胞腺癌）の場合もある。それぞれの器官は、種々の組織学的種類を示す腫瘍を生じることがあり、たとえば、卵巣は粘液性腺癌も嚢胞腺癌も生じることがある。

アデノーマは器官が異なれば振る舞いも異なる。一般に、カルシノーマがアデノーマ内に存在する（すなわち、がんの病巣が良性病変内で発生している）全体的可能性はおよそ５％である。しかし、これはアデノーマのサイズと関係がある。たとえば、大腸（具体的には結腸及び直腸）では、アデノーマ内でのがんの発生は、１センチメートル未満のアデノーマではまれである。大きさが４センチメートルを超えており、絨毛状変化又は高度異形成などのある種の組織学的変化を示すアデノーマではそのような発生は４０〜５０％と推定される。異形成の程度が高いアデノーマほど、カルシノーマの発生率が高くなる。所与の結腸直腸アデノーマでは、前記器官中の現在のがんの存在又は将来のがん発生の予測因子には、管状から絨毛状形態への変化のサイズ（特に９ｍｍを超える）程度、高度異形成の存在及び「鋸歯状アデノーマ」として記載される形態学的変化が含まれる。所与の個体では、加齢、結腸直腸アデノーマ若しくはがんの家族内発症、雄性又はアデノーマの多重度という追加の特徴が、前記器官におけるがんリスクの将来の増加、いわゆるがんのリスク因子を予想する。アデノーマの存在及びそのサイズを除いて、これらの特徴はどれ１つとして客観的に定義されておらず、数とサイズ以外の特徴はすべて観察者誤差及び問題の特徴の正確な定義に関して混同に陥りやすい。そのような因子は評価し定義するのが困難になることがあるために、がんの現在又は将来のリスクの予測因子としてのその価値は不正確である。

散発性アデノーマが発症してしまうと、新しいアデノーマが発生する可能性は２６か月以内でおよそ３０％である。

結腸直腸がんの症状は、大腸における腫瘍の位置及び腫瘍が転移してしまったかどうかに依拠する。不運にも、症状の多くは他の疾患でも同様に起こり得るもので、したがって、症状は結腸直腸がんの決定的診断には役立たない場合がある。

局所症状は、腫瘍が肛門近くに位置している場合は可能性が高くなる。排便習慣の変化（別の原因の非存在下での初発の便秘又は下痢）、不完全な排便感及び糞便径の減少が生じる場合がある。テネスムス及び糞便形状の変化は両方とも直腸がんに特徴的である。粘液の存在の増加と同じように、糞便中の明赤色血液の排泄を含む下部消化管出血は、結腸直腸がんを示している場合がある。外見がタール様の黒色便であるメレナは、通常は上部消化管出血において（たとえば、十二指腸潰瘍から）起こるが、疾患が大腸の起始部に位置する場合には結腸直腸がんにおいて遭遇することもある。

腸の全菅腔を満たすほど大きい腫瘍は、腸閉塞を引き起こし得る。このような状況は、便秘、腹痛、腹部膨満及び嘔吐により特徴付けられる。このために、閉塞性及び膨張した腸穿孔をもたらし腹膜炎を引き起こすこともある。

前記疾患がさらに進行すると結腸直腸がんのある種の局所的影響が生じる。腹部に触れると大きな腫瘍のほうが気づかれやすく、医師又は身体検査により気がつかれ得る。前記疾患は他の器官を浸潤し得、尿又は膣排泄物中に血液又は空気を引き起こし得る。

腫瘍が慢性的潜血を引き起こした場合、鉄欠乏性貧血が起こり得る。これは、疲労、動悸として経験され、蒼白として気づかれ得る。結腸直腸がんは、一般には食欲減退のせいで体重が低下することもある。

さらに普通でない全身症状は未解明の熱及びいくつかの腫瘍随伴症候群のうちの１つである。もっとも一般的な腫瘍随伴症候群は、血栓症、通常は深在静脈血栓症である。

結腸直腸がんはもっとも一般的に肝臓まで広がる。これは気がつかれないまま進行することがあるが、肝臓中の大きな沈着物は黄疸及び腹痛を引き起こし得る（嚢の伸長に起因する）。腫瘍沈着物が胆管を遮断する場合、黄疸は蒼白色の糞便などの胆管閉塞という他の特徴を伴うことがある。

結腸直腸がんは発症するのに何年もかかることがあり、結腸直腸がんの初期検出は予後を大いに改善する。結腸直腸がんスクリーニング法を実行する控えめな努力でさえ、がん死亡を低下させることが可能である。これにもかかわらず、結腸直腸がんスクリーニング率は依然として低い。現在、この目的のために利用可能であるいくつかの異なる検査が存在する。
直腸指診：医師は潤滑剤を付け手袋をした指を直腸に挿入し、指の感覚で異常な領域を探す。直腸指診は直腸の末端部分において感じ取れるほどの大きさの腫瘍を検出するのみであるが、最初のスクリーニング検査として有用である。
糞便潜血検査：糞便中の血液を調べる検査。糞便中の潜血を検出するためには２種類の検査、すなわち、グアヤクベース（化学的検査）の検査と免疫化学的検査を使用することが可能である。免疫化学的検査の感度は、特異性が容認できないほど減少することなく、化学的検査よりも優れている（Weitzel JN (December 1999). “Genetic cancer risk assessment. Putting it all together”. Cancer 86 (11 Suppl): 2483-92）。
内視鏡検査：
Ｓ字結腸鏡検査：照明付きプローブ（Ｓ字結腸鏡検査）が直腸及び結腸下部内に挿入されて、ポリープ及び他の異常について検査する。
結腸内視鏡検査：結腸内視鏡と呼ばれる照明付きプローブが直腸及び全結腸内に挿入されて、がんにより引き起こされることがあるポリープ及び他の異常を探す。結腸内視鏡検査には、その処置中にポリープが見つかった場合には、ポリープを直ちに除去することができるという利点がある。組織を生検のために採取することもできる。
二重造影注腸（ＤＣＢＥ）：先ず、一晩置いた調製物を取って結腸を洗浄する。硫酸バリウムを含有する浣腸液を投与し、次に結腸に空気を吹き込み、膨張させる。その結果、結腸の内層全体にバリウムの薄層ができ、これはＸ線フィルム上で可視になる。がん又は前がん性ポリープはこのようにして検出することが可能である。この技法では（より一般的ではない）平坦なポリープは見逃されることがある。
バーチャル結腸鏡検査は、二重造影注腸におけるＸ線フィルム（上記）を特殊なコンピュータ断層撮影スキャンで置き換えており、放射線科医が解釈することができるように特殊なワークステーションソフトウェアを必要とする。この技法は、ポリープに対する感度では結腸内視鏡検査に近づいている。しかし、それでも見つかるどんなポリープも標準結腸内視鏡検査により除去しなければならない。
標準コンピュータ体軸断層撮影は、がんの広がりの程度を決定するのに使用することができるＸ線法であるが、スクリーニングのために使用できるほどの感度はない。一部のがんは、他の理由で実施されるＣＡＴスキャンにおいて見つけられる。
血液検査：ある種のタンパク質レベルの上昇について患者の血液を測定することにより、腫瘍量を示すことが可能になる。特に、血液中の癌胎児性抗原（ＣＥＡ）レベルが高ければ腺癌が転移していることを示すことができる。これらの検査は偽陽性又は偽陰性であることが多く、スクリーニングには推奨されないが、疾患再発を評価するには有用になり得る。ＣＡ１９−９及びＣＡ２４２バイオマーカーは、ｅ−セレクチン関連転移リスクを示し、治療進展を追跡するのに役立ち、疾患再発を評価することができる。最近、セプチン９遺伝子のメチル化された配列の血漿中での検出のためのアッセイも利用できるようになって結腸直腸がんの診断に役立っている。
ポジトロン放射形断層撮影（ＰＥＴ）は、３次元走査技術であり、放射性糖が患者に注入され、前記糖は代謝活性が高い組織に集まり、前記糖からの放射線の放出を測定することにより画像が形成される。がん細胞は非常に高い代謝率を有する場合が多いので、これを使用して良性と悪性腫瘍を区別することが可能である。ＰＥＴはスクリーニングには使用されず、結腸直腸がん症例の定常精密検査には（まだ）用いられない。
糞便ＤＮＡ検査は、結腸直長がんについてのスクリーニングにおける先端技術である。前悪性アデノーマ及びがんはＤＮＡマーカーをその細胞から放ち、このマーカーは消化過程中分解されず糞便中で安定なままである。捕獲とそれに続くＰＣＲにより、ＤＮＡをアッセイのための検出可能レベルにまで増幅させる。
リスクマーカーとしての高いＣ反応性タンパク質レベル

これらの検査法が存在するが、診断は依然として問題がある。さらに感度の良い検査の大半は極めて侵襲的で高価であり、したがって患者による取り込みが低い。したがって、アデノーマ又はカルシノーマを発症している可能性の高い人に結腸内視鏡検査を受診するよう指示できるようになるようなもっと簡便でもっと情報価値のある診断プロトコール又は診断に役立つものを開発する必要性が現在も持続して存在する。簡便で正確なスクリーニング検査があれば、はるかに広く適用可能なスクリーニングシステムを提供できるようになると考えられる。

この目的を達成するために、大腸の新生物を発症している個体において、その発現レベルに関してモジュレートしている遺伝子マーカーが最近になって同定されている。これらのマーカーの一部はその発現レベルに関して上方調節されており、他のマーカーは下方調節されている。しかし、これらのマーカーの大半及び遺伝子マーカー発現レベル一般の診断としての使用に共通の特長は、これらのマーカーが多くの場合、中程度の感度及び特異性のみを示すことである。高レベルの感度及び特異性を与える診断プロトコールの開発が高度に求められている。

本発明に至る研究では、遺伝子マーカー、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＩＲＦ４、ＧＲＡＳＰ及びＣＡＨＭは、それぞれが個々に結腸直腸新生物発生を診断することに関して有用性を示すことが知られているいくつかの遺伝子マーカーの１つであるが、意外なことに、これらの遺伝子マーカーのいずれか１つが単独で又は他の無関係な遺伝子マーカーと一緒に分析される場合よりも、有意に高いレベルの感度又は特異性を集団的に達成できることが実際に確定され、断定されている。さらに具体的には、これら５つの特異的マーカーのうちの２つ又は３つ以上のメチル化のレベルの増加についてのスクリーニングは、これまで達成不可能であったレベルの感度又は特異性を達成するように設計することができる。

差次的遺伝子発現解析研究において、新生物でモジュレートした発現レベルを示すことが明らかにされている多数の遺伝子マーカーを念頭に置いて、５種の特異的マーカーが、これらのマーカー個別と比べて又はマーカーの他の群と比べて改善された診断結果を集団的に提供できることが確認されたのは思いがけないことでもあり予測不可能なことでもある。

本明細書及びこれに続く特許請求の範囲全体を通して、文脈が他の方法で要求していなければ、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」並びに「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などの変化は、述べられている整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群を含むが、他のいかなる整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群を排除しないことを意味すると解釈されることになる。

本明細書で使用されるように、用語「に由来する」は、特定の整数又は整数の群が明記されている種に由来しているが、必ずしも明記された供給源から直接入手されたわけではないことを示すと解釈されるものとする。さらに、本明細書で使用されるように、単数形の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が他の方法で明白に指示していなければ、複数の指示対象を含む。

本明細書で使用されるすべての技術及び科学用語は、他の方法で定義されていなければ、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されているのと同じ意味を有する。

主題の明細書は、文献目録の後で本明細書に提示されるプログラムＰａｔｅｎｔＩｎバージョン３．５を使用して準備されたヌクレオチド配列情報を含有する。それぞれのヌクレオチド配列は、数字指標＜２１０＞、続いて配列識別子（たとえば、＜２１０＞１、＜２１０＞２、等）により配列表において特定される。配列（ＤＮＡ、等）の長さ、種類、及び配列ごとの供給源生物は、それぞれ数字指標フィールド＜２１１＞、＜２１２＞及び＜２１３＞に提供される情報により示される。明細書において言及されるヌクレオチド配列は、指標配列番号、続いて配列識別子（たとえば、配列番号１、配列番号２、等）により特定される。明細書において言及される配列識別子は、配列識別子（たとえば、＜４００＞１、＜４００＞２、等）が後に続く、配列表における数字指標フィールド＜４００＞に提供される情報と相互関係がある。すなわち、明細書において詳述される配列番号１は、配列表において＜４００＞１として示される配列と相互関係がある。

本発明の一態様は、個体において大腸新生物の発症若しくは発症の素因についてスクリーニングする又はこれをモニターする方法であって、
前記個体由来の生体試料において
（ｉ）Ｈｇ１９座標
（１）ｃｈｒ１２：２４９６２９５８．．２５１０２３９３
（２）ｃｈｒ７：５０３４４３７８．．．５０４７２７９８
（３）ｃｈｒ６：３９１７３９．．４１１４４３；
（４）ｃｈｒ１２：５２４００７４８．．５２４０９６７１；及び
（５）ｃｈｒ６：１６３８３４０９７．．１６３８３４９８２；
のうちのいずれか２つ若しくは３つ以上により定義される、転写開始部位の２ｋｂ上流を含む、領域、又は
（ｉｉ）（１）ＢＣＡＴ１（２）ＩＫＺＦ１（３）ＩＲＦ４（４）ＧＲＡＳＰ及び（５）ＣＡＨＭ
のうちのいずれか２つ若しくは３つ以上の２ｋｂ上流を含む、遺伝子領域
から選択されるＤＮＡ領域のメチル化状態を評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群（ｉ）及び／又は（ｉｉ）のＤＮＡ領域の少なくとも１つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示す、前記方法を対象とする。

別の態様では、前記方法は前記ＤＮＡ領域のうちのいずれか１つがより高いレベルのメチル化を示している生体試料を同定することを対象とする。

さらに別の態様では、前記方法は前記ＤＮＡ領域のうちの２つ又は３つ以上がより高いレベルのメチル化を示している生体試料を同定することを対象とする。

さらに別の態様では、個体において大腸新生物の発症若しくは発症の素因についてスクリーニングする又はこれをモニターする方法であって、
前記個体由来の生体試料において
（ｉ）Ｈｇ１９座標
（１）ｃｈｒ１２：２４９６２９５８．．２５１０２３９３；及び
（２）ｃｈｒ７：５０３４４３７８．．．５０４７２７９８
並びに場合によって（３）ｃｈｒ６：３９１７３９．．４１１４４３、（４）ｃｈｒ１２：５２４００７４８．．５２４０９６７１及び（５）ｃｈｒ６：１６３８３４０９７．．１６３８３４９８２のうちの１つ若しくは複数
により定義される、転写開始部位の２ｋｂ上流を含む、ＤＮＡ領域、又は
（ｉｉ）（１）ＢＣＡＴ１；及び
（２）ＩＫＺＦ１；
並びに場合によって（３）ＩＲＦ４、（４）ＧＲＡＳＰ及び（５）ＣＡＨＭ
のうちの１つ若しくは複数の２ｋｂ上流を含む、遺伝子領域
のメチル化状態を評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群（ｉ）及び／又は（ｉｉ）のＤＮＡ領域の少なくとも１つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示す、前記方法が提供される。

本態様の一実施形態では、スクリーニングして探る遺伝子マーカーパネルは、
（ｉ）Ｈｇ１９座標
（１）ｃｈｒ１２：２４９６２９５８．．２５１０２３９３
（２）ｃｈｒ７：５０３４４３７８．．．５０４７２７９８；及び
（３）ｃｈｒ６：３９１７３９．．４１１４４３
により定義される、転写開始部位の２ｋｂ上流を含む、ＤＮＡ領域、又は
（ｉｉ）（１）ＢＣＡＴ１、（２）ＩＫＺＦ１及び（３）ＩＲＦ４
の２ｋｂ上流を含む、遺伝子領域である。

本態様の別の実施形態では、スクリーニングして探る遺伝子マーカーパネルは、
（ｉ）Ｈｇ１９座標
（１）ｃｈｒ１２：２４９６２９５８．．２５１０２３９３
（２）ｃｈｒ７：５０３４４３７８．．．５０４７２７９８；及び
（４）ｃｈｒ１２：５２４００７４８．．５２４０９６７１
により定義される、転写開始部位の２ｋｂ上流を含む、ＤＮＡ領域、又は
（ｉｉ）（１）ＢＣＡＴ１、（２）ＩＫＺＦ１及び（４）ＧＲＡＳＰ
の２ｋｂ上流を含む、遺伝子領域である。

本態様のさらに別の実施形態では、スクリーニングして探る遺伝子マーカーパネルは、
（ｉ）Ｈｇ１９座標
（１）ｃｈｒ１２：２４９６２９５８．．２５１０２３９３
（２）ｃｈｒ７：５０３４４３７８．．．５０４７２７９８；及び
（５）ｃｈｒ６：１６３８３４０９７．．１６３８３４９８２
により定義される、転写開始部位の２ｋｂ上流を含む、ＤＮＡ領域、又は
（ｉｉ）（１）ＢＣＡＴ１、（２）ＩＫＺＦ１及び（５）ＣＡＨＭ
の２ｋｂ上流を含む、遺伝子領域である。

本態様のさらに別の一実施形態では、スクリーニングして探る遺伝子マーカーパネルは、
（ｉ）Ｈｇ１９座標
（１）ｃｈｒ１２：２４９６２９５８．．２５１０２３９３
（２）ｃｈｒ７：５０３４４３７８．．．５０４７２７９８
（３）ｃｈｒ６：３９１７３９．．４１１４４３；及び
（４）ｃｈｒ１２：５２４００７４８．．５２４０９６７１
により定義される、転写開始部位の２ｋｂ上流を含む、ＤＮＡ領域、又は
（ｉｉ）（１）ＢＣＡＴ１、（２）ＩＫＺＦ１、（３）ＩＲＦ４及び（４）ＧＲＡＳＰ
の２ｋｂ上流を含む、遺伝子領域である。

本態様のさらに別の一実施形態では、スクリーニングして探る遺伝子マーカーパネルは、
（ｉ）Ｈｇ１９座標
（１）ｃｈｒ１２：２４９６２９５８．．２５１０２３９３
（２）ｃｈｒ７：５０３４４３７８．．．５０４７２７９８
（３）ｃｈｒ６：３９１７３９．．４１１４４３；及び
（５）ｃｈｒ６：１６３８３４０９７．．１６３８３４９８２
により定義される、転写開始部位の２ｋｂ上流を含む、ＤＮＡ領域、又は
（ｉｉ）（１）ＢＣＡＴ１、（２）ＩＫＺＦ１、（３）ＩＲＦ４及び（５）ＣＡＨＭ
の２ｋｂ上流を含む、遺伝子領域である。

本態様のさらに別の一実施形態では、スクリーニングして探る遺伝子マーカーパネルは、
（ｉ）Ｈｇ１９座標
（１）ｃｈｒ１２：２４９６２９５８．．２５１０２３９３
（２）ｃｈｒ７：５０３４４３７８．．．５０４７２７９８
（４）ｃｈｒ１２：５２４００７４８．．５２４０９６７１；及び
（５）ｃｈｒ６：１６３８３４０９７．．１６３８３４９８２
により定義される、転写開始部位の２ｋｂ上流を含む、ＤＮＡ領域、又は
（ｉｉ）（１）ＢＣＡＴ１、（２）ＩＫＺＦ１、（４）ＧＲＡＳＰ及び（５）ＣＡＨＭ
の２ｋｂ上流を含む、遺伝子領域である。

本態様のさらに別の一実施形態では、スクリーニングして探る遺伝子マーカーパネルは、
（ｉ）Ｈｇ１９座標
（１）ｃｈｒ１２：２４９６２９５８．．２５１０２３９３
（２）ｃｈｒ７：５０３４４３７８．．．５０４７２７９８
（３）ｃｈｒ６：３９１７３９．．４１１４４３
（４）ｃｈｒ１２：５２４００７４８．．５２４０９６７１；及び
（５）ｃｈｒ６：１６３８３４０９７．．１６３８３４９８２
により定義される、転写開始部位の２ｋｂ上流を含む、ＤＮＡ領域、又は
（ｉｉ）（１）ＢＣＡＴ１、（２）ＩＫＺＦ１、（３）ＩＲＦ４、（４）ＧＲＡＳＰ及び（５）ＣＡＨＭ
の２ｋｂ上流を含む、遺伝子領域である。

別の実施形態では、個体において大腸新生物の発症若しくは発症の素因についてスクリーニングする又はこれをモニターする方法であって、
前記個体由来の生体試料において
（ｉ）Ｈｇ１９座標
（１）ｃｈｒ１２：２４９６２９５８．．２５１０２３９３；及び
（５）ｃｈｒ６：１６３８３４０９７．．１６３８３４９８２
並びに場合によって（２）ｃｈｒ７：５０３４４３７８．．．５０４７２７９８、（３）ｃｈｒ６：３９１７３９．．４１１４４３；及び（４）ｃｈｒ１２：５２４００７４８．．５２４０９６７１のうちの１つ若しくは複数
により定義される、転写開始部位の２ｋｂ上流を含む、ＤＮＡ領域、又は
（ｉｉ）（１）ＢＣＡＴ１；及び
（５）ＣＡＨＭ；
並びに場合によって（２）ＩＫＺＦ１、（３）ＩＲＦ４及び（４）ＧＲＡＳＰ
のうちの１つ若しくは複数の２ｋｂ上流を含む、遺伝子領域
のメチル化状態を評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群（ｉ）及び／又は（ｉｉ）のＤＮＡ領域の少なくとも１つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示す、前記方法が提供される。

さらに別の実施形態では、個体において大腸新生物の発症若しくは発症の素因についてスクリーニングする又はこれをモニターする方法であって、
前記個体由来の生体試料において
（ｉ）Ｈｇ１９座標
（２）ｃｈｒ７：５０３４４３７８．．．５０４７２７９８；及び
（５）ｃｈｒ６：１６３８３４０９７．．１６３８３４９８２
並びに場合によって（１）ｃｈｒ１２：２４９６２９５８．．２５１０２３９３、（３）ｃｈｒ６：３９１７３９．．４１１４４３及び（４）ｃｈｒ１２：５２４００７４８．．５２４０９６７１のうちの１つ若しくは複数
により定義される、転写開始部位の２ｋｂ上流を含む、ＤＮＡ領域、又は
（ｉｉ）（２）ＩＫＺＦ１；及び
（５）ＣＡＨＭ；
並びに場合によって（１）ＢＣＡＴ１、（３）ＩＲＦ４及び（４）ＧＲＡＳＰ
のうちの１つ若しくは複数の２ｋｂ上流を含む、遺伝子領域
のメチル化状態を評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群（ｉ）及び／又は（ｉｉ）のＤＮＡ領域の少なくとも１つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示す、前記方法が提供される。

さらなる実施形態では、個体において大腸新生物の発症若しくは発症の素因についてスクリーニングする又はこれをモニターする方法であって、
前記個体由来の生体試料において
（ｉ）Ｈｇ１９座標
（１）ｃｈｒ１２：２４９６２９５８．．２５１０２３９３；及び
（３）ｃｈｒ６：３９１７３９．．４１１４４３；
並びに場合によって（２）ｃｈｒ７：５０３４４３７８．．．５０４７２７９８、（４）ｃｈｒ１２：５２４００７４８．．５２４０９６７１及び（５）ｃｈｒ６：１６３８３４０９７．．１６３８３４９８２
のうちの１つ若しくは複数
により定義される、転写開始部位の２ｋｂ上流を含む、ＤＮＡ領域、又は
（ｉｉ）（１）ＢＣＡＴ１；及び
（３）ＩＲＦ４；
並びに場合によって（２）ＩＫＺＦ１、（４）ＧＲＡＳＰ及び（５）ＣＡＨＭ
のうちの１つ若しくは複数の２ｋｂ上流を含む、遺伝子領域
のメチル化状態を評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群（ｉ）及び／又は（ｉｉ）のＤＮＡ領域の少なくとも１つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示す、前記方法が提供される。

さらに別のさらなる実施形態では、個体において大腸新生物の発症若しくは発症の素因についてスクリーニングする又はこれをモニターする方法であって、
前記個体由来の生体試料において
（ｉ）Ｈｇ１９座標
（１）ｃｈｒ１２：２４９６２９５８．．２５１０２３９３；及び
（４）ｃｈｒ１２：５２４００７４８．．５２４０９６７１；
並びに場合によって（２）ｃｈｒ７：５０３４４３７８．．．５０４７２７９８、（３）ｃｈｒ６：３９１７３９．．４１１４４３及び（５）ｃｈｒ６：１６３８３４０９７．．１６３８３４９８２
のうちの１つ若しくは複数
により定義される、転写開始部位の２ｋｂ上流を含む、ＤＮＡ領域、又は
（ｉｉ）（１）ＢＣＡＴ１；及び
（４）ＧＲＡＳＰ；
並びに場合によって（２）ＩＫＺＦ１、（３）ＩＲＦ４及び（５）ＣＡＨＭ
のうちの１つ若しくは複数の２ｋｂ上流を含む、遺伝子領域
のメチル化状態を評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群（ｉ）及び／又は（ｉｉ）のＤＮＡ領域の少なくとも１つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示す、前記方法が提供される。

さらに別のさらなる実施形態では、個体において大腸新生物の発症若しくは発症の素因についてスクリーニングする又はこれをモニターする方法であって、
前記個体由来の生体試料において
（ｉ）Ｈｇ１９座標
（２）ｃｈｒ７：５０３４４３７８．．．５０４７２７９８；及び
（３）ｃｈｒ６：３９１７３９．．４１１４４３；
並びに場合によって（１）ｃｈｒ１２：２４９６２９５８．．２５１０２３９３、（４）ｃｈｒ１２：５２４００７４８．．５２４０９６７１及び（５）ｃｈｒ６：１６３８３４０９７．．１６３８３４９８２
のうちの１つ若しくは複数
により定義される、転写開始部位の２ｋｂ上流を含む、ＤＮＡ領域、又は
（ｉｉ）（２）ＩＫＺＦ１；及び
（３）ＩＲＦ４；
並びに場合によって（１）ＢＣＡＴ１、（４）ＧＲＡＳＰ及び（５）ＣＡＨＭ
のうちの１つ若しくは複数の２ｋｂ上流を含む、遺伝子領域
のメチル化状態を評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群（ｉ）及び／又は（ｉｉ）のＤＮＡ領域の少なくとも１つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示す、前記方法が提供される。

さらに別の実施形態では、個体において大腸新生物の発症若しくは発症の素因についてスクリーニングする又はこれをモニターする方法であって、
前記個体由来の生体試料において
（ｉ）Ｈｇ１９座標
（２）ｃｈｒ７：５０３４４３７８．．．５０４７２７９８；及び
（４）ｃｈｒ１２：５２４００７４８．．５２４０９６７１；
並びに場合によって（１）ｃｈｒ１２：２４９６２９５８．．２５１０２３９３、（３）ｃｈｒ６：３９１７３９．．４１１４４３及び（５）ｃｈｒ６：１６３８３４０９７．．１６３８３４９８２
のうちの１つ若しくは複数
により定義される、転写開始部位の２ｋｂ上流を含む、ＤＮＡ領域、又は
（ｉｉ）（２）ＩＫＺＦ１；及び
（４）ＧＲＡＳＰ；
並びに場合によって（１）ＢＣＡＴ１、（３）ＩＲＦ４及び（５）ＣＡＨＭ
のうちの１つ若しくは複数の２ｋｂ上流を含む、遺伝子領域
のメチル化状態を評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群（ｉ）及び／又は（ｉｉ）のＤＮＡ領域の少なくとも１つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示す、前記方法が提供される。

さらに別の実施形態では、個体において大腸新生物の発症若しくは発症の素因についてスクリーニングする又はこれをモニターする方法であって、
前記個体由来の生体試料において
（ｉ）Ｈｇ１９座標
（３）ｃｈｒ６：３９１７３９．．４１１４４３；及び
（４）ｃｈｒ１２：５２４００７４８．．５２４０９６７１；
並びに場合によって（１）ｃｈｒ１２：２４９６２９５８．．２５１０２３９３、（２）ｃｈｒ７：５０３４４３７８．．．５０４７２７９８及び（５）ｃｈｒ６：１６３８３４０９７．．１６３８３４９８２
のうちの１つ若しくは複数
により定義される、転写開始部位の２ｋｂ上流を含む、ＤＮＡ領域、又は
（ｉｉ）（３）ＩＲＦ４；及び
（４）ＧＲＡＳＰ；
並びに場合によって（１）ＢＣＡＴ１、（２）ＩＫＺＦ１及び（５）ＣＡＨＭ
のうちの１つ若しくは複数の２ｋｂ上流を含む、遺伝子領域
のメチル化状態を評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群（ｉ）及び／又は（ｉｉ）のＤＮＡ領域の少なくとも１つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示す、前記方法が提供される。

別の実施形態では、個体において大腸新生物の発症若しくは発症の素因についてスクリーニングする又はこれをモニターする方法であって、
前記個体由来の生体試料において
（ｉ）Ｈｇ１９座標
（３）ｃｈｒ６：３９１７３９．．４１１４４３；及び
（５）ｃｈｒ６：１６３８３４０９７．．１６３８３４９８２；
並びに場合によって（１）ｃｈｒ１２：２４９６２９５８．．２５１０２３９３、（２）ｃｈｒ７：５０３４４３７８．．．５０４７２７９８及び（４）ｃｈｒ１２：５２４００７４８．．５２４０９６７１
のうちの１つ若しくは複数
により定義される、転写開始部位の２ｋｂ上流を含む、ＤＮＡ領域、又は
（ｉｉ）（３）ＩＲＦ４；及び
（５）ＣＡＨＭ；
並びに場合によって（１）ＢＣＡＴ１、（２）ＩＫＺＦ１及び（４）ＧＲＡＳＰ
のうちの１つ若しくは複数の２ｋｂ上流を含む、遺伝子領域
のメチル化状態を評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群（ｉ）及び／又は（ｉｉ）のＤＮＡ領域の少なくとも１つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示す、前記方法が提供される。

特定の有用性を示すことが確定されているサブ領域は、それが見出される場である遺伝子及び染色体領域を参照して、下に収載されている。
（１）ＢＣＡＴサブ領域：ｃｈｒ１２：２５１０１９９２〜２５１０２０９３（配列番号１又は対応するマイナス鎖）及びｃｈｒ１２：２５１０１９０９〜２５１０１９９５（配列番号２又は対応するマイナス鎖）
（２）ＩＫＺＦ１サブ領域：ｃｈｒ７：５０３４３８６７〜５０３４３９６１（配列番号３又は対応するマイナス鎖）及びｃｈｒ７：５０３４３８０４〜５０３３８９５（配列番号４又は対応するマイナス鎖）
（３）ＩＲＦ４サブ領域：ｃｈｒ６：３９２０３６〜３９２１４５（配列番号５又は対応するマイナス鎖）
（４）ＧＲＡＳＰサブ領域：ｃｈｒ１２：５２３９９６７２〜５２３９９９２２、ｃｈｒ１２：５２４００８２１〜５２４０１０５１（配列番号６又は対応するマイナス鎖）、ｃｈｒ１２：５２４０１４０７〜５２４０１６６４（配列番号７又は対応するマイナス鎖）、ｃｈｒ１２：５２４００８６６〜５２４００９７３及びＣｈｒ１２：５２４０１１０７〜５２４０１６６４
（５）ＣＡＨＭサブ領域：ｃｈｒ６：１６３８３４２９５〜１６３８３４５００（配列番号８又は対応するマイナス鎖）、ｃｈｒ６：１６３８３４６２１〜１６３８３４９０６、ｃｈｒ６：１６３８３４３９３〜１６３８３４４５５及びｃｈｒ６：１６３８３４３９３〜１６３８３４５１９

本発明の方法がＧＲＡＳＰのメチル化を解析することを含む限り、対象残基は：

又は反対のＤＮＡ鎖上のｎ＋１位の対応するシトシンである。

本発明の方法がＣＡＨＭを解析することを含む限り、対象残基は：

本発明の方法がＩＫＺＦ１を解析することを含む限り、対象残基は：

本発明の方法がＩＲＦ４を解析することを含む限り、対象残基は：

本発明の別の態様は、個体において大腸新生物の発症若しくは発症の素因についてスクリーニングする又はこれをモニターする方法であって、
前記個体由来の生体試料において
（ｉ）Ｈｇ１９座標
（１）ｃｈｒ１２：２４９６２９５８．．２５１０２３９３
（２）ｃｈｒ７：５０３４４３７８．．．５０４７２７９８
（３）ｃｈｒ６：３９１７３９．．４１１４４３；若しくは
（４）ｃｈｒ１２：５２４００７４８．．５２４０９６７１；及び
（５）ｃｈｒ６：１６３８３４０９７．．１６３８３４９８２；
のうちのいずれか２つ若しくは３つ以上により定義される、転写開始部位の２ｋｂ上流を含む、領域、又は
（ｉｉ）（１）ＢＣＡＴ１（２）ＩＫＺＦ１（３）ＩＲＦ４（４）ＧＲＡＳＰ及び（５）ＣＡＨＭ
のうちのいずれか２つ若しくは３つ以上の２ｋｂ上流を含む、遺伝子領域
から選択されるＤＮＡ領域の発現のレベルを評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群（ｉ）及び／又は（ｉｉ）のＤＮＡ領域の少なくとも１つのより低い発現レベルが、大腸新生物又は新生物状態の発症の素因を示す、前記方法を対象とする。

図１は、ＧＲＡＳＰのゲノム配列を描く図である。図２は、ＣＡＨＭのゲノム配列を描く図である。図３は、ＩＲＦ４のゲノム配列を描く図である。図４は、ＢＣＡＴ１のゲノム配列を描く図である。図５は、ＩＫＺＦ１のゲノム配列を描く図である。

本発明は、遺伝子マーカーのパネルのメチル化パターンの変化が、これらのマーカーのうちのいずれか１つが孤立して又は本明細書で特定されるマーカー以外のマーカーと一緒に試験される場合よりも集団的に試験した場合のほうが高いレベルの診断特異性又は診断感度を与えることができるという決定に一部基づいている。したがって、この発見により、遺伝子マーカーＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＣＡＨＭ、ＧＲＡＳＰ及びＩＲＦ４のうちの２つ又は３つ以上のメチル化を評価することに基づいて大腸の新生物を診断する、予後する又はモニターするための改良された試験の開発が現在推進されている。

本発明に従って、問題の細胞が新生物であるか否かに応じて、ある特定の遺伝子パネルは、メチル化のレベルの差次的変化の点からモジュレートしていることが確定された。問題の遺伝子は、その名称とその染色体座標を参照することの両方により本明細書では記載されることは理解されるべきである。染色体座標は２００９年２月に公表されたヒトゲノムデータベースバージョンＨｇ１９（本明細書では「Ｈｇ１９座標」と呼ばれる）と一致している。

したがって、本発明の一態様は、個体において大腸新生物の発症若しくは発症の素因についてスクリーニングする又はこれをモニターする方法であって、
前記個体由来の生体試料において
（ｉ）Ｈｇ１９座標
（１）ｃｈｒ１２：２４９６２９５８．．２５１０２３９３
（２）ｃｈｒ７：５０３４４３７８．．．５０４７２７９８
（３）ｃｈｒ６：３９１７３９．．４１１４４３；若しくは
（４）ｃｈｒ１２：５２４００７４８．．５２４０９６７１；及び
（５）ｃｈｒ６：１６３８３４０９７．．１６３８３４９８２；
のうちのいずれか２つ若しくは３つ以上により定義される、転写開始部位の２ｋｂ上流を含む、領域、又は
（ｉｉ）（１）ＢＣＡＴ１（２）ＩＫＺＦ１（３）ＩＲＦ４（４）ＧＲＡＳＰ及び（５）ＣＡＨＭ
のうちのいずれか２つ若しくは３つ以上の２ｋｂ上流を含む、遺伝子領域
から選択されるＤＮＡ領域のメチル化状態を評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群（ｉ）及び／又は（ｉｉ）のＤＮＡ領域の少なくとも１つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示す、前記方法を対象とする。

一実施形態では、前記方法は前記ＤＮＡ領域のうちのいずれか１つがより高いレベルのメチル化を示している生体試料を同定することを対象とする。

別の実施形態では、前記方法は前記ＤＮＡ領域のうちの２つ又は３つ以上がより高いレベルのメチル化を示している生体試料を同定することを対象とする。

本発明をいかなる１つの理論又は作用機序にも限定することなく、本明細書で特定されるＤＮＡ領域（マーカー）のパネルは先行技術方法と比べて改善された診断結果を提供するだけではなく、さらに高レベルの診断特異性又は高レベルの診断感度を提供することに焦点を合わせるように設計することができるスクリーニング法の開発も可能にする。当業者であれば理解されるように、診断という文脈では「感度」は正しく同定される陽性結果の割合、すなわち、問題の疾患を有すると正しく同定される個体の百分率を定義する。しかし、「特異性」は正しく同定される陰性結果の割合、すなわち、問題の疾患を有していないと正しく同定される個体の百分率を定義する。

本発明という文脈では、マーカーの特定されたパネルのメチル化状態について患者試料をスクリーニングすることが、高レベルの特異性を示す診断結果又は高レベルの感度を示す診断結果のいずれかを提供するように設計することができることが確定されている。

高レベルの感度が求められる場合、スクリーニング法は、パネルのマーカーのいずれか１つが対照レベルと比べて増大したメチル化を示す試料を同定するように設計される。すなわち、結果を陽性として定義するためにはマーカーがすべて高メチル化を示すことが必要なわけではない。さらに高いレベルの感度が求められる場合、特異性のレベルは本質的に減少する。しかし、より高いレベルの特異性（感度のレベルを下げる可能性がある）を追求することが望まれる場合、方法はＤＮＡ領域のパネルのうちの２つ又は３つ以上が増大したメチル化を示す試料を同定するように設計される。

したがって、本発明が、特定化されたパネルのＤＮＡ領域（マーカー）の「いずれか１つ」がより高いレベルのメチル化を示す方法の実施形態を目的とする限り、これらの実施形態は、パネル中のマーカーのいずれか１つが高メチル化されていることに基づいて増大した感度を示す結果を達成するように設計される。それぞれの試料において高メチル化されているのが同じマーカーである必要はないことが理解されるべきである。もっと正確に言えば、単にパネルの一部を形成するマーカーのうちの１つが高メチル化されている。一部の試料に関して、パネルのマーカーの２つ又は３つ以上が高メチル化されている可能性があることも理解するべきである。この実施形態は複数のマーカーが高メチル化されている状況を排除してはいないが、わずか１つのマーカーが高メチル化されている試料すべてをその範囲内に含んでいるだけなので、これらの試料はそれでもなお本発明のこの実施形態の範囲に収まると理解すべきである。全体として、これらのデータでは、感度は増大するが、特異性は低下することになる。

本発明が、特定化されたパネルのＤＮＡ領域（マーカー）のうちの「２つ又は３つ以上」がより高いレベルのメチル化を示す方法の実施形態を目的とする限り、これらの実施形態はより高いレベルの特異性を達成するように設計される。これは、マーカーの特定化されたパネルのうちの２つよりも多くはないとしても、少なくとも２つが高メチル化されていると判定されることにより達成される。

「大腸」への言及は、大腸の８つの解剖学的領域であって、回腸の末端領域の後で始まり、これらの領域が
（ｉ）盲腸
（ｉｉ）上行結腸
（ｉｉｉ）横行結腸
（ｉｖ）下行結腸
（ｖ）Ｓ状結腸
（ｖｉ）直腸
（ｖｉｉ）脾弯曲部、及び
（ｖｉｉｉ）右結腸曲
である領域のうちの１つに由来する細胞への言及として理解されるべきである。

「新生物」への言及は、病変、腫瘍又は他の被包性若しくは非被包性腫瘤又は新生物細胞を含む他の形態の成長への言及として理解されるべきである。「新生物細胞」は、異常な成長を示す細胞への言及として理解されるべきである。用語「成長」はそのもっとも広い意味で理解されるべきであり、増殖への言及を含む。この点に関して、異常な細胞成長の例は、細胞の制御されない増殖である。別の例は、細胞における失敗したアポトーシスであり、したがって細胞の通常の寿命の延長である。新生物細胞は良性細胞のこともあれば悪性細胞であることもある。好ましい実施形態では、対象の新生物はアデノーマ又は腺癌である。本発明をどれか１つの理論又は作用機序に限定せずに、アデノーマは一般には、上皮組織由来である又は明確に限定された上皮構造を示す上皮起源の良性腫瘍である。これらの構造物は腺外見を帯びることもある。アデノーマは、良性アデノーマ又は良性新生物病変の悪性腺癌への進行とともに起こるなどの、その内部に悪性細胞集団を含むことがある。

好ましくは、前記新生物細胞はアデノーマ又は腺癌であり、さらに好ましくは、結腸直腸アデノーマ又は腺癌である。

「ＤＮＡ領域」への言及は、ゲノムＤＮＡの特定のセクションへの言及として理解されるべきである。これらのＤＮＡ領域は、遺伝子名又は染色体座標のセットのいずれかを参照することにより特定される。遺伝子名も染色体座標も当業者には周知であり、理解されていると考えられる。上文に詳述されているように、染色体座標は、ゲノムのＨｇ１９バージョンに一致する。一般に、遺伝子は、それを介してその配列も染色体位置も常に得られるその名称を参照することにより、又はそれを介してその遺伝子名もその配列も常に得られるその染色体座標を参照することにより、常に同定することが可能である。

上で詳述される遺伝子／ＤＮＡ領域のそれぞれへの言及は、あらゆる形態のこれらの分子への及びその断片又はバリアントへの言及として理解されるべきである。当業者には認識されていると考えられるように、一部の遺伝子は、個体又は一塩基多型間で対立遺伝子変異を示すことが知られている。ＳＮＰは、変化するサイズの挿入及び欠失並びに、ジヌクレオチド及びトリヌクレオチド反復などの単純な配列反復を包含する。バリアントには、少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％配列同一性を共有する、すなわち、本明細書に記載されるＤＮＡ領域に対して１つ又は複数の欠失、付加、置換、逆方向配列等を有する同じ領域由来の核酸配列が含まれる。したがって、本発明は、現在の診断適用の点から、実際の核酸配列間の小さな遺伝子変異が個体間に存在し得るという事実にもかかわらず、同じ結果を達成するようなバリアントにまで及ぶと解釈されるべきである。したがって、本発明は、任意の他の突然変異、多型、又は対立遺伝子変異から生じるあらゆる形態のＤＮＡにまで及ぶと解釈されるべきである。

試験の対象である「個体」はいかなるヒト又は非ヒト哺乳動物であってもよいことは理解されるべきである。非ヒト哺乳動物の例には、霊長類、家畜動物（たとえば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ロバ、等）、実験室試験動物（たとえば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）、コンパニオンアニマル（たとえば、イヌ、ネコ）及び捕獲野生動物（たとえば、シカ、キツネ）が含まれる。

好ましくは、哺乳動物はヒトである。

同定されている遺伝子のパネルは、対応する非新生物細胞と比べて大腸新生物細胞におけるメチル化の増大を示している。この増大したメチル化は、いくつかの場合、ＤＮＡ領域内の少数の特定のＣｐＧ部位に局在化しており、他の場合には、広範囲のＣｐＧ部位にわたり観察される。しかし、すべての遺伝子由来の特定の領域は増大したメチル化を示し、したがって、有用な診断マーカーであるが、これらのマーカーを個別に解析する場合に得られる感度及び特異性と比べて独立した非常に著しい改善を与えたのはこれらの特定のマーカーのパネルとしての解析である。この改善は、大腸新生物の発症のマーカーとして増大したメチル化を示すことが知られている他のマーカーを使用して得ることができる感度及び特異性に対して考慮した場合でさえも有意義である。したがって、本発明の方法はこの時点で、現在まで得ることができたよりも高いレベルの感度及び特異性を達成する手段を提供している。

一態様では、個体において大腸新生物の発症若しくは発症の素因についてスクリーニングする又はこれをモニターする方法であって、
前記個体由来の生体試料において
（ｉ）Ｈｇ１９座標
（１）ｃｈｒ１２：２４９６２９５８．．２５１０２３９３；及び
（２）ｃｈｒ７：５０３４４３７８．．．５０４７２７９８
並びに場合によって（３）ｃｈｒ６：３９１７３９．．４１１４４３、（４）ｃｈｒ１２：５２４００７４８．．５２４０９６７１及び（５）ｃｈｒ６：１６３８３４０９７．．１６３８３４９８２のうちの１つ若しくは複数
により定義される、転写開始部位の２ｋｂ上流を含む、ＤＮＡ領域、又は
（ｉｉ）（１）ＢＣＡＴ１；及び
（２）ＩＫＺＦ１；
並びに場合によって（３）ＩＲＦ４、（４）ＧＲＡＳＰ及び（５）ＣＡＨＭ
のうちの１つ若しくは複数の２ｋｂ上流を含む、遺伝子領域
のメチル化状態を評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群（ｉ）及び／又は（ｉｉ）のＤＮＡ領域の少なくとも１つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示す、前記方法が提供される。

本態様のさらなる実施形態では、スクリーニングして探る遺伝子マーカーパネルは、
（ｉ）Ｈｇ１９座標
（１）ｃｈｒ１２：２４９６２９５８．．２５１０２３９３
（２）ｃｈｒ７：５０３４４３７８．．．５０４７２７９８
（４）ｃｈｒ１２：５２４００７４８．．５２４０９６７１；及び
（５）ｃｈｒ６：１６３８３４０９７．．１６３８３４９８２
により定義される、転写開始部位の２ｋｂ上流を含む、ＤＮＡ領域、又は
（ｉｉ）（１）ＢＣＡＴ１、（２）ＩＫＺＦ１、（４）ＧＲＡＳＰ及び（５）ＣＡＨＭ
の２ｋｂ上流を含む、遺伝子領域である。

本態様のさらに別のさらなる実施形態では、スクリーニングして探る遺伝子マーカーパネルは、
（ｉ）Ｈｇ１９座標
（１）ｃｈｒ１２：２４９６２９５８．．２５１０２３９３
（２）ｃｈｒ７：５０３４４３７８．．．５０４７２７９８
（３）ｃｈｒ６：３９１７３９．．４１１４４３
（４）ｃｈｒ１２：５２４００７４８．．５２４０９６７１；及び
（５）ｃｈｒ６：１６３８３４０９７．．１６３８３４９８２
により定義される、転写開始部位の２ｋｂ上流を含む、ＤＮＡ領域、又は
（ｉｉ）（１）ＢＣＡＴ１、（２）ＩＫＺＦ１、（３）ＩＲＦ４、（４）ＧＲＡＳＰ及び（５）ＣＡＨＭ
の２ｋｂ上流を含む、遺伝子領域である。

これらの態様及び実施形態に従えば、さらに別の実施形態において、前記対照レベルは非新生物レベルである。

一実施形態では、前記方法は、前記ＤＮＡ領域のいずれか１つがより高いレベルのメチル化を示す生体試料を同定することを対象とする。

別の実施形態では、前記方法は、前記ＤＮＡ領域のうちの２つ又は３つ以上がより高いレベルのメチル化を示す生体試料を同定することを対象とする。

さらに、別の実施形態では、前記大腸組織は好ましくは結腸直腸組織である。

さらに別の実施形態では、新生物は癌腫などの悪性である。

さらなる実施形態では、新生物は腺腫などの非悪性である。

これらの遺伝子領域のメチル化についてスクリーニングすることに関して、アッセイは、本明細書に収載されている特定の領域（遺伝子の「プラス」鎖に相当する）又は相補的「マイナス」鎖のいずれかをスクリーニングするように設計できることを理解しておくべきである。本明細書に提供される染色体座標に基づいてどの鎖を解析するかを選び、その鎖を標的にすることは当業者の技術の十分に範囲内である。いくつかの状況では、アッセイは両方の鎖をスクリーニングするように確立することができる。

マーカーの特定化されたパネルについてもっぱらスクリーニングしてもよいし、又は他のＤＮＡ高メチル化マーカー、他のＲＮＡ発現レベルマーカー若しくは他のタンパク質マーカーなどの他のマーカーについてさらにスクリーニングすることを選択してもよいことは理解しておくべきである。これらの他のマーカーは、たとえば、問題の患者の健康状態に関して追加の情報を提供することもある。

本発明をいかなる１つの理論又は作用機序にも限定することなく、これらのＤＮＡ領域全域でメチル化レベルを測定することは大腸新生物状態の診断に役立つが、別々のサブ領域は、これらのサブ領域が結腸直腸がんなどの大腸新生物において頻繁に高メチル化されている高密度のＣｐＧジヌクレオチドを含有するので、これに関しては特に有用であることが確定されている。この発見によりこれらのサブ領域は解析のために特に有用な標的になっている。なぜならば、解析を必要とするＤＮＡの領域が短くなりよりはっきりと定義されるようになり、しかもさらに、高メチル化の存在又は非存在に関して、これらの領域からの結果が、解析がＤＮＡ領域全体にわたって実施される場合に得られるよりも著しく決定的な結果をもたらすことの両方のせいでスクリーニング過程が簡略化されるからである。したがって、この発見はスクリーニング過程を簡略化し、しかも大腸新生物診断の感度と特異性を増大させる。

本発明をいかなる１つの理論又は作用機序にも限定することなく、当業者であれば遺伝子マーカーごとの１つ又は複数のサブ領域をスクリーニングしてもよい。

一実施形態では、選択された遺伝子マーカーごとに試験されるメチル化マーカーサブ領域は、
（１）配列番号１若しくは配列番号２により定義されるＢＣＡＴサブ領域又は対応するマイナス鎖；
（２）配列番号３若しくは配列番号４により定義されるＩＫＺＦ１サブ領域又は対応するマイナス鎖；
（３）配列番号５により定義されるＩＲＦ４サブ領域又は対応するマイナス鎖；
（４）配列番号６若しくは７により定義されるＧＲＡＳＰサブ領域又は対応するマイナス鎖；及び
（５）配列番号８により定義されるＣＡＨＭサブ領域又は対応するマイナス鎖
である。

本発明をどれか１つの理論又は作用機序に限定せずに、ＤＮＡメチル化は細菌、植物、及び動物において普遍的である。ＤＮＡメチル化は、細胞分裂のラウンドにわたり安定しているＤＮＡの化学修飾の一種であるが、生物の根底にあるＤＮＡ配列の変化を伴わない。クロマチン及びＤＮＡ修飾は、エピジェネティクスの２つの重要な特徴であり、細胞分化の過程に関与しており、細胞に同じゲノム物質を含有しているのにもかかわらず異なる特徴を安定的に維持させる。真核生物では、ＤＮＡメチル化はシトシンピリミジン環の番号５炭素でのみ起こる。哺乳動物では、ＤＮＡメチル化はＣｐＧジヌクレオチドのシトシンの番号５炭素で大部分起こる。ＣｐＧジヌクレオチドはおよそ１％のヒトゲノムを構成する。

すべてのＣｐＧの７０〜８０％はメチル化されている。ＣｐＧは、多くの遺伝子の５’調節領域に存在しメチル化されていないことが多い「ＣｐＧアイランド」と呼ばれるクラスターにグループ化されていることがある。がんなどの多くの疾患過程では、遺伝子プロモーター及び／又はＣｐＧアイランドは、遺伝性の転写サイレンシングに付随する異常な高度メチル化を獲得する。ＤＮＡメチル化は遺伝子の転写に２つの方法で影響を与え得る。第一に、ＤＮＡのメチル化は、それ自体が転写タンパク質の遺伝子への結合を物理的に阻害し、したがって転写を遮断することがある。第二に、メチル化されたＤＮＡには、メチル−ＣｐＧ−結合ドメインタンパク質（ＭＢＤ）として知られるタンパク質が結合し得る。次に、ＭＢＤタンパク質は、ヒストンデアセチラーゼ、及びヒストンを修飾しそれによりサイレントクロマチンと呼ばれる緻密で不活性なクロマチンを形成することができる他のクロマチン再構築タンパク質などの追加のタンパク質を遺伝子座に動員する。ＤＮＡメチル化とクロマチン構造間のこの連関は非常に重要である。特に、メチル−ＣｐＧ−結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）の喪失はレット症候群に関与しており、メチル−ＣｐＧ−結合ドメインタンパク質２（ＭＢＤ２）はがんにおいて高度メチル化された遺伝子の転写サイレンシングを媒介する。

ヒトでは、ＤＮＡメチル化のプロセスは、３種の酵素、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１、３ａ及び３ｂ（ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３ａ、ＤＮＭＴ３ｂ）により実行される。ＤＮＭＴ３ａ及びＤＮＭＴ３ｂは、発生の初期にＤＮＡメチル化パターンを設定する新規のメチルトランスフェラーゼであると考えられている。ＤＮＭＴ１は、ＤＮＡ複製中ＤＮＡメチル化パターンを娘鎖にコピーすることに関与している提唱されたメインテナンスメチルトランスフェラーゼである。ＤＮＭＴ３Ｌは、その他のＤＮＭＴ３に相同であるが触媒活性がないタンパク質である。代わりに、ＤＮＭＴ３Ｌは、ＤＮＡに結合する新規のメチルトランスフェラーゼの能力を増加させて、その活性を刺激することにより新規のメチルトランスフェラーゼを補助する。最後に、ＤＮＭＴ２は「謎の」ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ相同体として同定されており、すべてのＤＮＡメチルトランスフェラーゼに共通の１０個の配列モチーフすべてを含有するが、ＤＮＭＴ２はＤＮＡをメチル化しないことがあるが、代わりに、小型ＲＮＡをメチル化することが示されている。

したがって、「メチル化状態」は、ＤＮＡ領域内の特定のヌクレオチド（複数可）でのメチル化の存在、非存在及び／又は量への言及として理解されるべきである。特定のＤＮＡ配列のメチル化状態（たとえば、本明細書に記載されるＤＮＡ領域）は、前記配列におけるすべての塩基のメチル化状態を示すことができる、又は前記配列内の塩基対のサブセットのメチル化状態（たとえば、シトシンの、若しくは１つ若しくは複数の特定の制限酵素認識配列のメチル化状態）を示すことができる、或いは前記配列のどこでメチル化が起きているかについての正確な情報を与えることなく、前記配列内の領域メチル化密度に関する情報を示すことができる。メチル化状態は、任意選択で、「メチル化値」により表す又は示すことができる。メチル化値は、たとえば、メチル化依存性制限酵素での制限消化に続いて存在する無傷のＤＮＡの量を定量化することにより生み出すことができる。この例では、ＤＮＡ中の特定の配列が定量的ＰＣＲを使用して定量化される場合は、偽の処理をされた対照にほぼ等しい鋳型ＤＮＡの量は、前記配列が高度にメチル化されていないことを示し、偽の処理をされた試料において存在するよりも鋳型の量が実質的に少ないことは前記配列でのメチル化されたＤＮＡの存在を示している。したがって、たとえば、上記の例由来の値、すなわち、メチル化値はメチル化状態を表し、したがって、メチル化状態の定量的指標として使用することが可能である。試料中の配列のメチル化状態を閾値と比較することが望ましい場合、このことは特に有用である。

本発明の方法は、生体試料の特定のＤＮＡ領域のメチル化レベルとこれらのＤＮＡ領域の対照メチル化レベルとの比較に基づいている。「対照レベル」とは「正常レベル」であり、新生物ではない又はアッセイのためにＤＮＡを単離し得る別の生体試料における、対応する大腸細胞又は細胞集団のＤＮＡ領域のメチル化レベルである。

正常な（又は「非新生物の」）メチル化レベルは、検査の対象である同一個体由来の非新生物組織を使用して決定し得る。しかし、これは関係する個体に対して極めて侵襲的になり得ることは認識されると考えられ、したがって、問題の患者以外の個体から得られる個々の又は集団の結果を反映する標準結果に対して検査結果を解析するほうが都合がよい可能性がある。この後者の形態の分析は、実際、好ましい分析方法である。なぜならば、この方法は対象の試験試料である単一の生体試料の収集及び分析を必要とするキットの設計を可能にするからである。正常なメチル化レベルを与える標準結果は、当業者には周知と考えられる任意の適切な手段により計算し得る。たとえば、正常組織の集団は、本発明の遺伝子のメチル化レベルの点から評価し、それにより将来の試験試料すべてを分析する際の基準となる標準値又は値の範囲を与えることができる。正常レベルは、特定のコホートの対象から及びそのコホート由来の試験試料に関して使用するために決定し得ることも理解されるべきである。したがって、年齢、性別、民族性又は健康状態などの特徴の点で異なるコホートに対応するいくつかの標準値又は範囲を決定し得る。前記「正常レベル」は、別々のレベル又はある範囲のレベルでもよい。正常レベルと比べた対象遺伝子のメチル化レベルの増加は、組織が新生物であることを示している。

用語「メチル化」は、核酸、たとえば、ゲノムＤＮＡの領域においてＤＮＡメチルトランスフェラーゼ酵素の作用によりシトシン塩基（複数可）に付加されたメチル基の存在を意味すると解釈するものとする。本明細書に記載されるように、核酸のメチル化のレベル又は程度を決定するための当業者に公知の方法がいくつか存在する。

「より高いレベル」は、診断された対象中に、対照試料中よりも多くの数のメチル化されたＣｐＧジヌクレオチドが存在する、すなわち、特定のＣｐＧ部位でメチル化されたＤＮＡ分子の割合がより高い又は対象中にメチル化された個別のＣｐＧ部位の数が多いことを意味する。用語「増強された」又は「増加された」は用語「より高い」と互換的に使用されると理解されるべきである。

「より高いレベル」のメチル化を検出することに関して、いくつかの状況では正常／対照レベルは実際にはいかなる検出可能なメチル化も存在しないことに対応し、新生物レベルはメチル化が存在することそれ自体に対応することを理解するべきである。この状況では、その解析には定量化の方策が必ず必要になる対照レベルのメチル化と比べてメチル化レベルを評価することよりもむしろ単にメチル化の存在についてスクリーニングするだけ（すなわち、定性的評価のみ）でよいので、診断法は比較的簡単である。本発明を全く限定せずに、いくつかのマーカーという文脈では、新生物が発症するときのそのマーカーのメチル化の変化はメチル化の検出不可能なレベルから検出可能なメチル化の存在への移行であることが、たとえば、血液由来の試料において観察される。これらの状況では、試験試料をスクリーニングしてメチル化の存在又は非存在を判定するだけでよい比較的簡単な定性的評価が可能になる。本明細書で提供される定義という文脈では、「より高いレベル」への言及は、マーカーのメチル化のレベルの相対的増加又は以前は明白なものがなかったメチル化の発症の両方を包含する。上文に詳述したように、対照レベルは患者ごとに新たに評価することもあれば、すべての試験試料を評価する対照となる標準結果が存在することもある。メチル化が対象のマーカー上に存在しないことが分かっている場合、対照レベルはメチル化が非存在であり、それにより「より高いレベル」とはメチル化のいかなる量であれその存在であるために、メチル化の存在又は非存在についてスクリーニングするだけでよい。

本発明は、対象における新生物の診断に役立つと見なされるメチル化された残基の正確な数により限定されるべきではない。なぜならば、患者試料間のある程度の変動が存在することになるからである。本発明は、メチル化された残基の位置決めによって限定されることもない。

にもかかわらず、これらのサブ領域内の高メチル化を受ける多くの特定のシトシン残基が同定されてきた。これらの残基は、配列番号１及び２により定義されるＬＯＣ１００５２６８２０領域に位置付けられる。別の実施形態では、したがって、これらの残基又は反対のＤＮＡ鎖上のｎ＋１位の対応するシトシンのうちの１つ又は複数のメチル化状態を評価することに特に向けられるスクリーニング法を用いることが可能である。

この目的のために、この点に関して同定されているシトシン残基は表１に詳述されている。これら個々の残基はＨｇ１９を参照することにより番号付けがされており、これは上文に収載されている特定のサブ領域の番号付けとも一致していて、サブ領域ごとの座標番号付けが配列表に提供している対応するサブ領域配列に適用される場合はさらに同定することが可能になることを当業者であれば認識するべきである。これらの残基はサブ領域ＤＮＡという文脈で同定されていることを理解すべきである。しかし、サブ領域自体の外側でしかしサブ領域が由来するもっと大きなＤＮＡ領域内で高メチル化されている他の残基も存在する。したがって、これら特定化された残基は、本明細書で開示されるＤＮＡ領域及びサブ領域という文脈内で高メチル化を受ける個々のシトシン残基の特に有用なサブセットを表す。これらの個々の残基は、それが存在するＤＮＡ領域に従って下では分類されている。これらのＤＮＡ領域は、Ｈｇ１９染色体座標と遺伝子領域名の両方を参照することにより同定される。

本発明の方法がＧＲＡＳＰのメチル化を解析することを含む限り、対象残基は

又は反対のＤＮＡ鎖上のｎ＋１位での対応するシトシンである。

本発明の方法がＣＡＨＭを解析することを含む限り、対象残基は

本発明の方法がＩＫＺＦ１を解析することを含む限り、対象残基は

本発明の方法がＩＲＦ４を解析することを含む限り、対象残基は

本発明の検出法は任意の適切な生体試料で実施することが可能である。このために、「生体試料」への言及は、細胞物質、生体液（たとえば、血液）、糞便、組織生検標本、外科的標本又は動物の身体に導入されそれに続いて取り除かれた（たとえば、浣腸液から回収された溶液などの）液体などの、しかしこれらの限定されない動物由来の生体物質の任意の試料への言及として理解されるべきである。本発明の方法に従って試験される生体試料は、直接試験することもあれば、試験に先立ってある種の処理を必要とすることもある。たとえば、生検又は外科的試料は試験に先立って均質化を必要とすることもあれば、個々の遺伝子の質的発現レベルのインサイツ試験のためにセクショニングを必要とすることもある。代わりに、細胞試料は試験に先立って透過処理を必要とすることもある。さらに、生体試料が液体形態ではない限り、（そのような形態が試験のために必要であれば）前記生体試料は、試料を動態化するためにバッファーなどの試薬の添加を必要とすることもある。

対象のＤＮＡ領域が生体試料中に存在する限り、生体試料は直接試験してもよいし、さもなければ生体試料中に存在する核酸のすべて若しくは一部を試験に先立って単離してもよい。さらに別の例では、試料は部分的に精製される、又は分析に先立って他の方法で濃縮されてもよい。たとえば、生体試料が極めて多様な細胞集団を含む限り、特定の対象の亜集団について濃縮することが望ましいこともある。標的細胞集団又はそこに由来する分子を試験に先立って処理する、たとえば、生ウイルスを不活化することは本発明の範囲内である。生体試料は新たに収穫してもよく、又は試験に先立って保存していてもよく（たとえば、凍結により）、若しくは他の方法で試験に先立って処理してもよい（培養を受けることによりなど）ことも理解されるべきである。

本明細書に開示される方法に従って試験するためにはどのような種類の試料がもっとも適切なのかの選択は、状況の性質に依存することになる。好ましくは、前記試料は便（糞便）試料、浣腸水、外科的切除、組織生検又は血液試料（たとえば、全血、血清又は血漿）である。

さらに好ましくは、前記生体試料は血液試料、生検試料又は糞便試料である。

上文に詳述されるように、本発明は大腸に位置する新生物細胞又は細胞集団についてスクリーニングするように設計されている。したがって、「細胞又は細胞集団」への言及は、個々の細胞又は細胞の群への言及として理解されるべきである。前記細胞の群は、細胞の拡散集団、細胞懸濁液、細胞の被包性集団又は組織の形態をとる細胞の集団のこともある。

アデノーマ又は腺癌などの新生物の「発症」への言及は、異形成を示す個体の１つ又は複数の細胞への言及として理解されるべきである。この点に関して、アデノーマ又は腺癌は、多量の異形成細胞が発生している点でよく発達していることがある。代わりに、アデノーマ又は腺癌は、比較的少数の異常な細胞分裂のみが診断時に起きている点でごく初期段階であることもある。本発明は、アデノーマ又は腺癌などの新生物の発生の個体の素因の評価までにも及ぶ。本発明をいかなる点でも限定せずに、変化したメチル化レベルは、アデノーマ若しくは腺癌又は別のアデノーマ若しくは腺癌の将来の発生などの、新生物を発症する個体の素因を示していることがある。

好ましい方法は、新生物発生又はその素因を診断する目的でメチル化レベルを評価することであるが、前記メチル化のレベルにおける逆の変化の検出は、場合によっては、たとえば、アデノーマ又は腺癌の発生などの新生物状態を調節することに向けられる治療又は予防処置の有効性をモニターするためには望ましいこともある。たとえば、メチル化レベルの上昇が、個体がアデノーマ又は腺癌の発生により特徴付けられる状態を発症したことを示す場合、治療的処置レジメンの開始に続くメチル化レベルの減少についてのスクリーニングは、新生物細胞の排除に成功したことを示すのに利用し得る。別の例では、この方法を使用して腫瘍の全縁が取り除かれたかどうかを確定するために腫瘍切片の縁の組織を試験することができる。

したがって、本方法は、疾病リスクの診断、予後、分類、予測、疾病の再発の検出、いくつかの種類の新生物の治療の選択及び新生物のモニタリングに使用することが可能である。原発、転移性及び再発がんなどのいかなる進行段階のがんも検出することが可能である。

本発明は、哺乳動物（たとえば、ヒト）が大腸の新生物を有するかどうか、哺乳動物から採取した生体試料が新生物細胞若しくは新生物細胞由来のＤＮＡを含有するかどうかを確定する、哺乳動物が新生物を発症しているリスク若しくは可能性を推定する、抗がん治療の効力をモニターする、又はがんを有する哺乳動物における適切な抗がん治療を選択するための方法を提供する。そのような方法は、本明細書に記載されるＤＮＡ領域において新生物細胞が正常細胞とは異なるメチル化状態を有することの決定に基づいている。したがって、細胞が本明細書に記載されるＤＮＡ領域において差次的にメチル化された配列を含有するかどうかを確定することにより、細胞が新生物であると決定することが可能である。

本発明の方法は、新生物を有することが知られている若しくは疑われる個体を評価するために、又は常用の臨床試験として、すなわち、必ずしも新生物を有すると疑われるわけではない個体において使用することが可能である。追加の診断アッセイを実施して、個体における新生物の状態を確認することができる。

さらに、本方法を使用して処置経過の効力を評価し得る。たとえば、抗がん治療の効力は、がんに罹っている哺乳動物において本明細書に記載される配列のＤＮＡメチル化を時間をかけてモニターすることにより、評価することができる。たとえば、治療前に又は治療の早期に哺乳動物から採取した試料中のレベルと比べて、治療に続いて哺乳動物から採取した生体試料における本発明の診断配列のいずれかでのメチル化の減少又は非存在は、有効な治療であることを示している。

したがって、本発明の方法は、１回限りの検査として又は新生物発生の危険があると考えられる個体の継続的モニターとして又は新生物発生を阻害する若しくは他の方法で遅延することに向けられる治療的若しくは予防的処置レジメンの有効性のモニターとして有用である。これらの状況では、いずれか１つ又は複数の種類の生体試料におけるメチル化レベルのモジュレーションを位置付けることは、個体の状態又は現在使用されている治療的若しくは予防的レジメンの有効性についての価値ある指標である。したがって、本発明の方法は、その正常レベル（上文に定義されている）と比べて、又は個体の生体試料から確定された１つ若しくは複数の以前のメチル化レベルと比べて、前記個体におけるメチル化レベルの増加又は減少についてモニターすることにまで及ぶと理解されるべきである。

新生物を検出するための方法は、１つ又は複数の他のがん関連ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の検出を含むことができる。したがって、本発明の方法によるメチル化の検出は、単独で又は新生物の診断若しくは予後のための他のスクリーニング法と組み合わせて使用することが可能である。

ＤＮＡメチル化を検出するためのいかなる方法も、本発明の方法において使用することができる。いくつかの方法が、原発組織試料における又は血液、尿、糞便若しくは唾液などの患者試料における特定の遺伝子座での差次的にメチル化されたＤＮＡの検出に利用することが可能である（Kristensen and Hansen Clin Chem. 55:1471-83, 2009; Ammerpohl et al. Biochim Biophys Acta. 1790:847-62, 2009; Shames et al. Cancer Lett. 251:187-98, 2007; Clark et al. Nat Protoc. 1:2353-64, 2006に概説されている）。標的遺伝子のＤＮＡメチル化の割合又は程度の分析では、ＤＮＡは通常、亜硫酸水素ナトリウムで処理され、対象の領域は、ＤＮＡのメチル化状態とは無関係に増幅することになるプライマー及びＰＣＲ条件を使用して増幅される。次に、全体のアンプリコン又は個々のＣｐＧ部位のメチル化は、ピロシーケンス、制限酵素消化（ＣＯＢＲＡ）を含む塩基配列決定により又は融解曲線解析により評価することが可能である。代わりに、特定のＣｐＧ部位でのメチル化の分析のためのライゲーションベースの方法を使用し得る。腫瘍から体液中に放出された異常にメチル化されたＤＮＡの検出はがん診断の手段として開発中である。ここでは、高度メチル化された配列の場合、メチル化されていない正常細胞ＤＮＡの背景からのメチル化されたＤＮＡ配列の選択的増幅を可能にする感度の良い方法を使用する必要がある。亜硫酸水素塩処理されたＤＮＡに基づくそのような方法には、たとえば、メチル化選択ＰＣＲ（ＭＳＰ）、ＨｅａｖｙｍｅｔｈｙｌＰＣＲ、ヘッドループ（Ｈｅａｄｌｏｏｐ）ＰＣＲ及びヘルパー依存性（Ｈｅｌｐｅｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）連鎖反応（ＰＣＴ／ＡＵ２００８／００１４７５）が含まれる。

手短に言えば、いくつかの実施形態では、メチル化を検出するための方法は、ゲノムＤＮＡを無作為に剪断する又は無作為に断片化し、メチル化依存性又はメチル化感受性制限酵素でＤＮＡを切断し、それに続いて切断された又は切断されていないＤＮＡを選択的に同定する及び／又は分析することを含む。選択的同定には、たとえば、切断されたＤＮＡと切断されていないＤＮＡを分離し（たとえば、サイズにより）、切断された又は代わりに切断されていない対象の配列を定量化することを含むことができる。たとえば、米国特許第７，１８６，５１２号を参照されたい。代わりに、前記方法は、制限酵素消化後無傷のＤＮＡを増幅し、それによって増幅された領域において制限酵素により切断されなかったＤＮＡのみを増幅することを包含することができる。たとえば、米国特許出願第１０／９７１，９８６号、米国特許出願第１１／０７１，０１３号及び米国特許出願第１０／９７１，３３９号を参照されたい。いくつかの実施形態では、増幅は、遺伝子特異的であるプライマーを使用して実施することができる。代わりに、アダプターを無作為に断片化されたＤＮＡの端部に付加することができ、前記ＤＮＡはメチル化依存性又はメチル化感受性制限酵素で消化することができ、無傷のＤＮＡは前記アダプター配列にハイブリダイズするプライマーを使用して増幅することができる。この場合、ＤＮＡの増幅されたプールにおいて特定の遺伝子の存在、非存在又は量を決定する第２のステップを実施することができる。いくつかの実施形態では、前記ＤＮＡはリアルタイム定量的ＰＣＲを使用して増幅される。

いくつかの実施形態では、前記方法は、ゲノムＤＮＡの集団内の標的配列における平均メチル化密度を定量化することを含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、遺伝子座における潜在的制限酵素切断部位の少なくとも一部のコピーが切断されないままであることを可能にする条件下で、ゲノムＤＮＡをメチル化依存性制限酵素又はメチル化感受性制限酵素に接触させ、前記遺伝子座の無傷のコピーを定量化し、増幅された産物の量を対照ＤＮＡのメチル化の量を表す対照値と比較し、それによって前記対照ＤＮＡのメチル化密度と比べた前記遺伝子座における平均メチル化密度を定量化することを含む。

ＤＮＡの遺伝子座のメチル化の量は、前記遺伝子座を含むゲノムＤＮＡの試料を提供し、前記ＤＮＡをメチル化感受性又はメチル化依存性である制限酵素で切断し、次に無傷のＤＮＡの量を定量化する又は対象のＤＮＡ遺伝子座で切断されたＤＮＡの量を定量化することにより決定することができる。無傷の又は切断されたＤＮＡの量は、前記遺伝子座を含有するゲノムＤＮＡの最初の量、前記遺伝子座におけるメチル化の量、及び前記ゲノムＤＮＡにおいてメチル化されている遺伝子座におけるヌクレオチドの数（すなわち、割合）に依存することになる。ＤＮＡ遺伝子座におけるメチル化の量は、無傷のＤＮＡ又は切断されたＤＮＡの量を同様な処理を受けたＤＮＡ試料における無傷のＤＮＡ又は切断されたＤＮＡの量を表す対照値と比較することにより決定することができる。対照値は、メチル化されたヌクレオチドの既知の又は予想される数を表すことができる。代わりに、対照値は、別の（たとえば、正常な、非疾患）細胞における同じ遺伝子座又は第二の遺伝子座由来の無傷の又は切断されたＤＮＡの量を表すことができる。

遺伝子座における潜在的制限酵素切断部位の少なくとも一部のコピーが切断されないままであることを可能にする条件下で、少なくとも１つのメチル化感受性又はメチル化依存性制限酵素を使用し、それに続いて残っている無傷のコピーを定量化し、その量を対照と比較することにより、遺伝子座の平均メチル化密度を決定することができる。メチル化感受性酵素は、その認識配列がメチル化されていなければＤＮＡを切断する酵素であり、メチル化依存性酵素は、その認識配列がメチル化されているとＤＮＡを切断する。メチル化感受性制限酵素を、遺伝子座における潜在的制限酵素切断部位の少なくとも一部のコピーが切断されないままであることを可能にする条件下で、ＤＮＡ遺伝子座のコピーに接触させるならば、残っている無傷のＤＮＡはメチル化密度に正比例することになり、したがって、対照と比較して、試料中の遺伝子座の相対的メチル化密度を決定し得る。同様に、メチル化依存性制限酵素を、遺伝子座における潜在的制限酵素切断部位の少なくとも一部のコピーが切断されないままであることを可能にする条件下で、ＤＮＡ遺伝子座のコピーに接触させるならば、残っている無傷のＤＮＡはメチル化密度に反比例することになり、したがって、対照と比較して、試料中の遺伝子座の相対的メチル化密度を決定し得る。そのようなアッセイは、たとえば、米国特許出願第１０／９７１，９８６号に開示されている。

上記方法のためのキットは、たとえば、メチル化依存性制限酵素、メチル化感受性制限酵素、増幅（たとえば、ＰＣＲ）試薬、プローブ及び／又はプライマーのうちの１つ又は複数を含むことができる。

定量的増幅法（たとえば、定量的ＰＣＲ又は定量的線形増幅）を使用して、制限消化に続いて、増幅プライマーが隣接する遺伝子座内の無傷のＤＮＡの量を定量化することができる。定量的増幅の方法は、たとえば、米国特許第６，１８０，３４９号、米国特許第６，０３３，８５４号及び米国特許第５，９７２，６０２号、並びにたとえば、Gibson et al., Genome Research 6:995-1001 (1996); DeGraves, et al., Biotechniques 34(1):106-10, 112-5 (2003); Deiman B, et al., Mol. Biotechnol. 20(2):163-79 (2002)に開示されている。増幅は「リアルタイム」でモニターし得る。

ＤＮＡメチル化を検出するための追加の方法は、ＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する前及び後のゲノム配列決定を含むことができる。たとえば、Frommer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1827-1831 (1992)を参照されたい。亜硫酸水素ナトリウムをＤＮＡに接触させると、非メチル化シトシンはウラシルに変換され、メチル化されたシトシンは改変されない。

いくつかの実施形態では、亜硫酸水素塩変換ＤＮＡから増幅されたＰＣＲ産物の制限酵素消化を使用して、ＤＮＡメチル化を検出する。たとえば、Sadri & Hornsby, Nucl. Acids Res. 24:5058-5059 (1996); Xiong & Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534 (1997)を参照されたい。

いくつかの実施形態では、メチル化特異的ＰＣＲ（「ＭＳＰ」）反応は、単独で又はＤＮＡメチル化を検出する他の方法と組み合わせて使用される。ＭＳＰアッセイは、亜硫酸水素ナトリウムによるＤＮＡの最初の改変、すべての非メチル化であるがメチル化されないシトシンのウラシルへの変換、及びメチル化対非メチル化ＤＮＡに特異的なプライマーを用いたそれに続く増幅を必要とする。Herman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826 (1996)；米国特許第５，７８６，１４６号を参照されたい。

いくつかの実施形態では、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイは、単独で又はＤＮＡメチル化を検出する他の方法と組み合わせて使用される（Eads et al., Cancer Res. 59:2302-2306 (1999)参照）。手短に言えば、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔプロセスでは、ゲノムＤＮＡは亜硫酸水素ナトリウム反応において変換される（亜硫酸水素塩プロセスは非メチル化シトシン残基をウラシルに変換する）。次に、対象のＤＮＡ配列の増幅は、ＣｐＧジヌクレオチドにハイブリダイズするＰＣＲプライマーを使用して実施される。メチル化されたＤＮＡの亜硫酸水素塩変換から生じる配列（又は代わりに非メチル化配列）のみにハイブリダイズするプライマーを使用することにより、増幅は前記プライマーがハイブリダイズする配列のメチル化状態を示すことができる。さらに、増幅産物は、非メチル化ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理から生じる配列に特異的に結合するプローブを用いて検出することができる。必要であれば、プライマーとプローブの両方を使用してメチル化状態を検出することが可能である。したがって、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔで使用するためにキットは、亜硫酸水素ナトリウム及び、亜硫酸水素塩で処理されているメチル化されたＤＮＡと非メチル化ＤＮＡを区別するプライマー又は検出可能的に標識されたプローブ（Ｔａｑｍａｎ又は分子ビーコンプローブを含むがこれらに限定されない）を含むことができる。他のキット成分は、たとえば、ＰＣＲバッファー、デオキシヌクレオチド及び熱安定ポリメラーゼを含むがこれらに限定されない、ＤＮＡの増幅に必要な試薬を含むことができる。

いくつかの実施形態では、Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ（メチル化感受性一塩基プライマー伸長）反応は、単独で又はＤＮＡメチル化を検出する他の方法と組み合わせて使用される（Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531 (1997)参照）。Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ法は、ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理、続いて一塩基プライマー伸長に基づいて特定のＣｐＧ部位でのメチル化の差を評価するための定量的方法である（Ｇｏｎｚａｌｇｏ＆Ｊｏｎｅｓ、上記参照）。手短に言えば、ゲノムＤＮＡを亜硫酸水素ナトリウムと反応させて、５−メチルシトシンは不変のままにして、非メチル化シトシンをウラシルに変換する。次に、目的の標的配列の増幅は、亜硫酸水素塩変換ＤＮＡに特異的なＰＣＲプライマーを使用して実施され、得られた産物は単離されて対象のＣｐＧ部位（複数可）でのメチル化分析のための鋳型として使用される。

Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ分析のための典型的な試薬（たとえば、典型的なＭｓ−ＳＮｕＰＥベースのキットに見られるような）は、特定の遺伝子（又はメチル化変更されたＤＮＡ配列又はＣｐＧアイランド）のためのＰＣＲプライマー；最適化されたＰＣＲバッファー及びデオキシヌクレオチド；ゲル抽出キット；正の対照プライマー；特定の遺伝子のためのＭｓ−ＳＮｕＰＥプライマー；反応バッファー（Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ反応のための）；並びに検出可能的に標識されたヌクレオチドを含むことができるが、これらに限定されない。さらに、亜硫酸水素塩変換試薬は、ＤＮＡ変性バッファー；スルホン化バッファー；ＤＮＡ回収試薬又はキット（たとえば、沈殿、限外濾過、親和性カラム）；脱スルホン化バッファー；及びＤＮＡ回収成分を含み得る。

追加のメチル化検出法には、メチル化ＣｐＧアイランド増幅（Toyota et al., Cancer Res. 59:2307-12 (1999)参照）、たとえば、米国特許出願公開第２００５／００６９８７９号；Rein, et al. Nucleic Acids Res. 26 (10): 2255-64 (1998); Olek, et al. Nat. Genet. 17(3): 275-6 (1997)；及びＰＣＴ出願公開ＷＯ００／７００９０に記載されている方法が含まれるが、これらに限定されない。

これらの一般的に記載されている方法のいくつかに関するさらに詳細な情報は以下に提供される、
（ａ）プローブ又はプライマー設計及び／又は生成
新生物の診断のための本明細書に記載されるいくつかの方法は、１つ又は複数のプローブ及び／又はプライマーを使用する。たとえば、ＰＣＲ又はハイブリダイゼーションにおいて使用するためのプローブ及び／又はプライマーを設計するための方法は当技術分野では公知であり、たとえば、Dieffenbach and Dveksler (Eds) (In: PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, NY, 1995)に記載されている。さらに、種々のアッセイのための最適プローブ及び／又はプライマーを設計するいくつかのソフトウェアパッケージ、たとえば、ｔｈｅＣｅｎｔｅｒｆｏｒＧｅｎｏｍｅＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．、ＵＳＡから入手可能なＰｒｉｍｅｒ３が公開されている。

明らかに、プローブ又はプライマーの潜在的使用はその設計中に検討するほうがよい。たとえば、プローブ又はプライマーがメチル化特異的ＰＣＲ又はリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）アッセイにおいて使用するために生成されるとすれば、３’端部（又はＬＣＲの場合は５’端部）のヌクレオチドは好ましくは核酸中のメチル化されたヌクレオチドに一致するほうがよい。

新生物に関連する配列の検出に有用なプローブ及び／又はプライマーは評価されて、ヘアピンを形成することも、セルフプライムすることも、（たとえば、検出アッセイにおいて使用される別のプローブ又はプライマーと）プライマーダイマーを形成することもないプローブ及び／又はプライマーを決定する。さらに、プローブ又はプライマー（又はその配列）は評価されて、それが標的核酸から変性する温度（すなわち、プローブ若しくはプライマーの融解温度又はＴｍ）を決定する場合が多い。Ｔｍを推定するための方法は当技術分野では公知であり、たとえば、Santa Lucia, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 1460-1465, 1995 or Bresslauer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 3746-3750, 1986に記載されている。

本発明のプローブ又はプライマーを生成する／合成するための方法は当技術分野では公知である。たとえば、オリゴヌクレオチド合成は、Gait (Ed) (In: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1984)に記載されている。たとえば、プローブ又はプライマーは、生物学的合成により（たとえば、制限エンドヌクレアーゼを用いた核酸の消化により）又は化学合成により得られる。短い配列では（約１００ヌクレオチドまで）、化学合成が好ましい。

もっと長い配列では、たとえば、Messing, Methods Enzymol, 101, 20-78, 1983により記載される一本鎖ＤＮＡのためのＭ１３の使用などの、分子生物学で用いられる標準複製法が有用である。オリゴヌクレオチド合成のための他の方法には、たとえば、リン酸トリエステル及びリン酸ジエステル法（Narang, et al. Meth. Enzymol 68: 90, 1979）及び支持体上での合成（Beaucage, et al. Tetrahedron Letters 22:1859-1862, 1981）並びにホスホロアミド酸法、Caruthers, M. H., et al., Methods in Enzymology, Vol. 154, pp. 287-314 (1988)、並びに“Synthesis and Applications of DNA and RNA,” S. A. Narang, editor, Academic Press, New York, 1987及びそこに引用される参考文献に記載される他の方法が含まれる。ロックド核酸（ＬＮＡ）を含むプローブは、たとえば、Nielsen et al. J. Chem. Soc. Perkin Trans., 1:3423, 1997; Singh and Wengel, Chem. Commun. 1247, 1998に記載される通りに合成される。その上、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含むプローブは、たとえば、Egholm et al., Am. Chem. Soc., 114:1895, 1992; Egholm et al., Nature, 365:566, 1993；及びOrum et al., Nucl. Acids Res., 21:5332, 1993に記載される通りに合成される。

（ｂ）ＤＮＡのメチル化感受性エンドヌクレアーゼ消化
一例では、試料中のメチル化の増加は、核酸が消化されるのに十分な条件下で一定量のメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ酵素で核酸を処理し、次に生成された断片を検出することを含むプロセスを使用して決定される。例となるメチル化感受性エンドヌクレアーゼには、たとえば、ＨｈａＩ又はＨｐａＩＩが含まれる。好ましくは、アッセイは、用いられるメチル化感受性酵素と同じ特異性を有するメチル化非感受性酵素で消化される内部標準を含む。たとえば、メチル化非感受性酵素ＭｓｐＩは、メチル化感受性酵素ＨｐａＩＩのイソ制限酵素である。

ハイブリダイゼーションアッセイフォーマット
一例では、核酸の消化は未消化核酸へのプローブ又はプライマーの選択的ハイブリダイゼーションにより検出される。代わりに、プローブは消化された核酸と未消化核酸の両方に選択的にハイブリダイズするが、たとえば、電気泳動により両方の形態の区別を促進する。ハイブリダイゼーションプローブへの選択的ハイブリダイゼーションを達成するのに適切な検出法には、たとえば、サザン又は他の核酸ハイブリダイゼーションが含まれる（Kawai et al., Mol. Cell. Biol. 14:7421-7427, 1994; Gonzalgo et al., Cancer Res. 57:594-599, 1997）。

適切なハイブリダイゼーション条件は、プローブを含む核酸二重鎖の融解温度（Ｔｍ）に基づいて決定される。いくつかの一般論を適用することは可能であるが、最適ハイブリダイゼーション反応条件はプローブごとに経験的に決定するほうがよいことは当業者であれば知っている。好ましくは、短いオリゴヌクレオチドプローブを用いるハイブリダイゼーションは、低いから中程度の厳密性で実施される。ＧＣリッチプローブ若しくはプライマー又はもっと長いプローブ若しくはプライマーの場合には、高厳密性ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄が好ましい。高厳密性は本明細書では、約０．１×ＳＳＣバッファー及び／若しくは約０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ若しくはさらに低い塩濃度において、並びに／又は少なくとも６５℃の温度若しくは同等の条件で実施されるハイブリダイゼーション及び／又は洗浄であると定義される。特定レベルの厳密性への本明細書での言及は、当業者には公知のＳＳＣ以外の洗浄／ハイブリダイゼーション溶液を使用する同等の条件を包含する。

本例に従えば、試験試料及び負の対照試料のために生成される断片の差異は対象が新生物を有することを示している。同様に、対照試料が、腫瘍、がん組織又はがん細胞若しくは前がん細胞のデータを含む場合、試験試料と対照試料間の類似性は、必ずしも絶対的同一性ではないとしても、陽性診断（すなわち、がん）を示している。

増幅アッセイフォーマット
別の例では、制限酵素により生成される断片は、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、逆ポリメラーゼ連鎖反応（ｉＰＣＲ）、インサイツＰＣＲ（Singer-Sam et al., Nucl. Acids Res. 18:687, 1990）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）又はサイクリングプローブ技術などの増幅システムを使用して検出される。

ＰＣＲの方法は当技術分野では公知であり、たとえば、McPherson et al., PCR: A Practical Approach. (series eds, D. Rickwood and B. D. Hames), IRL Press Limited, Oxford. pp 1-253, 1991により、及びDieffenbach (ed) and Dveksler (ed) (In: PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratories, NY, 1995)により記載されており、前記内容はそれぞれが参照によりその全体を組み込まれている。一般に、ＰＣＲでは、少なくとも約１８ヌクレオチド長、さらに好ましくは少なくとも２０〜３０ヌクレオチド長を含む２つの非相補的核酸プライマー分子は、核酸鋳型分子の異なる鎖にそのそれぞれのアニーリング部位でハイブリダイズされ、アニーリング部位に介在する鋳型の特定の核酸分子コピーは酵素的に増幅される。増幅産物は、たとえば、電気泳動及び核酸に結合する検出可能マーカーを用いる検出を使用して検出し得る。代わりに、オリゴヌクレオチドのうちの１つ又は複数は検出可能なマーカー（たとえば、フルオロフォア）で標識され、増幅産物は、たとえば、ライトサイクラー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、Ｍａｓｓ．、ＵＳＡ；ＲｏｃｈｅＡｐｐｌｉｅｄＳｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）を使用して検出される。

鎖置換増幅（ＳＤＡ）は、オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ及び制限エンドヌクレアーゼを利用して標的配列を増幅する。オリゴヌクレオチドは標的核酸にハイブリダイズされ、ポリメラーゼを使用してプライマーアニーリング部位に介在する領域のコピーを生成する。次に、コピーされた核酸と標的核酸の二重鎖は、コピーされた核酸の始まりの配列を特異的に認識するエンドヌクレアーゼで切れ目が入れられる。ＤＮＡポリメラーゼは切れ目を入れられたＤＮＡを認識し、同時に標的領域の別のコピーを生成して、すでに生成されている核酸を置換する。ＳＤＡの利点は、それが等温フォーマットで起こり、それによってハイスループット自動分析を促進することである。

サイクリングプローブ技術は、標的配列にハイブリダイズすることができるＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡを含むキメラ合成プライマーを使用する。標的配列にハイブリダイズすると、形成されたＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖はリボヌクレアーゼＨの標的となり、それによってプライマーを切断する。次に、切断されたプライマーは、たとえば、質量分析又は電気泳動により検出される。

メチル化感受性エンドヌクレアーゼ認識部位に隣接する又は近接しているプライマーでは、そのようなプライマーは新生物において高度メチル化されている部位のみに隣接して確実に診断増幅産物が生成されるようにすることが好ましい。この点に関して、増幅産物は制限部位が切断されない場合、すなわち、制限部位がメチル化される場合のみ生成されることになる。したがって、増幅産物の検出は対象のＣｐＧジヌクレオチド（複数可）がメチル化されていることを示している。

当業者には公知であるように、増幅産物の正確な長さは、プライマー間の距離に応じて変動する。明らかに、それぞれのジヌクレオチドがメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ部位の中に存在すれば、この形式の分析を使用して複数のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を確定し得る。これらの方法では、プライマーのうちの１つ又は複数を検出可能なマーカー、たとえば、蛍光標識（たとえば、Ｃｙ５又はＣｙ３）又は放射性同位元素（たとえば、^３２Ｐ）で標識して、増幅された核酸の急速検出を促進し得る。

増幅された核酸は、一般に、たとえば、未変性アガロースゲル電気泳動、未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動、質量分析、液体クロマトグラフィー（たとえば、ＨＰＬＣ又はｄＨＰＬＣ）又はキャピラリー電気泳動（たとえば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を使用して分析される。たとえば、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、質量分析（タンデム質量分析、たとえば、ＬＣＭＳ／ＭＳを含む）、バイオセンサー技術、エバネッセントファイバーオプティックス技術又はＤＮＡチップ技術（たとえば、国際公開第９８／４９５５７号パンフレット；国際公開第９６／１７９５８号パンフレット；Fodor et al., Science 767-773, 1991；米国特許第５，１４３，８５４号及び米国特許第５，８３７，８３２号、これら文献の内容はすべてが参照により本明細書に組み込まれる）などのハイスループット検出法は、本明細書に記載されるすべてのアッセイフォーマットのために特に好ましい。代わりに、核酸の増幅は、本明細書及び／又はたとえば、米国特許第６，１７４，６７０号に記載される融解曲線分析法を使用して絶えずモニターし得る（前記特許文献は参照により本明細書に組み込まれる）。

（ｃ）他のアッセイフォーマット
別の例では、試料におけるメチル化の増加は、核酸が消化されるのに十分な条件下で核酸を含有するクロマチンを一定量のデオキシリボヌクレアーゼＩで処理し、次に生成された断片を検出することを含むプロセスを実施することにより決定される。このアッセイフォーマットは、メチル化されたＤＮＡ、たとえば、高度メチル化されたＤＮＡを含有するクロマチンは、非高度メチル化ＤＮＡよりも密に閉ざされた立体構造を有し、結果として、デオキシリボヌクレアーゼＩによるエンドヌクレアーゼ消化に感受性が低いという理解に基づいている。

この方法に従えば、長さの異なるＤＮＡ断片は、非メチル化ＤＮＡと比べたメチル化されたＤＮＡのデオキシリボヌクレアーゼＩ消化により生成される。そのような異なったＤＮＡ断片は、たとえば、以前記載されたアッセイを使用して検出される。代わりに、ＤＮＡ断片は、基本的には、たとえば、Gregory and Feil, Nucleic Acids Res., 27, e32i-e32iv, 1999に記載されているＰＣＲ−ＳＳＣＰを使用して検出される。ＰＣＲ−ＳＳＣＰを本発明に適応させる際、新生物試料ではデオキシリボヌクレアーゼＩ消化に抵抗性であるが健康な／正常な対照又は健康な／正常な試験試料ではデオキシリボヌクレアーゼＩ消化に抵抗性ではない核酸中の１つ又は複数のＣｐＧジヌクレオチドに隣接する又は含む増幅プライマーを使用して、デオキシリボヌクレアーゼＩ生成される断片を増幅する。この場合、デオキシリボヌクレアーゼＩを使用した特定の核酸断片の生成は新生物の診断に役立つ。なぜならば、ＤＮＡは効率的には分解されないからである。これとは対照的に、健康な／正常な対象試料由来の鋳型ＤＮＡはデオキシリボヌクレアーゼＩの作用により分解され、結果として、増幅は別々の増幅産物を生成することができない。たとえば、ＰＣＲ−ｄＨＰＬＣなどのＰＣＲ−ＳＳＣＰに代わる方法も当技術分野では公知であり、本発明により企図されている。

（ｄ）非メチル化ＤＮＡの選択的変異誘発
別の方法では、試料中のメチル化の増加は、変異誘発を誘導するのに十分な条件下でＣｐＧジヌクレオチド内の非メチル化シトシン残基を選択的に変異させる一定量の化合物で核酸を処理することを含むプロセスを使用して決定される。

たとえば、亜硫酸水素の塩、たとえば、亜硫酸水素ナトリウム又は亜硫酸水素カリウムなどの好ましい化合物はシトシンをウラシル又はチミジンに変異させる（Frommer et al., 1992、上記参照）。ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理は、ＣｐＧジヌクレオチド内にはない又はメチル化を受けないＣｐＧジヌクレオチド内に位置するシトシン残基を含む、メチル化により保護されないシトシン残基を変異させることにより、メチル化されたシトシン残基を非メチル化シトシン残基と区別することが知られている。

配列ベースの検出
一例では、１つ若しくは複数の変異ヌクレオチドの存在又は変異配列の数は変異ＤＮＡの塩基配列決定により決定される。一形態の分析は、本明細書に記載される増幅反応、たとえば、ＰＣＲを使用して変異核酸を増幅することを含む。次に、増幅された産物は直接塩基配列決定される又はクローニングされ、クローニングされた産物は塩基配列決定される。ＤＮＡを塩基配列決定するための方法は当技術分野では公知であり、たとえば、ジデオキシ連鎖終止法又はマクサムギルバート法が含まれる（Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd Ed., CSHP, New York 1989) 又はZyskind et al., Recombinant DNA Laboratory Manual, (Acad. Press, 1988)参照）。

たとえば、亜硫酸水素塩などの化合物で核酸を処理することにより非メチル化シトシンがウラシル（したがって、増幅過程後にチミジン）に変異されるので、配列の分析によりメチル化されたヌクレオチドの存在又は非存在が決定される。たとえば、対照試料若しくは亜硫酸水素塩で処理されていない試料を使用して得られる配列又は対象の領域の既知のヌクレオチド配列を処理された試料と比較することにより、ヌクレオチド配列の差異の検出が促進される。対照又は未処理の試料と比べられた処理された試料におけるシトシンの部位で検出されたどんなチミン残基も、亜硫酸水素塩処理の結果としての変異により引き起こされると見なし得る。亜硫酸水素塩処理された核酸の塩基配列決定を使用するメチル化の検出に適した方法は、たとえば、Frommer et al., 1992、上記参照又はClark et al., Nucl. Acids Res. 22:2990-2997, 1994に記載されている。

別の方法では、亜硫酸水素塩処理された試料における変異した又は非変異ヌクレオチドの存在は、たとえば、Uhlmann et al., Electrophoresis, 23: 4072-4079, 2002に記載されているなどのピロシーケンスを使用して検出される。基本的に、この方法は、メチル化されているシトシンの部位に隣接する又は近い部位にハイブリダイズするプライマーを使用するリアルタイム塩基配列決定の一種である。ＤＮＡポリメラーゼの存在下でのプライマーと鋳型のハイブリダイゼーションに続いて、４種の改変されたデオキシヌクレオチド三リン酸のそれぞれがあらかじめ決められた分配順に従って別々に付加される。亜硫酸水素塩処理された試料に相補的である付加されるヌクレオチドのみが組み込まれ、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）が遊離される。次に、ＰＰｉは反応を推進し、検出可能レベルの光を発生する。そのような方法により、プライマーのハイブリダイゼーション部位に隣接する特定のヌクレオチドの種類を決定することができる。

固相ピロシーケンスの方法は当技術分野では公知であり、たとえば、Landegren et al., Genome Res., 8(8): 769-776, 1998に概説されている。そのような方法により、いくつかのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化のハイスループット検出が可能になる。

亜硫酸水素塩処理されたヌクレオチドの配列を決定するための関連する方法は、メチル化感受性一塩基プライマー伸長（Ｍｅ−ＳｎｕＰＥ）又はＳＮａＰｍｅｔｈである。適切な方法は、たとえば、Gonzalgo and Jones, 1997、上記参照又はUhlmann et al., Electrophoresis, 23:4072-4079, 2002に記載されている。メチル化されているシトシンの部位に隣接する核酸の領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが使用される。次に、このオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ及び亜硫酸水素塩処理に続いてこの部位に存在する考えられる塩基（すなわち、チミン又はシトシン）のうちのどちらか又はいずれにでも一致する遊離のヌクレオチド二リン酸又はジデオキシヌクレオチド三リン酸を用いるプライマー伸長プロトコールにおいて使用される。好ましくは、ヌクレオチド−二リン酸は検出可能なマーカー（たとえば、フルオロフォア）で標識される。プライマー伸長に続いて、非結合の標識されたヌクレオチド二リン酸は、たとえば、サイズ排除クロマトグラフィー若しくは電気泳動を使用して取り除かれる、又はたとえば、アルカリホスファターゼを使用して加水分解され、標識されたヌクレオチドのオリゴヌクレオチドへの取り込みが検出され、前記部位に存在する塩基が示される。

明らかに、他のハイスループット塩基配列決定法は本発明に包含されている。そのような方法には、たとえば、固相ミニシークエンシング（たとえば、Southern et al., Genomics, 13:1008-1017, 1992に記載されている）、又はＦＲＥＴを用いるミニシークエンシング（たとえば、Chen and Kwok, Nucleic Acids Res. 25:347-353, 1997に記載されている）が含まれる。

制限エンドヌクレアーゼベースのアッセイフォーマット
一方法では、非変異配列の存在は、基本的にXiong and Laird, 2001、上記参照に記載されている組合せ亜硫酸水素塩制限分析（ＣＯＢＲＡ）を使用して検出される。この方法は、非メチル化シトシン残基を選択的に変異させる化合物、たとえば、亜硫酸水素塩を用いた処理後メチル化された核酸と非メチル化核酸間の制限酵素認識部位の差異を利用する。

亜硫酸水素塩処理に続いて、メチル化され制限エンドヌクレアーゼ認識配列に含まれる１つ又は複数のＣｐＧジヌクレオチドを含む対象の領域は、本明細書に記載される増幅反応、たとえば、ＰＣＲを使用して増幅される。次に、増幅産物を、切断が起こるのに十分な時間及び条件下で、ＣｐＧジヌクレオチドの部位で切断する制限酵素に接触させる。制限部位はメチル化の存在又は非存在を示すように選択され得る。たとえば、制限エンドヌクレアーゼＴａｑＩは配列ＴＣＧＡを切断するが、非メチル化核酸の亜硫酸水素塩処理に続いて、配列はＴＴＧＡになり、結果として、切断されなくなる。次に、消化及び／又は未消化核酸は、たとえば、電気泳動及び／又は質量分析などの、当技術分野で公知の検出手段を使用して検出される。核酸の切断又は非切断は対象におけるがんを示している。明らかに、この方法は、がんの診断のための陽性読出し又は陰性読出しシステムにおいて用い得る。

陽性読出しアッセイフォーマット
一実施形態では、本発明のアッセイフォーマットは、たとえば、亜硫酸水素塩で処理された試料由来のＤＮＡが陽性シグナルとして検出される陽性読出しシステムを含む。好ましくは、健康な又は正常な対照対象由来の非高度メチル化ＤＮＡは検出されない又は微弱にしか検出されない。

好ましい実施形態では、対象試料におけるメチル化の増加は、
（ｉ）変異誘発を誘導するのに十分な条件下で非メチル化シトシン残基を選択的に変異させる一定量の化合物で核酸を処理し、それによって変異核酸を生成するステップ、
（ｉｉ）非変異核酸への選択的ハイブリダイゼーションが起こるような条件下でメチル化されたシトシン残基を含む配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むプローブ又はプライマーに核酸をハイブリダイズさせるステップ、及び
（ｉｉｉ）選択的ハイブリダイゼーションを検出するステップ
を含むプロセスを使用して決定される。

この状況では、用語「選択的ハイブリダイゼーション」は、非変異核酸へのプローブ又はプライマーのハイブリダイゼーションが、対応する変異配列への同じプローブ又はプライマーのハイブリダイゼーションよりも高い頻度若しくは速度で起こる、又は高い最大反応速度を有することを意味する。好ましくは、プローブ又はプライマーは、使用される反応条件下では変異（複数可）を担持する非メチル化配列にはハイブリダイズしない。

ハイブリダイゼーションベースのアッセイフォーマット
一実施形態では、ハイブリダイゼーションは、サザン、ドットブロット、スロットブロット又は他の核酸ハイブリダイゼーション手段を使用して検出される（Kawai et al., 1994、上記参照；Gonzalgo et al., 1997、上記参照）。適切なプローブ選択を条件として、そのようなアッセイフォーマットは、本明細書において上に一般的に記載されており、現在記載されている選択的変異誘発アプローチを準用する。

好ましくは、リガーゼ連鎖反応フォーマットを用いて、変異と非変異核酸の区別をする。リガーゼ連鎖反応（ＥＰ３２０，３０８及び米国特許第４，８８３，７５０号に記載されている）は、標的核酸に並置されるように標的核酸にアニールする少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプローブを使用する。リガーゼ連鎖反応アッセイでは、標的核酸は、診断プローブが実質的に標的核酸のみに結合したままである条件下で、標的配列、たとえば、１つ又は複数のメチル化されたＣｐＧジヌクレオチド（複数可）を含む核酸の診断部分に相補的である第一のプローブ（診断プローブ）、及び診断部分に近接しているヌクレオチド配列に相補的である第二のプローブ（近接プローブ）にハイブリダイズされる。診断及び近接プローブは、ハイブリダイゼーションの厳密性を調整して標的へのその選択的ハイブリダイゼーションが可能になるように、長さが異なり及び／又は異なる融解温度を有することができ、融解温度が高いほうのプローブはより高い厳密性でハイブリダイズされ、未結合及び／又は非選択的に結合したプローブを洗浄して取り除くことに続いて融解温度が低いほうのもう一方のプローブはより低い厳密性でハイブリダイズされる。次に、診断プローブと近接プローブは、たとえば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用してなどの共有結合的にライゲートされて、それによって標的配列に相補的であるより大きな標的プローブを生成し、ライゲートされないプローブはハイブリダイゼーション厳密性を変更することにより取り除かれる。この点に関して、ライゲートされなかったプローブは、ライゲートされたプローブよりも低い厳密性ハイブリダイゼーション条件下で選択的にハイブリダイズすることになる。したがって、長いほうのプローブを、好ましくは、ライゲーションに続いて短いほうのプローブにより与えられる増加した長さに起因するより高い厳密性でハイブリダイズさせるのに使用される厳密性と少なくとも同じくらいの高さの厳密性までハイブリダイゼーションの厳密性を高めることが可能である。

別の例では、標的−プローブ二重鎖を溶解し、解離したプローブを溶出し、標識（複数可）について試験することにより、標的配列の存在又は非存在を試験することができるように、プローブのうちの１つ又は両方は標識される。両方のプローブが標識される場合、異なるリガンドを使用してライゲートされたプローブと非ライゲートプローブの区別を可能にし、その場合、同じ溶出画分中に両方のプローブが存在すればライゲーション事象が確認される。標的核酸が、たとえば、サザンハイブリダイゼーション、スロットブロット、ドットブロット、又はマイクロチップアッセイフォーマットにおいて固体マトリックスに結合しているならば、診断と近接プローブの両方の存在は直接決定することが可能である。

メチル化特異的マイクロアレイ（ＭＳＯ）も変異と非変異配列を区別するのに有用である。適切な方法は、たとえば、Adorjan et al. Nucl. Acids Res., 30: e21, 2002に記載されている。ＭＳＯでは、変異と非変異核酸の両方を増幅させる増幅反応のための鋳型として、非メチル化シトシン残基を選択的に変異させる化合物（たとえば、亜硫酸水素塩）で処理されている核酸が使用される。増幅は、たとえば、フルオロフォア、たとえば、Ｃｙ３又はＣｙ５などの検出可能標識を含む少なくとも１つのプライマーを用いて実施される。

変異核酸の検出のためのマイクロアレイを生成するために、オリゴヌクレオチドは、たとえば、グラススライド上に、好ましくはある程度重複してスポットされる（たとえば、Golub et al., Science, 286:531-537, 1999に記載されている）。好ましくは、分析されるＣｐＧジヌクレオチドごとに、２つの異なるオリゴヌクレオチドが使用される。それぞれのオリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドのメチル化又は非メチル化状態を反映する配列Ｎ_２−１６ＣＧＮ_２−１６又はＮ_２−１６ＴＧＮ_２−１６（Ｎは対象のＣｐＧジヌクレオチドに隣接している又は並置しているヌクレオチドの数である）を含む。

次に、標識された増幅産物は一塩基差異の検出を可能にする条件下、マイクロアレイ上でオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせる。洗浄して未結合増幅産物を取り除くことに続いて、ハイブリダイゼーションは、たとえば、マイクロアレイスキャナーを使用して検出される。この方法は、多数のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を決定することを可能にするだけではなく、半定量的でもあり、分析されるそれぞれのＣｐＧジヌクレオチドでメチル化の程度を決定することが可能である。１つの試料においてメチル化のある程度の不均一性が存在し得るので、そのような定量化はがんの診断に役立ち得る。

増幅ベースのアッセイフォーマット
別の例では、ハイブリダイゼーションは、増幅システムを使用して検出される。メチル化特異的ＰＣＲフォーマットでは（ＭＳＰ；Herman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1992）、ハイブリダイゼーションは亜硫酸水素塩処理されたＤＮＡを増幅することを含むプロセスを使用して検出される。したがって、中程度及び／又は高厳密性条件下で非変異配列に特異的にアニールする１つ又は複数のプローブ又はプライマーを使用することにより、増幅産物はメチル化されたヌクレオチドを含む試料のみを使用して生成される。亜硫酸水素塩処理されたＤＮＡの混合物からのメチル化された又は非メチル化成分の選択的増幅のために提供される別のアッセイは、Cottrell et al., Nucl. Acids Res. 32: e10, 2003（ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌＰＣＲ）、Rand et al. Nucl. Acids Res. 33:e127, 2005（ＨｅａｄｌｏｏｐＰＣＲ）、Rand et al. Epigenetics 1:94-100, 2006（ＢｉｓｕｌｆｉｔｅＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌＤｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎＰＣＲ）及びＰＣＴ／ＡＵ０７／０００３８９（Ｅｎｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃＰＣＲ）により提供される。

たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、逆ポリメラーゼ連鎖反応（ｉＰＣＲ）、インサイツＰＣＲ（Singer-Sam et al., 1990、上記参照）、鎖置換増幅又はサイクリングプローブ技術などの、本明細書に記載されるいずれの増幅アッセイフォーマットも使用することが可能である。ＰＣＲ技法は、遺伝子変異の検出（Kuppuswamy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1143-1147, 1991）及び対立遺伝子特異的発現の定量化（Szabo and Mann, Genes Dev. 9: 3097-3108, 1995；及びSinger-Sam et al., PCR Methods Appl. 1: 160-163, 1992）のために開発された。そのような技法は、ＰＣＲ生成された鋳型にアニールし、アッセイされる単一ヌクレオチドの５’で直ちに終結する内部プライマーを使用する。そのようなフォーマットは本明細書の上に記載されるリガーゼ連鎖反応と容易に組み合わされる。リアルタイム定量的アッセイフォーマットの使用も有用である。適切なプライマーを選択することを条件として、そのようなアッセイフォーマットは本明細書の上に一般的に記載されており、現在記載されている選択的変異誘発アプローチを準用する。

メチル化特異的融解曲線分析（基本的に、Worm et al., Clin. Chem., 47:1183-1189, 2001に記載されている）も本発明により企図されている。このプロセスは、亜硫酸水素塩処理されたメチル化された又は非メチル化核酸を使用して生成される増幅産物における融解温度の差異を利用する。基本的に、亜硫酸水素塩処理された試料の非差別的増幅が、二本鎖ＤＮＡに特異的に結合する蛍光色素（たとえば、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ）の存在下で実施される。蛍光をモニターしながら増幅産物の温度を増加することにより、融解特性及びしたがって増幅産物の配列が決定される。蛍光の減少は、増幅産物における少なくともドメインの融解を反映する。蛍光が減少する温度は、増幅された核酸のヌクレオチド配列を示しており、それによって１つ又は複数のＣｐＧジヌクレオチドの部位のヌクレオチドを、本発明を使用して増幅される核酸の配列として決定することができる。

本発明は、この実施例を実施するために、たとえば、ＴａｑＭａｎ（Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:7276-7280, 1991; Lee et al., Nucleic Acid Res. 21:3761-3766, 1993）などのリアルタイム定量型のＰＣＲの使用も包含している。たとえば、Eads et al., Nucl. Acids Res. 28: E32, 2000のＭｅｔｈｙｌＬｉｇｈｔ法では、修正されたＴａｑＭａｎアッセイを使用して、ＣｐＧジヌクレオチドのメチル化を検出する。基本的に、この方法は、核酸試料を亜硫酸水素塩で処理し、増幅反応、たとえば、ＰＣＲを使用して、新生物細胞ではメチル化されているが対照試料ではメチル化されていない１つ又は複数のＣｐＧジヌクレオチドを含む核酸を増幅させるステップを含む。増幅反応は、３つのオリゴヌクレオチド、対象の領域に隣接するフォワード及びリバースプライマー並びに前記２つのプライマー間で１つ又は複数のメチル化されたＣｐＧジヌクレオチドの部位にハイブリダイズするプローブの存在下で実施される。プローブは、５’蛍光レポーター及び３’クエンチャー（又は逆にして）で二重に標識される。プローブが無傷の場合、クエンチャー色素はその近接のせいでレポーターの蛍光を吸収する。ＰＣＲ産物へのアニーリングに続いて、プローブは、たとえば、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの５’から３’までのエキソヌクレアーゼ活性により切断される。この切断により、レポーターはクエンチャーから放出され、それによって最初の鋳型メチル化レベルを推定するのに使用することができる増大した蛍光シグナルを生じる。非変異核酸（すなわち、メチル化された核酸）に選択的にハイブリダイズするプローブ又はプライマーを使用することにより、たとえば、標準曲線を使用してメチル化のレベルが決定される。

代わりに、切断を必要とする標識されたプローブを使用するのではなく、たとえば、分子ビーコンなどのプローブが使用される（たとえば、Mhlanga and Malmberg, Methods 25:463-471, 2001参照）。分子ビーコンは、ステムループ構造を有する一本鎖核酸分子である。ループ構造は、新生物試料ではメチル化されているが対照試料ではメチル化されていない１つ又は複数のＣｐＧジヌクレオチドを囲む領域に相補的である。ステム構造は、プローブ（ループ）のどちら側にもある、互いに相補的な２本の「アーム」をアニールすることにより形成される。蛍光部分は一方のアームに結合しており、分子ビーコンが標的配列に結合していないときにはいかなる検出可能な蛍光も抑制する消光部分はもう一方のアームに結合している。ループ領域がその標的核酸に結合すると、アームは分離され蛍光が検出可能になる。しかし、単一の塩基ミスマッチでさえ、試料において検出される蛍光のレベルを著しく変える。したがって、特定の塩基の存在又は非存在は、検出される蛍光のレベルにより決定される。そのようなアッセイは、核酸における１つ又は複数の非変異部位（すなわち、メチル化されたヌクレオチド）の検出を促進する。

蛍光的に標識されたロックド核酸（ＬＮＡ）分子又は蛍光的に標識されたタンパク質−核酸（ＰＮＡ）分子は、ヌクレオチド差異の検出に有用である（たとえば、Simeonov and Nikiforov, Nucleic Acids Research, 30(17):1-5, 2002）。ＬＮＡ及びＰＮＡ分子は、核酸、特にＤＮＡに高親和性で結合する。ＬＮＡ又はＰＮＡプローブにコンジュゲートしたフルオロフォア（特に、ローダミン又はヘキサクロロフルオレセイン）は、標的核酸に前記プローブがハイブリダイズすると著しく大きなレベルで蛍光を発する。しかし、一つのヌクレオチドミスマッチでも存在すると、蛍光の増加レベルは同一レベルにまで増強されなくなる。したがって、試料において検出される蛍光の程度は、メチル化されたＣｐＧジヌクレオチドにおける変異シトシンの存在下などのＬＮＡ又はＰＮＡプローブと標的核酸間のミスマッチの存在を示している。好ましくは、蛍光的に標識されたＬＮＡ又はＰＮＡ技術を使用して、たとえば、当技術分野で公知の及び／又は本明細書に記載される増幅法を使用してすでに増幅されている核酸における少なくとも一塩基変化を検出する。

当業者には明らかになるように、ＬＮＡ又はＰＮＡ検出技術は、Orum et al., Clin. Chem. 45:1898-1905, 1999に記載されるように、ＬＮＡ又はＰＮＡプローブを固体支持体に固定化することにより、１つ又は複数のマーカーのハイスループット検出を受け入れることができる。

代わりに、たとえば、いわゆるＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌアッセイ（Cottrell et al., 2003、上記参照）などのリアルタイムアッセイを使用して、試験試料における核酸のメチル化の存在又はレベルを決定する。基本的に、この方法では、メチル化特異的な形で亜硫酸水素塩処理された核酸に結合する１つ又は複数の非伸長可能核酸（たとえば、オリゴヌクレオチド）ブロッカーが使用される（すなわち、ブロッカー（複数可）は中程度から高厳密性条件下で未変異ＤＮＡに特異的に結合する）。増幅反応は、任意選択でメチル化特異的であってもよいが１つ又は複数のブロッカーに隣接する１つ又は複数のプライマーを使用して実施される。非メチル化核酸（すなわち、非変異ＤＮＡ）の存在下で、ブロッカー（複数可）は結合し、ＰＣＲ産物は生成されない。基本的に上に記載される通りにＴａｑＭａｎアッセイを使用して、試料における核酸のメチル化レベルが決定される。

非メチル化シトシン残基を選択的に変異させる化合物を用いた処理に続いてメチル化された核酸を検出するための他の増幅ベースの方法には、たとえば、メチル化特異的一本鎖立体構造分析（ＭＳ−ＳＳＣＡ）（Bianco et al., Hum. Mutat., 14:289-293, 1999）、メチル化特異的変性勾配ゲル電気泳動（ＭＳ−ＤＧＧＥ）（Abrams and Stanton, Methods Enzymol., 212:71-74, 1992）及びメチル化特異的変性高速液体クロマトグラフィー（ＭＳ−ＤＨＰＬＣ）（Deng et al. Chin. J. Cancer Res., 12:171-191, 2000）が含まれる。これらの方法のそれぞれで、ヌクレオチド配列及び／又は二次構造における差異に基づいて増幅産物における核酸差異を検出するための異なった技法が使用される。そのような方法は、明らかに本発明により企図されている。

他の増幅ベースのアッセイフォーマットの場合と同じように、増幅産物は、ゲル電気泳動、ゲル濾過、質量分析を含む様々な手法を使用して、標識されたプライマーの場合には、増幅産物における標識を同定することにより、分析される、別の実施形態では、亜硫酸水素塩変換されたＤＮＡから増幅されるＰＣＲ産物の制限酵素消化は、基本的に、Sadri and Hornsby, Nucl. Acids Res. 24:5058-5059, 1996;及びXiong and Laird, Nucl. Acids Res. 25:2532-2534, 1997により記載される通りに実施されて、形成される産物を分析する。

たとえば、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、質量分析（タンデム質量分析、たとえば、ＬＣＭＳ／ＭＳを含む）、バイオセンサー技術、エバネッセントファイバーオプティクス技術又はＤＮＡチップ技術などのハイスループット検出法を用いることも可能である。

ハイブリダイゼーション及び／又は増幅検出システムを利用する本明細書に記載されるその他のアッセイフォーマットの場合と同じように、本明細書において上に記載されるようなプロセスの組合せは、本発明の選択的変異誘発ベースのアッセイフォーマットにより特に企図されている。一例では、
（ｉ）変異誘発を誘導するのに十分な条件下でＣｐＧジヌクレオチド内の非メチル化シトシン残基を選択的に変異させる一定量の化合物で核酸を処理し、それによって変異された核酸を生成するステップ、
（ｉｉ）非変異核酸へのハイブリダイゼーションが起こるような条件下で、メチル化されたシトシン残基を含むＤＮＡにおける配列に相補的であるヌクレオチド配列をそれぞれが含む２つの非重複及び非相補的プライマーに核酸をハイブリダイズさせるステップ、
（ｉｉｉ）ハイブリダイズされたプライマーに介在する核酸を増幅させ、それによってプライマー配列を含む配列からなるＤＮＡ断片を生成するステップ、
（ｉｖ）非変異核酸へのハイブリダイゼーションが起こるような条件下でメチル化されたシトシン残基を含む配列に一致する又は相補的であるヌクレオチド配列を含むプローブに増幅されたＤＮＡ断片をハイブリダイズさせるステップ、及び前記ハイブリダイゼーションを検出するステップ、
を含むプロセスを実施することによりメチル化の増加が検出される。

陰性読出しアッセイ
別の例では、アッセイフォーマットは、健康な／正常な対照試料由来のＤＮＡのメチル化の減少が陽性シグナルとして検出され、好ましくは、新生物試料由来のメチル化されたＤＮＡが検出されない又は微弱にしか検出されない陰性読出しシステムを含む。

好ましい実施形態では、
（ｉ）変異誘発を誘導するのに十分な条件下でＣｐＧアイランド内の非メチル化シトシン残基を選択的に変異させる一定量の化合物で核酸を処理し、それによって変異された核酸を生成するステップ、
（ｉｉ）変異核酸への選択的ハイブリダイゼーションが起こるような条件下で、変異シトシン残基を含む配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むプローブ又はプライマーに核酸をハイブリダイズさせるステップ、及び
（ｉｉｉ）前記選択的ハイブリダイゼーションを検出するステップ
を含むプロセスを使用して、メチル化の減少は決定される。

この状況では、用語「選択的ハイブリダイゼーション」は、変異核酸へのプローブ又はプライマーのハイブリダイゼーションが、対応する非変異配列への同一プローブ又はプライマーのハイブリダイゼーションよりも高い頻度で若しくは速度で起こる、又は高い最高反応速度を有することを意味する。好ましくは、前記プローブ又はプライマーは、使用される反応条件下ではメチル化された配列（又は非変異配列）にはハイブリダイズしない。

ハイブリダイゼーションベースのアッセイフォーマット
一実施形態では、ハイブリダイゼーションは、サザン、ドットブロット、スロットブロット又は他の核酸ハイブリダイゼーション手段を使用して検出される（Kawai et al., 1994、上記参照；Gonzalgo et al., 1997、上記参照）。適切なプローブ選択を条件として、そのようなアッセイフォーマットは、本明細書において上に一般的に記載されており、現在記載されている選択的変異誘発アプローチを準用する。好ましくは、リガーゼ連鎖反応フォーマットを用いて、非変異と変異核酸の区別をする。この点に関して、アッセイ要件及び条件は陽性読出しアッセイについて本明細書において上に記載されている通りであり、現在のフォーマットを準用する。しかし、プローブの選択は異なることになる。陰性読出しアッセイでは、非変異配列ではなく変異配列に選択的にハイブリダイズする１つ又は複数のプローブが選択される。

好ましくは、ＣｐＧジヌクレオチドのシトシンがチミジンに変異される場合、たとえば、非メチル化シトシン残基の場合にのみ、診断プローブ及び近接プローブがライゲートされることができるように、リガーゼ連鎖反応プローブ（複数可）は、健康な対照試料ではメチル化されていないが、癌では高度メチル化されているＣｐＧジヌクレオチドを含む３’端部及び／又は５’端部配列を有する。

当業者には明らかになるように、上に記載されるＭＳＯ法は陽性及び／又は陰性読出しアッセイのどちらか又は両方を受け入れられる。これは、記載されるアッセイが変異と非変異配列の両方を検出し、それによってメチル化のレベルを決定することを促進するからである。しかし、メチル化された又は非メチル化配列のみを検出するアッセイは本発明により企図されている。

増幅ベースのアッセイフォーマット
別の例では、ハイブリダイゼーションは、変異核酸に選択的にハイブリダイズするプライマー（及び適用可能な場合はプローブ）を使用しているのもかかわらず、陽性読出しアッセイのために本明細書において上に記載される任意の増幅アッセイフォーマットを使用する増幅システムを使用して検出される。

上に記載されるＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌアッセイを陰性読出しフォーマットに適応する際に、亜硫酸水素塩処理された核酸にメチル化特異的な形で結合するブロッカーは、中程度から高厳密性条件下で変異ＤＮＡに特異的に結合する。増幅反応は、任意選択でメチル化特異的であってもよい（すなわち、変異核酸のみに結合する）が１つ又は複数のブロッカーに隣接する１つ又は複数のプライマーを使用して実施される。メチル化された核酸（すなわち、変異ＤＮＡ）の存在下で、ブロッカー（単数／複数）は結合し、ＰＣＲ産物は生成されない。

一例では、
（ｉ）変異誘発を誘導するのに十分な条件下で非メチル化シトシン残基を選択的に変異させる一定量の化合物で核酸を処理して、それによって変異核酸を生成するステップ、
（ｉｉ）変異核酸へのハイブリダイゼーションが起こるような条件下で、変異シトシン残基を含むＤＮＡ中の配列に相補的であるヌクレオチド配列をそれぞれが含む２つの非重複及び非相補的プライマーに核酸をハイブリダイズさせるステップ、
（ｉｉｉ）ハイブリダイズしたプライマーに介在する核酸を増幅させそれによってプライマー配列を含む配列からなるＤＮＡ断片を生成するステップ、
（ｉｖ）変異核酸へのハイブリダイゼーションが起こるような条件下で、変異シトシン残基を含む配列に一致する又は相補的であるヌクレオチド配列を含むプローブに増幅されたＤＮＡ断片をハイブリダイズさせるステップ、並びに
（ｖ）前記ハイブリダイゼーションを検出するステップ
を含むプロセスを実施することにより正常な／健康な対照対象におけるメチル化の減少が検出される。

当業者には明らかになるように、陰性読出しアッセイは好ましくは、確実に陰性結果が反応の失敗ではなくメチル化された核酸により引き起こされるように適切な対照試料を含む。

本発明は、本明細書に記載される方法を使用する、本発明の診断配列又はその発現若しくはメチル化の検出及び／又は定量化のためのキットも提供する。

メチル化の検出のためのキットでは、本発明のキットは、本発明の診断配列のうちの少なくとも１つにハイブリダイズする少なくとも１つのポリヌクレオチド及び遺伝子メチル化の検出のための少なくとも１つの試薬を含むことができる。メチル化の検出のための試薬には、たとえば、亜硫酸水素ナトリウム、バイオマーカー配列がメチル化されていなければ（たとえば、少なくとも１つのＣ→Ｕ変換を含有する）、本発明のバイオマーカー配列の産物である配列にハイブリダイズするよう設計されたポリヌクレオチド及び／又はメチル化感受性若しくはメチル化依存性制限酵素が含まれる。キットは、配列のメチル化又は非メチル化形態を表す対照の天然又は合成ＤＮＡ配列も含み得る。キットは、アッセイにおいて使用するように構成されるアッセイ器具の形態で固体支持体を提供することができる。キットは、キットにおいて任意選択でポリヌクレオチド（たとえば、プローブ）に連結されている検出可能な標識をさらに含み得る。試験管、移動ピペット、及び同種のものを含む、アッセイの実施に有用な他の材料もキットに含めることが可能である。キットは、本明細書に記載されるアッセイのいずれにおいてもこれらの試薬のうちの１つ又は複数の使用のための書面による使用説明書も含むことが可能である。

上文で詳述されているように、高度メチル化は転写サイレンシングに関連している。したがって、大腸新生物の素因又は発症についてスクリーニングする基礎を提供するこれら遺伝子のメチル化レベルの増加に加えて、これら遺伝子の発現レベルの下方調節も診断的に価値がある。本発明のこの態様に従えば、遺伝子「発現産物」又は「遺伝子の発現」への言及は、転写産物（たとえば、一次ＲＮＡ又はｍＲＮＡ）又はタンパク質などの翻訳産物への言及である。この点に関して、生成される発現産物（すなわち、ＲＮＡ又はタンパク質）のレベルの変化、遺伝子に会合しているクロマチンタンパク質の変化、たとえば、アミノ酸位番号９若しくは２７のリシン上でのメチル化されたヒストンＨ３の存在（抑制的修飾）又はＤＮＡのメチル化の変化などの、発現を下方調節するよう作用するＤＮＡそれ自体の変化についてスクリーニングすることにより遺伝子の発現レベルの変化を評価することが可能である。これらの遺伝子及びその遺伝子発現産物は、それがＲＮＡ転写物であろうと、発現を下方調節するよう作用するＤＮＡの変化であろうと、コードされたタンパク質であろうと、全体として「新生物マーカー」と呼ばれる。

したがって、本発明の別の態様は、個体において大腸新生物の発症若しくは発症の素因についてスクリーニングする又はこれをモニターする方法であって、
前記個体由来の生体試料において
（ｉ）Ｈｇ１９座標
（１）ｃｈｒ１２：２４９６２９５８．．２５１０２３９３
（２）ｃｈｒ７：５０３４４３７８．．．５０４７２７９８
（３）ｃｈｒ６：３９１７３９．．４１１４４３；若しくは
（４）ｃｈｒ１２：５２４００７４８．．５２４０９６７１；及び
（５）ｃｈｒ６：１６３８３４０９７．．１６３８３４９８２；
のうちのいずれか２つ若しくは３つ以上により定義される、転写開始部位の２ｋｂ上流を含む、領域、又は
（ｉｉ）（１）ＢＣＡＴ１（２）ＩＫＺＦ１（３）ＩＲＦ４（４）ＧＲＡＳＰ及び（５）ＣＡＨＭ
のうちのいずれか２つ若しくは３つ以上の２ｋｂ上流を含む、遺伝子領域
から選択されるＤＮＡ領域の発現レベルを評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群（ｉ）及び／又は（ｉｉ）のＤＮＡ領域の少なくとも１つのより低い発現レベルが、大腸新生物又は新生物状態の発症の素因を示す、前記方法を対象とする。

本発明のこの態様の方法は、生体試料の新生物マーカーのレベルとこれらのマーカーの対照レベルとの比較に基づいている。「対照レベル」は、新生物ではない対応する大腸細胞又は細胞集団により発現されるマーカーのレベルである「正常レベル」でもよい。

上文で詳述されるように、正常（又は「非新生物」）レベルは、試験対象である同じ個体由来の組織を使用して決定し得る。しかし、これは関係する個体には極めて侵襲的になることがあり、したがって、問題の患者以外の個体から得られる個々の又は集団の結果を反映する標準結果と比べて試験結果を分析するほうが都合がよい可能性があることは認識されるであろう。

より詳細には、個体において大腸新生物の発症若しくは発症の素因についてスクリーニングする又はこれをモニターする方法であって、
前記個体由来の生体試料において
（ｉ）Ｈｇ１９座標
（１）ｃｈｒ１２：２４９６２９５８．．２５１０２３９３；及び
（２）ｃｈｒ７：５０３４４３７８．．．５０４７２７９８
並びに場合によって（３）ｃｈｒ６：３９１７３９．．４１１４４３、（４）ｃｈｒ１２：５２４００７４８．．５２４０９６７１及び（５）ｃｈｒ６：１６３８３４０９７．．１６３８３４９８２のうちの１つ若しくは複数
により定義される、転写開始部位の２ｋｂ上流を含む、ＤＮＡ領域、又は
（ｉｉ）（１）ＢＣＡＴ１；及び
（２）ＩＫＺＦ１；
並びに場合によって（３）ＩＲＦ４、（４）ＧＲＡＳＰ及び（５）ＣＡＨＭ
のうちの１つ若しくは複数の２ｋｂ上流を含む、遺伝子領域
から選択される１つ又は複数の遺伝子又は転写物の発現レベルを評価するステップを含み、
対照レベルと比べて群（ｉ）及び／又は（ｉｉ）のＤＮＡ領域の少なくとも１つのより低い発現レベルが、新生物大腸新生物又は新生物状態の発症の素因を示す、前記方法が提供される。

好ましくは、前記対照レベルは非新生物レベルである。

一実施形態では、前記方法は前記ＤＮＡ領域のうちのいずれか１つがより高いレベルのメチル化を示す生体試料を同定することを対象とする。

別の実施形態では、前記方法は前記ＤＮＡ領域のうちの２つ又は３つ以上がより高いレベルのメチル化を示す生体試料を同定することを対象とする。

上文で詳述されるように、本発明は、大腸に位置している新生物細胞又は細胞集団についてスクリーニングするように設計されている。したがって、「細胞又は細胞集団」への言及は、個々の細胞又は細胞の群への言及として理解されるべきである。前記細胞の群は拡散した細胞集団、細胞懸濁液、被包性細胞集団又は組織の形態をとる細胞集団であってもよい。

「発現」への言及は、核酸分子の転写及び／又は翻訳への言及として理解されるべきである。「ＲＮＡ」への言及は、一次ＲＮＡ又はｍＲＮＡ又は非翻訳ＲＮＡ（たとえば、ｍｉＲＮＡ、等）などの任意の形態のＲＮＡへの言及を包含すると理解されるべきである。いかなる点でも本発明を限定することなく、増加した又は減少したＲＮＡ合成をもたらす遺伝子転写のモジュレーションは、タンパク質産物を生成するこれらのＲＮＡ転写物の一部（たとえば、ｍＲＮＡ）の翻訳とも相関していることがある。したがって、本発明は、細胞又は細胞集団の新生物状態の指標としての新生物マーカータンパク質産物のモジュレートしたレベル又はパターンについてスクリーニングすることを対象とする検出方法論までにも及ぶ。一方法は、ｍＲＮＡ転写物及び／又は対応するタンパク質産物についてスクリーニングすることであるが、本発明はこの点に関して限定されることはなく、たとえば、一次ＲＮＡ転写物などの他の任意の形態の新生物マーカー発現産物についてスクリーニングすることにまで及ぶことは理解されるべきである。

マーカーの発現の下方調節についてスクリーニングする点に関して、ＤＮＡレベルで検出可能である変化は遺伝子発現活性の変化、したがって、発現産物レベルの変化を示していることも当業者には周知であろう。そのような変化には、ＤＮＡメチル化の変化が含まれるが、これに限定されない。したがって、「発現レベルをスクリーニングする」及びこれらの「発現レベル」と対照「発現レベル」の比較への本明細書での言及は、遺伝子／ＤＮＡメチル化パターンなどの、転写に関係しているＤＮＡ因子を評価することへの言及として理解されるべきである。これらのことは、ある程度上文に詳細に説明されている。

クロマチン構造の変化は遺伝子発現の変化を示していることも当業者には公知であろう。遺伝子発現のサイレンシングは、クロマチンタンパク質の修飾に関連する場合が多く、ヒストンＨ３の９位及び２７位のどちらか又は両方でのリシンのメチル化はよく研究されている例であり、活性なクロマチンはヒストンＨ３のリシン９のアセチル化を特徴とする。したがって、遺伝子配列と抑制的又は活性な修飾を担持しているクロマチンの会合を使用して、遺伝子の発現レベルの評価をすることが可能である。

「核酸分子」への言及は、デオキシリボ核酸分子とリボ核酸分子の両方及びその断片への言及として理解されるべきである。したがって、本発明は、生体試料においてｍＲＮＡレベルについて直接スクリーニングすること又は対象のｍＲＮＡ集団から逆転写されている相補的ｃＤＮＡについてスクリーニングすることの両方に及ぶ。ＤＮＡ又はＲＮＡのどちらかについてスクリーニングすることを対象とする方法論を設計することは十分に当業者の能力の範囲内である。上で詳述されたように、本発明の方法は対象ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡそれ自体から翻訳されたタンパク質産物についてスクリーニングすることにも及ぶ。

一好ましい実施形態では、遺伝子発現のレベルはタンパク質産物をコードする遺伝子を参照することにより測定され、より詳細には、前記発現レベルはタンパク質レベルで測定される。

別の特に好ましい実施形態では、前記遺伝子発現は、抑制的修飾、たとえば、ヒストンＨ３のリシン９又は２７のメチル化を担持するクロマチンタンパク質とのＤＮＡの会合により評価される。

本発明は、１つ又は複数の生体試料においてタンパク質及び／又は核酸分子の両方を同定することに基づく検出の方法を包含すると理解されるべきである。対象の新生物マーカーの一部がタンパク質産物をコードしていない遺伝子又は遺伝子断片と一致することがある限りこれは特に重要である場合がある。したがって、こうしたことが起こる限り、タンパク質について試験するのは可能ではないと考えられ、対象のマーカーは転写発現プロファイル又はゲノムＤＮＡの変化に基づいて評価しなければならないと考えられる。

用語「タンパク質」は、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質（タンパク質断片を含む）を包含すると理解されるべきである。タンパク質はグリコシル化されていることもグリコシル化されていないこともあり、及び／或いはタンパク質に融合している、連結している、結合している又は他の方法で会合しているアミノ酸、脂質、炭水化物又は他のペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質などの広範囲の他の分子を含有していることもある。「タンパク質」への本明細書での言及は、アミノ酸の配列を含むタンパク質並びにアミノ酸、脂質、炭水化物又は他のペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質などの他の分子と会合しているタンパク質を含む。

本発明の新生物マーカーにコードされているタンパク質は、２つ又は３つ以上の分子が互いに会合していることを意味する多量体形である場合もある。同じタンパク質分子が互いに会合している場合、その複合体はホモ多量体である。ホモ多量体の例はホモ二量体である。少なくとも１つのマーカータンパク質が少なくとも１つの非マーカータンパク質と会合している場合、その複合体はヘテロ二量体などのヘテロ多量体である。

「断片」への言及は、対象の核酸分子又はタンパク質の一部への言及として理解すべきである。対象ＲＮＡは腸の環境のせいで分解されている又は他の方法で断片化されている可能性があるために、大便試料においてモジュレートしたＲＮＡレベルについてスクリーニングすることに関してこのことは特に関連する。したがって、実際には対象ＲＮＡ分子の断片を検出している場合があり、この断片は適切な特異的プローブを使用することにより同定される。

好ましい方法は、新生物発生又はその素因を診断する目的で新生物マーカーの発現産物又はＤＮＡ変化を検出することであるが、前記マーカーのレベルの逆の変化の検出は、ある種の状況下では、たとえば、アデノーマ又は腺癌の発生などの新生物状態を調節することを対象とする治療的又は予防的処置の有効性をモニターするためには望ましいことがある。たとえば、対象マーカーの発現の減少が、個体がアデノーマ又は腺癌発生により特徴付けられる状態を発症していることを示す場合、たとえば、治療レジメンの開始に続いてこれらのマーカーのレベルの増加についてスクリーニングすることを利用して、対象個体の状態の回復又は他の形の改善を示し得る。したがって、本発明の方法は、１度限りの検査として又は新生物発生のリスクがあると考えられる個体の進行中のモニターとして又は新生物発生を阻害する若しくは他の方法で遅延させることを対象とする治療的若しくは予防的処置レジメンの有効性のモニターとして有用である。

生体試料において対象の発現された新生物マーカーを評価する手段は、当業者には周知であると考えられる任意の適切な方法により達成することができる。このために、均一な細胞集団（たとえば、腫瘍生検又は不均一な出発集団から濃縮された細胞集団）又は組織切片を調べている限り、インサイツハイブリダイゼーション、マイクロアッセイによる発現プロファイルの評価、免疫アッセイ及び同類のもの（下文にさらに詳細に記載されている）などの多種多様な技法を利用して、１つ又は複数の対象のマーカーの発現レベルの非存在又は下方調節を検出し得ることは認識されるであろう。しかし、不均一な細胞集団又は血液試料などの不均一な細胞集団が見出される体液をスクリーニングしている限り、特定のマーカーの発現レベルの非存在又は減少は、試料中に存在する非新生物細胞によるマーカーの固有の発現のせいで検出不可能であることもある。すなわち、細胞の亜集団の発現レベルの減少は検出可能ではないことがある。この状況では、１つ又は複数の本発明のマーカーの発現レベルの新生物の亜集団における減少を検出するさらに適切な機構は、エピジェネティック変化の検出などの間接的手段を介してである。

遺伝子発現レベルの変化を検出する方法（上文で詳細に記載されているメチル化分析に加えて）は、特に対象生体試料が多数の非新生物細胞で汚染されていない場合には、
（ｉ）インビボ検出
分子イメージング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍａｇｉｎｇ）は、腸組織におけるマーカーの変更された発現を明らかにすることができるイメージングプローブ又は試薬の投与に続いて使用し得る。
分子イメージング（Moore et al., BBA, 1402:239-249, 1988; Weissleder et al., Nature Medicine 6:351-355, 2000）は、Ｘ線、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、ＭＲＩ、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）又は内視鏡検査などの「古典的」画像診断法を使用して現在視覚化されているマクロ特徴と相関している分子発現のインビボイメージングである。
（ｉｉ）細胞における蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）による、又は細胞由来の抽出物における定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＲＴＰＣＲ）若しくは競合的ＲＴ−ＰＣＲ産物のフローサイトメトリー定量化などの技術による、ＲＮＡ発現の下方調節の検出（Wedemeyer et al., Clinical Chemistry 48:9 1398-1405, 2002）。
（ｉｉｉ）たとえば、アレイ技術によるＲＮＡの発現プロファイルの評価（Alon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 96:6745-6750, June 1999）
が含まれるが、これらに限定されない。

「マイクロアレイ」は、好ましくは個別領域を持つ線形の又は多次元アレイであり、それぞれの領域は一定面積を有し、固体支持体の表面上に形成されている。マイクロアレイ上の個別領域の密度は単一の固相支持体の表面上で検出される標的ポリヌクレオチドの総数により決定される。本明細書で使用されるように、ＤＮＡマイクロアレイは、チップ又は他の表面上に置かれ標的ポリヌクレオチドを増幅する又はクローニングするのに使用されるオリゴヌクレオチドプローブのアレイである。アレイにおけるそれぞれの特定のプローブ群の位置は分かっているので、標的ポリヌクレオチドの正体は、マイクロアレイ中の特定の位置にそれが結合することに基づいて決定することができる。

ＤＮＡマイクロアレイ技術により、単一固相支持体上での複数の標的核酸分子の大規模アッセイを行うことが可能になっている。米国特許第５，８３７，８３２（Ｃｈｅｅら）及び関連特許出願は、試料中の特定の核酸配列のハイブリダイゼーション及び検出のためのオリゴヌクレオチドプローブのアレイを固定化することを記載している。対象の組織から単離された対象の標的ポリヌクレオチドはＤＮＡチップにハイブリダイズされ、個別のプローブの位置での標的ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションの好みと程度に基づいて特異的配列が検出される。アレイの１つの重要な使用は差次的遺伝子発現の解析にあり、その場合異なる細胞又は組織、多くの場合、対象の組織及び対照組織における遺伝子発現のプロファイルが比較され、それぞれの組織間の遺伝子発現のいかなる違いも同定される。そのような情報は、発現プロファイルに基づく特定の組織型で発現される遺伝子の種類の同定及び病状の診断に有用である。
（ｉｖ）たとえば、免疫アッセイによる細胞抽出物における変更された新生物マーカータンパク質レベルの測定。
生体試料におけるタンパク質性新生物マーカー発現産物についての試験は、当業者に周知であるいくつかの適切な方法のうちのいずれか１つにより実施することが可能である。適切な方法の例には、組織切片、生検標本又は体液試料の抗体スクリーニングが含まれるが、これに限定されない。抗体ベースの診断法が使用される限り、マーカータンパク質の存在は、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ又はフローサイトメトリー法によるなどのいくつかの方法で決定し得る。当然、これらには、非競合的種類の並びに従来の競合的結合アッセイにおける単一部位と二部位の両方又は「サンドイッチ」アッセイが含まれる。これらのアッセイは、標的への標識された抗体の直接結合も含まれる。
（Ｖ）たとえば、免疫組織化学による細胞表面でのタンパク質新生物マーカーの変更された発現の決定。
（ｖｉ）上記のポイント（ｉｖ）及び（ｖ）において詳述された試験に加えて、任意の適切な機能試験、酵素試験又は免疫学的試験に基づいた変更されたタンパク質発現の決定、
が含まれるが、これらに限定されない。

当業者であれば、常用手順の問題として、特定種の生体試料への所与の方法の適用の妥当性を決定することができる。

本発明の関連する態様は、
（ｉ）上文に記載されている新生物マーカーＤＮＡのいずれか２つ若しくは３つ以上に一致するヌクレオチド配列又はそれに少なくとも８０％同一性を示す配列を含む核酸分子又はそのような核酸分子の機能的誘導体、断片、バリアント若しくは相同体、或いは
（ｉｉ）中程度厳密性条件の下で（ｉ）の配列のいずれか１つ若しくは複数にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む核酸分子又はそのような核酸分子の機能的誘導体、断片、バリアント若しくは相同体、或いは
（ｉｉｉ）中程度厳密性条件の下で（ｉ）の配列のいずれか２つ若しくは３つ以上にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む核酸プローブ若しくはオリゴヌクレオチド又はそのような核酸分子の機能的誘導体、断片、バリアント若しくは相同体、或いは
（ｉｖ）（ｉ）の核酸分子によりコードされるタンパク質のうちのいずれか２つ若しくは３つ以上又はその誘導体、断片若しくは相同体に結合することができるプローブ
のうちの複数を含むアレイであって、
（ｉ）〜（ｉｉｉ）の前記マーカー遺伝子又は（ｉｖ）のタンパク質の発現レベルが、大腸由来の細胞又は細胞の亜集団の新生物状態を示す
分子アレイを提供する。

好ましくは、前記パーセント同一性は少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である。

「ハイブリダイゼーション」とは、核酸鎖が塩基対合を通じて相補的鎖に結合するプロセスのことである。ハイブリダイゼーション反応は、対象の特定の配列を、その配列が低濃度で存在する試料中でも同定することができるように、感受性であり選択性であることが可能である。厳密な条件は、たとえば、プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション溶液中の塩若しくはホルムアミドの濃度により、又はハイブリダイゼーション温度により定義することができ、当技術分野では周知である。たとえば、厳密性は、下に詳細に記載されるように、塩の濃度を減少する、ホルムアミドの濃度を増加する、又はハイブリダイゼーション温度を上げる、ハイブリダイゼーションの時間を変更することにより増加させることができる。別の態様では、本発明の核酸は、本明細書に記載されるように、様々な厳密性条件（たとえば、高、中程度、及び低）下でハイブリダイズするその能力により定義される。

低厳密性への本明細書での言及は、ハイブリダイゼーションのための少なくとも約０〜少なくとも約１５％ｖ／ｖのホルムアミド及び少なくとも約１Ｍ〜少なくとも約２Ｍの塩、並びに洗浄条件のための少なくとも約１Ｍ〜少なくとも約２Ｍの塩を含み包含する。一般に、低厳密性は、約２５〜３０℃から約４２℃までである。温度は変更して、もっと高い温度を使用し、ホルムアミドを交換する及び／又は別の厳密性条件を与えてもよい。必要な場合は、ハイブリダイゼーションのための少なくとも約１６％ｖ／ｖ〜少なくとも約３０％ｖ／ｖのホルムアルデヒド及び少なくとも約０．５Ｍ〜少なくとも約０．９Ｍの塩、並びに洗浄条件のための少なくとも約０．５Ｍ〜少なくとも約０．９Ｍの塩を含み包含する中程度の厳密性、又はハイブリダイゼーションのための少なくとも約３１％ｖ／ｖ〜少なくとも約５０％ｖ／ｖのホルムアミド及び少なくとも約０．０１Ｍ〜少なくとも約０．１５Ｍの塩、並びに洗浄条件のための少なくとも約０．０１Ｍ〜少なくとも約０．１５Ｍの塩を含み包含する高厳密性などの、別の厳密性条件を適用し得る。一般に、洗浄は、Ｔ_ｍ＝６９．３＋０．４１（Ｇ＋Ｃ）％で実施される（Marmur and Doty, J. Mol. Biol. 5:109, 1962）。しかし、二重鎖ＤＮＡのＴ_ｍは、ミスマッチ塩基対の数が１％増加するごとに１℃低下する（Bonner and Laskey, Eur. J. Biochem. 46:83, 1974）。ホルムアミドはこれらのハイブリダイゼーション条件では任意選択である。したがって、厳密性の特に好ましいレベルは以下の通りに定義され：低厳密性は、２５〜４２℃で、６×ＳＳＣバッファー、０．１％ｗ／ｖＳＤＳ；中程度の厳密性は、２０℃〜６５℃の範囲の温度で、２×ＳＳＣバッファー、０．１％ｗ／ｖＳＤＳ；高厳密性は、少なくとも６５℃の温度で、０．１×ＳＳＣバッファー、０．１％ｗ／ｖＳＤＳである。

本発明の核酸が高厳密性下でハイブリダイズするその能力により定義される場合、これらの条件は約３７℃〜４２℃の温度で約５０％のホルムアミドを含む。一態様では、本発明の核酸は、約３０℃〜３５℃で約３５％〜２５％のホルムアミドでの条件を含む低下した厳密性下でハイブリダイズするその能力により定義される。代わりに、本発明の核酸は、４２℃で５０％のホルムアルデヒド、５×ＳＳＰＥ、０．３％のＳＤＳ、及びｃｏｔ−１又はサーモン精子ＤＮＡ（たとえば、２００ｎ／ｍｌの剪断され変性されたサーモン精子ＤＮＡ）などの反復配列ブロッキング核酸の条件を含む高厳密性下でハイブリダイズするその能力により定義される。一態様では、本発明の核酸は、３５℃の下げられた温度で３５％のホルムアミドを含む低下した厳密性条件下でハイブリダイズするその能力により定義される。

好ましくは、対象プローブは、それが非特異的反応性の発生率を最小限に抑えるレベルの特異性で向けられる核酸又はタンパク質に結合するように設計される。しかし、あらゆる潜在的な交差反応性又は非特異的反応性を取り除くことはできない場合があり、これはいかなるプローブベースのシステムにおいても固有の制限であることは認識されるであろう。

対象タンパク質を検出するのに使用されるプローブに関しては、プローブは抗体及びアプタマーを含むいかなる適切な形態でもとることが可能である。

核酸又はタンパク質プローブのライブラリー又はアレイは豊富で極めて価値ある情報を与える。さらに、そのような配列の２つ又は３つ以上のアレイ又はプロファイル（アレイの使用から得られる情報）は、結果の試験セットを別の試料又は保存されたキャリブレーターなどの基準と比較するために有用なツールである。アレイを使用する際に、個々のプローブは典型的には別々の位置で固定され、結合反応のために反応させておく。集められたセットのマーカーと関連しているプライマーは、配列のライブラリーを調製するために又は他の生体試料からマーカーを直接検出するために有用である。

遺伝子マーカーのライブラリー（又は、ライブラリー中の少なくともいくつかの配列に一致する物理的に分離された核酸に言及する場合はアレイ）は極めて望ましい特性を示す。これらの特性は特定の条件に関連しており、調節プロファイルとして特徴付けられる。ここで呼ばれるプロファイルとは、マーカーが元来由来した組織の診断情報を与える一組のメンバーのことである。プロファイルは多くの例では寄託配列から作られるアレイ上の一連のスポットを含む。

特徴的な患者プロファイルは一般にアレイを使用して調製される。アレイプロファイルは１つ又は複数の他のアレイプロファイル又は他の基準プロファイルと比較される場合がある。比較結果は、病状、発生状態、療法に対する受容力に関する豊富な情報及び患者についての他の情報を与えることができる。

本発明の別の態様は、１つ又は複数の新生物マーカーを検出するための１つ又は複数の作用物質を含む生体試料をアッセイするための診断キット及び前記作用物質による検出を促進するのに有用な試薬を提供する。たとえば、生体試料を受け取るための追加の手段も含むことができる。前記作用物質は任意の適切な検出分子でもよい。

本発明は、以下の非限定的実施例を参照することによりさらに説明される。

ＣＡＨＭ：結腸直腸腺癌高度メチル化
シングルプレックスパフォーマンス：
７４正常：０．８ｐｇ高度メチル化／ｍＬ血漿（９５％ＣＩ：０．２；１．４）
７３腺腫：９．１ｐｇ高度メチル化／ｍＬ血漿（９５％ＣＩ：−８；２７）
７３がん：１７８８高度メチル化／ｍＬ血漿（９５％ＣＩ：２３１；３３４４）
ＣＡＨＭアッセイ（閾値カット３ｐｇ／ｍＬ血漿）は結腸直腸がんに対して９３％特異性で５５％の感度である（図１）。

ＧＲＡＳＰ：ホスホイノシチド１関連スキャフォールドタンパク質に対する一般受容体
シングルプレックスパフォーマンス：
３４正常：１．３ｐｇ高度メチル化／ｍＬ血漿（９５％ＣＩ：０．２；２．５）
３３腺腫：０．１ｐｇ高度メチル化／ｍＬ血漿（９５％ＣＩ：−０．１；０．４）
３３がん：６７０．８ｐｇ高度メチル化／ｍＬ血漿（９５％ＣＩ：−４７０．７；１８１２）
ＧＲＡＳＰアッセイは、閾値カット２０ｐｇメチル化／ｍＬ血漿を使用して、結腸直腸がんに対して１００％特異性で５８％の感度である（図２）。

ＩＲＦ４：インターフェロン調節因子４
シングルプレックスパフォーマンス：
２４正常：６ｐｇ高度メチル化／ｍＬ血漿（９５％ＣＩ：２．９；９．０）
２３腺腫：３．７ｐｇ高度メチル化／ｍＬ血漿（９５％ＣＩ：−０．４；８．０）
３３がん：５３４０ｐｇ高度メチル化／ｍＬ血漿（９５％ＣＩ：−５３６９；１６０４９）
ＩＲＦ４アッセイは、閾値カット２０ｐｇメチル化／ｍＬ血漿を使用して、結腸直腸がんに対して９６％特異性で５７％の感度である（図３）。

ＢＣＡＴ１：分岐鎖アミノ酸トランスアミナーゼ１、細胞質ゾル
シングルプレックスパフォーマンス要約
１４正常：０ｐｇ高度メチル化／ｍＬ血漿（９５％ＣＩ：該当なし）
１３腺腫：０．４ｐｇ高度メチル化／ｍＬ血漿（９５％ＣＩ：−０．４；１．３）
１３がん：４０８８ｐｇ高度メチル化／ｍＬ血漿（９５％ＣＩ：−４４５９；１０５３９）
ＢＣＡＴ１アッセイは、閾値カット３ｐｇメチル化／ｍＬ血漿を使用して、結腸直腸がんに対して１００％特異性で６２％の感度である（図４）。

ＩＫＺＦ１：ＩＫＡＲＯＳファミリー亜鉛フィンガー１
シングルプレックスパフォーマンス要約
１４正常：０ｐｇ高度メチル化／ｍＬ血漿（９５％ＣＩ：該当なし）
１３腺腫：０ｐｇ高度メチル化／ｍＬ血漿（９５％ＣＩ：該当なし）
１３がん：１１３ｐｇ高度メチル化／ｍＬ血漿（９５％ＣＩ：−４３；２７０）
ＩＫＺＦ１アッセイは、閾値カット３ｐｇメチル化／ｍＬ血漿を使用して、結腸直腸がんに対して１００％特異性で５４％の感度である（図４）。

５つの遺伝子のメチル化レベルは同じ１４正常、１３腺腫及び１３がんにおいて測定した。下の表は、遺伝子のうちの２つのメチル化を測定した場合、臨床有用性の改善を示している。

５つの遺伝子のうちいずれか３つにおいて測定されるメチル化レベルを組み合わせると、
ＣＡＨＭ_{６ｐｇ／ｍＬ}−ＧＲＡＳＰ_{２０ｐｇ／ｍＬ}−ＩＲＦ４_{２０ｐｇ／ｍＬ}：７７％感度及び１００％特異性
ＣＡＨＭ_{６ｐｇ／ｍＬ}−ＧＲＡＳＰ_{２０ｐｇ／ｍＬ}−ＢＣＡＴ_{３ｐｇ／ｍＬ}：７７％感度及び１００％特異性
ＣＡＨＭ_{６ｐｇ／ｍＬ}−ＧＲＡＳＰ_{２０ｐｇ／ｍＬ}−ＩＫＺＦ１_{３ｐｇｍＬ}：７７％感度及び１００％特異性
ＣＡＨＭ_{６ｐｇ／ｍＬ}−ＩＫＺＦ１_{３ｐｇ／ｍＬ}−ＢＣＡＴ_{３ｐｇ／ｍＬ}：７７％感度及び１００％特異性
ＧＲＡＳＰ_{２０ｐｇ／ｍＬ}−ＩＫＺＦ１_{３ｐｇ／ｍＬ}−ＢＣＡＴ_{３ｐｇ／ｍＬ}：８５％感度及び１００％特異性
が得られた。

５つの遺伝子すべてからメチル化レベルを組み合わせると、９２％感度及び１００特異性が得られる。

ＧＲＡＳＰ、ＣＡＨＭ、ＩＲＦ４、ＩＫＺＦ１及びＢＣＡＴ１の標的にされたアンプリコン配列
ＣＡＨＭＭＳＰアンプリコンの野生型ＤＮＡ配列は染色体６、プラス鎖上に位置している；１６３，８３４，３９３⇒１６３，８３４，４５５（Ｈｇ１９）
GAAGGAAGCA TTTCGAGCAC GACTGACGCT CCCCTTATTA TTTGCTAAGC CGCTGCGCTC GGG

ＧＲＡＳＰＭＳＰアンプリコンの野生型ＤＮＡ配列は染色体１２、プラス鎖上に位置している；５２，４００，８８６⇒５２，４００，９７３（Ｈｇ１９）
cggaagtcgc gcccgccgct ccggtcccga ccccgggacc ccctgccgca gccgccaccc ctgggccccc agcggacgag ctgtacgc

ＩＫＺＦ１ＭＳＰアンプリコンの野生型ＤＮＡ配列は染色体７、プラス鎖上に位置している；５０，３４３，８６７⇒５０，３４３，９６１（Ｈｇ１９）
gacgacgcac cctctccgtg tcccgctctg cgcccttctg cgcgccccgc tccctgtacc ggagcagcga tccgggaggc ggccgagagg tg

ＢＣＡＴ１ＭＳＰアンプリコンの野生型ＤＮＡ配列は染色体１２、マイナス鎖上に位置している；２５，１０１，９９２⇒２５，１０２，０９３（Ｈｇ１９）
gtcttcctgc tgatgcaatc CGctaggtcg cgagtctccg ccgcgagagg gccggtctgc aatccagccc gccacgtgta ctcgccgccg cctcg

ＩＲＦ４ＭＳＰアンプリコンの野生型ＤＮＡ配列は染色体６、マイナス鎖上に位置している；３９２，０３６⇒３９２，１４５（Ｈｇ１９）
tgggtgcctt ggacggcccc gcctcagcca ctcctggggc cccgacagtc cggttagctc atcccgtcca gcttgtggcg accccgtcgc aggagcgcgg agggcaggcg

血漿検体中のＧＲＡＳＰ、ＣＡＨＭ、ＩＲＦ４、ＩＫＺＦ１及びＢＣＡＴ１にわたるメチル化レベルを測定するのに使用されるＰＣＲプロトコール

参考文献一覧

Claims

個体において大腸新生物の発症若しくは発症の素因についてスクリーニングする又はこれをモニターする方法であって、
前記個体由来の生体試料において
（１）ＢＣＡＴ１の２ｋｂ上流を含む、遺伝子領域と、
（２）ＩＫＺＦ１（３）ＩＲＦ４（４）ＧＲＡＳＰ及び（５）ＣＡＨＭ
のうちの１つ以上の２ｋｂ上流を含む、遺伝子領域と
のメチル化状態を評価するステップを含み、
前記生体試料が、血液であり、
対照のレベルと比べて前記遺伝子領域の少なくとも１つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症若しくは発症の素因を示し、
ここで、前記メチル化の状態及びレベルの評価は、前記遺伝子領域ごとに、下記表に示されるプライマー対（フォワード及びリバースプライマー）を用いた核酸増幅反応を行い、下記表に示されるアンプリコンの検出量と、予め設定された１００％特異性となる閾値を用いて行われるものである、
前記方法。
前記個体由来の生体試料において
（１）ＢＣＡＴ１；及び
（２）ＩＫＺＦ１；
又は、
（１）ＢＣＡＴ１；及び
（２）ＩＫＺＦ１；
並びに（３）ＩＲＦ４、（４）ＧＲＡＳＰ及び（５）ＣＡＨＭのうちの１つ若しくは複数
の２ｋｂ上流を含む、遺伝子領域
のメチル化状態を評価するステップを含み、
前記生体試料が、血液であり、
対照のレベルと比べて前記遺伝子領域の少なくとも１つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症若しくは発症の素因を示す、請求項１に記載の方法。
スクリーニングして探る遺伝子マーカーパネルが、
（１）ＢＣＡＴ１、（２）ＩＫＺＦ１及び（３）ＩＲＦ４
の２ｋｂ上流を含む、遺伝子領域である、請求項２に記載の方法。
スクリーニングして探る遺伝子マーカーパネルが、
（１）ＢＣＡＴ１、（２）ＩＫＺＦ１及び（４）ＧＲＡＳＰ
の２ｋｂ上流を含む、遺伝子領域である、請求項２に記載の方法。
スクリーニングして探る遺伝子マーカーパネルが、
（１）ＢＣＡＴ１、（２）ＩＫＺＦ１及び（５）ＣＡＨＭ
の２ｋｂ上流を含む、遺伝子領域である、請求項２に記載の方法。
スクリーニングして探る遺伝子マーカーパネルが、
（１）ＢＣＡＴ１、（２）ＩＫＺＦ１、（３）ＩＲＦ４及び（４）ＧＲＡＳＰ
の２ｋｂ上流を含む、遺伝子領域である、請求項２に記載の方法。
スクリーニングして探る遺伝子マーカーパネルが、
（１）ＢＣＡＴ１、（２）ＩＫＺＦ１、（３）ＩＲＦ４及び（５）ＣＡＨＭ
の２ｋｂ上流を含む、遺伝子領域である、請求項２に記載の方法。
スクリーニングして探る遺伝子マーカーパネルが、
（１）ＢＣＡＴ１、（２）ＩＫＺＦ１、（４）ＧＲＡＳＰ及び（５）ＣＡＨＭ
の２ｋｂ上流を含む、遺伝子領域である、請求項２に記載の方法。
スクリーニングして探る遺伝子マーカーパネルが、
（１）ＢＣＡＴ１、（２）ＩＫＺＦ１、（３）ＩＲＦ４、（４）ＧＲＡＳＰ及び（５）ＣＡＨＭ
の２ｋｂ上流を含む、遺伝子領域である、請求項２に記載の方法。
前記個体由来の生体試料において
（１）ＢＣＡＴ１；及び
（５）ＣＡＨＭ；
又は、
（１）ＢＣＡＴ１；及び
（５）ＣＡＨＭ；
並びに（２）ＩＫＺＦ１、（３）ＩＲＦ４及び（４）ＧＲＡＳＰのうちの１つ若しくは複数
の２ｋｂ上流を含む、遺伝子領域
のメチル化状態を評価するステップを含み、
前記生体試料が、血液であり、
対照のレベルと比べて前記遺伝子領域の少なくとも１つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症若しくは発症の素因を示す、請求項１に記載の方法。
前記個体由来の生体試料において
（１）ＢＣＡＴ１；及び
（３）ＩＲＦ４；
又は、
（１）ＢＣＡＴ１；及び
（３）ＩＲＦ４；
並びに（２）ＩＫＺＦ１、（４）ＧＲＡＳＰ及び（５）ＣＡＨＭのうちの１つ若しくは複数
の２ｋｂ上流を含む、遺伝子領域
のメチル化状態を評価するステップを含み、
前記生体試料が、血液であり、
対照のレベルと比べて前記遺伝子領域の少なくとも１つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症若しくは発症の素因を示す、請求項１に記載の方法。
前記個体由来の生体試料において
（１）ＢＣＡＴ１；及び
（４）ＧＲＡＳＰ；
又は、
（１）ＢＣＡＴ１；及び
（４）ＧＲＡＳＰ；
並びに（２）ＩＫＺＦ１、（３）ＩＲＦ４及び（５）ＣＡＨＭのうちの１つ若しくは複数
の２ｋｂ上流を含む、遺伝子領域
のメチル化状態を評価するステップを含み、
前記生体試料が、血液であり、
対照のレベルと比べて前記遺伝子領域の少なくとも１つのより高いレベルのメチル化が、大腸新生物又は大腸新生物状態の発症若しくは発症の素因を示す、請求項１に記載の方法。
前記ＤＮＡ領域のうちのいずれか１つがより高いレベルのメチル化を示す、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
前記ＤＮＡ領域のうちのいずれか２つ又は３つ以上がより高いレベルのメチル化を示す、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
前記新生物が腺腫又は腺癌である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
前記対照のレベルが非新生物のレベルである、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
前記新生物が結腸直腸新生物である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
前記レベルがゲノムＤＮＡの変化についてスクリーニングすることにより評価される、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。