DE4403780A1

DE4403780A1 - Verfahren zum nichtradioaktiven Nachweis von Biomolekülen

Info

Publication number: DE4403780A1
Application number: DE19944403780
Authority: DE
Inventors: Frank Dr Schubert; Uwe Dr Moeller; Andrea Knaf; Dieter Prof Dr Cech
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1994-02-03
Filing date: 1994-02-03
Publication date: 1995-08-10

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum nichtradioaktiven Nachweis von Biomolekülen (insbesondere Nukleinsäuren) in spezifischen Bindungsassays (Hybridisierung)
Der Einzug und die Verbreitung von Analysentechniken, die auf der hochspezifischen Wechselwirkung komplementärer Nukleinsäuresequenzen basieren, hat stark die Entwick lung nichtradioaktiver Markierungsstrategien stimuliert. Vor allem die durch den natürli chen Zerfall von bislang verwendeten Isotopen verursachte Kurzlebigkeit der genutzten Nukleinsäuresonden, die für das Arbeiten mit radioaktiven Isotopen notwendigen Sicherheitsvorkehrungen, das gesundheitliche Restrisiko und Probleme der Abfallbesei tigung, stellen eine breite Nutzung radioaktiver Markierungsverfahren in Frage. Alternativ wurden dementsprechend eine Reihe nichtradioaktiver Varianten zur Nuklein säuremarkierung entwickelt. Man unterscheidet zwei grundlegende Verfahren der Markie rung, das direkte und das indirekte Markieren.

Beim direkten Verfahren werden ein oder mehrere Markermoleküle mit der nachzuweisen den Nukleinsäure verbunden und der eigentliche Nachweis über die chemischen, biochemi schen oder physikochemischen Eigenschaften der Markierungsmoleküle geführt.

Diese Markierungsmoleküle können zum Beispiel Komplexe von Seltenerden- oder Über gangsmetallen mit organischen Liganden sein [Oser et al., Anal. Biochem. 191 (1990) 295; EP 0 340 675]. Zum eigentlichen Nachweis (Nukleinsäuredetektion) werden die Fluores zenzeigenschaften dieser Komplexe genutzt. Weiterhin sind an Nukleinsäuremoleküle ge bundene Proteine (z. B. alkalische Phosphatase oder Meerrettichperoxidase) und die Nutzung von deren Enzymaktivität in einer zur Produktion von Signalen geeigneten Folge reaktion (z. B. Lichtemission, Bildung eines Farbniederschlages) [Pollard-Knight et al., Anal. Biochem. 185 (1990) 84; Jablonski et al., Nucleic Acids Res. 14 (1986) 6115] be kannt. Der Einsatz von sequenzspezifisch an Nukleinsäuren bindende Proteine als direkte DNA-Marker [EP 0 310 251] ist ebenfalls erwähnt, wie der Einsatz von DNA-Doppel strang spezifischen Antikörpern [EP 0 135 159].

Die genannten direkten Verfahren zur Nukleinsäuremarkierung erfordern jedoch, um die notwendige Empfindlichkeit zu erreichen, einen nicht unerheblichen instrumentellen Auf wand an hochempfindlicher Analysentechnik zur Registrierung der Fluoreszenz- bzw. an derer Emissionen. Bei der Nutzung von Proteinen als direkte Nukleinsäuremarker wird da gegen die Anwendungsbreite der markierten Derivate dadurch eingeschränkt, daß die Wahl der Bedingungen für die den Assays zugrundeliegenden Hybridisierungsreaktionen, immer an den für die Enzymaktivität optimalen Parametern orientiert werden muß. Gleiches gilt für vorbereitende Amplifikationen (z. B. PCR). Dies ist erforderlich, um nicht durch Dena turierungserscheinungen die Marker irreversibel zu schädigen und damit die Sensitivität der Nachweise zu beeinträchtigen.

Indirekte Verfahren der Nukleinsäuremarkierung nutzen im Gegensatz zu direkten Anker moleküle, die in die zu markierenden Spezies eingeführt werden. Dies können Haptene sein, von denen bislang das Aglycon des Digitalistoxins "Digoxigenin" [Kessler, Mol. Cell. Probes 5 (1991) 161] aber auch andere Verbindungen, wie Nitrobenzenderivate [EP 0 485 155], Fluoreszein oder Xanthinverbindungen [EP 0 485 156] beschrieben sind. In ähnlicher Weise kommt Biotin zum Einsatz. Zur eigentlichen Detektion der mit Haptenen bzw. Bio tin markierten Biomoleküle wird der mit einem Enzym konjugierte spezifische Antikörper oder im Fall des Biotins Avidin bzw. Streptavidin gegeben. Nach erfolgter Bindung an das Hapten wird überschüssiges Antikörper/Enzymkonjugat aus dem Ansatz entfernt (i.d.R. durch Waschoperationen) und dann über die Enzymaktivität mit entsprechenden signal erzeugenden Reaktionen der eigentliche Nachweis durchgeführt.

Problematisch beim Einsatz enzymkonjugierter Antikörper ist vor allem, daß die verwendeten Derivate zur unspezifischen Bindung mit verwendeten Matrizes (z. B. Nylon- oder Nitrozellulosemembranen) neigen, was insbesondere bei längeren Inkubationszeiten zu unerwünschten Untergrundsignalen führt und die Sensitivität der Nachweise beein trächtigt. Deshalb sind zusätzliche Blockierungsschritte erforderlich, die das Gesamtverfah ren erschweren und die Assayzeit verlängern.

Dioxetane eignen sich aufgrund ihrer chemischen Eigenschaften gut als Substrate in signal erzeugenden Nachweisreaktionen. Diese Verbindungen lassen sich thermisch zersetzen bzw. zerfallen bei Änderung des Substitutionsmusters spontan. Beide Reaktionen verlaufen unter Emission von Licht, welches als Detektionsgröße in entsprechenden Analysenverfah ren nutzbar ist. So basieren einige der empfindlichsten nichtradioaktiven Nachweis verfahren für Biomoleküle, besonders auch Nukleinsäuren, auf der enzymatischen Ände rung des Substitutionsmusters und dem nachfolgenden Spontanzerfall von Dioxetan substraten, die a priori Bestandteil von Analysenkomponenten sind [Bronstein et al., Bio techniques 9 (1990) 160; Bronstein et al., Biotechniques 8 (1990) 310; Bronstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 4514]. Dabei werden beträchtliche Empfindlichkei ten (10^-21 Mol) erreicht.

Andererseits wurde vorgeschlagen, mit an Biomoleküle gebundenen Singulettsauerstoff generatoren durch Bestrahlung des zu analysierenden Materials in Gegenwart von in hoch siedenden organischen Lösungsmitteln gelösten Olefinen Dioxetane zu akkumulieren und diese in einer anschließenden Nachweisreaktion durch Erhitzen auf ca. 100°C unter Licht emission zu zersetzen [EP 0 345 776]. Hierbei werden Nachweisgrenzen von 10^-15 Mol angegeben. Das Erhitzen von Nylonmembranen, wie die Nutzung hochsiedener und zum Teil halogenierter Lösungsmittel ist jedoch aus technologischer und ökologischer Sicht nicht unproblematisch. Ebenso ist die erreichte Empfindlichkeit für Nukleinsäurenachweise nicht ausreichend.

Dieser Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein nichtradioaktives Nachweissystem für Biomoleküle zu entwickeln, welches sich durch sehr hohe Empfindlichkeit auszeichnet, was aber nicht durch zusätzliche Wasch- und Blockierungsoperationen verkompliziert wird. Weiterhin sollen die verwendeten Marker einen vielseitigen Einsatz der markierten Biomoleküle in biochemischen und molekularbiologischen Operationen (z. B. enzymatische Amplifikationsschritte) erlauben.

Es konnte gezeigt werden, daß in einem heterogenen System (fest/gasförmig), in dem ein Olefin der Struktur I auf eine feste Matrix aufgebracht ist, bei Anwesenheit geringster Spuren (bis zu 10^-21 Mol) von Molekülen, die in der Lage sind Singulettsauerstoff zu generieren, nach Bestrahlung mit Licht auf der festen Matrix, Dioxetane gebildet werden. Diese gebildeten Dioxetane sind so substituiert, daß nach Abspaltung eines Substituenten ein Spontanzerfall unter Lichtemission einsetzt. Das freiwerdende Licht ist in einem Strahlungsmeßgerät bzw. auf geeignetem photographischem Material detektierbar. Weiter hin stellte sich heraus, daß die Anwesenheit von biologischem Material, wie z. B. Proteine, Kohlenhydrate oder Nukleinsäuren, die Empfindlichkeit der Nachweise nicht beeinträchti gen. Damit kann das beschriebene Verfahren als hochempfindlicher nichtradioaktiver Nachweis für Biomoleküle genutzt werden.

Vorteilhaft sind dabei die folgenden Tatsachen:

- es ist, außer den allgemeinbekannten Lichtquellen (z. B. Wolframlampe) kein zusätzliches Gerät zur Detektion von Strahlung in der Routineanalytik erforderlich,
- die Detektion ist bei Raumtemperatur im wäßrigen Medien möglich. Damit entfallen sämtliche Entsorgungs- und Stabilitätsprobleme, die mit der Nutzung hoher Temperaturen und organischer Lösungsmittel verbunden sind,
- Probleme mit Untergrundsignalen treten nicht auf, da
a) die Sensibilisatoren (Marker) nicht zur unspezifischen Wechselwirkung mit den verwendeten festen Phasen neigen, Wasch- und Blockierungsschritte sind nicht erforderlich und
b) das emittierende Molekül sich ausschließlich dort befindet, wo auch das nachzuweisende Biomolekül ist,
- im Gegensatz zu Meßanordnungen, die a priori Dioxetane verwenden, sind quantitative Aussagen zu treffen, da die Menge des gebildeten Dioxetans und damit die des emittierten Lichtes proportional zur Markerkonzentration ist und keine der bekannten "Equalising" - Erscheinungen zu beobachten sind,
- andere molekularbiologische Verfahren, wie z. B. PCR u.ä. sind aufgrund der thermischen Stabilität der Markenmoleküle möglich, wobei sich der Detektionsprozeß unmittelbar an vorbereitende Arbeiten anschließen kann.

Im einzelnen ist der Analysengang wie im Folgenden beschrieben und in den Beispielen demonstriert. Nach einer dem jeweiligen analytischen Problem angepaßten Trennoperation (z. B. Elektrophorese) wird das zu analysierende Biomolekül auf eine allgemein übliche Art und Weise auf eine feste Matrix (z. B. Nitrozellulose- oder Nylonmembran) überführt (Blotting) und an diese feste Phase mit allgemein üblichen Methoden fixiert ("Backen", UV-crosslinking). Weiter wird dann, entsprechend dem Assay, ein komplementäres Mole kül, welches mit dem im Assay genutzten Farbstoff verbunden ist zugegeben (z. B. DNA- Sonde, Beispiel 2) und unter den üblichen Bedingungen an das nachzuweisende Molekül gebunden.

Nach Waschen der festen Phase und Trocknen, wird das zur Bildung des Dioxetans erfor derliche Olefin auf die feste Phase aufgebracht, was durch Bedampfen im Vakuum, Auf tragen als Lösung und Verdampfen des Lösungsmittels, Sublimation u.ä.Verfahren ge schieht. Die so präparierte Matrix wird mit Licht geeigneter Wellenlänge bestrahlt, wobei auch Filter zum Einsatz gelangen können (Beispiel 4).

Im Anschluß an die Bestrahlung wird die Membran mit der entsprechenden Hydrolyselö sung befeuchtet und mit dieser nun feuchten Membran ein geeigneter Film exponiert, der dann nach üblichen Verfahren entwickelt wird.

Beispiele Beispiel 1 3-[N-Methyl-N-(4-succinimidoxycarbonylbutyl)amino]-7-dimethylaminoph-enazathioniumchlorid (Abb. 1)

31,2 mg 3 [N-(4-Carboxybutyl)-N-methylamino]-7-dimethylaminophenazathioniumchl-orid (n = 0,077 mmol, M = 405,94 g/mol) werden in 6 ml absolutem Dimethylformamid gelöst. Diese Lösung wird unter Vakuum bis zu einem Volumen von 3 ml eingeengt. Dann gibt man 23,4 mg N-Hydroxysuccinimid (n = 0,2 mmol; M = 115,09 g/mol) und 38,9 mg wasserlösliches Carbodiimid (n = 0,2 mmol; M = 191,71 g/mol) hinzu und läßt das Reaktionsgemisch drei Tage im Dunkeln bei Raumtemperatur reagieren. Anschließend wird das Lösungsmittel unter Vakuum abdestilliert, der Rückstand in Chloroform aufge nommen und dreimal mit gesättigter NaCl-Lösung ausgeschüttelt. Die vereinigten wäßri gen Phasen werden noch zweimal mit frischem Chloroform gewaschen. Danach werden die organischen Phasen über Na₂SO₄ getrocknet und eingeengt. Man erhält 21,2 mg Rohpro dukt (55%), welches ohne weitere Reinigungsoperationen zur Markierung einsetzbar ist.

Beispiel 2 Kopplung von Methylenblau-Derivaten an ein aminofunktionalisiertes Oligonukleotid (Abb. 2)

Zu dem in 50 µl sterilem Wasser gelösten aminofunktionalisierten Oligonukleotid (40 nmol) werden 98,8 µl einer Lösung an TRIS/HCL-Puffer (pH = 8,0) und 39,5 µl einer Lö sung aus 10 mg/ml 3-[N-Methyl-N-(4-succinimidoxycarbonylbutyl)amino]-7- dimethylaminophenazathioniumchlorid in Dimethylformamid zugegeben. Anschließend werden noch 157,7 µl steriles Wasser dem Reaktionsansatz zugesetzt. Die Reaktionslösung wird 24 Stunden bei Raumtemperatur und unter Lichtausschluß bei fortwährender Durchmischung aufbewahrt. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels erfolgt die Entsal zung des Reaktionsansatzes über eine Sephadex G25 Säule. Im Ausschlußvolumen von 1,5 ml sind sowohl das freie aminofunktionalisierte Oligonukleotid als auch das markierte ent halten. Die weitere Aufarbeitung und Reinigung erfolgt mit Hilfe der präparativen HPLC.

Beispiel 3

Zu dem in 50 µl sterilem Wasser gelösten aminofunktionalisierten Oligonukleotid (40 nmol) gibt man 1 mg 3-[N-(4-Carboxybutyl)-N-methylamino]-7- dimethylaminophenazathionumchlorid (n = 2,46 µmol; M = 405,94 g/mol), 2,7 mg Imidazol (n = 39,76 µmol; M = 68,08), 0,6 mg wasserlösliches Carbodiimid (n = 2,98 µmol; M = 191,71 g/mol) und 100 µl MES-Puffer (pH = 6,0). Die Reaktionslösung wird 24 Stunden bei Raumtemperatur und unter Lichtausschluß bei fortwährender Durchmischung aufbewahrt. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels erfolgt die Entsalzung des Reaktions ansatzes über eine Sephadex G 25 Säule.

Beispiel 4 Nachweis von Plasmid-DNA (pUC 18) mittels Dotblot

Ausgehend von einer Stammlösung von Plasmid-DNA (C₀= 4 ng/µl) wird eine Konzen trationsreihe in sterilem Wasser durch jeweilige zehnfache Verdünnung im Bereich von 4 ng - 0,4 pg/µl erstellt. Nach Denaturieren der DNA im siedenden Wasserbad und Abkühlen auf Eis werden je ein Mikroliter der DNA-Lösungen auf eine Nylonmembran (Amersham Hybond N o. ä.) aufgetragen und durch Backen bei 120°C fixiert. Die anschließende Hybridisierung erfolgt nach allgemein bekannten Protokollen mit einer Sondenkonzentra tion (Markierung der DNA-Sonde s. Beispiel 1) von etwa 50 ng/ml. Den der Hybridisation folgenden Waschschritten schließt sich ein einmaliges Waschen der Membran mit ca. 5 ml sterilem Wasser (10 min) an, worauf die Membran mit einem Fön getrocknet wird. Das für den Detektionsprozeß erforderliche Olefin {1-Methoxy-1-(3-acetylphenyl)-2,2′- spiro-adamantyl-ethen} in Pentan (10 mg/100 ml) oder einem analogen Lösungsmittel, wird mittels eines Zerstäubers auf die Membran aufgetragen. Dem Trocknen der Membran folgt die Belichtung mit geeigneter Wellenlänge (z. B. im System Wolframlampe/Rotfilter) innerhalb von 10 Minuten. Im Anschluß daran taucht man die Membran kurz in 10%ige Tetrabutylammoniumhydroxidlösung, läßt überschüssige Flüssigkeit ablaufen und exponiert mit der feuchten Membran geeignetes photographisches Material (z. B. ECL- Hyperfilm, Amersham o. ä.) für ca. 15 Minuten. Nach der Filmentwicklung werden für alle aufgetragenen Konzentrationen Signale sichtbar.

Claims

1. Verfahren zum nichtradioaktiven Nachweis von Biomolekülen, dadurch gekennzeichnet, daß Dioxetane der Struktur II aus Olefinen der Struktur I als Precursorverbindungen in einer dem Detektionsprozeß vorangehenden Amplifikationsreaktion gebildet werden, wobei R₁, R₂ und R₃ Alkyl-, substituierte Alkylgruppen oder Alkoxy- bzw. substituierte Alkoxygruppen mit im Fall R₁ und R₂ mindestens 2 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 3 bis 6, die einzelkettig oder miteinander verzweigt bzw. über Brückenatome verbunden sein können und R₄ einen Arylrest symbolisiert, der mit mindestens einem im alkalischen Medium hydrolysierbaren Substituenten versehen ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Nachweisreaktion die Zersetzung von Dioxetanen der Struktur II, nach einer hydrolytischen Abspaltung von Substituenten an R₄ genutzt wird.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Bildung der Dioxetane nur in Verbindung mit einem als nichtradioaktives Markermolekül fungierenden Molekül, insbesondere Farbstoffe, erfolgt, die an das zu detektierende Biomolekül unter Ausnutzung kovalenter, ionischer, adsorptiver, insbesondere kovalenter Wechselwirkungen gebunden sind.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendeten Moleküle in der Lage sind, photochemisch Singulettsauerstoff zu generieren, insbesondere bei Wellenlängen größer 400 nm, vorzugsweise zwischen 600 und 800 nm.

5. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß diese Farbstoffe der Gruppe der Methylenblaufarbstoffe bzw. substituierte Methylenblauderivate, Phtalocyanine bzw. substituierte Phtalocyanine, Porphine bzw. substituierte Porphine, Haematoporphine, vorzugsweise Methylenblau angehören.

6. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Bildung der Dioxetane im System fest/gasförmig unter Einbeziehung von Sauerstoff oder Gasgemischen, die Sauerstoff enthalten, insbesondere Luft, ohne Einsatz von zusätzlichen, allgemein bekannten Lösungsmitteln erfolgt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als feste Phase Biomolekülbindende Materialien zum Einsatz kommen.

8. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Biomoleküle Nukleinsäuren, Eiweißstrukturen und Kohlenhydrate oder deren Kombinationen mit einer Größe von 1 bis ca. 5000 Monomereinheiten, insbesondere 10 bis 200, zum Einsatz kommen.

9. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydrolyse der Dioxetane durch chemische und/oder enzymatische Reaktionen bei pH-Werten größer 7, insbesondere 8-12 erfolgt.

10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Hydrolyselösung chemilumineszenzverstärkende Substanzen zugegeben werden können.

11. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Zerfall der Dioxetane unter Lichtemission erfolgt.