DE4403780A1 - Verfahren zum nichtradioaktiven Nachweis von Biomolekülen - Google Patents
Verfahren zum nichtradioaktiven Nachweis von BiomolekülenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum nichtradioaktiven Nachweis von Biomolekülen
(insbesondere Nukleinsäuren) in spezifischen Bindungsassays (Hybridisierung)
Der Einzug und die Verbreitung von Analysentechniken, die auf der hochspezifischen Wechselwirkung komplementärer Nukleinsäuresequenzen basieren, hat stark die Entwick lung nichtradioaktiver Markierungsstrategien stimuliert. Vor allem die durch den natürli chen Zerfall von bislang verwendeten Isotopen verursachte Kurzlebigkeit der genutzten Nukleinsäuresonden, die für das Arbeiten mit radioaktiven Isotopen notwendigen Sicherheitsvorkehrungen, das gesundheitliche Restrisiko und Probleme der Abfallbesei tigung, stellen eine breite Nutzung radioaktiver Markierungsverfahren in Frage. Alternativ wurden dementsprechend eine Reihe nichtradioaktiver Varianten zur Nuklein säuremarkierung entwickelt. Man unterscheidet zwei grundlegende Verfahren der Markie rung, das direkte und das indirekte Markieren.
Der Einzug und die Verbreitung von Analysentechniken, die auf der hochspezifischen Wechselwirkung komplementärer Nukleinsäuresequenzen basieren, hat stark die Entwick lung nichtradioaktiver Markierungsstrategien stimuliert. Vor allem die durch den natürli chen Zerfall von bislang verwendeten Isotopen verursachte Kurzlebigkeit der genutzten Nukleinsäuresonden, die für das Arbeiten mit radioaktiven Isotopen notwendigen Sicherheitsvorkehrungen, das gesundheitliche Restrisiko und Probleme der Abfallbesei tigung, stellen eine breite Nutzung radioaktiver Markierungsverfahren in Frage. Alternativ wurden dementsprechend eine Reihe nichtradioaktiver Varianten zur Nuklein säuremarkierung entwickelt. Man unterscheidet zwei grundlegende Verfahren der Markie rung, das direkte und das indirekte Markieren.
Beim direkten Verfahren werden ein oder mehrere Markermoleküle mit der nachzuweisen
den Nukleinsäure verbunden und der eigentliche Nachweis über die chemischen, biochemi
schen oder physikochemischen Eigenschaften der Markierungsmoleküle geführt.
Diese Markierungsmoleküle können zum Beispiel Komplexe von Seltenerden- oder Über
gangsmetallen mit organischen Liganden sein [Oser et al., Anal. Biochem. 191 (1990) 295;
EP 0 340 675]. Zum eigentlichen Nachweis (Nukleinsäuredetektion) werden die Fluores
zenzeigenschaften dieser Komplexe genutzt. Weiterhin sind an Nukleinsäuremoleküle ge
bundene Proteine (z. B. alkalische Phosphatase oder Meerrettichperoxidase) und die
Nutzung von deren Enzymaktivität in einer zur Produktion von Signalen geeigneten Folge
reaktion (z. B. Lichtemission, Bildung eines Farbniederschlages) [Pollard-Knight et al.,
Anal. Biochem. 185 (1990) 84; Jablonski et al., Nucleic Acids Res. 14 (1986) 6115] be
kannt. Der Einsatz von sequenzspezifisch an Nukleinsäuren bindende Proteine als direkte
DNA-Marker [EP 0 310 251] ist ebenfalls erwähnt, wie der Einsatz von DNA-Doppel
strang spezifischen Antikörpern [EP 0 135 159].
Die genannten direkten Verfahren zur Nukleinsäuremarkierung erfordern jedoch, um die
notwendige Empfindlichkeit zu erreichen, einen nicht unerheblichen instrumentellen Auf
wand an hochempfindlicher Analysentechnik zur Registrierung der Fluoreszenz- bzw. an
derer Emissionen. Bei der Nutzung von Proteinen als direkte Nukleinsäuremarker wird da
gegen die Anwendungsbreite der markierten Derivate dadurch eingeschränkt, daß die Wahl
der Bedingungen für die den Assays zugrundeliegenden Hybridisierungsreaktionen, immer
an den für die Enzymaktivität optimalen Parametern orientiert werden muß. Gleiches gilt
für vorbereitende Amplifikationen (z. B. PCR). Dies ist erforderlich, um nicht durch Dena
turierungserscheinungen die Marker irreversibel zu schädigen und damit die Sensitivität
der Nachweise zu beeinträchtigen.
Indirekte Verfahren der Nukleinsäuremarkierung nutzen im Gegensatz zu direkten Anker
moleküle, die in die zu markierenden Spezies eingeführt werden. Dies können Haptene
sein, von denen bislang das Aglycon des Digitalistoxins "Digoxigenin" [Kessler, Mol. Cell.
Probes 5 (1991) 161] aber auch andere Verbindungen, wie Nitrobenzenderivate [EP 0 485
155], Fluoreszein oder Xanthinverbindungen [EP 0 485 156] beschrieben sind. In ähnlicher
Weise kommt Biotin zum Einsatz. Zur eigentlichen Detektion der mit Haptenen bzw. Bio
tin markierten Biomoleküle wird der mit einem Enzym konjugierte spezifische Antikörper
oder im Fall des Biotins Avidin bzw. Streptavidin gegeben. Nach erfolgter Bindung an das
Hapten wird überschüssiges Antikörper/Enzymkonjugat aus dem Ansatz entfernt (i.d.R.
durch Waschoperationen) und dann über die Enzymaktivität mit entsprechenden signal
erzeugenden Reaktionen der eigentliche Nachweis durchgeführt.
Problematisch beim Einsatz enzymkonjugierter Antikörper ist vor allem, daß die
verwendeten Derivate zur unspezifischen Bindung mit verwendeten Matrizes (z. B. Nylon-
oder Nitrozellulosemembranen) neigen, was insbesondere bei längeren Inkubationszeiten
zu unerwünschten Untergrundsignalen führt und die Sensitivität der Nachweise beein
trächtigt. Deshalb sind zusätzliche Blockierungsschritte erforderlich, die das Gesamtverfah
ren erschweren und die Assayzeit verlängern.
Dioxetane eignen sich aufgrund ihrer chemischen Eigenschaften gut als Substrate in signal
erzeugenden Nachweisreaktionen. Diese Verbindungen lassen sich thermisch zersetzen
bzw. zerfallen bei Änderung des Substitutionsmusters spontan. Beide Reaktionen verlaufen
unter Emission von Licht, welches als Detektionsgröße in entsprechenden Analysenverfah
ren nutzbar ist. So basieren einige der empfindlichsten nichtradioaktiven Nachweis
verfahren für Biomoleküle, besonders auch Nukleinsäuren, auf der enzymatischen Ände
rung des Substitutionsmusters und dem nachfolgenden Spontanzerfall von Dioxetan
substraten, die a priori Bestandteil von Analysenkomponenten sind [Bronstein et al., Bio
techniques 9 (1990) 160; Bronstein et al., Biotechniques 8 (1990) 310; Bronstein et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 4514]. Dabei werden beträchtliche Empfindlichkei
ten (10-21 Mol) erreicht.
Andererseits wurde vorgeschlagen, mit an Biomoleküle gebundenen Singulettsauerstoff
generatoren durch Bestrahlung des zu analysierenden Materials in Gegenwart von in hoch
siedenden organischen Lösungsmitteln gelösten Olefinen Dioxetane zu akkumulieren und
diese in einer anschließenden Nachweisreaktion durch Erhitzen auf ca. 100°C unter Licht
emission zu zersetzen [EP 0 345 776]. Hierbei werden Nachweisgrenzen von 10-15 Mol
angegeben. Das Erhitzen von Nylonmembranen, wie die Nutzung hochsiedener und zum
Teil halogenierter Lösungsmittel ist jedoch aus technologischer und ökologischer Sicht
nicht unproblematisch. Ebenso ist die erreichte Empfindlichkeit für Nukleinsäurenachweise
nicht ausreichend.
Dieser Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein nichtradioaktives Nachweissystem für
Biomoleküle zu entwickeln, welches sich durch sehr hohe Empfindlichkeit auszeichnet,
was aber nicht durch zusätzliche Wasch- und Blockierungsoperationen verkompliziert
wird. Weiterhin sollen die verwendeten Marker einen vielseitigen Einsatz der markierten
Biomoleküle in biochemischen und molekularbiologischen Operationen (z. B. enzymatische
Amplifikationsschritte) erlauben.
Es konnte gezeigt werden, daß in einem heterogenen System (fest/gasförmig), in dem ein
Olefin der Struktur I auf eine feste Matrix aufgebracht ist, bei Anwesenheit geringster
Spuren (bis zu 10-21 Mol) von Molekülen, die in der Lage sind Singulettsauerstoff zu
generieren, nach Bestrahlung mit Licht auf der festen Matrix, Dioxetane gebildet werden.
Diese gebildeten Dioxetane sind so substituiert, daß nach Abspaltung eines Substituenten
ein Spontanzerfall unter Lichtemission einsetzt. Das freiwerdende Licht ist in einem
Strahlungsmeßgerät bzw. auf geeignetem photographischem Material detektierbar. Weiter
hin stellte sich heraus, daß die Anwesenheit von biologischem Material, wie z. B. Proteine,
Kohlenhydrate oder Nukleinsäuren, die Empfindlichkeit der Nachweise nicht beeinträchti
gen. Damit kann das beschriebene Verfahren als hochempfindlicher nichtradioaktiver
Nachweis für Biomoleküle genutzt werden.
Vorteilhaft sind dabei die folgenden Tatsachen:
- - es ist, außer den allgemeinbekannten Lichtquellen (z. B. Wolframlampe) kein zusätzliches Gerät zur Detektion von Strahlung in der Routineanalytik erforderlich,
- - die Detektion ist bei Raumtemperatur im wäßrigen Medien möglich. Damit entfallen sämtliche Entsorgungs- und Stabilitätsprobleme, die mit der Nutzung hoher Temperaturen und organischer Lösungsmittel verbunden sind,
- - Probleme mit Untergrundsignalen treten nicht auf, da
- a) die Sensibilisatoren (Marker) nicht zur unspezifischen Wechselwirkung mit den verwendeten festen Phasen neigen, Wasch- und Blockierungsschritte sind nicht erforderlich und
- b) das emittierende Molekül sich ausschließlich dort befindet, wo auch das nachzuweisende Biomolekül ist,
- - im Gegensatz zu Meßanordnungen, die a priori Dioxetane verwenden, sind quantitative Aussagen zu treffen, da die Menge des gebildeten Dioxetans und damit die des emittierten Lichtes proportional zur Markerkonzentration ist und keine der bekannten "Equalising" - Erscheinungen zu beobachten sind,
- - andere molekularbiologische Verfahren, wie z. B. PCR u.ä. sind aufgrund der thermischen Stabilität der Markenmoleküle möglich, wobei sich der Detektionsprozeß unmittelbar an vorbereitende Arbeiten anschließen kann.
Im einzelnen ist der Analysengang wie im Folgenden beschrieben und in den Beispielen
demonstriert. Nach einer dem jeweiligen analytischen Problem angepaßten Trennoperation
(z. B. Elektrophorese) wird das zu analysierende Biomolekül auf eine allgemein übliche Art
und Weise auf eine feste Matrix (z. B. Nitrozellulose- oder Nylonmembran) überführt
(Blotting) und an diese feste Phase mit allgemein üblichen Methoden fixiert ("Backen",
UV-crosslinking). Weiter wird dann, entsprechend dem Assay, ein komplementäres Mole
kül, welches mit dem im Assay genutzten Farbstoff verbunden ist zugegeben (z. B. DNA-
Sonde, Beispiel 2) und unter den üblichen Bedingungen an das nachzuweisende Molekül
gebunden.
Nach Waschen der festen Phase und Trocknen, wird das zur Bildung des Dioxetans erfor
derliche Olefin auf die feste Phase aufgebracht, was durch Bedampfen im Vakuum, Auf
tragen als Lösung und Verdampfen des Lösungsmittels, Sublimation u.ä.Verfahren ge
schieht. Die so präparierte Matrix wird mit Licht geeigneter Wellenlänge bestrahlt, wobei
auch Filter zum Einsatz gelangen können (Beispiel 4).
Im Anschluß an die Bestrahlung wird die Membran mit der entsprechenden Hydrolyselö
sung befeuchtet und mit dieser nun feuchten Membran ein geeigneter Film exponiert, der
dann nach üblichen Verfahren entwickelt wird.
31,2 mg 3 [N-(4-Carboxybutyl)-N-methylamino]-7-dimethylaminophenazathioniumchl-orid
(n = 0,077 mmol, M = 405,94 g/mol) werden in 6 ml absolutem Dimethylformamid
gelöst. Diese Lösung wird unter Vakuum bis zu einem Volumen von 3 ml eingeengt. Dann
gibt man 23,4 mg N-Hydroxysuccinimid (n = 0,2 mmol; M = 115,09 g/mol) und 38,9 mg
wasserlösliches Carbodiimid (n = 0,2 mmol; M = 191,71 g/mol) hinzu und läßt das
Reaktionsgemisch drei Tage im Dunkeln bei Raumtemperatur reagieren. Anschließend
wird das Lösungsmittel unter Vakuum abdestilliert, der Rückstand in Chloroform aufge
nommen und dreimal mit gesättigter NaCl-Lösung ausgeschüttelt. Die vereinigten wäßri
gen Phasen werden noch zweimal mit frischem Chloroform gewaschen. Danach werden die
organischen Phasen über Na₂SO₄ getrocknet und eingeengt. Man erhält 21,2 mg Rohpro
dukt (55%), welches ohne weitere Reinigungsoperationen zur Markierung einsetzbar ist.
Zu dem in 50 µl sterilem Wasser gelösten aminofunktionalisierten Oligonukleotid (40
nmol) werden 98,8 µl einer Lösung an TRIS/HCL-Puffer (pH = 8,0) und 39,5 µl einer Lö
sung aus 10 mg/ml 3-[N-Methyl-N-(4-succinimidoxycarbonylbutyl)amino]-7-
dimethylaminophenazathioniumchlorid in Dimethylformamid zugegeben. Anschließend
werden noch 157,7 µl steriles Wasser dem Reaktionsansatz zugesetzt. Die Reaktionslösung
wird 24 Stunden bei Raumtemperatur und unter Lichtausschluß bei fortwährender
Durchmischung aufbewahrt. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels erfolgt die Entsal
zung des Reaktionsansatzes über eine Sephadex G25 Säule. Im Ausschlußvolumen von 1,5 ml
sind sowohl das freie aminofunktionalisierte Oligonukleotid als auch das markierte ent
halten. Die weitere Aufarbeitung und Reinigung erfolgt mit Hilfe der präparativen HPLC.
Zu dem in 50 µl sterilem Wasser gelösten aminofunktionalisierten Oligonukleotid (40
nmol) gibt man 1 mg 3-[N-(4-Carboxybutyl)-N-methylamino]-7-
dimethylaminophenazathionumchlorid (n = 2,46 µmol; M = 405,94 g/mol), 2,7 mg
Imidazol (n = 39,76 µmol; M = 68,08), 0,6 mg wasserlösliches Carbodiimid (n = 2,98
µmol; M = 191,71 g/mol) und 100 µl MES-Puffer (pH = 6,0). Die Reaktionslösung wird 24
Stunden bei Raumtemperatur und unter Lichtausschluß bei fortwährender Durchmischung
aufbewahrt. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels erfolgt die Entsalzung des Reaktions
ansatzes über eine Sephadex G 25 Säule.
Ausgehend von einer Stammlösung von Plasmid-DNA (C₀= 4 ng/µl) wird eine Konzen
trationsreihe in sterilem Wasser durch jeweilige zehnfache Verdünnung im Bereich von 4
ng - 0,4 pg/µl erstellt. Nach Denaturieren der DNA im siedenden Wasserbad und Abkühlen
auf Eis werden je ein Mikroliter der DNA-Lösungen auf eine Nylonmembran (Amersham
Hybond N o. ä.) aufgetragen und durch Backen bei 120°C fixiert. Die anschließende
Hybridisierung erfolgt nach allgemein bekannten Protokollen mit einer Sondenkonzentra
tion (Markierung der DNA-Sonde s. Beispiel 1) von etwa 50 ng/ml. Den der Hybridisation
folgenden Waschschritten schließt sich ein einmaliges Waschen der Membran mit ca. 5 ml
sterilem Wasser (10 min) an, worauf die Membran mit einem Fön getrocknet wird.
Das für den Detektionsprozeß erforderliche Olefin {1-Methoxy-1-(3-acetylphenyl)-2,2′-
spiro-adamantyl-ethen} in Pentan (10 mg/100 ml) oder einem analogen Lösungsmittel, wird
mittels eines Zerstäubers auf die Membran aufgetragen. Dem Trocknen der Membran folgt
die Belichtung mit geeigneter Wellenlänge (z. B. im System Wolframlampe/Rotfilter)
innerhalb von 10 Minuten. Im Anschluß daran taucht man die Membran kurz in 10%ige
Tetrabutylammoniumhydroxidlösung, läßt überschüssige Flüssigkeit ablaufen und
exponiert mit der feuchten Membran geeignetes photographisches Material (z. B. ECL-
Hyperfilm, Amersham o. ä.) für ca. 15 Minuten. Nach der Filmentwicklung werden für alle
aufgetragenen Konzentrationen Signale sichtbar.
Claims (11)
1. Verfahren zum nichtradioaktiven Nachweis von Biomolekülen, dadurch
gekennzeichnet, daß Dioxetane der Struktur II aus Olefinen der Struktur I als
Precursorverbindungen in einer dem Detektionsprozeß vorangehenden
Amplifikationsreaktion gebildet werden, wobei R₁, R₂ und R₃ Alkyl-, substituierte
Alkylgruppen oder Alkoxy- bzw. substituierte Alkoxygruppen mit im Fall R₁ und R₂
mindestens 2 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 3 bis 6, die einzelkettig oder
miteinander verzweigt bzw. über Brückenatome verbunden sein können und R₄ einen
Arylrest symbolisiert, der mit mindestens einem im alkalischen Medium
hydrolysierbaren Substituenten versehen ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Nachweisreaktion die Zersetzung von Dioxetanen der Struktur II, nach einer hydrolytischen Abspaltung von
Substituenten an R₄ genutzt wird.
3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Bildung der
Dioxetane nur in Verbindung mit einem als nichtradioaktives Markermolekül fungierenden
Molekül, insbesondere Farbstoffe, erfolgt, die an das zu detektierende Biomolekül unter
Ausnutzung kovalenter, ionischer, adsorptiver, insbesondere kovalenter Wechselwirkungen
gebunden sind.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendeten Moleküle in
der Lage sind, photochemisch Singulettsauerstoff zu generieren, insbesondere bei
Wellenlängen größer 400 nm, vorzugsweise zwischen 600 und 800 nm.
5. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß diese Farbstoffe der
Gruppe der Methylenblaufarbstoffe bzw. substituierte Methylenblauderivate,
Phtalocyanine bzw. substituierte Phtalocyanine, Porphine bzw. substituierte Porphine,
Haematoporphine, vorzugsweise Methylenblau angehören.
6. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Bildung der
Dioxetane im System fest/gasförmig unter Einbeziehung von Sauerstoff oder
Gasgemischen, die Sauerstoff enthalten, insbesondere Luft, ohne Einsatz von zusätzlichen,
allgemein bekannten Lösungsmitteln erfolgt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als feste Phase
Biomolekülbindende Materialien zum Einsatz kommen.
8. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Biomoleküle
Nukleinsäuren, Eiweißstrukturen und Kohlenhydrate oder deren Kombinationen mit einer
Größe von 1 bis ca. 5000 Monomereinheiten, insbesondere 10 bis 200, zum Einsatz
kommen.
9. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydrolyse der
Dioxetane durch chemische und/oder enzymatische Reaktionen bei pH-Werten größer 7,
insbesondere 8-12 erfolgt.
10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Hydrolyselösung
chemilumineszenzverstärkende Substanzen zugegeben werden können.
11. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Zerfall der
Dioxetane unter Lichtemission erfolgt.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19944403780 DE4403780A1 (de) | 1994-02-03 | 1994-02-03 | Verfahren zum nichtradioaktiven Nachweis von Biomolekülen |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19944403780 DE4403780A1 (de) | 1994-02-03 | 1994-02-03 | Verfahren zum nichtradioaktiven Nachweis von Biomolekülen |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE4403780A1 true DE4403780A1 (de) | 1995-08-10 |
Family
ID=6509682
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19944403780 Withdrawn DE4403780A1 (de) | 1994-02-03 | 1994-02-03 | Verfahren zum nichtradioaktiven Nachweis von Biomolekülen |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE4403780A1 (de) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0944642A1 (de) * | 1996-12-16 | 1999-09-29 | Tropix, Inc. | Mit dioxetan markierte sonden und sie verwendende nachweistests |
EP1523668A1 (de) * | 2002-07-16 | 2005-04-20 | EMP Biotech Gmbh | Nachweis von sensitizer-markierten analyten |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0345776A2 (de) * | 1988-06-08 | 1989-12-13 | London Diagnostics, Inc. | Testsysteme mit sensitizerinduzierter Produktion von feststellbaren Signalen |
-
1994
- 1994-02-03 DE DE19944403780 patent/DE4403780A1/de not_active Withdrawn
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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EP0345776A2 (de) * | 1988-06-08 | 1989-12-13 | London Diagnostics, Inc. | Testsysteme mit sensitizerinduzierter Produktion von feststellbaren Signalen |
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EP0944642A4 (de) * | 1996-12-16 | 2002-01-30 | Tropix Inc | Mit dioxetan markierte sonden und sie verwendende nachweistests |
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